KR20170138453A

KR20170138453A - Braf 유전자 변이를 갖는 세포에 대한 세포사 유도제, 당해 세포의 증식 억제제 및 당해 세포의 증식 이상에서 기인하는 질환의 치료용 의약 조성물

Info

Publication number: KR20170138453A
Application number: KR1020177031501A
Authority: KR
Inventors: 요시로 니이츠; 히로키 니시타
Original assignee: 닛토덴코 가부시키가이샤
Priority date: 2015-04-16
Filing date: 2016-04-15
Publication date: 2017-12-15
Also published as: JP2022177146A; JP2021054841A; AU2016249567A1; TWI767883B; CA2982643A1; US20180135058A1; JP7471361B2; JP2016204365A; AU2016249567B2; EP3284481A4; EP3284481B1; US10570396B2; JP6864990B2; EP3284481A1; CN107530433A; TW201642875A

Abstract

BRAF 유전자에 변이를 갖는 세포에 대해서 세포사를 유도 및/또는 세포 증식을 억제한다. GST-π 를 억제하는 약물을 유효 성분으로서 함유한다.

Description

BRAF 유전자 변이를 갖는 세포에 대한 세포사 유도제, 당해 세포의 증식 억제제 및 당해 세포의 증식 이상에서 기인하는 질환의 치료용 의약 조성물{CELL DEATH INDUCING AGENT FOR CELLS HAVING BRAF GENE MUTATION, AGENT FOR INHIBITING PROLIFERATION OF SAID CELLS AND PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR TREATING PATIENT SUFFERING FROM EFFECTS OF ABNORMAL PROLIFERATION OF SAID CELLS}

본 발명은 BRAF 유전자 변이를 갖는 세포 (예를 들어, 암 세포의 1 종) 에 대한 세포사 유도제, 당해 세포의 증식 억제제 및 당해 세포의 증식 이상에서 기인하는 질환의 치료용 의약 조성물에 관한 것이고, 또한 세포사 유도제 및/또는 세포 증식 억제제를 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.

BRAF 유전자는 RAS-RAF-MAPK 경로를 구성하는 세린 트레오닌 키나아제의 1 종을 코드하는 유전자이다. 다양한 종양에 있어서, BRAF 유전자의 변이가 보고되어 있다. 예를 들어, 600 번째의 발린이 글루타민산으로 치환되는 변이 (V600E) 는 많은 암 세포에서 확인된다. V600E 변이를 갖는 BRAF 는 하류의 시그널을 항상 활성화하여, 세포 외로부터의 자극이 없어도 세포의 증식을 일어나게 하는 것이 알려져 있다.

예를 들어, 많은 대장암 (5 ∼ 15 ％) 이나 멜라노마 (약 60 ％) 에 있어서, V600E 변이를 갖는 BRAF 유전자가 확인되고 있다. 또한, 췌장암이나 대장암 등의 많은 암에 있어서, KRAS 유전자에 있어서의 변이가 고빈도로 확인된다. KRAS 단백질은 세포막의 내측에 국재되어 있는 G 단백질이다. KRAS 등의 RAS 는 CRAF 나 BRAF 등의 RAF 를 활성화하고, RAF 는 계속하여 MEK 를, MEK 는 MAPK 를 활성화한다는 캐스케이드를 형성하고 있다 (비특허문헌 1 및 2). BRAF 변이 및 KRAS 변이를 모두 갖는 케이스는 드물어, BRAF 변이 및 KRAS 변이 상호 배타의 관계에 있다 (비특허문헌 3).

현재, V600E 변이를 갖는 BRAF 가 확인되는 암에 대해서는, V600E 변이를 갖는 BRAF 에 대한 저해제에 의한 치료가 유효하다고 되어 있다. 이와 같은 저해제로는, 베무라페닙 (Vemurafenib (PLX4032)) 이나 PLX4720 등이 알려져 있다. 그러나, 당해 저해제의 계속적인 투여에 의해서, 암 세포가 당해 저해제에 대해서 내성을 획득하는 경우가 있어 치료 효과는 한정적이다. 따라서, BRAF 유전자에 변이를 갖는 암 세포에 대해서는, 이들 저해제에 대신하는, 보다 효과적인 세포사 유도제나 증식 억제제가 요청되고 있었다.

그런데, 글루타티온 함유를 촉매하는 효소의 하나인 글루타티온-S-트랜스페라아제 (GST) 는, 약제 등의 물질을 글루타티온 (GSH) 과 공액시켜, 수용성의 물질로 하는 효소로서 알려져 있다. GST 는 아미노산 배열에 기초하여, 대표적인 것으로서 α, μ, ω, π, θ 및 ζ 의 6 종류의 아이소자임으로 분류된다. 그 중에서도, 특히 GST-π (glutathione S-transferase pi, GSTP1 이라고도 한다) 의 발현이, 여러 가지 암 세포에 있어서 증대되고 있고, 이것이 일부의 항암제에 대한 내성의 하나의 요인으로 되어 있을 가능성이 지적되고 있다. 실제로, GST-π 를 과잉 발현하고, 약물 내성을 나타내는 암 세포계에 GST-π 에 대한 안티센스 DNA 나 GST-π 저해제를 작용시키면, 약제 내성이 억제되는 것이 알려져 있다 (비특허문헌 4 ∼ 6). 또한, 최근의 보고에서는, GST-π 를 과잉 발현하는 안드로겐 비의존성 전립선암 세포계에 GST-π 에 대한 siRNA 를 작용시키면 그 증식이 억제되고, 아포토시스가 증대되는 것이 보고되어 있다 (비특허문헌 7).

또, GST-π 에 대해서는, c-Jun N 말단 키나아제 (JNK) 와 복합체를 형성하여, JNK 활성을 저해하는 것이 알려져 있다 (비특허문헌 8). 또한, GST-π 에 대해서는, 세포의 스트레스 응답에 관련되는 단백질의 S-글루타티온화에 관여하는 것이 알려져 있다 (비특허문헌 9). 게다가 또, GST-π 에 대해서는, 활성 산소종 (ROS) 에 의해서 유도되는 세포사에 대한 보호 작용에 기여하는 것이 알려져 있다 (비특허문헌 10). 이와 같이, GST 중에서도 GST-π 는 여러 가지 특징·기능을 갖고 있는 것을 이해할 수 있다.

KRAS 에 변이를 갖는 암 세포계에 GST-π 에 대한 siRNA 를 작용시키면, Akt 의 활성화가 억제되고, 오토 파지가 증대되지만, 아포토시스의 유도는 중 (中) 정도가 되는 것이 보고되어 있다 (비특허문헌 11). 특허문헌 1 에는, GST-π 를 억제하는 약물과, 3-메틸아데닌 등의 오토 파지 저해제를 활성 성분으로 함으로써, 암 세포의 아포토시스를 유도할 수 있는 것이 개시되어 있다. 또한, 특허문헌 2 에는, GST-π 와 Akt 등의 발현을 동시에 저해하면, 세포 증식이 억제되어 세포사가 유도되는 것, GST-π 의 발현 저해에 의해서 유도된 오토 파지가, Akt 등의 발현을 동시에 저해함으로써 현저하게 억제되는 것이 개시되어 있다.

그러나, 상기 서술한 BRAF 유전자에 변이를 갖는 세포에 있어서, GST-π 의 발현과 세포 증식 혹은 세포사의 관계나, 시그널 전달에 관한 GST-π 의 역할 등에 관한 지견은 없다.

WO2012/176282 WO2014/098210

Curr Top Microbiol Immunol. 2012 : 355 : 83-98 Curr Opin Pharmacol. 2008 Aug : 8 (4) : 419-26. British Journal of Cancer (2013) 108, 1757-1764. Takahashi and Niitsu, Gan To Kagaku Ryoho. 1994 : 21 (7) : 945-51 Ban et al., Cancer Res. 1996 : 56 (15) : 3577-82 Nakajima et al., J Pharmacol Exp Ther. 2003 : 306 (3) : 861-9 Hokaiwado et al., Carcinogenesis. 2008 : 29 (6) : 1134-8 Adler et.al., EMBO J. 1999, 18, 1321-1334 Townsend, et.al., J. Biol. Chem. 2009, 284, 436-445 Yin et.al., Cancer Res. 2000 60, 4053-4057 Nishita et al., AACR 102nd Annual Meeting, Abstract No.1065

그래서, 본 발명은, BRAF 유전자에 변이를 갖는 세포에 대해서, 세포사 유도 작용 및/또는 세포 증식 억제 작용을 갖는 제 (劑) 를 제공하고, 세포 증식 이상에서 기인하는 질환의 치료용 의약 조성물을 제공하며, 세포사 유도제 및/또는 세포 증식 억제제를 스크리닝하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 서술한 목적을 감안하여, 본 발명자들이 예의 검토한 결과, BRAF 유전자에 변이를 갖는 세포에 있어서, GST-π 를 억제하면 세포 증식이 강력하게 억제되는 것, 또, 종래 공지된 BRAF 저해제에 대한 내성을 나타내는, BRAF 유전자에 변이를 갖는 세포에 있어서도 GST-π 를 억제하면 세포 증식이 강력하게 억제되는 것을 알아내고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다. 본 발명은 이하를 포함한다.

(1) GST-π 를 억제하는 약물을 유효 성분으로서 함유하는, BRAF 유전자에 변이를 갖는 세포의 세포사 유도제.

(2) GST-π 를 억제하는 약물을 유효 성분으로서 함유하는, BRAF 유전자에 변이를 갖는 세포의 세포 증식 억제제.

(3) 상기 변이는 V600E 변이인 것을 특징으로 하는 (1) 또는 (2) 에 기재된 제.

(4) 상기 BRAF 유전자에 변이를 갖는 세포는, BRAF 저해제에 대한 내성을 갖는 세포인 것을 특징으로 하는 (1) 또는 (2) 에 기재된 제.

(5) 상기 약물이, RNAi 분자, 리보자임, 안티센스 핵산, DNA/RNA 키메라 폴리뉴클레오티드 및 이것들 중 적어도 1 종을 발현하는 벡터로 이루어지는 군에서 선택되는 물질인 것을 특징으로 하는 (1) 또는 (2) 에 기재된 제.

(6) 상기 BRAF 유전자에 변이를 갖는 세포가, GST-π 를 고발현하는 암 세포인 것을 특징으로 하는 (1) 또는 (2) 에 기재된 제.

