TW201642875A - 針對具有ｂｒａｆ基因突變之細胞之細胞死亡誘導劑、該細胞之增殖抑制劑及起因於該細胞之增殖異常之疾病之治療用醫藥組合物 - Google Patents

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Abstract

本發明針對具有BRAF基因突變之細胞誘導細胞死亡及/或抑制細胞增殖。本發明包含抑制GST-π之藥物作為有效成分。

Description

針對具有BRAF基因突變之細胞之細胞死亡誘導劑、該細胞之增殖抑制劑及起因於該細胞之增殖異常之疾病之治療用醫藥組合物
本發明係關於一種針對具有BRAF基因突變之細胞(例如癌細胞之一種)之細胞死亡誘導劑、該細胞之增殖抑制劑及起因於該細胞之增殖異常之疾病之治療用醫藥組合物，進而係關於一種對細胞死亡誘導劑及/或細胞增殖抑制劑進行篩選之方法。
BRAF基因係對構成RAS-RAF-MAPK路徑之絲胺酸/蘇胺酸激酶之一種進行編碼之基因。於各種腫瘤中，報告有BRAF基因之突變。例如，於大量癌細胞中確認到第600號纈胺酸替換成麩胺酸之突變(V600E)。已知具有V600E突變之BRAF使下游之訊號始終活化，即便不存在來自細胞外部之刺激，亦會導致細胞之增殖。
例如，於大量大腸癌(5~15%)或黑色素瘤(約60%)中確認到具有V600E突變之BRAF基因。再者，於胰腺癌或大腸癌等大量癌中以高頻率確認到KRAS基因中之突變。KRAS蛋白質係局部存在於細胞膜 之內側之G蛋白質。KRAS等之RAS形成使CRAF或BRAF等之RAF活化，RAF接下來使MEK活化，MEK使MAPK活化之級聯(非專利文獻1及2)。同時具有BRAF突變及KRAS突變之案例罕見，處於BRAF突變及KRAS突變相互排斥之關係(非專利文獻3)。
目前，針對確認到具有V600E突變之BRAF之癌，認為利用針對具有V600E突變之BRAF之抑制劑所進行之治療有效。作為此種抑制劑，已知有威羅非尼(Vemurafenib(PLX4032))或PLX4720等。然而，存在因持續投予該抑制劑而導致癌細胞對該抑制劑獲得耐受性之情形，從而治療效果被限定。因此，針對具有BRAF基因突變之癌細胞，要求代替該等抑制劑之更有效之細胞死亡誘導劑或增殖抑制劑。
可是，將包含麩胱甘肽作為觸媒之酵素之一之麩胱甘肽-S-轉移酶(GST)已知為使藥劑等物質與麩胱甘肽(GSH)偶合而將其製成水溶性之物質之酵素。GST基於胺基酸序列，被分類為α、μ、ω、π、θ及ζ之6種同功酶作為代表性者。其中，尤其是GST-π(glutathione S-transferase pi，亦稱為GSTP1)之表現於各種癌細胞中增大，指出其可能會成為對於一部分抗癌劑之耐受性之一個因素。實際上已知若使GST-π過度表現，並使針對GST-π之反義DNA(Deoxyribonucleic Acid，脫氧核糖核酸)或GST-π抑制劑作用於表現出藥物耐受性之癌細胞系，則藥劑耐受性被抑制(非專利文獻4~6)。進而，於最近之報告中報告有若使針對GST-π之siRNA(Small interfering RNA，小干擾RNA)作用於使GST-π過度表現之雄性素非依存性前列腺癌細胞系統，則其增殖被抑制，從而細胞凋亡增大(非專利文獻7)。
又，已知GST-π與c-Jun N末端激酶(JNK)形成複合體而阻礙JNK活性(非專利文獻8)。進而，已知GST-π與和細胞之應力應答相關聯之蛋白質之S-麩胱甘肽化相關(非專利文獻9)。又，進而已知GST-π有助於針對經活性氧種(ROS)誘導之細胞死亡之保護作用(非專利文獻 10)。如此，可理解為GST中之GST-π具有各種特徵、功能。
報告有若使針對GST-π之siRNA作用於KRAS具有突變之癌細胞系，則Akt之活化被抑制，自噬增大，但細胞凋亡之誘導成為中等程度(非專利文獻11)。於專利文獻1中揭示有藉由將抑制GST-π之藥物與3-甲基腺嘌呤等自噬抑制劑作為活性成分，可誘導癌細胞之細胞凋亡。進而，於專利文獻2中揭示有若同時地抑制GST-π與Akt等之表現，則細胞增殖被抑制而誘導細胞死亡且藉由抑制GST-π之表現而誘導之自噬因同時地抑制Akt等之表現而被顯著地抑制。
然而，並無與於上述具有BRAF基因突變之細胞中GST-π之表現與細胞增殖或者細胞死亡之關係或與訊號傳遞相關之GST-π之作用等相關之見解。
[先前技術文獻] [專利文獻]
[專利文獻1]WO2012/176282
[專利文獻2]WO2014/098210
[非專利文獻]
[非專利文獻1]Curr Top Microbiol Immunol. 2012; 355:83-98
[非專利文獻2]Curr Opin Pharmacol. 2008 Aug; 8(4):419-26.
[非專利文獻3]British Journal of Cancer (2013) 108, 1757-1764.
