JP6864990B2 - Ｂｒａｆ遺伝子変異を有する細胞に対する細胞死誘導剤、当該細胞の増殖抑制剤及び当該細胞の増殖異常に起因する疾患の治療用医薬組成物 - Google Patents

Ｂｒａｆ遺伝子変異を有する細胞に対する細胞死誘導剤、当該細胞の増殖抑制剤及び当該細胞の増殖異常に起因する疾患の治療用医薬組成物 Download PDF

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本発明は、ＢＲＡＦ遺伝子変異を有する細胞（例えばがん細胞の一種）に対する細胞死誘導剤、当該細胞の増殖抑制剤及び当該細胞の増殖異常に起因する疾患の治療用医薬組成物に関し、更に細胞死誘導剤及び／又は細胞増殖抑制剤をスクリーニングする方法に関する。
ＢＲＡＦ遺伝子は、ＲＡＳ−ＲＡＦ−ＭＡＰＫ経路を構成するセリンスレオニンキナーゼの一種をコードする遺伝子である。様々な腫瘍において、ＢＲＡＦ遺伝子の変異が報告されている。例えば、６００番目のバリンがグルタミン酸に置換する変異（Ｖ６００Ｅ）は、多くのがん細胞において認められる。Ｖ６００Ｅ変異を有するＢＲＡＦは、下流のシグナルを常時活性化し、細胞外からの刺激がなくても細胞の増殖をもたらすことが知られている。
例えば、多くの大腸がん（５〜１５％）やメラノーマ（約６０％）において、Ｖ６００Ｅ変異を有するＢＲＡＦ遺伝子が認められている。なお、膵臓がんや大腸がん等の多くのがんにおいて、ＫＲＡＳ遺伝子における変異が高頻度で認められる。ＫＲＡＳタンパク質は、細胞膜の内側に局在しているＧタンパク質である。ＫＲＡＳ等のＲＡＳは、ＣＲＡＦやＢＲＡＦ等のＲＡＦを活性化し、ＲＡＦは引き続きＭＥＫを、ＭＥＫはＭＡＰＫを活性化するというカスケードを形成している（非特許文献１及び２）。ＢＲＡＦ変異及びＫＲＡＳ変異を共に有するケースはまれであり、ＢＲＡＦ変異及びＫＲＡＳ変異相互排他の関係にある（非特許文献３）。
現在、Ｖ６００Ｅ変異を有するＢＲＡＦが認められるがんに対しては、Ｖ６００Ｅ変異を有するＢＲＡＦに対する阻害剤による治療が有効であるとされている。このような阻害剤としては、ベムラフェニブ（Vemurafenib（PLX4032））やPLX4720等が知られている。しかしながら、当該阻害剤の継続的な投与により、がん細胞が当該阻害剤に対して耐性を獲得する場合があり、治療効果は限定的である。よって、ＢＲＡＦ遺伝子に変異を有するがん細胞に対しては、これら阻害剤に代わる、より効果的な細胞死誘導剤や増殖抑制剤が求められていた。
ところで、グルタチオン包含を触媒する酵素の１つであるグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）は、薬剤等の物質をグルタチオン（ＧＳＨ）と共役させ、水溶性の物質とする酵素として知られている。ＧＳＴは、アミノ酸配列に基づいて、代表的なものとして、α、μ、ω、π、θ及びζの６種類のアイソザイムに分類される。なかでも、特にＧＳＴ−π（glutathione S-transferase pi、ＧＳＴＰ１ともいう）の発現が、種々のがん細胞において増大しており、これが一部の抗がん剤に対する耐性の一因となっている可能性が指摘されている。実際、ＧＳＴ−πを過剰発現しており、薬物耐性を示すがん細胞系に、ＧＳＴ−πに対するアンチセンスＤＮＡやＧＳＴ−π阻害剤を作用させると、薬剤耐性が抑制されることが知られている（非特許文献４〜６）。さらに、最近の報告では、ＧＳＴ−πを過剰発現するアンドロゲン非依存性前立腺がん細胞系にＧＳＴ−πに対するｓｉＲＮＡを作用させるとその増殖が抑制され、アポトーシスが増大することが報告されている（非特許文献７）。
また、ＧＳＴ−πについては、ｃ−Ｊｕｎ Ｎ末端キナーゼ（ＪＮＫ）と複合体を形成し、ＪＮＫ活性を阻害することが知られている（非特許文献８）。さらに、ＧＳＴ−πについては、細胞のストレス応答に関連するタンパク質のS-グルタチオン化に関与することが知られている（非特許文献９）。さらにまた、ＧＳＴ−πについては、活性酸素種（ＲＯＳ）によって誘導される細胞死に対する保護作用に寄与することが知られている（非特許文献１０）。このように、ＧＳＴのなかでもＧＳＴ−πは、様々な特徴・機能を有していることが理解できる。
ＫＲＡＳに変異を有するがん細胞系にＧＳＴ−πに対するｓｉＲＮＡを作用させると、Ａｋｔの活性化が抑制され、オートファジーが増大するが、アポトーシスの誘導は中程度となることが報告されている（非特許文献１１）。特許文献１には、ＧＳＴ−πを抑制する薬物と、３−メチルアデニン等のオートファジー阻害剤とを活性成分とすることで、がん細胞のアポトーシスを誘導できることが開示されている。さらに、特許文献２には、ＧＳＴ−πとＡｋｔ等の発現を同時に阻害すると、細胞増殖が抑制され、細胞死が誘導されること、ＧＳＴ−πの発現阻害により誘導されたオートファジーが、Ａｋｔ等の発現を同時に阻害することにより顕著に抑制されることが開示されている。
しかしながら、上述したＢＲＡＦ遺伝子に変異を有する細胞において、ＧＳＴ−πの発現と細胞増殖或いは細胞死との関係や、シグナル伝達に関するＧＳＴ−πの役割等に関する知見はない。
WO2012/176282 WO2014/098210
Curr Top Microbiol Immunol. 2012; 355: 83-98 Curr Opin Pharmacol. 2008 Aug; 8(4): 419-26. British Journal of Cancer (2013) 108, 1757-1764. Takahashi and Niitsu, Gan To Kagaku Ryoho. 1994;21(7):945-51 Ban et al., Cancer Res. 1996;56(15):3577-82 Nakajima et al., J Pharmacol Exp Ther. 2003;306(3):861-9 Hokaiwado et al., Carcinogenesis. 2008;29(6):1134-8 Adler et.al, EMBO J. 1999, 18, 1321-1334 Townsend, et.al, J. Biol. Chem. 2009, 284, 436-445 Yin et.al, Cancer Res. 2000 60, 4053-4057 Nishita et al., AACR 102nd Annual Meeting, Abstract No. 1065
そこで、本発明は、ＢＲＡＦ遺伝子に変異を有する細胞に対して、細胞死誘導作用及び/又は細胞増殖抑制作用を有する剤を提供し、細胞増殖異常に起因する疾患の治療用医薬組成物を提供し、細胞死誘導剤及び/又は細胞増殖抑制剤をスクリーニングする方法を提供することを目的とする。
上述した目的に鑑み、本発明者らが鋭意検討した結果、ＢＲＡＦ遺伝子に変異を有する細胞において、ＧＳＴ−πを抑制すると細胞増殖が強力に抑制されること、また、従来公知のＢＲＡＦ阻害剤に対する耐性を示す、ＢＲＡＦ遺伝子に変異を有する細胞においてもＧＳＴ−πを抑制すると細胞増殖が強力に抑制されることを見いだし、本発明を完成するに至った。本発明は以下を包含する。
（１）ＧＳＴ−πを抑制する薬物を有効成分として含む、ＢＲＡＦ遺伝子に変異を有する細胞の細胞死誘導剤。
（２）ＧＳＴ−πを抑制する薬物を有効成分として含む、ＢＲＡＦ遺伝子に変異を有する細胞の細胞増殖抑制剤。
（３）上記変異は、Ｖ６００Ｅ変異であることを特徴とする（１）又は（２）記載の剤。
（４）上記ＢＲＡＦ遺伝子に変異を有する細胞は、ＢＲＡＦ阻害剤に対する耐性を有する細胞であることを特徴とする（１）又は（２）記載の剤。
（５）上記薬物が、ＲＮＡｉ分子、リボザイム、アンチセンス核酸、ＤＮＡ／ＲＮＡキメラポリヌクレオチド及びこれらのうち少なくとも１種を発現するベクターからなる群から選択される物質であることを特徴とする（１）又は（２）記載の剤。
（６）上記ＢＲＡＦ遺伝子に変異を有する細胞が、ＧＳＴ−πを高発現するがん細胞であることを特徴とする（１）又は（２）記載の剤。