(7) 상기 (1) ∼ (6) 중 어느 하나에 기재된 제를 함유하는, BRAF 유전자에 변이를 갖는 세포의 증식 이상에서 기인하는 질환의 치료용 의약 조성물.

(8) 상기 질환이 암인 것을 특징으로 하는 (7) 에 기재된 의약 조성물.

(9) 상기 암은 GST-π 를 고발현하는 암인 것을 특징으로 하는 (8) 에 기재된 의약 조성물.

(10) 상기 암은 대장암 또는 멜라노마인 것을 특징으로 하는 (8) 에 기재된 의약 조성물.

(11) GST-π 를 억제하는 약물을 선택하는 것을 포함하는, BRAF 유전자에 변이를 갖는 세포의 세포사 유도제 및/또는 세포 증식 억제제의 스크리닝 방법.

(12) 암 세포에 대해서 피검 물질을 접촉시키는 공정과, 상기 세포에 있어서의 GST-π 의 발현량을 측정하는 공정과, 피검 물질의 비존재 하에 있어서 측정한 경우와 비교하여, 당해 발현량이 저하된 경우에 상기 GST-π 를 억제하는 약물로서 선택하는 공정을 포함하는 (11) 에 기재된 스크리닝 방법.

본 명세서는 본원의 우선권의 기초가 되는 일본국 특허출원번호 2015-84286호 및 일본국 특허출원번호 2016-78710호의 개시 내용을 포함한다.

본 발명에 관련된 세포사 유도제에 따르면, BRAF 유전자에 변이를 갖는 세포에 대해서 매우 강력하게 세포사를 유도할 수 있다. 따라서, 본 발명에 관련된 세포사 유도제는, BRAF 유전자에 변이를 갖는 세포의 증식 이상에서 기인하는 질환의 치료용의 의약 조성물로서 매우 높은 약효를 얻을 수 있게 된다.

또, 본 발명에 관련된 세포 증식 억제제에 따르면, BRAF 유전자에 변이를 갖는 세포에 대해서 매우 강력하게 세포 증식을 억제할 수 있다. 따라서, 본 발명에 관련된 세포 증식 억제제는, BRAF 유전자에 변이를 갖는 세포의 증식 이상에서 기인하는 질환의 치료용의 의약 조성물로서 매우 높은 약효를 얻을 수 있게 된다.

또한, 본 발명에 관련된 스크리닝 방법에 의하면, BRAF 유전자에 변이를 갖는 세포에 대해서 매우 강력하게 세포사를 유도하는 및/또는 세포 증식을 억제하는 약제를 선택할 수 있다.

도 1 은, BRAF 유전자에 변이를 갖는 대장암 세포주에 있어서, GST-π 녹다운에 의한 세포 증식 억제 효과를 검증한 결과 (세포수 측정 결과, 웨스턴 블롯 결과) 를 나타내는 특성도이다.
도 2 는, BRAF 유전자에 변이를 갖는 멜라노마 세포주에 있어서, GST-π 녹다운에 의한 세포 증식 억제 효과를 검증한 결과 (세포수 측정 결과, 웨스턴 블롯 결과) 를 나타내는 특성도이다.
도 3 은, BRAF 유전자에 변이를 갖는 대장암 세포주에 있어서, GST-π siRNA 및 BRAF 저해제를 병용했을 때의 세포 증식 억제 효과를 검증한 결과를 나타내는 특성도이다.
도 4 는, BRAF 유전자에 변이를 갖는 멜라노마 세포주에 있어서, GST-π siRNA 및 BRAF 저해제를 병용했을 때의 세포 증식 억제 효과를 검증한 결과를 나타내는 특성도이다.
도 5 는, BRAF 유전자에 변이를 갖고, BRAF 저해제에 내성을 갖는 멜라노마 세포주에 있어서, GST-π 녹다운에 의한 세포 증식 억제 효과를 검증한 결과를 나타내는 특성도이다.
도 6 은, BRAF 유전자에 변이를 갖고, BRAF 저해제에 내성을 갖는 멜라노마 세포주에 있어서, GST-π 녹다운했을 때의 GST-π 발현을 웨스턴 블롯에 의해서 해석한 결과를 나타내는 전기 영동 사진이다.

본 발명에 관련된 세포사 유도제 및 세포 증식 억제제는, GST-π 를 억제하는 약물을 유효 성분으로서 함유한다. 본 발명에 관련된 세포사 유도제 및 세포 증식 억제제는, BRAF 유전자에 변이를 갖는 세포에 대해서 세포사 유도 효과 및 세포 증식 억제 효과를 나타내는 것이다.

본 명세서에서 사용하는 경우, GST-π 는, GSTP1 유전자에 의해서 코드되는, 글루타티온 콘주게이션을 촉매하는 효소를 가리킨다. GST-π 는 인간을 포함하는 여러 동물에 존재하고, 그 배열 정보도 공지되어 있다 (예를 들어, 인간 : NM_000852 (NP_000843), 래트 : NM_012577 (NP_036709), 마우스 : NM_013541 (NP_038569) 등. 번호는 NCBI 데이터 베이스의 억세션 번호를 나타내고, 괄호외는 염기 배열, 괄호내는 아미노산 배열의 번호이다). 일례로서, 데이터 베이스에 등록되어 있는 인간 GST-π 유전자의 코딩 영역의 염기 배열을 배열 번호 1 에 나타내고, 당해 인간 GST-π 유전자가 코드하는 인간 GST-π 단백질의 아미노산 배열을 배열 번호 2 에 나타낸다.

또한, GST-π 에 대해서, 상기 서술한 바와 같이, 구체적인 염기 배열 및 아미노산 배열에 의해서 특정할 수 있지만, 생물 개체간에 있어서 염기 배열이나 아미노산 배열의 변이가 발생될 가능성 (다형을 포함한다) 을 고려해야만 한다. 즉, GST-π 는, 데이터 베이스에 등록된 아미노산 배열과 동일한 배열을 갖는 단백질에 한정되지 않고, 동 배열에 대해서 1 개 또는 2 개 이상, 전형적으로는 1 개 또는 수 개, 예를 들어, 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 5 개, 6 개, 7 개, 8 개, 9 개 또는 10 개의 아미노산이 서로 상이한 배열을 갖고, GST-π 와 동등한 기능을 갖는 것도 포함한다. 또, GST-π 는, 상기 서술한 구체적인 염기 배열에 대해서 70 ％ 이상, 80 ％ 이상, 90 ％ 이상, 95 ％ 이상 또는 97 ％ 이상의 동일성을 갖는 염기 배열로 이루어지고, GST-π 와 동등한 기능을 갖는 단백질을 코드하는 것도 포함한다. 또한, GST-π 의 구체적 기능에 대해서는, 상기 서술한 바와 같이, 글루타티온 콘주게이션을 촉매하는 효소 활성을 의미한다.

또한, 본 명세서에 있어서, 「본 명세서에서 사용하는 경우」, 「본 명세서에서 사용하는」, 「본 명세서에 있어서」, 「본 명세서에 기재하는」등의 문구는, 특별히 별도로 기재하지 않는 한, 이것에 이어지는 기재가 본 명세서에 기재된 모든 발명에 적용되는 것을 의미하는 것으로 한다. 또, 달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용하는 모든 기술 용어 및 과학 용어는, 당업자가 통상적으로 이해하고 있는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서 중에서 참조하는 모든 특허, 공보 및 다른 출판물은 그 전체를 본 명세서에 원용한다.

본 명세서에서 사용하는 「GST-π 를 억제하는 약물」에는, 한정되지 않고, 예를 들어, GST-π 의 산생 및/또는 활성을 억제하는 약물이나, GST-π 의 분해 및/또는 불활성화를 촉진하는 약물 등이 포함된다. GST-π 의 산생을 억제하는 약물로는, 이것에 한정하는 것은 아니지만, 예를 들어 GST-π 를 코드하는 DNA 에 대한 RNAi 분자, 리보자임, 안티센스 핵산, DNA/RNA 키메라 폴리뉴클레오티드 및 이것들을 발현하는 벡터 등을 들 수 있다.

또, GST-π 를 억제하는 약물로는, GST-π 에 대해서 작용하는 어떠한 화합물이라도 사용할 수 있다. 이와 같은 화합물로는, 유기 화합물 (아미노산, 폴리펩티드 또는 그 유도체, 저분자 화합물, 당, 고분자 화합물 등), 무기 화합물 등을 사용할 수 있다. 또, 이와 같은 화합물은 천연 물질 및 비천연 물질의 어느 것이어도 된다. 폴리펩티드의 유도체로는, 수식기를 부가하여 얻어진 수식 폴리펩티드, 아미노산 잔기를 개변함으로써 얻어진 베리언트 폴리펩티드 등을 들 수 있다. 나아가, 이와 같은 화합물은 단일 화합물이어도 되지만, 화합물 라이브러리, 유전자 라이브러리의 발현 산물, 세포 추출물, 세포 배양 상청, 발효 미생물 산생물, 해양 생물 추출물, 식물 추출물 등이어도 된다. 즉, 「GST-π 를 억제하는 약물」에는 RNAi 분자 등의 핵산에 한정되지 않고, 어떠한 화합물도 포함된다.

구체적으로는, GST-π 의 활성을 억제하는 약물로는, 이것에 한정하는 것은 아니지만, 예를 들어, GST-π 에 결합되는 물질, 예를 들어, 글루타티온, 글루타티온 아날로그 (예를 들어, WO 95/08563, WO 96/40205, WO 99/54346, 비특허문헌 4 등에 기재된 것), 케토프로펜 (비특허문헌 2), 인도메타신 (Hall et al., Cancer Res. 1989 : 49 (22) : 6265-8), 에타크릴산, 피로프로스트 (Tew et al., Cancer Res. 1988 : 48 (13) : 3622-5), 항 GST-π 항체, GST-π 의 도미넌트 네거티브 변이체 등을 들 수 있다. 이들 약물은 시판되고 있거나, 공지된 기술에 기초하여 적절히 제조할 수 있다.

GST-π 의 산생 또는 활성을 억제하는 약물로는, 높은 특이성이나, 낮은 부작용의 가능성으로부터, GST-π 를 코드하는 DNA 에 대한 RNAi 분자, 리보자임, 안티센스 핵산, DNA/RNA 키메라 폴리뉴클레오티드 및 이것들을 발현하는 벡터가 바람직하다.