[非專利文獻4]Takahashi and Niitsu, Gan To Kagaku Ryoho. 1994;21(7):945-51
[非專利文獻5]Ban et al., Cancer Res. 1996;56(15):3577-82
[非專利文獻6]Nakajima et al., J Pharmacol Exp Ther. 2003;306(3):861-9
[非專利文獻7]Hokaiwado et al., Carcinogenesis. 2008;29(6):1134-8
[非專利文獻8]Adler et.al, EMBO J. 1999, 18, 1321-1334
[非專利文獻9]Townsend, et. al, J. Biol. Chem. 2009, 284, 436-445
[非專利文獻10]Yin et.al, Cancer Res. 2000 60, 4053-4057
[非專利文獻11]Nishita et al., AACR 102nd Annual Meeting, Abstract No. 1065
因此，本發明之目的在於提供一種針對具有BRAF基因突變之細胞具有細胞死亡誘導作用及/或細胞增殖抑制作用之劑，且提供一種起因於細胞增殖異常之疾病之治療用醫藥組合物，且提供一種對細胞死亡誘導劑及/或細胞增殖抑制劑進行篩選之方法。
鑒於上述目的，本發明者等人進行了努力研究，結果發現，於具有BRAF基因突變之細胞中，若抑制GST-π，則細胞增殖被強力地抑制，又，即便於對先前公知之BRAF抑制劑表現出耐受性之具有BRAF基因突變之細胞中，若抑制GST-π，則細胞增殖亦被強力地抑制，從而完成了本發明。本發明包含以下。
(1)一種具有BRAF基因突變之細胞之細胞死亡誘導劑，其包含抑制GST-π之藥物作為有效成分。
(2)一種具有BRAF基因突變之細胞之細胞增殖抑制劑，其包含抑制GST-π之藥物作為有效成分。
(3)如(1)或(2)之劑，其特徵在於：上述突變係V600E突變。
(4)如(1)或(2)之劑，其特徵在於：上述具有BRAF基因突變之細胞係對BRAF抑制劑具有耐受性之細胞。
(5)如(1)或(2)之劑，其特徵在於：上述藥物係選自由RNAi(RNA interference，RNA干擾)分子、核酶、反義核酸、DNA/RNA(Ribonucleic Acid，核糖核酸)嵌合聚核苷酸及表現該等中 之至少1種之載體所組成之群中之物質。
(6)如(1)或(2)之劑，其特徵在於：上述具有BRAF基因突變之細胞係高表現GST-π之癌細胞。
(7)一種起因於具有BRAF基因突變之細胞之增殖異常之疾病之治療用醫藥組合物，其包含如上述(1)~(6)中任一項之劑。
(8)如(7)之醫藥組合物，其特徵在於：上述疾病為癌。
(9)如(8)之醫藥組合物，其特徵在於：上述癌為高表現GST-π之癌。
(10)如(8)之醫藥組合物，其特徵在於：上述癌為大腸癌或黑色素瘤。
(11)一種具有BRAF基因突變之細胞之細胞死亡誘導劑及/或細胞增殖抑制劑之篩選方法，其包含選擇抑制GST-π之藥物。
(12)如(11)之篩選方法，其包含如下步驟：使被檢測物質與癌細胞接觸之步驟；測定上述細胞中之GST-π之表現量之步驟；及於與被檢測物質之非存在下測定之情形時相比該表現量降低之情形時，選擇作為抑制上述GST-π之藥物之步驟。
本說明書包含成為本案之優先權之基礎之日本專利申請編號2015-84286號及日本專利申請編號2016-78710號之揭示內容。
根據本發明之細胞死亡誘導劑，針對具有BRAF基因突變之細胞，可非常強力地誘導細胞死亡。因此，本發明之細胞死亡誘導劑可作為起因於具有BRAF基因突變之細胞之增殖異常之疾病之治療用之醫藥組合物發揮非常高之藥效。
又，根據本發明之細胞增殖抑制劑，針對具有BRAF基因突變之細胞，可非常強力地抑制細胞增殖。因此，本發明之細胞增殖抑制劑可作為起因於具有BRAF基因突變之細胞之增殖異常之疾病之治療用 之醫藥組合物而發揮非常高之藥效。
進而，根據本發明之篩選方法，可選擇針對具有BRAF基因突變之細胞非常強力地誘導細胞死亡及/或抑制細胞增殖之藥劑。
圖1係表示於具有BRAF基因突變之大腸癌細胞株中對GST-π減弱所帶來之細胞增殖抑制效果進行驗證之結果(細胞數測定結果、西方墨點結果)之特性圖。
圖2(a)~(d)係表示於具有BRAF基因突變之黑色素瘤細胞株中對GST-π減弱所帶來之細胞增殖抑制效果進行驗證之結果(細胞數測定結果、西方墨點結果)之特性圖。
圖3係表示於具有BRAF基因突變之大腸癌細胞株中對將GST-πsiRNA及BRAF抑制劑併用時之細胞增殖抑制效果進行驗證之結果之特性圖。
圖4(a)、(b)係表示於具有BRAF基因突變之黑色素瘤細胞株中對將GST-π siRNA及BRAF抑制劑併用時之細胞增殖抑制效果進行驗證之結果之特性圖。
圖5係表示於具有BRAF基因突變且對BRAF抑制劑具有耐受性之黑色素瘤細胞株中對GST-π減弱所帶來之細胞增殖抑制效果進行驗證之結果之特性圖。
圖6係表示於具有BRAF基因突變且對BRAF抑制劑具有耐受性之黑色素瘤細胞株中，藉由西方墨點對GST-π減弱時之GST-π表現進行解析之結果之電泳照片。
本發明之細胞死亡誘導劑及細胞增殖抑制劑包含抑制GST-π之藥物作為有效成分。本發明之細胞死亡誘導劑及細胞增殖抑制劑對具有BRAF基因突變之細胞表現出細胞死亡誘導效果及細胞增殖抑制效 果。
於在本說明書中使用之情形時，GST-π係指將由GSTP1基因編碼之麩胱甘肽結合作為觸媒之酵素。GST-π存在於包含人在內之各種動物中，其序列資訊亦為公知(例如人：NM_000852(NP_000843)，大鼠：NM_012577(NP_036709)，小鼠：NM_013541(NP_038569)等。編號表示NCBI資料庫之登錄編號，括號外為鹼基序列之編號，括號內為胺基酸序列之編號)。作為一例，將登錄於資料庫中之人GST-π基因之編碼區域之鹼基序列表示為序列編號1，將該人GST-π基因所編碼之人GST-π蛋白質之胺基酸序列表示為序列編號2。
再者，關於GST-π，如上所述，可根據具體之鹼基序列及胺基酸序列進行特定，但不得不考慮到於生物個體間可能會產生鹼基序列或胺基酸序列之突變(包含各種類型)。即，GST-π並不限定於具有與登錄於資料庫中之胺基酸序列相同之序列之蛋白質，亦包含具有相對於該序列而1個或2個以上、典型而言1個或數個、例如1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個或10個胺基酸不同之序列且具有與GST-π同等之功能者。又，GST-π亦包含對包含相對於上述具體之鹼基序列具有70%以上、80%以上、90%以上、95%以上或97%以上之相同性之鹼基序列並具有與GST-π同等之功能之蛋白質進行編碼者。再者，關於GST-π之具體之功能，如上所述，意指將麩胱甘肽結合作為觸媒之酵素活性。
再者，於本說明書，「於在本說明書中使用之情形時」、「於本說明書中使用」、「於本說明書中」、「本說明書所記載」等句子只要未另行記載，則意指將緊接其後之記載應用於本說明書所記載之全部發明。又，只要未另行定義，則本說明書中所使用之技術用語及科學用語具有與業者通常理解者相同之意義。本說明書中所參照之全部專利、公報及其他出版物係將其整體援用至本說明書中。