（７）上記（１）〜（６）のいずれかに記載の剤を含む、ＢＲＡＦ遺伝子に変異を有する細胞の増殖異常に起因する疾患の治療用医薬組成物。
（８）上記疾患ががんであることを特徴とする（７）記載の医薬組成物。
（９）上記がんはＧＳＴ−πを高発現するがんであることを特徴とする（８）記載の医薬組成物。
（１０）上記がんは大腸癌又はメラノーマであることを特徴とする（８）記載の医薬組成物。
（１１）ＧＳＴ−πを抑制する薬物を選択することを含む、ＢＲＡＦ遺伝子に変異を有する細胞の細胞死誘導剤及び/又は細胞増殖抑制剤のスクリーニング方法。
（１２）がん細胞に対して被検物質を接触させる工程と、上記細胞におけるＧＳＴ−πの発現量を測定する工程と、被検物質の非存在下において測定した場合と比較して、当該発現量が低下した場合に上記ＧＳＴ−πを抑制する薬物として選択する工程とを含む（１１）記載のスクリーニング方法。
本発明に係る細胞死誘導剤によれば、ＢＲＡＦ遺伝子に変異を有する細胞に対して非常に強力に細胞死を誘導することができる。よって、本発明に係る細胞死誘導剤は、ＢＲＡＦ遺伝子に変異を有する細胞の増殖異常に起因する疾患の治療用の医薬組成物として非常に高い薬効を奏することが可能となる。
また、本発明に係る細胞増殖抑制剤によれば、ＢＲＡＦ遺伝子に変異を有する細胞に対して非常に強力に細胞増殖を抑制することができる。よって、本発明に係る細胞増殖抑制剤は、ＢＲＡＦ遺伝子に変異を有する細胞の増殖異常に起因する疾患の治療用の医薬組成物として非常に高い薬効を奏することが可能となる。
さらに、本発明に係るスクリーニング方法によれば、ＢＲＡＦ遺伝子に変異を有する細胞に対して非常に強力に細胞死を誘導する及び/又は細胞増殖を抑制する薬剤を選択することができる。
ＢＲＡＦ遺伝子に変異を有する大腸癌細胞株において、GST-πノックダウンによる細胞増殖抑制効果を検証した結果（細胞数測定結果、ウェスタンブロット結果）を示す特性図である。 ＢＲＡＦ遺伝子に変異を有するメラノーマ細胞株において、GST-πノックダウンによる細胞増殖抑制効果を検証した結果（細胞数測定結果、ウェスタンブロット結果）を示す特性図である。 ＢＲＡＦ遺伝子に変異を有する大腸癌細胞株において、GST-π siRNA及びＢＲＡＦ阻害剤を併用したときの細胞増殖抑制効果を検証した結果を示す特性図である。 ＢＲＡＦ遺伝子に変異を有するメラノーマ細胞株において、GST-π siRNA及びＢＲＡＦ阻害剤を併用したときの細胞増殖抑制効果を検証した結果を示す特性図である。 ＢＲＡＦ遺伝子に変異を有し、ＢＲＡＦ阻害剤に耐性を有するメラノーマ細胞株において、GST-πノックダウンによる細胞増殖抑制効果を検証した結果を示す特性図である。 ＢＲＡＦ遺伝子に変異を有し、ＢＲＡＦ阻害剤に耐性を有するメラノーマ細胞株において、GST-πノックダウンしたときのGST-π発現をウエスタンブロットにより解析した結果を示す電気泳動写真である。
本発明に係る細胞死誘導剤及び細胞増殖抑制剤は、ＧＳＴ−πを抑制する薬物を有効成分として含む。本発明に係る細胞死誘導剤及び細胞増殖抑制剤は、ＢＲＡＦ遺伝子に変異を有する細胞に対して細胞死誘導効果及び細胞増殖抑制効果を示すものである。
本明細書で用いる場合、ＧＳＴ−πは、ＧＳＴＰ１遺伝子によりコードされる、グルタチオン抱合を触媒する酵素を指す。ＧＳＴ−πはヒトを含む種々の動物に存在し、その配列情報も公知である（例えば、ヒト：NM_000852（NP_000843）、ラット：NM_012577（NP_036709）、マウス：NM_013541（NP_038569）など。番号はＮＣＢＩデータベースのアクセッション番号を示し、括弧外は塩基配列、括弧内はアミノ酸配列の番号である）。一例として、データベースに登録されているヒトＧＳＴ−π遺伝子のコーディング領域の塩基配列を配列番号１に示し、当該ヒトＧＳＴ−π遺伝子がコードするヒトＧＳＴ−πタンパク質のアミノ酸配列を配列番号２に示す。
なお、ＧＳＴ−πについて、上述のように、具体的な塩基配列及びアミノ酸配列により特定できるが、生物個体間において塩基配列やアミノ酸配列の変異が生じる可能性（多型を含む）を考慮しなければならない。すなわち、ＧＳＴ−πは、データベースに登録されたアミノ酸配列と同一の配列を有するタンパク質に限定されず、同配列に対し１個又は２個以上、典型的には１個又は数個、例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個又は１０個のアミノ酸が相違する配列を有し、ＧＳＴ−πと同等の機能を有するものも含む。また、ＧＳＴ−πは、上述した具体的な塩基配列に対して７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上又は９７％以上の同一性を有する塩基配列からなり、ＧＳＴ−πと同等の機能を有するタンパク質をコードするものも含む。なお、ＧＳＴ−πの具体的機能については、上述のように、グルタチオン抱合を触媒する酵素活性を意味する。
なお、本明細書において、「本明細書で用いる場合」、「本明細書で用いる」、「本明細書において」、「本明細書に記載される」等の句は、特に別記しない限り、これに引続く記載が本明細書に記載された全ての発明に適用されることを意味するものとする。また、他に定義されない限り、本明細書で用いる全ての技術用語及び科学用語は、当業者が通常理解しているものと同じ意味を有する。本明細書中で参照する全ての特許、公報及び他の出版物は、その全体を本明細書に援用する。
本明細書で用いる「ＧＳＴ−πを抑制する薬物」には、限定されずに、例えば、ＧＳＴ−πの産生及び/又は活性を抑制する薬物や、ＧＳＴ−πの分解及び/又は不活性化を促進する薬物などが含まれる。ＧＳＴ−πの産生を抑制する薬物としては、これに限定するものではないが、例えばＧＳＴ−πをコードするＤＮＡに対するＲＮＡｉ分子、リボザイム、アンチセンス核酸、ＤＮＡ／ＲＮＡキメラポリヌクレオチド及びこれらを発現するベクター等が挙げられる。
また、ＧＳＴ−πを抑制する薬物としては、ＧＳＴ−πに対して作用する如何なる化合物であっても使用することができる。このような化合物としては、有機化合物（アミノ酸、ポリペプチド又はその誘導体、低分子化合物、糖、高分子化合物等）、無機化合物等を使用することができる。また、このような化合物は、天然物質及び非天然物質のいずれであってもよい。ポリペプチドの誘導体としては、修飾基を付加して得られた修飾ポリペプチド、アミノ酸残基を改変することにより得られたバリアントポリペプチド等が挙げられる。さらに、このような化合物は、単一化合物であってもよいが、化合物ライブラリー、遺伝子ライブラリーの発現産物、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物等であってもよい。すなわち、「ＧＳＴ−πを抑制する薬物」には、ＲＮＡｉ分子等の核酸に限定されず、如何なる化合物も含まれる。
具体的には、ＧＳＴ−πの活性を抑制する薬物としては、これに限定するものではないが、例えば、ＧＳＴ−πに結合する物質、例えば、グルタチオン、グルタチオンアナログ（例えば、WO 95/08563、WO 96/40205、WO 99/54346、非特許文献４等に記載のもの）、ケトプロフェン（非特許文献２）、インドメタシン（Hall et al., Cancer Res. 1989;49(22):6265-8）、エタクリン酸、ピロプロスト（Tew et al., Cancer Res. 1988;48(13):3622-5）、抗ＧＳＴ−π抗体、ＧＳＴ−πのドミナントネガティブ変異体等が挙げられる。これらの薬物は市販されているか、公知の技術に基づいて適宜製造することができる。
ＧＳＴ−πの産生又は活性を抑制する薬物としては、特異性の高さや、副作用の可能性の低さから、ＧＳＴ−πをコードするＤＮＡに対するＲＮＡｉ分子、リボザイム、アンチセンス核酸、ＤＮＡ／ＲＮＡキメラポリヌクレオチド及びこれらを発現するベクターが好ましい。