GST-π 의 억제는, GST-π 억제제를 작용시키지 않는 경우에 비해서, 세포에 있어서 GST-π 의 발현이나 활성이 억제되어 있음으로써 결정할 수 있다. GST-π 의 발현은, 이미 알려진 임의의 수법에 한정되지 않고, 예를 들어, 항 GST-π 항체를 이용한 면역 침강법, EIA, ELISA, IRA, IRMA, 웨스턴 블롯팅법, 면역 조직 화학법, 면역 세포 화학법, 플로 사이토메트리법, GST-π 를 코드하는 핵산 혹은 그 유니크한 단편 또는 그 핵산의 전사 산물 (예를 들어, mRNA) 혹은 스프라이싱 산물에 특이적으로 하이브리다이즈하는 핵산을 이용한, 여러 가지의 하이브리다이제이션법, 노던 블롯법, 서든 블롯법, 여러 가지의 PCR 법 등에 의해서 평가할 수 있다.

또, GST-π 의 활성은 GST-π 의 이미 알려진 활성에 한정되지 않고, 예를 들어, Raf-1 (특히 인산화 Raf-1) 이나, EGFR (특히 인산화 EGFR) 등의 단백질과의 결합성 등을, 이미 알려진 임의의 방법, 예를 들어, 면역 침강법, 웨스턴 블롯팅법, 질량 분석법, 풀 다운법, 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 법 등에 의해서 해석함으로써 평가할 수 있다.

본 명세서에서 사용하는 경우, RNAi 분자는 RNA 간섭을 초래하는 임의의 분자를 가리키지만, 이에 한정되지 않고, siRNA (small interfering RNA), miRNA (micro RNA), shRNA (short hairpin RNA), ddRNA (DNA-directed RNA), piRNA (Piwi-interacting RNA), rasiRNA (repeat associated siRNA) 등의 이중쇄 RNA 및 이것들의 개변체 등을 포함한다. 이들 RNAi 분자는 시판되고 있거나, 공지된 배열 정보, 즉, 배열 번호 1 에 나타낸 염기 배열 및/또는 배열 번호 2 에 나타낸 아미노산 배열에 기초하여 설계, 제작하는 것이 가능하다. 또, 본 명세서에서 사용하는 경우, 안티센스 핵산은 RNA, DNA, PNA 또는 이것들의 복합물을 포함한다.

본 명세서에서 사용하는 경우, DNA/RNA 키메라 폴리뉴클레오티드는 한정되지 않고, 예를 들어, 일본 공개특허공보 2003-219893 에 기재된, 표적 유전자의 발현을 저해하는 DNA 와 RNA 로 이루어지는 2 본쇄 폴리뉴클레오티드를 포함한다.

본 발명의 제 또는 조성물에 있어서의 유효 성분의 배합량은, 제 또는 조성물이 투여된 경우, 아포토시스와 같은 세포사가 유도 및/또는 세포 증식이 억제되는 양이어도 된다. 또, 투여에 의한 이익을 초과하는 악영향이 발생되지 않는 양이 바람직하다. 이러한 양은 공지되거나, 배양 세포 등을 사용한 in vitro 시험이나, 마우스, 래트, 개 또는 돼지 등의 모델 동물에서의 시험에 의해서 적절히 결정할 수 있고, 이와 같은 시험법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 아포토시스의 유도는, 여러 가지의 이미 알려진 수법, 예를 들어, DNA 단편화, 아넥신 V 의 세포막에 대한 결합, 미토콘드리아막 전위의 변화, 카스파아제의 활성화 등의 아포토시스 특유의 현상의 검출이나, TUNEL 염색 등에 의해서 평가할 수 있다. 또, 세포 증식의 억제는 여러 가지의 이미 알려진 수법, 예를 들어, 시간 경과적인 생세포수의 계수, 종양의 사이즈, 체적 또는 중량의 측정, DNA 합성량의 측정, WST-1 법, BrdU (브로모디옥시우리딘) 법, 3H 티미딘 도입법, 등에 의해서 평가할 수 있다. 활성 성분의 배합량은 제나 조성물의 투약 양태에 따라서 변화될 수 있다. 예를 들어, 1 회의 투여에 복수 단위의 조성물을 사용할 경우, 조성물 1 단위에 배합되는 유효 성분의 양은, 1 회의 투여에 필요한 유효 성분의 양의 복수 분의 1 로 할 수 있다. 이러한 배합량의 조정은 당업자가 적절히 행할 수 있다.

또, GST-π 를 억제하는 약물을 유효 성분으로서 배합함으로써, 세포사 유도제, 세포 증식 억제제, 세포사 유도 조성물 또는 세포 증식 억제 조성물을 제조할 수 있다.

또한, 세포사 유도 또는 세포 증식 억제에 사용하는, GST-π 를 억제하는 약물을 제공할 수 있다. 게다가 또, 유효량의 GST-π 를 억제하는 약물을 투여하는 것을 포함하는, 세포사의 유도 방법 또는 세포 증식의 억제 방법을 제공할 수 있다.

또한, 상기 서술한 아포토시스 등의 세포사 유도 또는 세포 증식 억제 방법은 어느 것이나 in vitro 방법이어도 되고, in vivo 방법이어도 된다. 또, 당해 방법에 있어서의 약물에 대해서는 앞서 상기 서술한 바와 같고, 약물의 유효량은 투여한 세포에 있어서 세포사가 유도되거나, 또는 세포 증식이 억제되는 양이어도 된다. 또, 투여에 의한 이익을 초과하는 악영향이 발생되지 않는 양이 바람직하다. 이러한 양은 공지되거나, 배양 세포 등을 사용한 in vitro 시험 등에 의해서 적절히 결정할 수 있고, 이와 같은 시험법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 세포사의 유도 또는 세포 증식의 억제는, 상기 서술한 것을 포함하는 여러 가지의 이미 알려진 수법에 의해서 평가할 수 있다. 상기 유효량은, 약물을 소정의 암 세포 집단에 투여한 경우에, 반드시 동 세포 집단의 모든 세포에 세포사 또는 증식 억제를 초래하는 것이 아니어도 된다. 예를 들어, 상기 유효량은, 당해 세포 집단에 있어서의 세포의 1 ％ 이상, 2 ％ 이상, 3 ％ 이상, 4 ％ 이상, 5 ％ 이상, 6 ％ 이상, 8 ％ 이상, 10 ％ 이상, 12 ％ 이상, 15 ％ 이상, 20 ％ 이상, 나아가서는 25 ％ 이상 등으로 아포토시스 또는 증식 억제를 초래하는 양이어도 된다.

본 발명에 관련된 세포사 유도제 및 세포 증식 억제제는 BRAF 유전자에 변이를 갖는 세포에 작용한다. BRAF 유전자에 변이를 갖는 세포란, BRAF 유전자가 변이를 가짐으로써 증식 이상을 나타내는 세포 (전형적으로는 암 세포) 이다.

특히, 본 발명에 관련된 세포사 유도제 및 세포 증식 억제제는, BRAF 유전자가 변이를 가짐으로써 증식 이상을 나타내는 세포 중 GST-π 를 고발현하는 세포 (전형적으로는 GST-π 를 고발현하는 암 세포) 에 적용하는 것이 바람직하다. 여기서, GST-π 를 고발현하는 암 세포란, BRAF 유전자가 변이를 갖고, 세포 증식 이상을 나타내는 세포 중, GST-π 의 발현량이 정상 세포와 비교하여 유의하게 높은 세포를 의미한다. 또한 GST-π 의 발현량은 RT-PCR 이나 마이크로 어레이 등 정법 (定法) 에 따라서 측정할 수 있다.

BRAF 유전자에 있어서의 변이란, 야생형 BRAF 의 아미노산 배열에 대한 결실, 치환, 부가, 삽입 등의 변이, BRAF 유전자의 발현 제어 영역에 대한 변이를 의미한다. 또한, 여기서, BRAF 유전자에 있어서의 변이는, 이른바 기능 획득성 변이 (gain of function) 이다. 즉, 변이를 갖는 BRAF 유전자 (변이형 BRAF 유전자라고 칭하는 경우도 있다) 에는, 당해 변이에서 기인하여 세린 트레오닌 키나아제 활성이 항진한 변이형 BRAF 를 코드하는 유전자가 포함된다. 또, 변이형 BRAF 유전자에는 발현 제어 영역에 변이가 포함되고, 야생형 BRAF 유전자와 비교하여 발현량이 항진한 것도 포함된다. 즉, 변이형 BRAF 유전자를 발현하는 세포에서는, 변이형 BRAF 를 발현하거나 또는 BRAF 의 발현량이 항진함으로써, BRAF 로부터 하류로의 시그널 (예를 들어, MEK 로의 시그널) 이 항상적으로 지속되는 특징을 갖는다.

변이형 BRAF 유전자로는, 야생형 BRAF 유전자에 있어서의 코돈 600 에 의해서 코드되는 발린이 글루타민산으로 치환된 변이형 BRAF (V600E 로 표기한다. 이하 동일) 를 코드하는 유전자, V600D, V600G, V600K, V600M, V600R, V600L, G469A, G469V, D594N, V600insT (T 의 insertion) 등을 들 수 있다.

본 발명의 세포사 유도제 또는 세포 증식 억제제는, BRAF 유전자에 변이를 갖는 암 세포에 있어서도 효과적으로 세포사를 유도할 수 있거나, 또는 세포 증식을 억제할 수 있기 때문에, BRAF 유전자에 변이를 갖는 암 세포의 증식 이상에서 기인하는 질환에 대한 의약 조성물의 성분으로서 유효하다. 또, GST-π 를 억제하는 약물을 유효 성분으로서 배합함으로써, BRAF 유전자에 변이를 갖는 암 세포의 증식 이상에서 기인하는 질환에 대한 의약 조성물을 제조할 수 있다. 또한, 제조된 의약 조성물의 유효량을, 그것을 필요로 하는 대상에 투여하는 것을 포함하는, 세포의 증식 이상에서 기인하는 질환을 처치·치료할 수 있다.

당해 의약 조성물은, BRAF 유전자에 변이를 갖는 암 세포의 증식 이상에서 기인하는 질환을 처치하는 데 유효하다. BRAF 유전자에 변이를 갖는 암 세포에서 기인되는 질환에는, 한정되지 않고, GST-π 를 고발현하는 암 등을 들 수 있고, 대개의 경우, BRAF 유전자에 변이를 갖는 암은 GST-π 를 고발현하는 암에 포함된다.