本說明書中所使用之「抑制GST-π之藥物」並未限定，例如包含抑制GST-π之產生及/或活性之藥物或促進GST-π之分解及/或不活化之藥物等。作為抑制GST-π之產生之藥物，並不限定於此，例如可列舉針對將GST-π編碼之DNA之RNAi分子、核酶、反義核酸、DNA/RNA嵌合聚核苷酸及表現該等之載體等。
又，作為抑制GST-π之藥物，可使用作用於GST-π之任何化合物。作為此種化合物，可使用有機化合物(胺基酸、多肽或其衍生物、低分子化合物、糖、高分子化合物等)、無機化合物等。又，此種化合物可為天然物質及非天然物質之任一種。作為多肽之衍生物，可列舉對修飾基加成而獲得之修飾多肽、藉由改變胺基酸殘基而獲得之變異體多肽等。進而，此種化合物既可為單一化合物，亦可為化合物基因庫、基因基因庫之表現產物、細胞萃取物、細胞培養上清液、醱酵微生物產生物、海洋生物萃取物、植物萃取物等。即，「抑制GST-π之藥物」並不限定於RNAi分子等之核酸，亦包含任何化合物。
具體而言，作為抑制GST-π之活性之藥物，並不限定於此，例如可列舉鍵結於GST-π之物質，例如麩胱甘肽、麩胱甘肽類似物(例如WO95/08563、WO96/40205、WO99/54346、非專利文獻4等所記載者)、Ketoprofen(非專利文獻2)、吲哚美辛(Hall et al.,Cancer Res.1989；49(22)：6265-8)、利尿酸、Piroprost(Tew et al.,Cancer Res.1988；48(13)：3622-5)、抗GST-π抗體、GST-π之顯性負性突變體等。該等藥物被市售或可基於公知之技術適當製造。
作為抑制GST-π之產生或活性之藥物，就特異性之高程度或副作用之可能性之低程度之方面而言，較佳為針對將GST-π編碼之DNA之RNAi分子、核酶、反義核酸、DNA/RNA嵌合聚核苷酸及表現該等之載體。
GST-π之抑制可藉由於未使GST-π抑制劑發揮作用之情形時相 比，於細胞中GST-π之表現或活性受到抑制而確定。GST-π之表現可藉由已知之任意方法進行評價，並未限定，例如可藉由利用抗GST-π抗體之免疫沈澱法、EIA(enzyme immunoassay，酵素免疫分析法)、ELISA(enzyme-linked immuno sorbent assay，酶聯免疫吸附測定)、IRA(Immunoradio assay，免疫放射檢測)、IRMA(immunoradiometric assay，免疫放射量測定)、西方墨點法、免疫組織化學法、免疫細胞化學法、流式細胞法、利用將GST-π編碼之核酸或者其獨特之片段或與該核酸之轉錄產物(例如mRNA)或者剪切產物特異性地雜交之核酸之各種雜交法、北方墨點法、南方墨點法、各種PCR(polymerase chain reaction，聚合酶鏈反應)法等進行評價。
又，GST-π之活性為GST-π之已知之活性，並未限定地例如可藉由利用已知之任意方法例如免疫沈澱法、西方墨點法、質量分析法、下拉法、表面電漿子共振(SPR)法等對與Raf-1(尤其是磷酸化Raf-1)或EGFR(尤其是磷酸化EGFR)等蛋白質之結合性等進行解析而評價。
於在本說明書中使用之情形時，RNAi分子係指導致RNA干擾之任意之分子，並未限定，包含siRNA(small interfering RNA)、miRNA(micro RNA，微小RNA)、shRNA(short hairpin RNA，短髮夾RNA)、ddRNA(DNA-directed RNA，DNA指導的RNA)、piRNA(Piwi-interacting RNA)、rasiRNA(repeat associated siRNA，重複序列相關siRNA)等雙鏈RNA及該等之突變體等。該等RNAi分子被市售或可基於公知之序列資訊即序列編號1所表示之鹼基序列及/或序列編號2所表示之胺基酸序列進行設計、製作。又，於在本說明書中使用之情形時，反義核酸包含RNA、DNA、PNA(Peptide Nucleic Acid，肽核酸)或該等之複合物。
於在本說明書中使用之情形時，DNA/RNA嵌合聚核苷酸並未限定地例如包含日本專利特開2003-219893所記載之包含抑制目標基因 之表現之DNA與RNA之雙鏈聚核苷酸。
關於本發明之劑或組合物中之有效成分之調配量，於投予劑或組合物之情形時，可為誘導細胞凋亡等細胞死亡及/或抑制細胞增殖之量。又，較佳為不會產生超出投予所帶來之好處之惡劣影響之量。該量為公知或可藉由使用培養細胞等之in vitro(活體外)試驗或小鼠、大鼠、狗或豬等模型動物中之試驗適當決定，業者熟知此種試驗法。細胞凋亡之誘導可利用各種已知之方法例如DNA片段化、膜聯蛋白V對細胞膜之結合、線粒體膜電位之變化、半胱天冬酶之活化等細胞凋亡特有之現象之檢測或TUNEL(TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling，末端脫氧核苷酸轉移酶介導之dUTP缺口末端標記)染色等進行評價。又，細胞增殖之抑制可利用各種已知之方法例如經時性之活細胞數之計數、腫瘤之尺寸、體積或重量之測定、DNA合成量之測定、WST-1法、BrdU(溴脫氧尿苷)法、3H胸苷摻入法等進行評價。活性成分之調配量可根據劑或組合物之投藥態様進行變化。例如於1次投予使用複數個單位之組合物之情形時，1個單位之組合物中所調配之有效成分之量可設為1次投予所必需之有效成分之量之複數分之一。業者可適當進行該調配量之調整。
又，藉由調配抑制GST-π之藥物作為有效成分，可製造細胞死亡誘導劑、細胞增殖抑制劑、細胞死亡誘導組合物或細胞增殖抑制組合物。
進而，可提供一種細胞死亡誘導或細胞增殖抑制所使用之抑制GST-π之藥物。又，進而，可提供一種包含投予有效量之抑制GST-π之藥物之細胞死亡之誘導方法或細胞增殖之抑制方法。
再者，上述細胞凋亡等細胞死亡誘導或細胞增殖抑制方法均可為in vitro之方法，亦可為in vivo(活體內)之方法。又，關於該方法中之藥物，已如上所述，藥物之有效量可為於所投予之細胞中誘導細胞 死亡或抑制細胞增殖之量。又，較佳為不會產生超出投予所帶來之好處之惡劣影響之量。該量為公知或可藉由使用培養細胞等之in vitro試驗等適當確定，業者熟知此種試驗法。細胞死亡之誘導或細胞增殖之抑制可藉由包含上述者之各種已知之方法進行評價。關於上述有效量，於將藥物投予至特定之癌細胞集團之情形時，可並非為對該細胞集團之所有細胞造成細胞死亡或增殖抑制之量。例如上述有效量可為對該細胞集團中之細胞之1%以上、2%以上、3%以上、4%以上、5%以上、6%以上、8%以上、10%以上、12%以上、15%以上、20%以上、進而25%以上等造成細胞凋亡或增殖抑制之量。
本發明之細胞死亡誘導劑及細胞增殖抑制劑作用於具有BRAF基因突變之細胞。所謂具有BRAF基因突變之細胞，係因BRAF基因具有突變而表現出增殖異常之細胞(典型而言為癌細胞)。
尤其是本發明之細胞死亡誘導劑及細胞增殖抑制劑較佳為應用於高表現因BRAF基因具有突變而表現出增殖異常之細胞中之GST-π之細胞(典型而言為高表現GST-π之癌細胞)。此處，所謂高表現GST-π之癌細胞，意指BRAF基因具有突變而表現出細胞增殖異常之細胞中之GST-π之表現量與正常細胞相比明顯較高之細胞。再者，GST-π之表現量可依據RT-PCR(Reverse transcription polymerase chain reaction，逆轉錄-聚合酶鏈反應)或微陣列等慣例進行測定。