ＧＳＴ−πの抑制は、ＧＳＴ−π抑制剤を作用させなかった場合に比べ、細胞においてＧＳＴ−πの発現や活性が抑制されていることにより決定することができる。ＧＳＴ−πの発現は、既知の任意の手法、限定されずに、例えば、抗ＧＳＴ−π抗体を利用した免疫沈降法、ＥＩＡ、ＥＬＩＳＡ、ＩＲＡ、ＩＲＭＡ、ウェスタンブロッティング法、免疫組織化学法、免疫細胞化学法、フローサイトメトリー法、ＧＳＴ−πをコードする核酸もしくはそのユニークな断片又は該核酸の転写産物（例えば、ｍＲＮＡ）もしくはスプライシング産物に特異的にハイブリダイズする核酸を利用した、種々のハイブリダイゼーション法、ノーザンブロット法、サザンブロット法、種々のＰＣＲ法などにより評価することができる。
また、ＧＳＴ−πの活性は、ＧＳＴ−πの既知の活性、限定されずに、例えば、Ｒａｆ−１（特にリン酸化Ｒａｆ−１）や、ＥＧＦＲ（特にリン酸化ＥＧＦＲ）などのタンパク質との結合性などを、既知の任意の方法、例えば、免疫沈降法、ウェスタンブロッティング法、質量分析法、プルダウン法、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法などにより解析することによって評価することができる。
本明細書で用いる場合、ＲＮＡｉ分子は、ＲＮＡ干渉をもたらす任意の分子を指し、限定されずに、ｓｉＲＮＡ（small interfering RNA）、ｍｉＲＮＡ（micro RNA)、ｓｈＲ
ＮＡ（short hairpin RNA）、ｄｄＲＮＡ（DNA-directed RNA）、ｐｉＲＮＡ（Piwi-interacting RNA）、ｒａｓｉＲＮＡ（repeat associated siRNA）などの二重鎖ＲＮＡ及びこれらの改変体などを含む。これらのＲＮＡｉ分子は市販されているか、公知の配列情報、すなわち、配列番号１に示した塩基配列及び/又は配列番号２に示したアミノ酸配列に基づいて設計、作製することが可能である。また、本明細書で用いる場合、アンチセンス核酸は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＰＮＡ、又はこれらの複合物を含む。
本明細書で用いる場合、ＤＮＡ／ＲＮＡキメラポリヌクレオチドは、限定されずに、例えば、特開2003-219893に記載の、標的遺伝子の発現を阻害するＤＮＡとＲＮＡとからなる２本鎖ポリヌクレオチドを含む。
本発明の剤又は組成物における有効成分の配合量は、剤又は組成物が投与された場合に、アポトーシスといった細胞死が誘導及び/又は細胞増殖が抑制される量であってもよい。また、投与による利益を超える悪影響が生じない量が好ましい。かかる量は公知であるか、培養細胞などを用いたin vitro試験や、マウス、ラット、イヌ又はブタなどのモデル動物における試験により適宜決定することができ、このような試験法は当業者によく知られている。アポトーシスの誘導は、種々の既知の手法、例えば、ＤＮＡ断片化、アネキシンＶの細胞膜への結合、ミトコンドリア膜電位の変化、カスパーゼの活性化などのアポトーシス特有の現象の検出や、ＴＵＮＥＬ染色などにより評価することができる。また、細胞増殖の抑制は、種々の既知の手法、例えば、経時的な生細胞数の計数、腫瘍のサイズ、体積又は重量の測定、ＤＮＡ合成量の測定、ＷＳＴ−１法、ＢｒｄＵ（ブロモデオキシウリジン）法、３Ｈチミジン取込み法、などにより評価することができる。活性成分の配合量は、剤や組成物の投薬態様によって変化し得る。例えば、１回の投与に複数の単位の組成物を用いる場合、組成物１単位に配合する有効成分の量は、１回の投与に必要な有効成分の量の複数分の１とすることができる。かかる配合量の調整は当業者が適宜行うことができる。
また、ＧＳＴ−πを抑制する薬物を有効成分として配合することで、細胞死誘導剤、細胞増殖抑制剤、細胞死誘導組成物又は細胞増殖抑制組成物を製造することができる。
さらに、細胞死誘導又は細胞増殖抑制に使用する、ＧＳＴ−πを抑制する薬物を提供することができる。さらにまた、有効量のＧＳＴ−πを抑制する薬物を投与することを含む、細胞死の誘導方法又は細胞増殖の抑制方法を提供することができる。
なお、上述したアポトーシス等の細胞死誘導又は細胞増殖抑制方法はいずれも、in vitroの方法であっても、in vivoの方法であってもよい。また、当該方法における薬物については既に上述したとおりであり、薬物の有効量は、投与した細胞において細胞死が誘導される、又は細胞増殖が抑制される量であってもよい。また、投与による利益を超える悪影響が生じない量が好ましい。かかる量は公知であるか、培養細胞などを用いたin vitro試験などにより適宜決定することができ、このような試験法は当業者によく知られている。細胞死の誘導又は細胞増殖の抑制は、上述のものを含む種々の既知の手法により評価することができる。上記有効量は、薬物を所定のがん細胞集団に投与した場合に、必ずしも同細胞集団の全ての細胞に細胞死又は増殖抑制をもたらすものでなくともよい。例えば、上記有効量は、当該細胞集団における細胞の１％以上、２％以上、３％以上、４％以上、５％以上、６％以上、８％以上、１０％以上、１２％以上、１５％以上、２０％以上、さらには２５％以上などにアポトーシス又は増殖抑制をもたらす量であってよい。
本発明に係る細胞死誘導剤及び細胞増殖抑制剤は、ＢＲＡＦ遺伝子に変異を有する細胞に作用する。ＢＲＡＦ遺伝子に変異を有する細胞とは、ＢＲＡＦ遺伝子が変異を有することによって増殖異常を示す細胞（典型的にはがん細胞）である。
特に、本発明に係る細胞死誘導剤及び細胞増殖抑制剤は、ＢＲＡＦ遺伝子が変異を有することによって増殖異常を示す細胞のうちＧＳＴ−πを高発現する細胞（典型的にはＧＳＴ−πを高発現するがん細胞）に適用することが好ましい。ここで、ＧＳＴ−πを高発現するがん細胞とは、ＢＲＡＦ遺伝子が変異を有し、細胞増殖異常を示す細胞のうち、ＧＳＴ−πの発現量が正常細胞と比較して有意に高い細胞を意味する。なおＧＳＴ−πの発現量は、ＲＴ−ＰＣＲやマイクロアレイ等、定法に従って測定することができる。
ＢＲＡＦ遺伝子における変異とは、野生型ＢＲＡＦのアミノ酸配列に対する欠失、置換、付加、挿入といった変異、ＢＲＡＦ遺伝子の発現制御領域に対する変異を意味する。なお、ここで、ＢＲＡＦ遺伝子における変異は、いわゆる機能獲得性変異（gain of function）である。すなわち、変異を有するＢＲＡＦ遺伝子（変異型ＢＲＡＦ遺伝子と称する場合もある）には、当該変異に起因してセリンスレオニンキナーゼ活性が亢進した変異型ＢＲＡＦをコードする遺伝子が含まれる。また、変異型ＢＲＡＦ遺伝子には、発現制御領域に変異が含まれ、野生型ＢＲＡＦ遺伝子と比較して発現量が亢進したものも含まれる。すなわち、変異型ＢＲＡＦ遺伝子を発現する細胞では、変異型ＢＲＡＦを発現する又はＢＲＡＦの発現量が亢進することで、ＢＲＡＦから下流へのシグナル（例えばＭＥＫへのシグナル）が恒常的に持続する特徴をもつ。
変異型ＢＲＡＦ遺伝子としては、野生型ＢＲＡＦ遺伝子におけるコドン６００によりコードされるバリンがグルタミン酸に置換した変異型ＢＲＡＦ（V600Eと表記する。以下同様）をコードする遺伝子、V600D、V600G、V600K、V600M、V600R、V600L、G469A、G469V、D594N、V600insT（Tのinsertion）等を挙げることができる。
本発明の細胞死誘導剤又は細胞増殖抑制剤は、ＢＲＡＦ遺伝子に変異を有するがん細胞においても効果的に細胞死を誘導でき又は細胞増殖を抑制できるため、ＢＲＡＦ遺伝子に変異を有するがん細胞の増殖異常に起因する疾患に対する医薬組成物の成分として有効である。また、ＧＳＴ−πを抑制する薬物を有効成分として配合することで、ＢＲＡＦ遺伝子に変異を有するがん細胞の増殖異常に起因する疾患に対する医薬組成物を製造することができる。さらに、製造された医薬組成物の有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、細胞の増殖異常に起因する疾患を処置・治療することができる。