이것들로는, 한정되지 않고, 예를 들어, 섬유 육종, 악성 섬유성 조직구종, 지방 육종, 횡문근 육종, 평활근 육종, 혈관 육종, 카포지 육종, 임파관 육종, 활막 육종, 연골 육종, 골 육종 등의 육종, 안암, 갑상선암 (유두암), 수막암, 뇌종양, 하수체암, 타액선암, 두경부암, 유방암, 폐암 (비소 세포암), 식도암, 위암, 십이지장암, 충수암, 대장암, 직장암, 간암, 췌암, 담낭암, 담관암, 항문암, 신장암, 요관암, 방광암, 전립선암, 음경암, 정소암, 자궁암 (자궁 내막암), 난소암 (난소 장액성암), 외음암, 질암, 피부암 (악성 흑색종) 등의 암종, 나아가서는 백혈병이나 악성 임파종 등을 들 수 있다. 또한, 본 발명에서는, 「암」은 상피성 악성 종양 및 비상피성 악성 종양을 포함한다. 본 발명에 있어서의 암은, 신체의 임의의 부위, 예를 들어, 뇌, 두경부, 흉부, 사지, 폐, 심장, 흉선, 식도, 위, 소장 (십이지장, 공장, 회장), 대장 (결장, 맹장, 충수, 직장), 간장, 췌장, 담낭, 항문, 신장, 요관, 방광, 전립선, 음경, 정소, 자궁, 난소, 외음, 질, 피부, 횡문근, 평활근, 활막, 연골, 골, 갑상선, 부신, 복막, 장간막, 골수, 혈액, 혈관계, 림프절 등의 림프액계, 림프액 등에 존재할 수 있다.

특히, 본 발명의 세포사 유도제 또는 세포 증식 억제제는, BRAF 유전자에 변이를 갖는 세포 중, BRAF 저해제에 대해서 내성을 획득한 세포에 대해서도 효과적으로 세포사를 유도할 수 있거나, 또는 세포 증식을 억제할 수 있다. 따라서, 본 발명의 세포사 유도제 또는 세포 증식 억제제는, BRAF 유전자에 변이를 갖는 암 세포로서, BRAF 저해제에 내성을 갖는 암 세포의 증식 이상에서 기인하는 질환에 대한 의약 조성물의 성분으로서 유효하다. 또, GST-π 를 억제하는 약물을 유효 성분으로서 배합함으로써, BRAF 유전자에 변이를 갖는 암 세포로서, BRAF 저해제에 내성을 갖는 암 세포의 증식 이상에서 기인하는 질환에 대한 의약 조성물을 제조할 수 있다. 또한, 제조된 의약 조성물의 유효량을, 그것을 필요로 하는 대상, 즉 BRAF 저해제에 의한 치료 효과가 저감된 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 세포의 증식 이상에서 기인하는 질환을 처치·치료할 수 있다.

여기서, BRAF 저해제란, BRAF 로부터 하류로의 시그널 전달을 저해하는 물질, 특히, 상기 서술한 기능 획득성 변이 (gain of function) 를 갖는 변이형 BRAF 에서 기인하는 시그널 전달을 특이적으로 저해하는 물질을 함유하는 의미이다. BRAF 저해제로는, 예를 들어, 베무라페닙 (Vemurafenib (PLX4032), Cas No. : 918504-65-1, N-[3-[5-(4-클로로페닐)-1H-피롤로[2,3-b]피리딘-3-카르보닐]-2,4-디플루오로페닐]프로판-1-설폰아마이드) 나 PLX4720 (Cas No. : 918505-84-7, N-[3-(5-클로로-1H-피롤로[2,3-b]피리딘-3-카르보닐)-2,4-디플루오로페닐]프로판-1-설폰아마이드) 등이 알려져 있다.

또, BRAF 저해제로는, 예를 들어, 레고라페닙, 다사티닙, PLX-8394, BeiGene-283, PLX-3603, RG-7304 (CAS NO. : 213406-50-9), LY-3009120 (CAS NO. : 1454682-72-4), rebastinib (레바스티닙) (Cas.No. : 1020172-07-9), 1H-피라졸로[3,4-b]피리딘-5-카르복사미드 아날로그, ASN-003, 베무라페닙프로드럭, N-(티오펜-2-일)벤즈아마이드 유도체, DCB-R0237, REDX-04988, EBI-907, EBI-945, 고시핀, 나노리포리-007, TEW-0201, miRNA-3157 및 티아졸 유도체 (NMS-P186, NMS-P285, NMS-P349, NMS-P383, NMS-P396 및 NMS-P730) 를 들 수 있다.

또한, BRAF 저해제로는, 이것들 이외에도 SB590885 (Cas No. : 405554-55-4, N,N-디메틸-2-[4-[(4Z)-4-(1-니트로소-2,3-디하이드로인덴-5-일리덴)-5-(1H-피리딘-4-일리덴)-1H-이미다졸-2-일]페녹시]에탄아민), B-Raf 저해제 1 (Cas No. : 1093100-40-3, 1-N-(4-클로로페닐)-6-메틸-5-N-[3-(7H-푸린-6-일)피리딘-2-일]이소퀴놀린-1,5-디아민), B-Raf 저해제 1 디하이드로클로라이드 (Cas No. : 1191385-19-9, 1-N-(4-클로로페닐)-6-메틸-5-N-[3-(7H-푸린-6-일)피리딘-2-일]이소퀴놀린-1,5-디아민 ; 디하이드로클로라이드), 다브라페닙 (Dabrafenib, Cas No. : 1195765-45-7, N-[3-[5-(2-아미노피리미딘-4-일)-2-tert-부틸-1,3-티아졸-4-일]-2-플루오로페닐]-2,6-디플루오로벤젠설폰아마이드), LGX818 (Cas No. : 1269440-17-6, 메틸 N-[(2S)-1-[[4-[3-[5-클로로-2-플루오로-3-(메탄설폰아마이도)페닐]-1-프로판-2-일피라졸-4-일]피리미딘-2-일]아미노]프로판-2-일]카바메이트), HG6-64-1 (Cas No. : 1315329-43-1, WO 2011/090738.참조), PF-04880594 (Cas No. : 1111636-35-1, 3-[[4-[1-(2,2-디플루오로에틸)-3-(1H-피롤로[2,3-b]피리딘-5-일)피라졸-4-일]피리미딘-2-일]아미노]프로판니트릴), BRAF 저해제 (Cas No. : 918505-61-0, N-[2,4-디플루오로-3-(5-피리딘-3-일-1H-피롤로[2,3-b]피리딘-3-카르보닐)페닐]프로판-2-설폰아마이드), B-Raf 저해제 (Cas No. : 1315330-11-0, N-[4-[(4-에틸피페라진-1-일)메틸]-3-(트리플루오로메틸)페닐]-4-메틸-3-[(6-메틸-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)옥시]벤즈아마이드), TAK-632 (Cas No. : 1228591-30-7, N-[7-시아노-6-[4-플루오로-3-[[2-[3-(트리플루오로메틸)페닐]아세틸]아미노]페녹시]-1,3-벤조티아졸-2-일]시클로프로판카르복사미드), AZ628 (Cas No. : 878739-06-1, 3-(2-시아노프로판-2-일)-N-[4-메틸-3-[(3-메틸-4-옥소퀴나졸린-6-일)아미노]페닐]벤즈아마이드), RAF265 (Cas No. : 927880-90-8, 1-메틸-5-[2-[5-(트리플루오로메틸)-1H-이미다졸-2-일]피리딘-4-일]옥시-N-[4-(트리플루오로메틸)페닐]벤조이미다졸-2-아민), CEP-32496 (Cas No. : 1188910-76-0, 1-[3-(6,7-디메톡시퀴나졸린-4-일)옥시페닐]-3-[5-(1,1,1-트리플루오로-2-메틸프로판-2-일)-1,2-옥사졸-3-일]우레아), GDC-0879 (Cas No. : 905281-76-7, 2-[4-[(1E)-1-하이드록시이미노-2,3-디하이드로인덴-5-일]-3-피리딘-4-일피라졸-1-일]에탄올), 토실산소라페닙 (Cas No. : 475207-59-1, 4-[4-[[4-클로로-3-(트리플루오로메틸)페닐]카르바모일아미노]페녹시]-N-메틸피리딘-2-카르복사미드 ; 4-메틸벤젠설폰산), 다브라페닙토실산염 (Cas No. : 1195768-06-9, N-[3-[5-(2-아미노피리미딘-4-일)-2-tert-부틸-1,3-티아졸-4-일]-2-플루오로페닐]-2,6-디플루오로벤젠설폰아마이드 ; 메탄설폰산), CEP-32496 염산염 (Cas No. : 1227678-26-3, 1-[3-(6,7-디메톡시퀴나졸린-4-일)옥시페닐]-3-[5-(1,1,1-트리플루오로-2-메틸프로판-2-일)-1,2-옥사졸-3-일]우레아 ; 하이드로클로라이드), 및 소라페닙 (Cas No. : 284461-73-0, 4-[4-[[4-클로로-3-(트리플루오로메틸)페닐]카르바모일아미노]페녹시]-N-메틸피리딘-2-카르복사미드) 를 들 수 있다.

또, 본 발명에 관련된 의약 조성물은, GST-π 를 억제하는 약물 이외에 다른 유효 성분과 병용해도 된다. 여기서, 병용한다는 것은, 예를 들어, 다른 유효 성분을 각각 다른 제제로서 투여하는 것, 및, 다른 유효 성분을 적어도 1 종의 다른 약제와의 합제로서 투여하는 것 등을 포함한다. 각각 다른 제제로서 투여하는 경우에는, 다른 유효 성분을 함유하는 제제를, 다른 제제보다 전에, 다른 제제와 동시에, 또는, 다른 제제보다 후에 투여해도 된다.