所謂BRAF基因中之突變，意指對野生型BRAF之胺基酸序列之缺失、替換、加成、插入等突變、對BRAF基因之表現控制區域之突變。再者，此處，BRAF基因中之突變係所謂之功能獲得性突變(gain of function)。即，於具有突變之BRAF基因(亦存在稱為突變型BRAF基因之情形)中包含對因該突變而導致絲胺酸/蘇胺酸激酶活性亢進之突變型BRAF進行編碼之基因。又，於突變型BRAF基因中包含於表現控制區域包含突變且與野生型BRAF基因相比表現量亢進者。即，於 表現突變型BRAF基因之細胞中具有如下特徵，即藉由表現突變型BRAF或BRAF之表現量亢進，BRAF向下游之訊號(例如向MEK之訊號)恆常地持續。
作為突變型BRAF基因，可列舉對經野生型BRAF基因中之密碼子600編碼之纈胺酸替換成麩胺酸後之突變型BRAF(表述為V600E，以下同樣)進行編碼之基因、V600D、V600G、V600K、V600M、V600R、V600L、G469A、G469V、D594N、V600insT(T之插入(insertion))等。
本發明之細胞死亡誘導劑或細胞增殖抑制劑即便於具有BRAF基因突變之癌細胞中亦可有效地誘導細胞死亡或抑制細胞增殖，故而作為針對起因於具有BRAF基因突變之癌細胞之增殖異常之疾病之醫藥組合物之成分有效。又，藉由調配抑制GST-π之藥物作為有效成分，可製造針對起因於具有BRAF基因突變之癌細胞之增殖異常之疾病之醫藥組合物。進而，可對包含將所製造之醫藥組合物之有效量投予至必需該有效量之對象之起因於細胞之增殖異常之疾病進行處理、治療。
該醫藥組合物對處理起因於具有BRAF基因突變之癌細胞之增殖異常之疾病有效。作為起因於具有BRAF基因突變之癌細胞之疾病，並未限定，可列舉高表現GST-π之癌等，於較多之情形時，具有BRAF基因突變之癌包含於高表現GST-π之癌中。
作為該等，並未限定，例如可列舉：纖維肉瘤、惡性纖維性組織球瘤、脂肪肉瘤、橫紋肌肉瘤、平滑肌肉瘤、血管肉瘤、卡波西氏肉瘤、淋巴管肉瘤、滑膜肉瘤、軟骨肉瘤、骨肉瘤等肉瘤；眼癌、甲狀腺癌(乳頭癌)、腦膜癌、腦腫瘤、下垂體癌、唾液腺癌、頭頸癌、乳癌、肺癌(非小細胞癌)、食道癌、胃癌、十二指腸癌、闌尾癌、大腸癌、直腸癌、肝癌、胰臟癌、膽囊癌、膽管癌、肛門癌、腎癌、尿 管癌、膀胱癌、前列腺癌、陰莖癌、睾丸癌、子宮癌(子宮內膜癌)、卵巢癌(卵巢漿液性癌)、外陰癌、陰道癌、皮膚癌(惡性黑色素瘤)等癌；進而白血病或惡性淋巴癌等。再者，於本發明中，「癌」包含上皮性惡性腫瘤及非上皮性惡性腫瘤。本發明中之癌可存在於身體之任意部位，例如腦、頭頸部、胸部、四肢、肺、心臟、胸腺、食道、胃、小腸(十二指腸、空腸、次腸)、大腸(結腸、盲腸、闌尾、直腸)、肝臟、胰腺、膽囊、肛門、腎、尿管、膀胱、前列腺、陰莖、睾丸、子宮、卵巢、外陰、陰道、皮膚、橫紋肌、平滑肌、滑膜、軟骨、骨、甲狀腺、腎上腺、腹膜、腸間膜、骨髄、血液、血管系統、淋巴節等淋巴系統、淋巴液等中。
尤其是本發明之細胞死亡誘導劑或細胞增殖抑制劑即便對於具有BRAF基因突變之細胞中對BRAF抑制劑獲得了耐受性之細胞，亦可有效地誘導細胞死亡或抑制細胞增殖。因此，本發明之細胞死亡誘導劑或細胞增殖抑制劑作為針對起因於具有BRAF基因突變並且對BRAF抑制劑具有耐受性之癌細胞之增殖異常之疾病之醫藥組合物之成分有效。又，藉由調配抑制GST-π之藥物作為有效成分，可製造針對起因於具有BRAF基因突變並且對BRAF抑制劑具有耐受性之癌細胞之增殖異常之疾病之醫藥組合物。進而，可對包含將所製造之醫藥組合物之有效量投予至必需該有效量之對象、即利用BRAF抑制劑之治療效果降低之患者之起因於細胞之增殖異常之疾病進行處理、治療。
此處，所謂BRAF抑制劑，係包含抑制BRAF向下游之訊號傳遞之物質、尤其是特異性地抑制起因於具有上述功能獲得性突變(gain of function)之突變型BRAF之訊號傳遞之物質之意義。作為BRAF抑制劑，例如已知有威羅非尼(Vemurafenib(PLX4032)，Cas No.：918504-65-1，N-[3-[5-(4-氯苯基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-羰基]-2,4-二氟苯基]丙烷-1-磺醯胺)或PLX4720(Cas No.：918505-84-7，N-[3-(5-氯-1H- 吡咯并[2,3-b]吡啶-3-羰基)-2,4-二氟苯基]丙烷-1-磺醯胺)等。
進而，作為BRAF抑制劑，例如可列舉：Regorafenib、Dasatinib、PLX-8394、BeiGene-283、PLX-3603、RG-7304(CAS NO.：213406-50-9)、LY-3009120(CAS NO.：1454682-72-4)、rebastinib(Cas.No.：1020172-07-9)、1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-5-甲醯胺類似物、ASN-003、威羅非尼前驅藥、N-(噻吩-2-基)苯甲醯胺衍生物、DCB-R0237、REDX-04988、EBI-907、EBI-945、Gossypin、nanolipolee-007、TEW-0201、miRNA-3157及噻唑衍生物(NMS-P186、NMS-P285、NMS-P349、NMS-P383、NMS-P396及NMS-P730)。
進而，作為BRAF抑制劑，除該等以外，亦可列舉：SB590885(Cas No.：405554-55-4，N,N-二甲基-2-[4-[(4Z)-4-(1-亞硝基-2,3-二氫茚-5-亞基)-5-(1H-吡啶-4-亞基)-1H-咪唑-2-基]苯氧基]乙醯胺)、B-Raf抑制劑1(Cas No.：1093100-40-3，1-N-(4-氯苯基)-6-甲基-5-N-[3-(7H-嘌呤-6-基)吡啶-2-基]異喹啉-1,5-二胺)、B-Raf抑制劑1二鹽酸鹽(Cas No.：1191385-19-9，1-N-(4-氯苯基)-6-甲基-5-N-[3-(7H-嘌呤-6-基)吡啶-2-基]異喹啉-1,5-二胺；二鹽酸鹽)、達拉非尼(Dabrafenib，Cas No.：1195765-45-7，N-[3-[5-(2-胺基嘧啶-4-基)-2-第三丁基-1,3-噻唑-4-基]-2-氟苯基]-2,6-二氟苯磺醯胺)、LGX818(Cas No.：1269440-17-6，N-[(2S)-1-[[4-[3-[5-氯-2-氟-3-(甲磺醯胺基)苯基]-1-丙烷-2-基吡唑-4-基]嘧啶-2-基]胺基]丙烷-2-基]胺基甲酸甲酯)、HG6-64-1(Cas No.：1315329-43-1，參照WO2011/090738.)、PF-04880594(Cas No.：1111636-35-1，3-[[4-[1-(2,2-二氟乙基)-3-(1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基)吡唑-4-基]嘧啶-2-基]胺基]丙腈)、BRAF抑制劑(Cas No.：918505-61-0，N-[2,4-二氟-3-(5-吡啶-3-基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-羰基)苯基]丙烷-2-磺醯胺)、B-Raf抑制劑(Cas No.