当該医薬組成物は、ＢＲＡＦ遺伝子に変異を有するがん細胞の増殖異常に起因する疾患を処置するのに有効である。ＢＲＡＦ遺伝子に変異を有するがん細胞に起因する疾患としては、限定されずに、ＧＳＴ−πを高発現するがん等が挙げられ、多くの場合、ＢＲＡＦ遺伝子に変異を有するがんは、ＧＳＴ−πを高発現するがんに包含される。
これらとしては、限定されずに、例えば、線維肉腫、悪性線維性組織球腫 、脂肪肉腫、横紋筋肉腫、平滑筋肉腫、血管肉腫、カポジ肉腫、リンパ管肉腫、滑膜肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫などの肉腫、眼癌、甲状腺癌（乳頭癌）、髄膜癌、脳腫瘍、下垂体癌、唾液腺癌、頭頚部癌、乳癌、肺癌（非小細胞癌）、食道癌、胃癌、十二指腸癌、虫垂癌、大腸癌、直腸癌、肝癌、膵癌、胆嚢癌、胆管癌、肛門癌、腎癌、尿管癌、膀胱癌、前立腺癌、陰茎癌、精巣癌、子宮癌（子宮内膜癌）、卵巣癌（卵巣漿液性癌）、外陰癌、膣癌、皮膚癌（悪性黒色腫）などの癌腫、さらには白血病や悪性リンパ腫などが挙げられる。なお、本発明では、「がん」は、上皮性悪性腫瘍及び非上皮性悪性腫瘍を含む。本発明におけるがんは、身体の任意の部位、例えば、脳、頭頚部、胸部、四肢、肺、心臓、胸腺、食道、胃、小腸（十二指腸、空腸、回腸）、大腸（結腸、盲腸、虫垂、直腸）、肝臓、膵臓、胆嚢、肛門、腎、尿管、膀胱、前立腺、陰茎、精巣、子宮、卵巣、外陰、膣、皮膚、横紋筋、平滑筋、滑膜、軟骨、骨、甲状腺、副腎、腹膜、腸間膜、骨髄、血液、血管系、リンパ節等のリンパ系、リンパ液などに存在し得る。
特に、本発明の細胞死誘導剤又は細胞増殖抑制剤は、ＢＲＡＦ遺伝子に変異を有する細胞のうち、ＢＲＡＦ阻害剤に対して耐性を獲得した細胞に対しても効果的に細胞死を誘導でき又は細胞増殖を抑制できる。したがって、本発明の細胞死誘導剤又は細胞増殖抑制剤は、ＢＲＡＦ遺伝子に変異を有するがん細胞であって、ＢＲＡＦ阻害剤に耐性を有するがん細胞の増殖異常に起因する疾患に対する医薬組成物の成分として有効である。また、ＧＳＴ−πを抑制する薬物を有効成分として配合することで、ＢＲＡＦ遺伝子に変異を有するがん細胞であって、ＢＲＡＦ阻害剤に耐性を有するがん細胞の増殖異常に起因する疾患に対する医薬組成物を製造することができる。さらに、製造された医薬組成物の有効量を、それを必要とする対象、すなわちＢＲＡＦ阻害剤による治療効果が低減した患者に投与することを含む、細胞の増殖異常に起因する疾患を処置・治療することができる。
ここで、ＢＲＡＦ阻害剤とは、ＢＲＡＦから下流へのシグナル伝達を阻害する物質、特に、上述した機能獲得性変異（gain of function）を有する変異型ＢＲＡＦに起因するシグナル伝達を特異的に阻害する物質を含む意味である。ＢＲＡＦ阻害剤としては、例えば、ベムラフェニブ（Vemurafenib（PLX4032）、Cas No.: 918504-65-1、N-[3-[5-(4-chlorophenyl)-1H-pyrrolo[2,3-b]pyridine-3-carbonyl]-2,4-difluorophenyl]propane-1-sulfonamide）やPLX4720（Cas No.: 918505-84-7、N-[3-(5-chloro-1H-pyrrolo[2,3-b]pyridine-3-carbonyl)-2,4-difluorophenyl]propane-1-sulfonamide）等が知られている。
さらに、ＢＲＡＦ阻害剤としては、例えば、レゴラフェニブ、ダサチニブ、PLX-8394、BeiGene-283、PLX-3603、RG-7304（CAS NO. :213406-50-9）、LY-3009120 (CAS NO.: 1454682-72-4)、rebastinib (Cas.No.: 1020172-07-9)、1H-pyrazolo[3,4-b]pyridine-5-carboxamideアナログ、ASN-003、ベムラフェニブプロドラッグ、N-(thiophen-2-yl) benzamide誘導体、DCB-R0237、REDX-04988、EBI-907、EBI-945、ゴッシピン、nanolipolee-007、TEW-0201、miRNA-3157及びチアゾール誘導体（NMS-P186、NMS-P285、NMS-P349、NMS-P383、NMS-P396及びNMS-P730）を挙げることができる。
さらに、ＢＲＡＦ阻害剤としては、これら以外にもSB590885（Cas No.: 405554-55-4、N,N-dimethyl-2-[4-[(4Z)-4-(1-nitroso-2,3-dihydroinden-5-ylidene)-5-(1H-pyridin-4-ylidene)-1H-imidazol-2-yl]phenoxy]ethanamine）、B-Raf inhibitor 1（Cas No.：1093100-40-3、1-N-(4-chlorophenyl)-6-methyl-5-N-[3-(7H-purin-6-yl)pyridin-2-yl]isoquinoline-1,5-diamine）、B-Raf inhibitor 1 dihydrochloride（Cas No.：1191385-19-9、1-N-(4-chlorophenyl)-6-methyl-5-N-[3-(7H-purin-6-yl)pyridin-2-yl]isoquinoline-1,5-diamine;dihydrochloride）、ダブラフェニブ（Dabrafenib、Cas No.：1195765-45-7、N-[3-[5-(2-aminopyrimidin-4-yl)-2-tert-butyl-1,3-thiazol-4-yl]-2-fluorophenyl]-2,6-difluorobenzenesulfonamide）、LGX818（Cas No.：1269440-17-6、methyl N-[(2S)-1-[[4-[3-[5-chloro-2-fluoro-3-(methanesulfonamido)phenyl]-1-propan-2-ylpyrazol-4-yl]pyrimidin-2-yl]amino]propan-2-yl]carbamate）、HG6-64-1（Cas No.: 1315329-43-1、WO 2011/090738.参照）、PF-04880594（Cas No.: 1111636-35-1、3-[[4-[1-(2,2-difluoroethyl)-3-(1H-pyrrolo[2,3-b]pyridin-5-yl)pyrazol-4-yl]pyrimidin-2-yl]amino]propanenitrile）、BRAF inhibitor（Cas No.: 918505-61-0、N-[2,4-difluoro-3-(5-pyridin-3-yl-1H-pyrrolo[2,3-b]pyridine-3-carbonyl)phenyl]propane-2-sulfonamide）、B-Raf inhibitor （Cas No.: 1315330-11-0、N-[4-[(4-ethylpiperazin-1-yl)methyl]-3-(trifluoromethyl)phenyl]-4-methyl-3-[(6-methyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-4-yl)oxy]benzamide）、TAK-632（Cas No.: 1228591-30-7、N-[7-cyano-6-[4-fluoro-3-[[2-[3-(trifluoromethyl)phenyl]acetyl]amino]phenoxy]-1,3-benzothiazol-2-yl]cyclopropanecarboxamide）、AZ 628（Cas No.: 878739-06-1、3-(2-cyanopropan-2-yl)-N-[4-methyl-3-[(3-methyl-4-oxoquinazolin-6-yl)amino]phenyl]benzamide）、RAF265（Cas