이러한 다른 유효 성분으로는, 상기 서술한 BRAF 저해제를 적절히 사용할 수 있다. 또, 다른 유효 성분으로는, 대상이 되는 질환의 처치에 유효한 것을 들 수 있다. 예를 들어, 처치하는 질환이 암인 경우에는 항암제를 병용할 수 있다. 항암제의 예로는, 예를 들어, 이포스파마이드, 염산니무스틴, 시클로포스파미드, 다카르바진, 멜팔란, 라니무스틴 등의 알킬화제, 염산겜시타빈, 에노시타빈, 시타라빈·옥포스페이트, 시타라빈 제제, 테가푸르·우라실, 테가푸르·기메라실·오테라실칼륨 배합제 (예를 들어, TS-1), 독시플루리딘, 하이드록시카르바미드, 플루오로우라실, 메토트렉사트, 메르캅토퓨린 등의 대사 길항제, 염산이다루비신, 염산에피루비신, 염산다우노루비신, 시트르산다우노루비신, 염산독소루비신, 염산피라루비신, 염산블레오마이신, 황산페플로마이신, 염산미톡산트론, 마이토마이신 C 등의 항종양성 항생 물질, 에토포사이드, 염산이리노테칸, 타르타르산비노렐빈, 도세탁셀 수화물, 파클리탁셀, 황산빈크리스틴, 황산빈데신, 황산빈브라스틴 등의 알칼로이드, 아나스트로졸, 시트르산타목시펜, 시트르산트레미펜, 비칼루타미드, 플루타미드, 인산에스트라무스틴 등의 호르몬 요법제, 카르보플라틴, 시스플라틴 (CDDP), 네다플라틴 등의 백금 착물, 살리도마이드, 네오바스타트, 베바시주맙 등의 혈관 신생 저해제, L-아스파라기나제 등을 들 수 있다.

본 명세서에 기재하는 본 발명의 각종의 제나 조성물, 처치 방법 등에 있어서의 활성 성분이 핵산, 예를 들어, RNAi 분자, 리보자임, 안티센스 핵산, DNA/RNA 키메라 폴리뉴클레오티드 등인 경우, 이것들은, 노출된 (naked) 핵산으로서 그대로 이용할 수도 있지만, 여러 가지의 벡터에 담지시킬 수도 있다. 벡터로는, 플라스미드 벡터, 파지 벡터, 파지미드 벡터, 코스미드벡터, 바이러스 벡터 등의 공지된 임의의 것을 이용할 수 있다. 벡터는, 담지하는 핵산의 발현을 증강시키는 프로모터를 적어도 함유하고 있는 것이 바람직하고, 이 경우, 그 핵산은 이러한 프로모터와 작동 가능하게 연결되어 있는 것이 바람직하다. 핵산이 프로모터에 작동 가능하게 연결되어 있다는 것은, 프로모터의 작용에 의해서 그 핵산이 코드하는 단백질이 적절히 산생되도록, 그 핵산과 프로모터가 배치되어 있는 것을 의미한다. 벡터는, 숙주 세포 내에서 복제 가능해도 되고 가능하지 않아도 되며, 또, 유전자의 전사는 숙주 세포의 핵 외에서 행해져도 되고, 핵 내에서 행해져도 된다. 후자의 경우, 핵산은 숙주 세포의 게놈에 넣어져도 된다.

또, 유효 성분은, 여러 가지의 비바이러스성 지질 또는 단백질 담체에 담지시킬 수도 있다. 이러한 담체로는 한정되지 않고, 예를 들어, 콜레스테롤, 리포솜, 항체 프로토마, 시클로덱스트린 나노 입자, 융합 펩티드, 앱타머, 생분해성 폴리락트산 코폴리머, 폴리머 등을 들 수 있고, 세포 내로의 도입 효율을 높일 수 있다 (예를 들어, Pirollo and Chang, Cancer Res. 2008 : 68 (5) : 1247-50 등을 참조). 특히, 카티온성 리포솜이나 폴리머 (예를 들어, 폴리에틸렌이민 등) 가 유용하다. 이러한 담체로서 유용한 폴리머의 추가적인 예로는, 예를 들어, US 2008/0207553, US 2008/0312174 등에 기재된 것 등을 들 수 있다.

본 명세서에 기재하는 본 발명의 각종 의약 조성물에 있어서는, 활성 성분의 효과를 방해하지 않는 이상, 활성 성분을 다른 임의 성분과 조합해도 된다. 그와 같은 임의 성분으로는, 예를 들어, 다른 화학 치료제, 약리학적으로 허용되는 담체, 부형제, 희석제 등을 들 수 있다. 또, 투여 경로나 약물 방출 양식 등에 따라서, 상기 조성물을 적절한 재료, 예를 들어, 장용성의 코팅이나, 시한 붕괴성의 재료로 피복해도 되고, 또, 적절한 약물 방출 시스템에 넣어도 된다.

본 명세서에 기재하는 본 발명의 각종 제 및 조성물 (각종 의약 조성물을 포함한다) 은, 경구 및 비경구의 양방을 포함하는 여러 가지의 경로, 예를 들어, 한정하지 않고, 경구, 정맥 내, 근육 내, 피하, 국소, 종양 내, 직장, 동맥 내, 문맥 내, 심실 내, 경점막, 경피, 비 내, 복강 내, 폐 내 및 자궁 내 등의 경로로 투여해도 되고, 각 투여 경로에 적합한 제형으로 제제 (製劑) 해도 된다. 이러한 제형 및 제제 방법은 임의의 공지된 것을 적절히 채용할 수 있다 (예를 들어, 표준 약제학, 와타나베 요시테루 외 편, 난코우토우, 2003 년 등을 참조).

예를 들어, 경구 투여에 적합한 제형으로는, 한정하지 않고, 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 액제, 현탁제, 유제, 겔제, 시럽제 등을 들 수 있고, 또 비경구 투여에 적합한 제형으로는, 용액성 주사제, 현탁성 주사제, 유탁성 주사제, 용시 (用時) 조제형 주사제 등의 주사제를 들 수 있다. 비경구 투여용 제제는 수성 또는 비수성의 등장성 무균 용액 또는 현탁액의 형태일 수 있다.

본 명세서에 기재하는 본 발명의 각종 제 또는 조성물 (각종 의약 조성물을 포함한다) 은, 특정 조직이나 세포에 표적화되어 있어도 된다. 표적화는 이미 알려진 임의의 수법에 의해서 달성할 수 있다. 암으로의 송달을 기도 (企圖) 하는 경우에는, 한정되지 않고, 예를 들어, 제제를 EPR (enhanced permeability and retention) 효과의 발현에 바람직한 직경 50 ∼ 200 ㎚, 특히 75 ∼ 150 ㎚ 등의 사이즈로 하는 것에 의한 패시브 타깃팅이나, CD19, HER2, 트랜스페린 수용체, 엽산 수용체, VIP 수용체, EGFR (Torchilin, AAPS J. 2007 : 9 (2) : E128-47), RAAG10 (일본 공표특허공보 2005-532050호), PIPA (일본 공표특허공보 2006-506071호), KID3 (일본 공표특허공보 2007-529197호) 등의 리간드나, RGD 모티프나 NGR 모티프를 갖는 펩티드, F3, LyP-1 (Ruoslahti et al., J Cell Biol. 2010 : 188 (6) : 759-68) 등을 표적화제로서 이용하는 액티브 타깃팅 등의 수법을 사용할 수 있다. 또, 레티노이드 또는 그 유도체가 암 세포에 대한 표적화제로서 유용한 것도 알려져 있기 때문에 (WO 2008/120815), 레티노이드를 표적화제로서 함유하는 담체를 이용할 수도 있다. 이러한 담체는, 상기 문헌 외에, WO 2009/036368, WO 2010/014117, WO 2012/170952 등에 기재되어 있다.

본 명세서에 기재하는 본 발명의 각종 제 또는 조성물 (각종 의약 조성물을 포함한다) 은 모든 형태로 공급되어도 되지만, 보존 안정성의 관점에서 용시 조제 가능한 형태, 예를 들어, 의료의 현장 혹은 그 근방에 있어서, 의사 및/또는 약제사, 간호사, 혹은 그 밖의 파라메디컬 등에 의해서 조제될 수 있는 형태로 제공해도 된다. 이러한 형태는 본 발명의 제 또는 조성물이 지질이나 단백질, 핵산 등의 안정적인 보존이 어려운 성분을 함유할 때에 특히 유용하다. 이 경우, 본 발명의 제 또는 조성물은 이것들에 필수인 구성 요소의 적어도 1 개를 포함하는 1 개 또는 2 개 이상의 용기로서 제공되고, 사용 전, 예를 들어, 24 시간 전 이내, 바람직하게는 3 시간 전 이내, 그리고 보다 바람직하게는 사용 직전에 조제된다. 조제시에는 조제하는 장소에서 통상적으로 입수 가능한 시약, 용매, 조제 기구 등을 적절히 사용할 수 있다.

따라서, 본 발명은, 본 발명의 각종 제 또는 조성물에 함유될 수 있는 활성 성분을, 단독으로 혹은 조합하여 포함하는 1 개 또는 2 개 이상의 용기를 포함하는 조성물의 조제 키트, 그리고, 그와 같은 키트의 형태로 제공되는 각종 제 또는 조성물의 필요 구성 요소에도 관한 것이다. 본 발명의 키트는, 상기 외에, 본 발명의 각종 제 또는 조성물의 조제 방법이나 투여 방법 등이 기재된 지시, 예를 들어 설명서나, CD, DVD 등의 전자 기록 매체 등을 포함하고 있어도 된다. 또, 본 발명의 키트는, 본 발명의 각종 제 또는 조성물을 완성하기 위한 구성 요소 모두를 포함하고 있어도 되지만, 반드시 모든 구성 요소를 포함하지 않아도 된다. 따라서, 본 발명의 키트는, 의료 현장이나, 실험 시설 등에서 통상적으로 입수 가능한 시약이나 용매, 예를 들어, 무균수나, 생리 식염수, 포도당 용액 등을 포함하지 않아도 된다.

본 명세서에 기재하는 본 발명의 각종 처치 방법에 있어서의 유효량이란, 예를 들어, 질환의 증상을 저감하거나, 또는 질환의 진행을 지연 혹은 정지시키는 양으로서, 바람직하게는 질환을 억제하거나 또는 치유하는 양이다. 또, 투여에 의한 이익을 초과하는 악영향이 발생되지 않는 양이 바람직하다. 이러한 양은, 배양 세포 등을 사용한 in vitro 시험이나, 마우스, 래트, 개 또는 돼지 등의 모델 동물에 있어서의 시험에 의해서 적절히 결정할 수 있고, 이와 같은 시험법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 또, 본 발명의 처치 방법에 사용하는 약물의 용량은 당업자에게 공지된 것이거나, 또는, 상기한 시험 등에 의해서 적절히 결정할 수 있다.

본 명세서에 기재하는 본 발명의 처치 방법에 있어서 투여하는 활성 성분의 구체적인 용량은, 처치를 요하는 대상에 관한 여러 가지의 조건, 예를 들어, 증상의 중독도, 대상의 일반 건강 상태, 연령, 체중, 대상의 성별, 식사, 투여의 시기 및 빈도, 병용하고 있는 의약, 치료에 대한 반응성, 제형, 및 치료에 대한 컴플리언스 등을 고려해서 결정될 수 있다.