： 1315330-11-0，N-[4-[(4-乙基哌啶-1-基)甲基]-3-(三氟甲基)苯基]-4-甲基-3-[(6-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)氧基]苯甲醯胺)、TAK-632(Cas No.：1228591-30-7，N-[7-氰基-6-[4-氟-3-[[2-[3-(三氟甲基)苯基]乙醯基]胺基]苯氧基]-1,3-苯并噻唑-2-基]環丙烷甲醯胺)、AZ 628(Cas No.：878739-06-1，3-(2-氰基丙烷-2-基)-N-[4-甲基-3-[(3-甲基-4-氧代喹唑啉-6-基)胺基]苯基]苯甲醯胺)、RAF265(Cas No.：927880-90-8，1-甲基-5-[2-[5-(三氟甲基)-1H-咪唑-2-基]吡啶-4-基]氧基-N-[4-(三氟甲基)苯基]苯并咪唑-2-胺)、CEP-32496(Cas No.：1188910-76-0，1-[3-(6,7-二甲氧基喹唑啉-4-基)氧基苯基]-3-[5-(1,1,1-三氟-2-甲基丙烷-2-基)-1,2-唑-3-基]脲)、GDC-0879(Cas No.：905281-76-7，2-[4-[(1E)-1-羥亞胺基-2,3-二氫茚-5-基]-3-吡啶-4-基吡唑-1-基]乙醇)、對甲苯磺酸索拉非尼(Cas No.：475207-59-1，4-[4-[[4-氯-3-(三氟甲基)苯基]胺甲醯基胺基]苯氧基]-N-甲基吡啶-2-甲醯胺；4-甲基苯磺酸)、達拉非尼對甲苯磺酸鹽(Cas No.：1195768-06-9，N-[3-[5-(2-胺基嘧啶-4-基)-2-第三丁基-1,3-噻唑-4-基]-2-氟苯基]-2,6-二氟苯磺醯胺；甲磺酸)、CEP-32496鹽酸鹽(Cas No.：1227678-26-3，1-[3-(6,7-二甲氧基喹唑啉-4-基)氧基苯基]-3-[5-(1,1,1-三氟-2-甲基丙烷-2-基)-1,2-唑-3-基]脲；氫氯化物)、及索拉非尼(Cas No.：284461-73-0，4-[4-[[4-氯-3-(三氟甲基)苯基]胺甲醯基胺基]苯氧基]-N-甲基吡啶-2-甲醯胺)。
又，本發明之醫藥組合物除抑制GST-π之藥物以外，亦可與其他有效成分併用。此處，所謂併用，例如包含投予其他有效成分作為另外之製劑、及投予其他有效成分作為與至少1種其他藥劑之合劑等。於作為另外之製劑而投予之情形時，可於其他製劑之前、與其他製劑同時、或其他製劑之後投予包含其他有效成分之製劑。
作為該其他有效成分，可適當使用上述BRAF抑制劑。又，作為 其他有效成分，可列舉對成為對象之疾病之處理有效者。例如於欲處理之疾病為癌之情形時，可併用抗癌劑。作為抗癌劑之例，例如可列舉：異環磷醯胺、鹽酸尼莫司汀、環磷醯胺、達卡巴嗪、美法侖、雷莫司汀等烷基化劑；鹽酸吉西他濱、依諾他濱、阿糖胞苷十八烷基磷酸鹽、阿糖胞苷製劑、喃氟啶‧尿嘧啶、替加氟-吉美嘧啶-奧替拉西鉀調配劑(例如TS-1)、去氧氟尿苷、羥基脲、氟尿嘧啶、甲胺蝶呤、巰嘌呤等代謝拮抗劑；鹽酸艾達黴素、鹽酸艾達黴素、鹽酸柔紅黴素、檸檬酸柔紅黴素、鹽酸多柔比星、鹽酸吡柔比星、鹽酸博萊黴素、硫酸培洛黴素、鹽酸米托蒽醌、絲裂黴素C等抗腫瘤性抗生物質；依託泊苷、鹽酸伊立替康、酒石酸長春瑞賓、歐洲紫杉醇水合物、紫杉醇、硫酸長春新鹼、硫酸長春地辛、硫酸長春花鹼等之生物鹼、阿那曲唑、檸檬酸他莫昔芬、檸檬酸托瑞米芬、比卡魯胺、氟他胺、雌莫司汀磷酸鈉等激素療法劑；卡鉑、順鉑(CDDP)、奈達鉑等鉑錯合物；沙立度胺、Neovastat、Bevacizumab等血管新生抑制劑；及L-天冬醯胺酸酶等。
於本說明書所記載之本發明之各種劑或組合物、處理方法等中之活性成分為核酸例如RNAi分子、核酶、反義核酸、DNA/RNA嵌合聚核苷酸等之情形時，該等可直接作為裸核酸利用，亦可擔載於各種載體。作為載體，可利用質體載體、噬菌體載體、噬菌粒載體、黏接質體載體、病毒載體等公知之任意者。載體較佳為至少包含增強所擔載之核酸之表現之啟動子，於此情形時，該核酸較佳為與該啟動子可作動地連結。所謂核酸可作動地連結於啟動子，意指以藉由啟動子之作用而適當產生該核酸所編碼之蛋白質之方式配置該核酸與啟動子。載體既可於宿主細胞內複製，亦可無法複製，又，基因之轉錄既可於宿主細胞之核外進行，亦可於核內進行。於後者之情形時，核酸亦可被組入至宿主細胞之基因組。
又，有效成分亦可擔載於各種非病毒性脂質或蛋白質載體。作為該載體，並未限定，例如可列舉：膽固醇、脂質體、抗體原聚體、環糊精奈米粒子、融合肽、適體、生物降解性聚乳酸共聚物、聚合物等，可提高向細胞內之組入效率(例如參照Pirollo and Chang,Cancer Res.2008；68(5)：1247-50等)。尤其是陽離子性脂質體或聚合物(例如聚伸乙基亞胺等)有用。作為可用作該載體之聚合物之另外之例，例如可列舉US2008/0207553、US2008/0312174等所記載者等。
於本說明書所記載之本發明之各種醫藥組合物中，只要不妨礙活性成分之效果，則亦可將活性成分與其他任意成分進行組合。作為此種任意成分，例如可列舉：其他化學治療劑、藥理學上所容許之載體、賦形劑、稀釋劑等。又，可根據投予路徑或藥物釋出樣式等利用適當之材料例如腸溶性之包衣或時限崩解性之材料被覆上述組合物，又，亦可將上述組合物組入至適當之藥物釋出系統中。
本說明書所記載之本發明之各種劑及組合物(包含各種醫藥組合物)能以包含經口及非經口之兩者之各種路徑進行投予，並無限定，例如能以經口、靜脈內、肌肉內、皮下、局部、腫瘤內、直腸、動脈內、門靜脈內、心室內、黏膜、經皮、鼻內、腹腔內、肺內及子宮內等路徑進行投予，亦可製劑成適合各投予路徑之劑形。該劑形及製劑方法可適當採用任意公知者(例如參照標準藥劑學、渡邊喜照等編、南江堂、2003年等)。
例如，作為適合經口投予之劑形，並無限定，可列舉：散劑、顆粒劑、片劑、膠囊劑、液劑、懸浮劑、乳劑、凝膠劑、糖漿劑等，又，作為適合非經口投予之劑形，可列舉：溶液性注射劑、懸浮性注射劑、乳濁性注射劑、用時調製型注射劑等注射劑。非經口投予用製劑可為水性或非水性之等張性無菌溶液或懸浮液之形態。
本說明書所記載之本發明之各種劑或組合物(包含各種醫藥組合 物)亦可目標化至特定之組織或細胞中。目標化可藉由已知之任意方法達成。於欲實現送達至癌中之情形時，並無限定，例如可使用將製劑製成適合EPR(enhanced permeability and retention，滲透性和保持力)效果之表現之直徑50~200nm、尤其是75~150nm等尺寸之被動目標法或將CD19、HER2、轉鐵蛋白受體、葉酸受體、VIP(Vasoactive intestinal peptide，血管活性腸肽)受體、EGFR(Torchilin，AAPS J.2007；9(2)：E128-47)、RAAG10(日本專利特表2005-532050)、PIPA(日本專利特表2006-506071)、KID3(日本專利特表2007-529197)等配位子或具有RGD結構或NGR結構之肽、F3、LyP-1(Ruoslahti et al.,J Cell Biol.2010；188(6)：759-68)等用作目標化劑之主動目標法等方法。又，亦已知類視黃素或其衍生物作為向癌細胞之目標化劑有用(WO 2008/120815)，故而亦可利用包含類視黃素作為目標化劑之載體。該載體除記載於上述文獻中以外，亦記載於WO 2009/036368、WO 2010/014117、WO 2012/170952等中。