No.: 927880-90-8、1-methyl-5-[2-[5-(trifluoromethyl)-1H-imidazol-2-yl]pyridin-4-yl]oxy-N-[4-(trifluoromethyl)phenyl]benzimidazol-2-amine）、CEP-32496（Cas No.: 1188910-76-0、1-[3-(6,7-dimethoxyquinazolin-4-yl)oxyphenyl]-3-[5-(1,1,1-trifluoro-2-methylpropan-2-yl)-1,2-oxazol-3-yl]urea）、GDC-0879 （Cas No.: 905281-76-7、2-[4-[(1E)-1-hydroxyimino-2,3-dihydroinden-5-yl]-3-pyridin-4-ylpyrazol-1-yl]ethanol）、トシル酸ソラフェニブ（Cas No.: 475207-59-1、4-[4-[[4-chloro-3-(trifluoromethyl)phenyl]carbamoylamino]phenoxy]-N-methylpyridine-2-carboxamide;4-methylbenzenesulfonic acid）、ダブラフェニブトシル酸塩（Cas No.: 1195768-06-9、N-[3-[5-(2-aminopyrimidin-4-yl)-2-tert-butyl-1,3-thiazol-4-yl]-2-fluorophenyl]-2,6-difluorobenzenesulfonamide;methanesulfonic acid）、CEP-32496 塩酸塩（Cas No.: 1227678-26-3、1-[3-(6,7-dimethoxyquinazolin-4-yl)oxyphenyl]-3-[5-(1,1,1-trifluoro-2-methylpropan-2-yl)-1,2-oxazol-3-yl]urea;hydrochloride）、及びソラフェニブ（Cas No.: 284461-73-0、4-[4-[[4-chloro-3-(trifluoromethyl)phenyl]carbamoylamino]phenoxy]-N-methylpyridine-2-carboxamide）を挙げることができる。
また、本発明に係る医薬組成物は、ＧＳＴ−πを抑制する薬物以外に、他の有効成分と併用してもよい。ここで、併用するとは、例えば、他の有効成分を別々の製剤として投与すること、及び、他の有効成分を、少なくとも１種の他の薬剤との合剤として投与することなどを含む。別々の製剤として投与する場合には、他の有効成分を含む製剤を、他の製剤より前、他の製剤と同時、又は、他の製剤より後に投与してもよい。
かかる他の有効成分としては、上述したＢＲＡＦ阻害剤を適宜使用することができる。また、他の有効成分としては、対象となる疾患の処置に有効なものが挙げられる。例えば、処置する疾患ががんである場合は、抗がん剤を併用することができる。抗がん剤の例としては、例えば、イホスファミド、塩酸ニムスチン、シクロホスファミド、ダカルバジン、メルファラン、ラニムスチン等のアルキル化剤、塩酸ゲムシタビン、エノシタビン、シタラビン・オクホスファート、シタラビン製剤、テガフール・ウラシル、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤（例えば、ＴＳ−１）、ドキシフルリジン、ヒドロキシカルバミド、フルオロウラシル、メトトレキサート、メルカプトプリン等の代謝拮抗剤、塩酸イダルビシン、塩酸エピルビシン、塩酸ダウノルビシン、クエン酸ダウノルビシン、塩酸ドキソルビシン、塩酸ピラルビシン、塩酸ブレオマイシン、硫酸ペプロマイシ
ン、塩酸ミトキサントロン、マイトマイシンＣ等の抗腫瘍性抗生物質、エトポシド、塩酸イリノテカン、酒石酸ビノレルビン、ドセタキセル水和物、パクリタキセル、硫酸ビンクリスチン、硫酸ビンデシン、硫酸ビンブラスチン等のアルカロイド、アナストロゾール、クエン酸タモキシフェン、クエン酸トレミフェン、ビカルタミド、フルタミド、リン酸エストラムスチン等のホルモン療法剤、カルボプラチン、シスプラチン（ＣＤＤＰ）、ネダプラチン等の白金錯体、サリドマイド、ネオバスタット、ベバシズマブ等の血管新生阻害剤、Ｌ−アスパラギナーゼなどを挙げることができる。
本明細書に記載される本発明の各種の剤や組成物、処置方法等における活性成分が核酸、例えば、ＲＮＡｉ分子、リボザイム、アンチセンス核酸、ＤＮＡ／ＲＮＡキメラポリヌクレオチドなどである場合、これらは、裸の核酸としてそのまま利用することもできるが、種々のベクターに担持させることもできる。ベクターとしては、プラスミドベクター、ファージベクター、ファージミドベクター、コスミドベクター、ウイルスベクター等の公知の任意のものを利用することができる。ベクターは、担持する核酸の発現を増強するプロモーターを少なくとも含んでいることが好ましく、この場合、該核酸は、かかるプロモーターと作動可能に連結されていることが好ましい。核酸がプロモーターに作動可能に連結されているとは、プロモーターの作用により、該核酸のコードするタンパク質が適切に産生されるように、該核酸とプロモーターとが配置されていることを意味する。ベクターは、宿主細胞内で複製可能であってもなくてもよく、また、遺伝子の転写は宿主細胞の核外で行われても、核内で行われてもよい。後者の場合、核酸は宿主細胞のゲノムに組み込まれてもよい。
また、有効成分は、種々の非ウイルス性脂質又はタンパク質担体に担持させることもできる。かかる担体としては、限定されずに、例えば、コレステロール、リポソーム、抗体プロトマー、シクロデキストリンナノ粒子、融合ペプチド、アプタマー、生分解性ポリ乳酸コポリマー、ポリマーなどが挙げられ、細胞内への取込み効率を高めることができる（例えば、Pirollo and Chang, Cancer Res. 2008;68(5):1247-50などを参照）。特に、カチオン性リポソームやポリマー（例えば、ポリエチレンイミンなど）が有用である。かかる担体として有用なポリマーのさらなる例としては、例えば、US 2008/0207553、US 2008/0312174等に記載のものなどが挙げられる。
本明細書に記載される本発明の各種医薬組成物においては、活性成分の効果を妨げない限り、活性成分を他の任意成分と組み合わせてもよい。そのような任意成分としては、例えば、他の化学治療剤、薬理学的に許容される担体、賦形剤、希釈剤等が挙げられる。また、投与経路や薬物放出様式などに応じて、上記組成物を、適切な材料、例えば、腸溶性のコーティングや、時限崩壊性の材料で被覆してもよく、また、適切な薬物放出システムに組み込んでもよい。
本明細書に記載される本発明の各種剤及び組成物（各種医薬組成物を含む）は、経口及び非経口の両方を包含する種々の経路、例えば、限定することなく、経口、静脈内、筋肉内、皮下、局所、腫瘍内、直腸、動脈内、門脈内、心室内、経粘膜、経皮、鼻内、腹腔内、肺内及び子宮内等の経路で投与してもよく、各投与経路に適した剤形に製剤してもよい。かかる剤形及び製剤方法は任意の公知のものを適宜採用することができる（例えば、標準薬剤学、渡辺喜照ら編、南江堂、２００３年などを参照）。
例えば、経口投与に適した剤形としては、限定することなく、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、液剤、懸濁剤、乳剤、ゲル剤、シロップ剤などが挙げられ、また非経口投与に適した剤形としては、溶液性注射剤、懸濁性注射剤、乳濁性注射剤、用時調製型注射剤などの注射剤が挙げられる。非経口投与用製剤は、水性又は非水性の等張性無菌溶液又は懸濁液の形態であることができる。