투여 경로로는, 경구 및 비경구의 양방을 포함하는 여러 가지의 경로, 예를 들어, 경구, 정맥 내, 근육 내, 피하, 국소, 종양 내, 직장, 동맥 내, 문맥 내, 심실 내, 경점막, 경피, 비 내, 복강 내, 폐 내 및 자궁 내 등의 경로가 포함된다.

투여 빈도는 사용하는 제나 조성물의 성상이나, 상기한 것을 포함하는 대상의 조건에 따라서 상이한데, 예를 들어, 1 일 다수 회 (즉 1 일 2, 3, 4 회 또는 5 회 이상), 1 일 1 회, 수 일마다 (즉 2, 3, 4, 5, 6, 7 일마다 등), 1 주일마다. 수 주일마다 (즉 2, 3, 4 주일마다 등) 여도 된다.

본 명세서에서 사용하는 경우, 용어 「대상」은, 임의의 생물 개체를 의미하고, 바람직하게는 동물, 더욱 바람직하게는 포유 동물, 더욱 바람직하게는 인간 개체이다. 본 발명에 있어서, 대상은 건강해도 되고, 어떠한 질환에 걸려 있어도 되는 것으로 하지만, 특정 질환의 처치가 기도되는 경우에는, 전형적으로는 이러한 질환에 걸려 있거나, 걸릴 리스크를 갖는 대상을 의미한다.

또, 용어 「처치」는, 본 명세서에서 사용하는 경우, 질환의 치유, 일시적 관해 (寬解) 또는 예방 등을 목적으로 하는 의학적으로 허용되는 모든 종류의 예방적 및/또는 치료적 개입을 포함하는 것으로 한다. 예를 들어, 「처치」의 용어는, 질환의 진행의 지연 또는 정지, 병변의 퇴축 또는 소실, 발증의 예방 또는 재발의 방지 등을 포함하는, 여러 가지 목적의 의학적으로 허용되는 개입을 포함한다.

그런데, 상기 서술한 바와 같이, GST-π 를 억제하는 약물은, BRAF 유전자에 변이를 갖는 세포에 대해서 세포사 유도 및/또는 세포 증식 억제를 나타낸다. 따라서, GST-π 에 대한 억제를 지표로 하여, BRAF 유전자에 변이를 갖는 세포의 세포사 유도제 및/또는 세포 증식 억제제를 스크리닝할 수 있다. 즉, GST-π 를 억제할 수 있는 물질은, BRAF 유전자에 변이를 갖는 세포 (전형적으로는 암 세포) 의 세포사 유도제 및/또는 세포 증식 억제제의 후보 물질이 된다.

예를 들어, 암 세포의 일례로서, BRAF 유전자에 변이를 갖는 암 세포에 대해서 피검 물질을 접촉시키고, 당해 세포에 있어서의 GST-π 의 발현량을 측정한다. 피검 물질의 비존재 하에서 측정한 발현량과 비교하여, 피검 물질을 접촉시켰을 때의 발현량이 저하된 경우, 당해 피검 물질을 GST-π 를 억제하는 약물의 후보 물질로서 선택할 수 있다.

여기서, 피검 물질로는, 전혀 한정되지 않고, 어떠한 물질이어도 된다. 피검 물질로는, 단독의 물질이어도 되고, 복수의 구성 성분으로 이루어지는 혼합물이어도 된다. 피검 물질로는, 예를 들어 미생물 혹은 배양액으로부터의 추출물과 같이 미동정의 물질을 함유하는 구성이어도 되고, 이미 알려진 조성물을 소정의 조성비로 함유하는 구성이어도 된다. 또, 피검 물질로는, 단백질, 핵산, 지질, 다당류, 유기 화합물 및 무기 화합물의 어느 것이어도 된다.

실시예

이하, 실시예에 의해서 본 발명을 더욱 상세하게 설명하지만, 본 발명의 기술적 범위는 이하의 실시예에 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1]

본 실시예에서는, BRAF 유전자에 변이를 갖는 세포에 대해서 GST-π 를 억제하는 약물을 작용시켰을 때의 세포 증식 억제 효과를 검토하였다. 먼저, BRAF 유전자에 변이 (V600E) 를 갖는 암 세포로서 대장암 세포주 1 종류 (CACO-2), 멜라노마 세포주 4 종류 (A375, SK-MEL-28, A2058, Malme-3M) 를 37 ℃ 에서 5 ％ CO₂ 를 함유하는 대기 하에서 배양하였다. 사용한 배지는, CACO-2 는 MEM ＋ 20 ％, FBS ＋ 0.1 mM 및 NEAA 로 하고, A375 는 DMEM ＋ 15 ％ 및 FBS 로 하고, SK-MEL-28 은 EMEM ＋ 10 ％ 및 FBS 로 하고, A2058 은 DMEM ＋ 10 ％ 및 FBS 로 하고, Malme-3M 은 IMDM ＋ 20 ％ 및 FBS 로 하여, 모두 항생 물질을 첨가하였다.

그리고, 트랜스펙션의 전날, 각 세포를 10 ∼ 20 ％ 컨플루언트가 되도록 항생 물질을 함유하지 않는 배지를 사용하여 100 ㎜ 조직 배양 플라스틱 접시에 파종하였다. 1 ㎖ 의 Opti-MEM I 혈청 감소 배지 (GIBCO 사) 중에 GST-π siRNA (GGGAGGCAAGACCUUCAUUTT, siRNA ID#2385, Ambion 사 (배열 번호 3)) 를 600 pmol 첨가하고, 천천히 혼합하였다. 다음으로, Lipofectamine RNAi MAX (Invitrogen 사) 를 1 ㎖ 의 Opti-MEM I 혈청 감소 배지 (GIBCO 사) 중에 35 ㎕ 를 희석하고, 천천히 혼합하였다. 희석된 GST-π siRNA 와 희석된 Lipofectamine RNAi MAX 를 천천히 혼합한 후, 실온에서 10 분간 인큐베이트하였다. 그 동안, 배지를 10 ㎖ 의 Opti-MEM I 혈청 감소 배지로 교환하였다. 10 분간의 인큐베이션 후, GST-π siRNA 와 Lipofectamine RNAi MAX 의 복합체를 세포에 첨가하고, 37 ℃ 에서 5 ％ CO₂ 를 포함하는 대기 하에서 인큐베이트하였다. 5 시간의 인큐베이션 후, 10 ㎖ 의 항생 물질을 함유하지 않는 배지로 교환하였다. 배지 교환 후 1 시간 동안, PBS 로 세정하고, 0.25 ％ Trypsin-EDTA (SIGMA 사) 를 사용하여 세포를 떼어내고, 항생 물질을 함유하는 배지에 현탁하였다. 세포는 5 ㎖ 의 배지에 현탁하고, 60 ㎜ 조직 배양 플라스틱 접시에 파종하였다 (CACO-2 : 0.4 × 10⁵ 개, A375 : 1.0 × 10⁵ 개, SK-MEL-28 : 0.2 × 10⁵ 개, A2058 : 0.8 × 10⁵ 개, Malme-3M : 0.6 × 10⁵ 개).

컨트롤 실험으로서 Scramble siRNA (CGAUUCGCUAGACCGGCUUCAUUGCAG, 홋카이도 시스템 사이언스사 (배열 번호 4)), 또는 AllStars Negative Control siRNA (siControl) (QIAGEN 사) 를 사용하여 동일한 조작을 행하였다. GST-π siRNA 의 트랜스펙션 후, 0 일째와 5 일째에 각각 세포수를 계측하였다.

또, 본 실시예에서는, CACO-2 세포, A375 세포, SK-MEL-28 세포, A2058 세포 및 Malme-3M 세포에 대해서 GST-π siRNA 를 작용시켰을 때의 GST-π 의 발현을 웨스턴 블롯에 의해서 각각 확인하였다. 즉, GST-π siRNA 의 트랜스펙션 후 3 일째에 채취한 세포를 사용하여 GST-π 녹다운의 웨스턴 블롯 해석을 행하였다. 먼저, 채취된 세포를 냉 PBS 로 씻은 후, 냉 라이시스 버퍼 (lysis buffer) (1 ％ NP-40, 50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 완전한 Mini EDTA-프리 (Roche 사), PhosSTOP (Roche 사)) 를 첨가하여, 빙랭, 30 분간 인큐베이트하여 가용화하였다. 그 후, 4 ℃, 15000 rpm 으로 15 분간 원심 분리를 행하여, 세포 추출액을 얻었다. 얻어진 세포 추출액에 대해서, Micro BCA Protein Assay Kit (Thermo SCIENTIFIC 사) 를 사용하여 단백의 정량을 행하였다. 다음으로, 20 ㎍ 의 세포 추출액을 환원 조건 하에서 변성시키고, 멀티 겔 Ⅱ 미니 4/20 (13 w) (코스모바이오사) 을 사용하여, SDS-PAGE 를 행하고, 단백질을 분리하였다. SDS-PAGE 종료 후, 탱크식 블롯팅 장치를 사용하여, PVDF 막에 전사하였다. 전사막을 5 ％ 스킴 밀크/0.05 ％ Tween20 첨가 PBS (PBS-T 로 약기함) 로 4 ℃, 16 시간 동안 인큐베이트하여 블로킹을 행하였다. 계속해서, 멤브레인 블로킹 용액 (membrane blocking Solution) (Invitrogen 사) 으로 희석한 항 GST-π 항체 (MBL 사) 와 4 ℃ 에서 16 시간 반응시켰다. 2 차 항체 반응은 서양 와사비 퍼옥시다아제 (HRP) 표지한 토끼 항체를 사용하여 실온에서 1 시간 행하였다. 밴드의 시그널 검출은 ECL Western Blocking Detection Reagents (GE Healthcare 사) 를 사용한 화학 발광법에 의해서 X 선 필름 상에서 행하였다. 각 조작 동안의 세정은, PBS-T 를 사용하여 5 분간의 진탕을 4 회 행하였다.