本說明書所記載之本發明之各種劑或組合物(包含各種醫藥組合物)能以任一形態供給，就保存穩定性之觀點而言，能以可於使用時調製之形態例如於醫療現場或其附近可由醫師及/或藥劑師、護士、或者其他醫務輔助人員等製備之形態提供。該形態於本發明之劑或組合物包含脂質或蛋白質、核酸等難以實現穩定之保存之成分時尤其有用。於此情形時，本發明之劑或組合物係作為包含該等所必需之構成要素之至少1種之1個或2個以上之容器而提供，且係於使用之前、例如24小時前以內、較佳為3小時前以內、並且更佳為即將要使用之前製備。於製備時，可適當使用通常可於製備之場所獲取之試劑、溶劑、調劑器具等。
因此，本發明亦關於一種包含單獨或者組合包含本發明之各種劑或組合物可包含之活性成分之1個或2個以上之容器之組合物之製備 套組、以及以此種套組之形態提供之各種劑或組合物之必需構成要素。本發明之套組除上述以外，亦包含記載有本發明之各種劑或組合物之製備方法或投予方法等之指示例如說明書或CD(Compact Disc，光碟)、DVD(Digital Versatile Disc，數位多功能光碟)等電子記錄媒體等。又，本發明之套組可包含用以完成本發明之各種劑或組合物之全部構成要素，亦可未必包含全部構成要素。因此，本發明之套組亦可包含通常可於醫療現場或實驗設施等獲取之試劑或溶劑例如無菌水或生理鹽水、葡萄糖溶液等。
所謂本說明書所記載之本發明之各種處理方法中之有效量，例如係減少疾病之症狀或使疾病之進行延遲或者停止之量，較佳為抑制或治癒疾病之量。又，較佳為不會產生超出投予所帶來之好處之惡劣影響之量。該量可藉由使用培養細胞等之in vitro試驗或小鼠、大鼠、狗或豬等模型動物之試驗適當確定，業者熟知此種試驗法。又，本發明之處理方法所使用之藥物之用量對於業者而言為公知或可藉由上述試驗等適當確定。
於本說明書所記載之本發明之處理方法中投予之活性成分之具體之用量可考慮與需要處理之對象相關之各種條件例如症狀之嚴重程度、對象之一般健康狀態、年齡、體重、對象之性別、飲食、投予之時期及頻率、併用之醫藥、對治療之反應性、劑形、及對治療之適應性等而確定。
作為投予路徑，包含包括經口及非經口之兩者之各種路徑，例如經口、靜脈內、肌肉內、皮下、局部、腫瘤內、直腸、動脈內、門靜脈內、心室內、經黏膜、經皮、鼻內、腹腔內、肺內及子宮內等路徑。
投予頻率因所使用之劑或組合物之性狀或包含上述者之對象之條件而有所不同，例如可為1天數次(即1天2、3、4次或5次以上)、1 天1次、每隔數天(即每隔2、3、4、5、6、7天等)、每隔1週、每隔數週(即每隔2、3、4週等)。
於在本說明書中使用之情形時，用語「對象」意指任意之生物個體，較佳為動物，進而較佳為哺乳動物，進而較佳為人之個體。於本發明中，對象既可健康，亦可患有某種疾病，於企圖進行特定疾病之處理之情形時，典型而言意指患有該疾病或具有患病之風險之對象。
又，用語「處理」於在本說明書中使用之情形時，包含以疾病之治癒、暫時之緩解或預防等為目的之醫學上所容許之所有種類之預防性及/或治療性干擾。例如，「處理」之用語包含包括疾病之進行之延遲或停止、病變之消退或消失、發病之預防或再發之防止等各種目的之醫學上所容許之干擾。
可是，如上所述，抑制GST-π之藥物對具有BRAF基因突變之細胞表現出細胞死亡誘導及/或細胞增殖抑制。因此，可將對GST-π之抑制作為指標，對具有BRAF基因突變之細胞之細胞死亡誘導劑及/或細胞增殖抑制劑進行篩選。即，可抑制GST-π之物質成為具有BRAF基因突變之細胞(典型而言為癌細胞)之細胞死亡誘導劑及/或細胞增殖抑制劑之候補物質。
例如，使被檢測物質與作為癌細胞之一例之具有BRAF基因突變之癌細胞接觸，並測定該細胞中之GST-π之表現量。於與被檢測物質之非存在下測定之表現量相比使被檢測物質接觸時之表現量降低之情形時，可選擇該被檢測物質作為抑制GST-π之藥物之候補物質。
此處，作為被檢測物質，並無任何限定，可為任何物質。作為被檢測物質，既可為單獨之物質，亦可為包含複數個構成成分之混合物。作為被檢測物質，例如可為如微生物或者來自培養液之萃取物般包含未鑑定之物質之構成，亦可為以特定之組成比包含已知之組合物 般之構成。又，作為被檢測物質，可為蛋白質、核酸、脂質、多糖類、有機化合物及無機化合物之任一者。
[實施例]
以下，藉由實施例對本發明進而詳細地進行說明，但本發明之技術範圍並不限定於以下之實施例。
[實施例1]
於本實施例中，對使抑制GST-π之藥物作用於具有BRAF基因突變之細胞時之細胞增殖抑制效果進行了研究。首先，於37℃下並於包含5%CO2之大氣下培養1種大腸癌細胞株(CACO-2)、4種黑色素瘤細胞株(A375、SK-MEL-28、A2058、Malme-3M)作為具有BRAF基因突變(V600E)之癌細胞。關於所使用之培養基，CACO-2設為MEM+20%、FBS+0.1mM及NEAA，A375設為DMEM+15%及FBS，SK-MEL-28設為EMEM+10%及FBS，A2058設為DMEM+10%及FBS，Malme-3M設為IMDM+20%及FBS，任一者均添加抗生物質。
接下來，於轉染之前一天，使用不含抗生物質之培養基將各細胞以成為10~20%融合之方式播種至100mm組織培養塑膠盤。向1mL之Opti-MEM I Reduced Serum Medium(GIBCO公司)中添加600pmol之GST-π siRNA(GGGAGGCAAGACCUUCAUUTT，siRNA ID#2385，Ambion公司(序列編號3))，並平穩地混合。繼而，將35μL之Lipofectamine RNAi MAX(Invitrogen公司)於1mL之Opti-MEM I Reduced Serum Medium(GIBCO公司)中稀釋，並平穩地混合。於將稀釋後之GST-π siRNA與稀釋後之Lipofectamine RNAi MAX平穩地混合後，於室溫下培養10分鐘。於該期間內，將培養基更換成10mL之Opti-MEM I Reduced Serum Medium。於培養10分鐘後，將GST-π siRNA與Lipofectamine RNAi MAX之複合體添加至細胞中，於37℃下並於包含5%CO2之大氣下進行培養。於培養5小時後，更換成10mL之 不含抗生物質之培養基。於培養基更換後1小時內利用PBS(Phosphate Buffered Saline，磷酸鹽緩衝液)洗淨，並使用0.25% Trypsin-EDTA(SIGMA公司)將細胞剝離而使其懸浮於包含抗生物質之培養基中。使細胞懸浮於5ml之培養基中，並播種至60mm組織培養塑膠盤(CACO-2：0.4×105個，A375：1.0×105個，SK-MEL-28：0.2×105個，A2058：0.8×105個，Malme-3M：0.6×105個)。
作為對照實驗，使用Scramble(零亂)siRNA(CGAUUCGCUAGACCGGCUUCAUUGCAG，北海道system-science公司(序列編號4))或AllStars Negative Control siRNA(siControl)(QIAGEN公司)進行同樣之操作。於GST-π siRNA之轉染後，於第0天與第5天分別測量細胞數。