本明細書に記載される本発明の各種剤又は組成物（各種医薬組成物を含む）は、特定の組織や細胞に標的化されていてもよい。標的化は、既知の任意の手法により達成することができる。がんへの送達を企図する場合は、限定されずに、例えば、製剤をＥＰＲ（enhanced permeability and retention）効果の発現に好適な直径５０〜２００nm、特に７５〜１５０nmなどのサイズにすることによるパッシブターゲティングや、ＣＤ１９、ＨＥＲ２、トランスフェリン受容体、葉酸受容体、ＶＩＰ受容体、ＥＧＦＲ（Torchilin, AAPS J. 2007;9(2):E128-47）、ＲＡＡＧ１０（特表２００５−５３２０５０）、ＰＩＰＡ（特表２００６−５０６０７１）、ＫＩＤ３（特表２００７−５２９１９７）などのリガンドや、ＲＧＤモチーフやＮＧＲモチーフを有するペプチド、Ｆ３、ＬｙＰ−１（Ruoslahti et al., J Cell Biol. 2010;188(6):759-68）などを標的化剤として利用するアクティブターゲティングなどの手法を用いることができる。また、レチノイド又はその誘導体ががん細胞への標的化剤として有用であることも知られているため（WO 2008/120815）、レチノイドを標的化剤として含む担体を利用することもできる。かかる担体は、上記文献のほか、WO 2009/036368、WO 2010/014117、WO 2012/170952などに記載されている。
本明細書に記載される本発明の各種剤又は組成物（各種医薬組成物を含む）はいずれの形態で供給されてもよいが、保存安定性の観点から、用時調製可能な形態、例えば、医療の現場あるいはその近傍において、医師及び／又は薬剤師、看護士、もしくはその他のパラメディカルなどによって調製され得る形態で提供してもよい。かかる形態は、本発明の剤又は組成物が、脂質やタンパク質、核酸などの安定した保存が難しい成分を含むときに特に有用である。この場合、本発明の剤又は組成物は、これらに必須の構成要素の少なくとも１つを含む１個又は２個以上の容器として提供され、使用の前、例えば、２４時間前以内、好ましくは３時間前以内、そしてより好ましくは使用の直前に調製される。調製に際しては、調製する場所において通常入手可能な試薬、溶媒、調剤器具などを適宜使用することができる。
したがって、本発明は、本発明の各種剤又は組成物に含まれ得る活性成分を、単独でもしくは組み合わせて含む１個又は２個以上の容器を含む組成物の調製キット、ならびに、そのようなキットの形で提供される各種剤又は組成物の必要構成要素にも関する。本発明のキットは、上記のほか、本発明の各種剤又は組成物の調製方法や投与方法などが記載された指示、例えば説明書や、ＣＤ、ＤＶＤ等の電子記録媒体等を含んでいてもよい。また、本発明のキットは、本発明の各種剤又は組成物を完成するための構成要素の全てを含んでいてもよいが、必ずしも全ての構成要素を含んでいなくてもよい。したがって、本発明のキットは、医療現場や、実験施設などで通常入手可能な試薬や溶媒、例えば、無菌水や、生理食塩水、ブドウ糖溶液などを含んでいなくてもよい。
本明細書に記載される本発明の各種処置方法における有効量とは、例えば、疾患の症状を低減し、又は疾患の進行を遅延もしくは停止する量であり、好ましくは、疾患を抑制し、又は治癒する量である。また、投与による利益を超える悪影響が生じない量が好ましい。かかる量は、培養細胞などを用いたin vitro試験や、マウス、ラット、イヌ又はブタなどのモデル動物における試験により適宜決定することができ、このような試験法は当業者によく知られている。また、本発明の処置方法に用いる薬物の用量は当業者に公知であるか、又は、上記の試験等により適宜決定することができる。
本明細書に記載される本発明の処置方法において投与する活性成分の具体的な用量は、処置を要する対象に関する種々の条件、例えば、症状の重篤度、対象の一般健康状態、年齢、体重、対象の性別、食事、投与の時期及び頻度、併用している医薬、治療への反応性、剤形、及び治療に対するコンプライアンスなどを考慮して決定され得る。
投与経路としては、経口及び非経口の両方を包含する種々の経路、例えば、経口、静脈内、筋肉内、皮下、局所、腫瘍内、直腸、動脈内、門脈内、心室内、経粘膜、経皮、鼻内、腹腔内、肺内及び子宮内等の経路が含まれる。
投与頻度は、用いる剤や組成物の性状や、上記のものを含む対象の条件によって異なるが、例えば、１日多数回（すなわち１日２、３、４回又は５回以上）、１日１回、数日毎（すなわち２、３、４、５、６、７日毎など）、１週間毎、数週間毎（すなわち２、３、４週間毎など）であってもよい。
本明細書で用いる場合、用語「対象」は、任意の生物個体を意味し、好ましくは動物、さらに好ましくは哺乳動物、さらに好ましくはヒトの個体である。本発明において、対象は健常であっても、何らかの疾患に罹患していてもよいものとするが、特定の疾患の処置が企図される場合には、典型的にはかかる疾患に罹患しているか、罹患するリスクを有する対象を意味する。
また、用語「処置」は、本明細書で用いる場合、疾患の治癒、一時的寛解又は予防などを目的とする医学的に許容される全ての種類の予防的及び／又は治療的介入を包含するものとする。例えば、「処置」の用語は、疾患の進行の遅延又は停止、病変の退縮又は消失、発症の予防又は再発の防止などを含む、種々の目的の医学的に許容される介入を包含する。
ところで、上述のように、ＧＳＴ−πを抑制する薬物は、ＢＲＡＦ遺伝子に変異を有する細胞に対して細胞死誘導及び/又は細胞増殖抑制を示す。したがって、ＧＳＴ−πに対する抑制を指標として、ＢＲＡＦ遺伝子に変異を有する細胞の細胞死誘導剤及び/又は細胞増殖抑制剤をスクリーニングすることができる。すなわち、ＧＳＴ−πを抑制できる物質は、ＢＲＡＦ遺伝子に変異を有する細胞（典型的にはがん細胞）の細胞死誘導剤及び/又は細胞増殖抑制剤の候補物質となる。
例えば、がん細胞の一例として、ＢＲＡＦ遺伝子に変異を有するがん細胞に対して被検物質を接触させ、当該細胞における、ＧＳＴ−πの発現量を測定する。被検物質の非存在下において測定した発現量と比較して、被検物質を接触させたときの発現量が低下した場合、当該被検物質をＧＳＴ−πを抑制する薬物の候補物質として選択することができる。
ここで、被検物質としては、何ら限定されず、如何なる物質であってもよい。被検物質としては、単独の物質であってもよいし、複数の構成成分からなる混合物であってもよい。被検物質としては、例えば微生物若しくは培養液からの抽出物のように未同定の物質を含むような構成であってもよいし、既知の組成物を所定の組成比で含むような構成であってもよい。また、被検物質としては、タンパク質、核酸、脂質、多糖類、有機化合物及び無機化合物のいずれでもよい。
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。
〔実施例１〕
本実施例では、ＢＲＡＦ遺伝子に変異を有する細胞に対してＧＳＴ−πを抑制する薬物を作用させたときの細胞増殖抑制効果を検討した。先ず、ＢＲＡＦ遺伝子に変異（V600E）を有するがん細胞として、大腸癌細胞株1種類（CACO-2）、メラノーマ細胞株4種類（A375、SK-MEL-28、A2058、Malme-3M）を37℃で5% CO2を含む大気下で培養した。使用した培地は、CACO-2はMEM+20%、FBS+0.1mM及びNEAAとし、A375はDMEM+15%及びFBSとし、SK-MEL-28はEMEM+10%及びFBSとし、A2058はDMEM+10%及びFBSとし、Malme-3MはIMDM+20%及びFBSとし、いずれも抗生物質を添加した。