대장암 세포주에 관한 결과를 도 1 에 나타내고, 멜라노마 세포주에 관한 결과를 도 2 에 나타낸다. 또한, 도 1 및 2 에는 세포수를 측정한 결과와 웨스턴 블롯에 의한 해석 결과를 함께 나타내고 있다. 도 1 및 2 에 나타내는 바와 같이, 대장암 세포주 및 멜라노마 세포주 모두, BRAF 유전자에 변이를 갖는 암 세포에 있어서는, GST-π 를 억제하는 약제인 GST-π siRNA 에 의해서 GST-π 녹다운에 의해서 세포 증식능이 현저하게 억제되었다. BRAF 유전자에 있어서의 변이는 악성도가 높은 종양에서 확인되었고, 대장암에서는 절제 불능 대장암에 있어서의 예후 불량 인자로서 알려져 있다. 멜라노마의 환자의 절반수는 BRAF 유전자에 변이를 갖고 있어, 전이능이 높을 경우, 치사율·악성도가 가장 높다. 본 실시예의 결과로부터, 이와 같은 BRAF 유전자에 변이를 갖는 암에 대해서, GST-π 를 억제하는 약제가 세포 증식 억제에 효과가 있는 것이 시사된 점에서, 이들 난치성 암의 신규 치료법으로 이어질 것이 기대된다.

[실시예 2]

본 실시예에서는, BRAF 유전자에 변이를 갖는 세포에 대해서 GST-π 를 억제하는 약물 및 BRAF 저해제를 작용시켰을 때의 세포 증식 억제 효과를 검토하였다.

먼저, 실시예 1 과 동일하게 하여 대장암 세포주 1 종류 (CACO-2) 및 멜라노마 세포주 2 종류 (SK-MEL-28 및 A2058) 를 각각 배양하고, 트랜스펙션의 전날, 10 ∼ 20 ％ 컨플루언트가 되도록 항생 물질을 함유하지 않는 배지를 사용하여 100 ㎜ 조직 배양 플라스틱 접시에 파종하였다. 1 ㎖ 의 Opti-MEM I 혈청 감소 배지 (GIBCO 사) 중에 GST-π siRNA (GGGAGGCAAGACCUUCAUUTT, siRNA ID#2385, Ambion 사 (배열 번호 3)) 를 600 pmol 첨가하고, 천천히 혼합하였다. 다음으로, Lipofectamine RNAi MAX (Invitrogen 사) 를 1 ㎖ 의 Opti-MEM I 혈청 감소 배지 (GIBCO 사) 중에 35 ㎕ 를 희석하고, 천천히 혼합하였다. 희석된 GST-π siRNA 와 희석된 Lipofectamine RNAi MAX 를 천천히 혼합한 후, 실온에서 10 분간 인큐베이트하였다. 그 동안, 배지를 10 ㎖ 의 Opti-MEM I 혈청 감소 배지로 교환하였다. 10 분간의 인큐베이션 후, GST-π siRNA 와 Lipofectamine RNAi MAX 의 복합체를 세포에 첨가하고, 37 ℃ 에서 5 ％ CO₂ 를 함유하는 대기 하에서 인큐베이트하였다. 5 시간의 인큐베이션 후, 10 ㎖ 의 항생 물질을 함유하지 않는 배지로 교환하였다. 배지 교환 후 1 시간 동안, PBS 로 세정하고, 0.25 ％ Trypsin-EDTA (SIGMA 사) 를 사용하여 세포를 떼어내고, 항생 물질을 함유하는 배지에 현탁하였다. 세포는 5 ㎖ 의 배지에 현탁하고, 60 ㎜ 조직 배양 플라스틱 접시에 파종하였다 (CACO-2 : 0.4 × 10⁵ 개, SK-MEL-28 : 0.2 × 10⁵ 개 및 A2058 : 0.2 × 10⁵ 개). 컨트롤 실험으로서, AllStars Negative Control siRNA (siControl) (QIAGEN 사) 를 사용하여 동일한 조작을 행하였다. 트랜스펙션 후 1 일째부터, BRAF 저해제인 PLX4720 (Selleck 사) 를, CACO-2 에 대해서는 40 μM, SK-MEL-28 에 대해서는 0.7 μM, 및 A2058 에 대해서는 10 μM 가 되도록 배지 중에 첨가하여 5 일째까지 배양하였다. PLX4720 처리의 컨트롤은 용매의 DMSO (와코 순약) 를 첨가하여 배양하였다. 성장 어세이 (Growth assay) 는 트랜스펙션 후 0 일째부터 5 일째까지의 세포수를 계측함으로써 행하였다.

CACO-2 에 대해서 세포수를 계측한 결과를 도 3 에 나타내고, SK-MEL-28 및 A2058 에 대해서 세포수를 계측한 결과를 도 4 에 나타낸다. 도 3 으로부터 알 수 있는 바와 같이, GST-π siRNA 를 단독으로 대장암 세포주 (BRAF 유전자에 변이를 갖는 CACO-2 주) 에 작용시킨 경우, PLX4720 을 siControl 과 함께 당해 대장암 세포주에 작용시킨 경우와 비교하여, 이들 GST-π siRNA 및 PLX4720 을 병용하여 동 세포주에 작용시킨 경우에는 세포 증식 억제 효과가 현저한 것이 나타났다. 또, 도 4 로부터 알 수 있는 바와 같이, GST-π siRNA 를 단독으로 멜라노마 세포주 (BRAF 유전자에 변이를 갖는 SK-MEL-28 및 A2058) 에 작용시킨 경우, PLX4720 을 siControl 과 함께 당해 멜라노마 세포주에 작용시킨 경우와 비교하여, 이들 GST-π siRNA 및 PLX4720 을 병용하여 동 세포주에 작용시킨 경우에는 세포 증식 억제 효과가 현저한 것이 나타났다.

[실시예 3]

본 실시예에서는, BRAF 유전자에 변이를 갖는 세포로서 BRAF 저해제에 내성을 갖는 세포 (BRAF 저해제 내성 세포) 에 대해서 GST-π 를 억제하는 약물을 작용시켰을 때의 세포 증식 억제 효과를 검토하였다.

＜세포수 측정＞

본 실시예에서 사용한 BRAF 저해제 내성 세포는 이하와 같이 제작하였다. 실시예 1 에서 사용한 멜라노마 세포주 A375 를 1 ∼ 5 μM 의 PLX4720 (Selleck 사) 를 첨가한 항생 물질과 15 ％ FBS 를 함유하는 DMEM 배지에서, 37 ℃ 에서 5 ％ CO₂ 를 함유하는 대기 하에서 1 개월간 인큐베이트하였다. 1 개월간의 인큐베이트 후에 생존하는 세포주를 PLX4720 내성 A375 세포로서 본 실시예에 사용하였다.

본 실시예에서는, 트랜스펙션의 전날, PLX4720 내성 A375 세포를 0.5 × 10⁶ 개/10 ㎖ 가 되도록 항생 물질을 함유하지 않는 15 ％ FBS 함유 DMEM 배지를 사용하여 100 ㎜ 조직 배양 플라스틱 접시에 파종하였다. 1 ㎖ 의 Opti-MEM I 혈청 감소 배지 (GIBCO 사) 중에 GST-π siRNA (GGGAGGCAAGACCUUCAUUTT, siRNA ID#2385, Ambion 사 (배열 번호 3)) 를 600 pmol 첨가하고, 천천히 혼합하였다. 다음으로, Lipofectamine RNAi MAX (Invitrogen 사) 를 1 ㎖ 의 Opti-MEM I 혈청 감소 배지 (GIBCO 사) 중에 35 ㎕ 를 희석하고, 천천히 혼합하였다. 희석된 GST-π siRNA 와 희석된 Lipofectamine RNAi MAX 를 천천히 혼합한 후, 실온에서 10 분간 인큐베이트하였다. 그 동안, 배지를 10 ㎖ 의 Opti-MEM I 혈청 감소 배지로 교환하였다. 10 분간의 인큐베이션 후, GST-π siRNA 와 Lipofectamine RNAi MAX 의 복합체를 세포에 첨가하고, 37 ℃ 에서 5 ％ CO₂ 를 함유하는 대기 하에서 인큐베이트하였다. 5 시간의 인큐베이션 후, 10 ㎖ 의 항생 물질을 함유하지 않는 15 ％ FBS 함유 DMEM 배지로 교환하였다. 배지 교환 후 2 시간 동안, PBS 에 의한 세정 후, 0.5 ％ Trypsin-EDTA (SIGMA 사) 를 사용하여 세포를 떼어내고, 항생 물질과 15 ％ FBS 를 함유하는 DMEM 배지에 현탁하였다. 현탁액 중의 세포는 1.0 × 10⁵ 개/5 ㎖ 가 되도록 60 ㎜ 조직 배양 플라스틱 접시에 파종하였다. 컨트롤 실험으로서 Scramble siRNA (CGAUUCGCUAGACCGGCUUCAUUGCAG, 홋카이도 시스템 사이언스사 (배열 번호 4)), 혹은 AllStars Negative Control siRNA (QIAGEN 사) 를 사용하여 동일한 조작을 행하였다. GST-π siRNA 의 트랜스펙션 후 각각 0, 1, 2, 3, 4, 5 일째에 세포수를 계측하였다.

＜GST-π 발현 확인＞

상기 서술한 바와 같이, PLX4720 내성 A375 세포에 대해서 GST-π siRNA 를 작용시켰을 때의 GST-π 의 발현을 웨스턴 블롯에 의해서 확인하였다. 즉, GST-π siRNA 의 트랜스펙션 후의 상기 각 시점에서 채취한 세포를 사용하여 GST-π 녹다운의 웨스턴 블롯 해석을 행하였다.

먼저, 채취된 세포를 냉 PBS 로 씻은 후, 냉 라이시스 버퍼 (lysis buffer) (1 ％ NP-40, 50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 완전한 Mini EDTA-프리 (Roche 사), PhosSTOP (Roche 사)) 를 첨가하여, 빙랭, 30 분간 인큐베이트하여 가용화하였다. 4 ℃, 15000 rpm 으로 15 분간 원심 분리를 행하여, 세포 추출액을 얻었다. 얻어진 세포 추출액에 대해서, Micro BCA Protein Assay Kit (Thermo SCIENTIFIC 사) 를 사용하여 단백의 정량을 행하였다. 다음으로, 20 ㎍ 의 세포 추출액을 환원 조건 하에서 변성시키고, 멀티 겔 Ⅱ 미니 4/20 (13 w) (코스모바이오사) 을 사용하여, SDS-PAGE 를 행하고, 단백질을 분리하였다. SDS-PAGE 종료 후, 탱크식 블롯팅 장치를 사용하여, PVDF 막에 전사하였다. 전사막을 5 ％ 스킴 밀크/0.05 ％ Tween20 첨가 PBS (PBS-T 로 약기함) 로 4 ℃, 16 시간 동안에 인큐베이트하여 블로킹을 행하였다. 계속해서, 멤브레인 블로킹 용액 (Membrane blocking Solution) (Invitrogen 사) 으로 희석된 항 GST-π 항체 (MBL 사) 와 4 ℃ 에서 16 시간 반응시켰다. 2 차 항체 반응은 서양 와사비 퍼옥시다아제 (HRP) 표지한 토끼 항체를 사용하여 실온에서 1 시간 행하였다. 밴드의 시그널 검출은 ECL Western Blocking Detection Reagents (GE Healthcare 사) 를 사용한 화학 발광법에 의해서 X 선 필름 상에서 행하였다. 각 조작 동안의 세정은, PBS-T 를 사용하여 5 분간의 진탕을 4 회 행하였다.