又，於本實施例中，藉由西方墨點分別確認使GST-π siRNA作用於CACO-2細胞、A375細胞、SK-MEL-28細胞、A2058細胞及Malme-3M細胞時之GST-π之表現。即，使用於GST-π siRNA之轉染後第3天採取之細胞進行GST-π減弱之西方墨點解析。首先，於利用冷PBS對所採取之細胞進行清洗後，添加冷lysis buffer(裂解緩衝液)(1% NP-40，50mM Tris-HCl(pH7.4)，150mM NaCl，1mM EDTA，complete Mini EDTA-free(Roche公司)，PhosSTOP(Roche公司))進行冰冷並培養30分鐘而使之可溶化。其後，於4℃下以15000rpm進行15分鐘離心分離而獲得細胞萃取液。針對所獲得之細胞萃取液，使用Micro BCA Protein Assay Kit(Thermo SCIENTIFIC公司)進行蛋白之定量。繼而，使20μg之細胞萃取液於還原條件下改性，使用Multigel II mini 4/20(13w)(Cosmobio公司)進行SDS-PAGE(Sodium Dodecyl Sulfate-PolyAcrylamide Gel Electrophoresis，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳)，將蛋白質分離。於SDS-PAGE結束後，使用箱式點墨裝置轉錄至PVDF(Polyvinylidene Fluoride，聚偏二氟乙烯)膜。將轉錄膜於添 加有5%脫脂乳/0.05% Tween20之PBS(簡稱為PBS-T)中並於4℃下培養16小時進行阻斷。接下來，使之與利用Membrane blocking Solution(Invitrogen公司)稀釋後之抗GST-π抗體(MBL公司)於4℃下反應16小時。二次抗體反應係使用辣根過氧化酶(HRP)標記之兔子抗體並於室溫下進行1小時。頻帶之訊號檢測係利用使用ECL Western Blocking Detection Reagents(GE Healthcare公司)之化學發光法於X射線膜上進行。各操作間之洗淨係使用PBS-T進行4次5分鐘之振盪。
將與大腸癌細胞株相關之結果示於圖1，將與黑色素瘤細胞株相關之結果示於圖2。再者，於圖1及2中一併表示對細胞數進行測定之結果與利用西方墨點之解析之結果。如圖1及2所示，關於大腸癌細胞株及黑色素瘤細胞株，於具有BRAF基因突變之癌細胞中，均藉由作為抑制GST-π之藥劑之GST-π siRNA減弱GST-π，藉此細胞增殖能力被顯著地抑制。BRAF基因中之突變於惡性度較高之腫瘤中被確認到，且已知為大腸癌中無法切除之大腸癌之預後不良因子。黑色素瘤之患者之一半具有BRAF基因突變，於轉移能力較高之情形時，致死率‧惡性度最高。根據本實施例之結果暗示，關於此種具有BRAF基因突變之癌，抑制GST-π之藥劑對細胞增殖抑制有效，因此期待將該等與難治性癌之新穎之治療法聯繫起來。
[實施例2]
於本實施例中，對使抑制GST-π之藥物及BRAF抑制劑作用於具有BRAF基因突變之細胞時之細胞增殖抑制效果進行了研究。
首先，以與實施例1相同之方式分別培養1種大腸癌細胞株(CACO-2)及2種黑色素瘤細胞株(SK-MEL-28及A2058)，並於轉染之前一天，以成為10~20%融合之方式使用不含抗生物質之培養基將其等播種至100mm組織培養塑膠盤。向1mL之Opti-MEM I Reduced Serum Medium(GIBCO公司)中添加600pmol GST-π siRNA(GGGAGGCAAGACCUUCAUUTT，siRNA ID#2385，Ambion公司(序列編號3))，並平穩地混合。繼而，將35μL之Lipofectamine RNAi MAX(Invitrogen公司)於1mL之Opti-MEM I Reduced Serum Medium(GIBCO公司)中稀釋，並平穩地混合。於將稀釋後之GST-π siRNA與稀釋後之Lipofectamine RNAi MAX平穩地混合後，於室溫下培養10分鐘。於該期間內，將培養基更換成10mL之Opti-MEM I Reduced Serum Medium。於培養10分鐘後，將GST-π siRNA與Lipofectamine RNAi MAX之複合體添加至細胞中，於37℃下並於包含5%CO2之大氣下進行培養。於培養5小時後，更換成10mL之不含抗生物質之培養基。於培養基更換後1小時內利用PBS洗淨，並使用0.25% Trypsin-EDTA(SIGMA公司)將細胞剝離而使其懸浮於包含抗生物質之培養基中。使細胞懸浮於5ml之培養基中，並將其播種至60mm組織培養塑膠盤(CACO-2：0.4×105個，SK-MEL-28：0.2×105個及A2058：0.2×105個)。作為對照實驗，使用AllStars Negative Control siRNA(siControl)(QIAGEN公司)進行相同之操作。自轉染後第1天起將作為BRAF抑制劑之PLX4720(Selleck公司)以相對於CACO-2成為40μM、相對於SK-MEL-28成為0.7μM、及相對於A2058成為10μM之方式添加至培養基中並培養至第5天為止。關於PLX4720處理之對照，添加溶劑之DMSO(Dimethyl sulfoxide，二甲基亞碸)(和光純藥)進行培養。Growth assay(生長測定)係藉由測量轉染後0天起至第5天為止之細胞數而進行。
將針對CACO-2測量細胞數之結果示於圖3，將針對SK-MEL-28及A2058測量細胞數之結果示於圖4。根據圖3得知，於使GST-π siRNA單獨作用於大腸癌細胞株(具有BRAF基因突變之CACO-2株)之情形時，與使PLX4720與siControl一併作用於該大腸癌細胞株之情形時相比，於將該等GST-π siRNA及PLX4720併用後作用於該細胞株之 情形時顯示出細胞增殖抑制效果顯著。又，根據圖4得知，於使GST-π siRNA單獨作用於黑色素瘤細胞株(具有BRAF基因突變之SK-MEL-28及A2058)之情形時，與使PLX4720與siControl一併作用於該黑色素瘤細胞株之情形時相比，於將該等GST-π siRNA及PLX4720併用後作用於該細胞株之情形時顯示出細胞增殖抑制效果顯著。
[實施例3]
於本實施例中，對使抑制GST-π之藥物作用於具有BRAF基因突變並且對BRAF抑制劑具有耐受性之細胞(BRAF抑制劑耐受性細胞)時之細胞增殖抑制效果進行了研究。
<細胞數測定>
於本實施例中使用之BRAF抑制劑耐受性細胞係以如下方式而製作。將實施例1中所使用之黑色素瘤細胞株A375於添加有1~5μM之PLX4720(Selleck公司)之包含抗生物質與15% FBS(Fetal Calf Serum，胎牛血清)之DMEM(Dulbecco's Modified Eagles Medium，Dulbecco改進之Eagle培養基)培養基中於37℃下並於包含5%CO2之大氣下培養1個月。將於培養1個月後生存之細胞株作為PLX4720耐受性A375細胞用於本實施例。