そして、トランスフェクションの前日、各細胞を10〜20%コンフルエントとなるように抗生物質不含の培地を用いて100mm組織培養プラスチックディッシュに播種した。1mLのOpti-MEM I Reduced Serum Medium（GIBCO社）中にGST-π siRNA（GGGAGGCAAGACCUUCAUUTT、siRNA ID#2385、Ambion社（配列番号３））を600pmol加え、穏やかに混合した。次に、Lipofectamine RNAi MAX（Invitrogen社）を1mLのOpti-MEM I Reduced Serum Medium（GIBCO社）中に35μLを希釈し、穏やかに混合した。希釈したGST-π siRNAと希釈したLipofectamine RNAi MAXを穏やかに混合した後、室温で10分間インキュベートした。この間、培地を10mLのOpti-MEM I Reduced Serum Mediumに交換した。10分間のインキュベーション後、GST-π siRNAとLipofectamine RNAi MAXとの複合体を細胞に加え、37℃で5% CO2を含む大気下でインキュベートした。5時間のインキュベーション後、10mLの抗生物質不含の培地に交換した。培地交換後1時間で、PBSで洗浄し、0.25% Trypsin-EDTA（SIGMA社）を用いて細胞を剥がし、抗生物質を含む培地に懸濁した。細胞は5mlの培地に懸濁し、60mm組織培養プラスチックディッシュに播種した（CACO-2：0.4×105個、A375：1.0×105個、SK-MEL-28：0.2×105個、A2058：0.8×105個、Malme-3M：0.6×105個）。
コントロール実験として、Scramble siRNA（CGAUUCGCUAGACCGGCUUCAUUGCAG、北海道システムサイエンス社（配列番号４））、又はAllStars Negative Control siRNA（siControl）（QIAGEN社）を用いて同様の操作を行った。GST-π siRNAのトランスフェクション後、０日目と５日目にそれぞれ細胞数を計測した。
また、本実施例では、CACO-2細胞、A375細胞、SK-MEL-28細胞、A2058細胞及びMalme-3M細胞に対してGST-π siRNAを作用させたときのGST-πの発現をウエスタンブロットによりそれぞれ確認した。すなわち、GST-π siRNAのトランスフェクション後3日目において採取した細胞を用いてGST-πノックダウンのウエスタンブロット解析を行った。先ず、採取した細胞を冷PBSで洗った後、冷lysis buffer（1% NP-40、50mM Tris-HCl（pH7.4）、150mM NaCl、1mM EDTA、complete Mini EDTA-free（Roche社）、PhosSTOP（Roche社））を加えて、氷冷、30分間インキュベートして可溶化した。その後、4℃、15000rpmで15分間遠心分離を行い、細胞抽出液を得た。得られた細胞抽出液に対し、Micro BCA Protein Assay Kit（Thermo SCIENTIFIC社）を用いてタンパクの定量を行った。次に、20μgの細胞抽出液を還元条件下で変性させ、マルチゲルIIミニ4/20（13w）（コスモバイオ社）を用いて、SDS-PAGEを行い、タンパク質を分離した。SDS-PAGE終了後、タンク式ブロッティング装置を用いて、PVDF膜に転写した。転写膜を5%スキムミルク/0.05% Tween20添加PBS（PBS-Tと略す）で4℃、16時間でインキュベートしてブロッキングを行った。続いて、Membrane blocking Solution（Invitrogen社）で希釈した抗GST-π抗体（MBL社）と4℃で16時間反応させた。二次抗体反応は西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）標識したウサギ抗体を用いて室温で1時間行った。バンドのシグナル検出はECL Western Blocking Detection Reagents（GE Healthcare社）を用いた化学発光法によってX線フィルム上で行った。各操作の間の洗浄は、PBS-Tを用いて5分間の振盪を4回行った。
大腸癌細胞株に関する結果を図１に示し、メラノーマ細胞株に関する結果を図２に示す。なお、図１及び２には、細胞数を測定した結果とウェスタンブロットによる解析の結果とを併せて示している。図１及び２に示すように、大腸癌細胞株及びメラノーマ細胞株ともに、ＢＲＡＦ遺伝子に変異を有するがん細胞においては、GST-πを抑制する薬剤であるGST-π siRNAによりGST-πノックダウンにより細胞増殖能が顕著に抑制された。ＢＲＡＦ遺伝子における変異は悪性度の高い腫瘍において認められており、大腸癌では切除不能大腸癌における予後不良因子として知られている。メラノーマの患者の半数はＢＲＡＦ遺伝子に変異をもっており、転移能が高い場合、致死率・悪性度が最も高い。本実施例の結果より、このようなＢＲＡＦ遺伝子に変異を有するがんについて、GST-πを抑制する薬剤が細胞増殖抑制に効くことが示唆されたことから、これらの難治性癌の新規治療法につながることが期待される。
〔実施例２〕
本実施例では、ＢＲＡＦ遺伝子に変異を有する細胞に対してＧＳＴ−πを抑制する薬物及びＢＲＡＦ阻害剤を作用させたときの細胞増殖抑制効果を検討した。
先ず、実施例１と同様にして大腸癌細胞株1種類（CACO-2）及びメラノーマ細胞株2種類（SK-MEL-28及びA2058）をそれぞれ培養し、トランスフェクションの前日、10〜20%コンフルエントとなるように抗生物質不含の培地を用いて100mm組織培養プラスチックディッシュに播種した。1mLのOpti-MEM I Reduced Serum Medium（GIBCO社）中にGST-π siRNA（GGGAGGCAAGACCUUCAUUTT、siRNA ID#2385、Ambion社（配列番号３））を600pmol加え、穏やかに混合した。次に、Lipofectamine RNAi MAX（Invitrogen社）を1mLのOpti-MEM I Reduced Serum Medium（GIBCO社）中に35μLを希釈し、穏やかに混合した。希釈したGST-π siRNAと希釈したLipofectamine RNAi MAXを穏やかに混合した後、室温で10分間インキュベートした。この間、培地を10mLのOpti-MEM I Reduced Serum Mediumに交換した。10分間のインキュベーション後、GST-π siRNAとLipofectamine RNAi MAXとの複合体を細胞に加え、37℃で5% CO2を含む大気下でインキュベートした。5時間のインキュベーション後、10mLの抗生物質不含の培地に交換した。培地交換後1時間で、PBSで洗浄し、0.25% Trypsin-EDTA（SIGMA社）を用いて細胞を剥がし、抗生物質を含む培地に懸濁した。細胞は5mlの培地に懸濁し、60mm組織培養プラスチックディッシュに播種した（CACO-2：0.4×105個、SK-MEL-28：0.2×105個及びA2058：0.2×105個）。コントロール実験として、AllStars Negative Control siRNA（siControl）（QIAGEN社）を用いて同様の操作を行った。トランスフェクション後1日目から、ＢＲＡＦ阻害剤であるPLX4720（Selleck社）を、CACO-2に対しては40μM、SK-MEL-28に対しては0.7μM、及びA2058に対しては10μMになるように培地中に加え5日目まで培養した。PLX4720処理のコントロールは溶媒のDMSO（和光純薬）を加えて培養した。Growth assayはトランスフェクション後０日目から５日目までの細胞数を計測することで行った。
CACO-2について細胞数を計測した結果を図３に示し、SK-MEL-28及びA2058について細胞数を計測した結果を図４に示す。図３から分かるように、GST-π siRNAを単独で大腸癌細胞株（ＢＲＡＦ遺伝子に変異を有するCACO-2株）に作用させた場合、PLX4720をsiControlとともに当該大腸癌細胞株に作用させた場合と比較して、これらGST-π siRNA及びPLX4720を併用して同細胞株に作用させた場合には細胞増殖抑制効果が顕著であることが示された。また、図４から分かるように、GST-π siRNAを単独でメラノーマ細胞株（ＢＲＡＦ遺伝子に変異を有するSK-MEL-28及びA2058）に作用させた場合、PLX4720をsiControlとともに当該メラノーマ細胞株に作用させた場合と比較して、これらGST-π siRNA及びPLX4720を併用して同細胞株に作用させた場合には細胞増殖抑制効果が顕著であることが示された。