＜결과＞

최근, BRAF 저해제 내성을 획득한 멜라노마 세포주가 멜라노마의 재발에 관여하는 것을 알 수 있었다. 그래서, GST-π 가 BRAF 저해제 내성 멜라노마의 CRAF 의존성을 촉진하고 있는지의 여부를 조사하기 위해서, PLX4720 내성 A375 로 GST-π 를 녹다운하였다. 세포 증식을 측정한 결과, 현저한 증식 억제 효과가 확인정되었다 (도 5). GST-π 녹다운을 확인한 결과, 2 일째와 3 일째에 GST-π 발현이 억제되어 있었다 (도 6).

본 실시예에 의해서, BRAF 유전자에 변이를 갖는 세포로서 BRAF 저해제에 내성을 갖는 세포 (BRAF 저해제 내성 세포) 의 증식을 효과적으로 억제할 수 있는 것이 나타났다. 이 결과로부터. BRAF 저해제 내성 세포가 하나의 요인이 되는 질환, 예를 들어 멜라노마의 재발을 방지할 수 있거나 혹은 저감할 수 있는 등의 효과를 기대할 수 있다.

본 명세서에서 인용한 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 그대로 인용에 의해서 본 명세서에 받아들이는 것으로 한다.

SEQUENCE LISTING <110> NITTO DENKO CORPORATION <120> Cell death-inducing agent for a cell having mutated BRAF gene, Cell proliferation-inhibiting agent, and a pharmaceutical composition for treatment of disease resulting from cell proliferative abnormality <130> PH-6539-PCT <150> JP 2015-084286 <151> 2015-04-16 <150> JP 2016-078710 <151> 2016-04-11 <160> 4 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 986 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (250)..(882) <400> 1 tgggaaagag ggaaaggctt ccccggccag ctgcgcggcg actccgggga ctccagggcg 60 cccctctgcg gccgacgccc ggggtgcagc ggccgccggg gctggggccg gcgggagtcc 120 gcgggaccct ccagaagagc ggccggcgcc gtgactcagc actggggcgg agcggggcgg 180 gaccaccctt ataaggctcg gaggccgcga ggccttcgct ggagtttcgc cgccgcagtc 240 ttcgccacc atg ccg ccc tac acc gtg gtc tat ttc cca gtt cga ggc cgc 291 Met Pro Pro Tyr Thr Val Val Tyr Phe Pro Val Arg Gly Arg 1 5 10 tgc gcg gcc ctg cgc atg ctg ctg gca gat cag ggc cag agc tgg aag 339 Cys Ala Ala Leu Arg Met Leu Leu Ala Asp Gln Gly Gln Ser Trp Lys 15 20 25 30 gag gag gtg gtg acc gtg gag acg tgg cag gag ggc tca ctc aaa gcc 387 Glu Glu Val Val Thr Val Glu Thr Trp Gln Glu Gly Ser Leu Lys Ala 35 40 45 tcc tgc cta tac ggg cag ctc ccc aag ttc cag gac gga gac ctc acc 435 Ser Cys Leu Tyr Gly Gln Leu Pro Lys Phe Gln Asp Gly Asp Leu Thr 50 55 60 ctg tac cag tcc aat acc atc ctg cgt cac ctg ggc cgc acc ctt ggg 483 Leu Tyr Gln Ser Asn Thr Ile Leu Arg His Leu Gly Arg Thr Leu Gly 65 70 75 ctc tat ggg aag gac cag cag gag gca gcc ctg gtg gac atg gtg aat 531 Leu Tyr Gly Lys Asp Gln Gln Glu Ala Ala Leu Val Asp Met Val Asn 80 85 90 gac ggc gtg gag gac ctc cgc tgc aaa tac atc tcc ctc atc tac acc 579 Asp Gly Val Glu Asp Leu Arg Cys Lys Tyr Ile Ser Leu Ile Tyr Thr 95 100 105 110 aac tat gag gcg ggc aag gat gac tat gtg aag gca ctg ccc ggg caa 627 Asn Tyr Glu Ala Gly Lys Asp Asp Tyr Val Lys Ala Leu Pro Gly Gln 115 120 125 ctg aag cct ttt gag acc ctg ctg tcc cag aac cag gga ggc aag acc 675 Leu Lys Pro Phe Glu Thr Leu Leu Ser Gln Asn Gln Gly Gly Lys Thr 130 135 140 ttc att gtg gga gac cag atc tcc ttc gct gac tac aac ctg ctg gac 723 Phe Ile Val Gly Asp Gln Ile Ser Phe Ala Asp Tyr Asn Leu Leu Asp 145 150 155 ttg ctg ctg atc cat gag gtc cta gcc cct ggc tgc ctg gat gcg ttc 771 Leu Leu Leu Ile His Glu Val Leu Ala Pro Gly Cys Leu Asp Ala Phe 160 165 170 ccc ctg ctc tca gca tat gtg ggg cgc ctc agt gcc cgg ccc aag ctc 819 Pro Leu Leu Ser Ala Tyr Val Gly Arg Leu Ser Ala Arg Pro Lys Leu 175 180 185 190 aag gcc ttc ctg gcc tcc cct gag tac gtg aac ctc ccc atc aat ggc 867 Lys Ala Phe Leu Ala Ser Pro Glu Tyr Val Asn Leu Pro Ile Asn Gly 195 200 205 aac ggg aaa cag tga gggttggggg gactctgagc gggaggcaga gtttgccttc 922 Asn Gly Lys Gln 210 ctttctccag gaccaataaa atttctaaga gagctaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 982 aaaa 986 <210> 2 <211> 210 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Pro Pro Tyr Thr Val Val Tyr Phe Pro Val Arg Gly Arg Cys Ala 1 5 10 15 Ala Leu Arg Met Leu Leu Ala Asp Gln Gly Gln Ser Trp Lys Glu Glu 20 25 30 Val Val Thr Val Glu Thr Trp Gln Glu Gly Ser Leu Lys Ala Ser Cys 35 40 45 Leu Tyr Gly Gln Leu Pro Lys Phe Gln Asp Gly Asp Leu Thr Leu Tyr 50 55 60 Gln Ser Asn Thr Ile Leu Arg His Leu Gly Arg Thr Leu Gly Leu Tyr 65 70 75 80 Gly Lys Asp Gln Gln Glu Ala Ala Leu Val Asp Met Val Asn Asp Gly 85 90 95 Val Glu Asp Leu Arg Cys Lys Tyr Ile Ser Leu Ile Tyr Thr Asn Tyr 100 105 110 Glu Ala Gly Lys Asp Asp Tyr Val Lys Ala Leu Pro Gly Gln Leu Lys 115 120 125 Pro Phe Glu Thr Leu Leu Ser Gln Asn Gln Gly Gly Lys Thr Phe Ile 130 135 140 Val Gly Asp Gln Ile Ser Phe Ala Asp Tyr Asn Leu Leu Asp Leu Leu 145 150 155 160 Leu Ile His Glu Val Leu Ala Pro Gly Cys Leu Asp Ala Phe Pro Leu 165 170 175 Leu Ser Ala Tyr Val Gly Arg Leu Ser Ala Arg Pro Lys Leu Lys Ala 180 185 190 Phe Leu Ala Ser Pro Glu Tyr Val Asn Leu Pro Ile Asn Gly Asn Gly 195 200 205 Lys Gln 210 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthesize RNA <400> 3 gggaggcaag accuucauut t 21 <210> 4 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthesize RNA <400> 4 cgauucgcua gaccggcuuc auugcag 27

Claims

GST-π 를 억제하는 약물을 유효 성분으로서 함유하는, BRAF 유전자에 변이를 갖는 세포의 세포사 유도제.
GST-π 를 억제하는 약물을 유효 성분으로서 함유하는, BRAF 유전자에 변이를 갖는 세포의 세포 증식 억제제.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
상기 변이는 V600E 변이인 것을 특징으로 하는 제.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
상기 BRAF 유전자에 변이를 갖는 세포는 BRAF 저해제에 대한 내성을 갖는 세포인 것을 특징으로 하는 제.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
상기 약물이 RNAi 분자, 리보자임, 안티센스 핵산, DNA/RNA 키메라 폴리뉴클레오티드 및 이것들 중 적어도 1 종을 발현하는 벡터로 이루어지는 군에서 선택되는 물질인 것을 특징으로 하는 제.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
상기 BRAF 유전자에 변이를 갖는 세포가 GST-π 를 고발현하는 암 세포인 것을 특징으로 하는 제.
제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 기재된 제를 함유하는, BRAF 유전자에 변이를 갖는 세포의 증식 이상에서 기인하는 질환의 치료용 의약 조성물.
제 7 항에 있어서,
상기 질환이 암인 것을 특징으로 하는 의약 조성물.
제 8 항에 있어서,
상기 암은 GST-π 를 고발현하는 암인 것을 특징으로 하는 의약 조성물.
제 8 항에 있어서,
상기 암은 대장암 또는 멜라노마인 것을 특징으로 하는 의약 조성물.
GST-π 를 억제하는 약물을 선택하는 것을 포함하는, BRAF 유전자에 변이를 갖는 세포의 세포사 유도제 및/또는 세포 증식 억제제의 스크리닝 방법.
제 11 항에 있어서,
암 세포에 대해서 피검 물질을 접촉시키는 공정과, 상기 세포에 있어서의 GST-π 의 발현량을 측정하는 공정과, 피검 물질의 비존재 하에 있어서 측정한 경우와 비교하여, 당해 발현량이 저하된 경우에 상기 GST-π 를 억제하는 약물로서 선택하는 공정을 포함하는 스크리닝 방법.