於本實施例中，於轉染之前一天，使用不含抗生物質之添加有15% FBS之DMEM培養基將PLX4720耐受性A375細胞以成為0.5×106個/10ml之方式播種至100mm組織培養塑膠盤。向1mL之Opti-MEM I Reduced Serum Medium(GIBCO公司)中添加600pmol GST-π siRNA(GGGAGGCAAGACCUUCAUUTT，siRNA ID#2385，Ambion公司(序列編號3))，並平穩地混合。繼而，將35μL之Lipofectamine RNAi MAX(Invitrogen公司)稀釋於1mL之Opti-MEM I Reduced Serum Medium(GIBCO公司)中，並平穩地混合。於將稀釋後之GST-π siRNA 與稀釋後之Lipofectamine RNAi MAX平穩地混合後，於室溫下培養10分鐘。於該期間內，將培養基更換成10mL之Opti-MEM I Reduced Serum Medium。於培養10分鐘後，將GST-π siRNA與Lipofectamine RNAi MAX之複合體添加至細胞中，於37℃下並於包含5%CO2之大氣下進行培養。於培養5小時後，更換成10mL之不含抗生物質之添加有15% FBS之DMEM培養基。於培養基更換後2小時內利用PBS進行洗淨，然後使用0.5% Trypsin-EDTA(SIGMA公司)將細胞剝離而使其懸浮於包含抗生物質與15% FBS之DMEM培養基中。將懸浮液中之細胞以成為1.0×105個/5ml之方式播種至60mm組織培養塑膠盤。作為對照實驗，使用Scramble siRNA(CGAUUCGCUAGACCGGCUUCAUUGCAG，北海道system-science公司(序列編號4))或者AllStars Negative Control siRNA(QIAGEN公司)進行相同之操作。於GST-π siRNA之轉染後分別於第0、1、2、3、4、5天測量細胞數。
<GST-π表現確認>
如上所述，藉由西方墨點確認使GST-π siRNA作用於PLX4720耐受性A375細胞時之GST-π之表現。即，使用於GST-π siRNA之轉染後之上述各時點採取之細胞進行GST-π減弱之西方墨點解析。
首先，於利用冷PBS將所採取之細胞清洗後，添加冷lysis buffer(1%NP-40，50mM Tris-HCl(pH7.4)，150mM NaCl，1mM EDTA，complete Mini EDTA-free(Roche公司)，PhosSTOP(Roche公司))進行冰冷並培養30分鐘而使之可溶化。於4℃下以15000rpm進行15分鐘離心分離而獲得細胞萃取液。針對所獲得之細胞萃取液，使用Micro BCA Protein Assay Kit(Thermo SCIENTIFIC公司)進行蛋白之定量。繼而，使20μg之細胞萃取液於還原條件下改性，並使用Multigel II mini 4/20(13w)(Cosmobio公司)進行SDS-PAGE而將蛋白質分離。於 SDS-PAGE結束後，使用箱式點墨裝置轉錄至PVDF膜。將轉錄膜於添加有5%脫脂乳/0.05% Tween20之PBS(簡稱為PBS-T)中於4℃下培養16小時進行阻斷。接下來，使其與利用Membrane blocking Solution(Invitrogen公司)稀釋後之抗GST-π抗體(MBL公司)於4℃下反應16小時。二次抗體反應係使用辣根過氧化酶(HRP)標記之兔子抗體於室溫下進行1小時。頻帶之訊號檢測係藉由使用ECL Western Blocking Detection Reagents(GE Healthcare公司)之化學發光法於X射線膜上進行。各操作間之洗淨係使用PBS-T進行4次5分鐘之振盪。
<結果>
近年來，瞭解到獲得了BRAF抑制劑耐受性之黑色素瘤細胞株與黑色素瘤之再發相關。因此，為了確認GST-π是否促進BRAF抑制劑耐受性黑色素瘤之CRAF依存性，於PLX4720耐受性A375中減弱GST-π。測定細胞增殖，結果確認到顯著之增殖抑制效果(圖5)。對GST-π減弱進行了確認，結果於第2天與第3天GST-π表現被抑制(圖6)。
藉由本實施例，顯示出可有效地抑制具有BRAF基因突變並且對BRAF抑制劑具有耐受性之細胞(BRAF抑制劑耐受性細胞)之增殖。根據該結果，可期待可防止或者減少BRAF抑制劑耐受性細胞成為一個因素之疾病例如黑色素瘤之再發等效果。
本說明書中所引用之所有發行物、專利及專利申請係直接藉由引用而組入至本說明書中。
<110> 日商日東電工股份有限公司
<120> 針對具有BRAF基因突變之細胞之細胞死亡誘導劑、該細胞之增殖抑 制劑及起因於該細胞之增殖異常之疾病之治療用醫藥組合物
<130> PH-6539-TW
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<151> 2015-04-16
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<151> 2016-04-11
<160> 4
<170> 專利版本3.5
<210> 1
<211> 986
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> CDS
<222> (250)..(882)
<400> 1
<210> 2
<211> 210
<212> PRT
<213> 智人
<400> 2
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人造
<220>
<223> 合成RNA
<400> 3
<210> 4
<211> 27
<212> DNA
<213> 人造
<220>
<223> 合成RNA
<400> 4

Claims (12)

  1. 一種具有BRAF基因突變之細胞之細胞死亡誘導劑，其包含抑制GST-π之藥物作為有效成分。
  2. 一種具有BRAF基因突變之細胞之細胞增殖抑制劑，其包含抑制GST-π之藥物作為有效成分。
  3. 如請求項1或2之劑，其中上述突變係V600E突變。
  4. 如請求項1或2之劑，其中上述具有BRAF基因突變之細胞係對BRAF抑制劑具有耐受性之細胞。
  5. 如請求項1或2之劑，其中上述藥物係選自由RNAi分子、核酶、反義核酸、DNA/RNA嵌合聚核苷酸及表現該等中之至少1種之載體所組成之群中之物質。
  6. 如請求項1或2之劑，其中上述具有BRAF基因突變之細胞係高表現GST-π之癌細胞。
  7. 一種起因於具有BRAF基因突變之細胞之增殖異常之疾病之治療用醫藥組合物，其包含如請求項1至6中任一項之劑。
  8. 如請求項7之醫藥組合物，其中上述疾病為癌。
  9. 如請求項8之醫藥組合物，其中上述癌為高表現GST-π之癌。
  10. 如請求項8之醫藥組合物，其中上述癌為大腸癌或黑色素瘤。
  11. 一種具有BRAF基因突變之細胞之細胞死亡誘導劑及/或細胞增殖抑制劑之篩選方法，其包含選擇抑制GST-π之藥物。
  12. 如請求項11之篩選方法，其包括如下步驟：使被檢測物質與癌細胞接觸之步驟；測定上述細胞中之GST-π之表現量之步驟；及於與被檢測物質之非存在下測定之情形時相比該表現量降低之情況下，選擇其作為抑制上述GST-π之藥物之步驟。
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