〔実施例３〕
本実施例では、ＢＲＡＦ遺伝子に変異を有する細胞であってＢＲＡＦ阻害剤に耐性を有する細胞（ＢＲＡＦ阻害剤耐性細胞）に対してＧＳＴ−πを抑制する薬物を作用させたときの細胞増殖抑制効果を検討した。
＜細胞数測定＞
本実施例で使用したＢＲＡＦ阻害剤耐性細胞は以下のように作製した。実施例１で使用したメラノーマ細胞株A375を1〜5μMのPLX4720（Selleck社）を添加した抗生物質と15% FBSを含むDMEM培地で、37℃で5% CO2を含む大気下で1ヵ月間インキュベートした。1ヵ月間のインキュベートの後に生存する細胞株をPLX4720耐性A375細胞として本実施例に使用した。
本実施例では、トランスフェクションの前日、PLX4720耐性A375細胞を0.5×106個/10mlとなるように抗生物質不含の15% FBS入りDMEM培地を用いて100mm組織培養プラスチックディッシュに播種した。1mLのOpti-MEM I Reduced Serum Medium（GIBCO社）中にGST-π siRNA（GGGAGGCAAGACCUUCAUUTT、siRNA ID#2385、Ambion社（配列番号３））を600pmol加え、穏やかに混合した。次に、Lipofectamine RNAi MAX（Invitrogen社）を1mLのOpti-MEM I Reduced Serum Medium（GIBCO社）中に35μLを希釈し、穏やかに混合した。希釈したGST-π siRNAと希釈したLipofectamine RNAi MAXを穏やかに混合した後、室温で10分間インキュベートした。この間、培地を10mLのOpti-MEM I Reduced Serum Mediumに交換した。10分間のインキュベーション後、GST-π siRNAとLipofectamine RNAi MAXとの複合体を細胞に加え、37℃で5% CO2を含む大気下でインキュベートした。5時間のインキュベーション後、10mLの抗生物質不含の15% FBS入りDMEM培地に交換した。培地交換後2時間で、PBSによる洗浄後、0.5% Trypsin-EDTA（SIGMA社）を用いて細胞を剥がし、抗生物質と15% FBSを含むDMEM培地に懸濁した。懸濁液中の細胞は1.0×105個/5mlになるように60mm組織培養プラスチックディッシュに播種した。コントロール実験としてScramble siRNA（CGAUUCGCUAGACCGGCUUCAUUGCAG、北海道システムサイエンス社（配列番号４））、あるいはAllStars Negative Control siRNA（QIAGEN社）を用いて同様の操作を行った。GST-π siRNAのトランスフェクション後それぞれ０、１、２、３、４、５日目において細胞数を計測した。
＜GST-π発現確認＞
上述のように、PLX4720耐性A375細胞に対してGST-π siRNAを作用させたときのGST-πの発現をウエスタンブロットにより確認した。すなわち、GST-π siRNAのトランスフェクション後の上記各時点において採取した細胞を用いてGST-πノックダウンのウエスタンブロット解析を行った。
先ず、採取した細胞を冷PBSで洗った後、冷lysis buffer（1% NP-40、50mM Tris-HCl（pH7.4）、150mM NaCl、1mM EDTA、complete Mini EDTA-free（Roche社）、PhosSTOP（Roche社））を加えて、氷冷、30分間インキュベートして可溶化した。4℃、15000rpmで15分間遠心分離を行い、細胞抽出液を得た。得られた細胞抽出液に対し、Micro BCA Protein Assay Kit（Thermo SCIENTIFIC社）を用いてタンパクの定量を行った。次に、20μgの細胞抽出液を還元条件下で変性させ、マルチゲルIIミニ4/20（13w）（コスモバイオ社）を用いて、SDS-PAGEを行い、タンパク質を分離した。SDS-PAGE終了後、タンク式ブロッティング装置を用いて、PVDF膜に転写した。転写膜を5%スキムミルク/0.05% Tween20添加PBS（PBS-Tと略す）で4℃、16時間でインキュベートしてブロッキングを行った。続いて、Membrane blocking Solution（Invitrogen社）で希釈した抗GST-π抗体（MBL社）と4℃で16時間反応させた。二次抗体反応は西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）標識したウサギ抗体を用いて室温で1時間行った。バンドのシグナル検出はECL Western Blocking Detection Reagents（GE Healthcare社）を用いた化学発光法によってX線フィルム上で行った。各操作の間の洗浄は、PBS-Tを用いて5分間の振盪を4回行った。
＜結果＞
近年、ＢＲＡＦ阻害剤耐性を獲得したメラノーマ細胞株がメラノーマの再発に関与することが解っている。そこで、GST-πがＢＲＡＦ阻害剤耐性メラノーマのＣＲＡＦ依存性を促進しているかどうかを調べるために、PLX4720耐性A375でGST-πをノックダウンした。細胞増殖を測定したところ、顕著な増殖抑制効果が認められた（図５）。GST-πノックダウンを確認したところ、2日目と3日目でGST-π発現が抑制されていた（図６）。
本実施例により、ＢＲＡＦ遺伝子に変異を有する細胞であってＢＲＡＦ阻害剤に耐性を有する細胞（ＢＲＡＦ阻害剤耐性細胞）の増殖を効果的に抑制できることが示された。この結果より、ＢＲＡＦ阻害剤耐性細胞が一因となる疾患、例えばメラノーマの再発を防止できる或いは低減できるといった効果が期待できる。

Claims (11)

  1. ＧＳＴ−πの産生を抑制する薬物を有効成分として含み、前記薬物が、ＲＮＡｉ分子、リボザイム、アンチセンス核酸、ＤＮＡ／ＲＮＡキメラポリヌクレオチド及びこれらのうち少なくとも１種を発現するベクターからなる群から選択される物質である、ＢＲＡＦ遺伝子に変異を有し、かつＢＲＡＦ阻害剤に対する耐性を有する細胞の細胞死誘導剤。
  2. ＧＳＴ−πの産生を抑制する薬物を有効成分として含み、前記薬物が、ＲＮＡｉ分子、リボザイム、アンチセンス核酸、ＤＮＡ／ＲＮＡキメラポリヌクレオチド及びこれらのうち少なくとも１種を発現するベクターからなる群から選択される物質である、ＢＲＡＦ遺伝子に変異を有し、かつＢＲＡＦ阻害剤に対する耐性を有する細胞の細胞増殖抑制剤。
  3. 上記変異は、Ｖ６００Ｅ変異であることを特徴とする請求項１又は２記載の剤。
  4. 上記ＢＲＡＦ遺伝子に変異を有する細胞が、ＧＳＴ−πを高発現するがん細胞であることを特徴とする請求項１乃至３いずれか一項記載の剤。
  5. 請求項１乃至４のいずれか一項記載の剤を含む、ＢＲＡＦ遺伝子に変異を有し、かつＢＲＡＦ阻害剤に対する耐性を有する細胞の増殖異常に起因する疾患の治療用医薬組成物。
  6. 上記疾患ががんであることを特徴とする請求項５記載の医薬組成物。
  7. 上記がんはＧＳＴ−πを高発現するがんであることを特徴とする請求項６記載の医薬組成物。
  8. 上記がんは大腸癌又はメラノーマであることを特徴とする請求項６又は７記載の医薬組成物。
  9. 上記がんは大腸癌であることを特徴とする請求項６又は７記載の医薬組成物。
  10. ＧＳＴ−πの産生を抑制する薬物を選択することを含む、ＢＲＡＦ遺伝子に変異を有し、かつＢＲＡＦ阻害剤に対する耐性を有する細胞の細胞死誘導剤及び/又は細胞増殖抑制剤のスクリーニング方法。
  11. がん細胞に対して被検物質を接触させる工程と、上記細胞におけるＧＳＴ−πの発現量を測定する工程と、被検物質の非存在下において測定した場合と比較して、当該発現量が低下した場合に上記ＧＳＴ−πの産生を抑制する薬物として選択する工程とを含む請求項１０記載のスクリーニング方法。
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