CN108088990B - 用于蛋白微阵列检测的多效性细胞蛋白提取液及制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及蛋白微阵列检测试剂，公开了一种用于蛋白微阵列检测的多效性细胞蛋白提取液，包括十二烷基硫酸钠、二硫苏糖醇、Tris缓冲液系统、二甲亚砜、亚精胺、氯化钠、氯化镁以及蛋白酶抑制剂，此外还公开了上述用于蛋白微阵列检测的多效性细胞蛋白提取液的制备方法。本发明的优点在于，解决了目前市场上已经有的商用裂解液/蛋白提取液通用性较差，价格高昂，效果不佳，和真实数据偏差较大，相关性不高的问题，具有较高的应用价值。

Description

用于蛋白微阵列检测的多效性细胞蛋白提取液及制备方法
技术领域
本发明涉及蛋白微阵列检测试剂，特别涉及一种用于蛋白微阵列检测的多效性细胞蛋白提取液以及该提取液的制备方法。
背景技术
反相蛋白微阵列技术从出现以来一直不断在进行技术更新，在硬件及分析技术不断提升的同时，其样本处理方法及技术流程并没有实质性的改变。反相蛋白微阵列技术主要的流程是将从细胞来源的蛋白提取物通过微量打印的方式制备在平面基质上来进行基于免疫反应的检测。在此领域，平面基质材料的选取多为SiO2材质，因不同方法采用的表面修饰不同，不同工作环境需要特殊的溶液系统进行匹配。一类是基于硝酸纤维膜的芯片，另一类是基于SAM单分子层的芯片。两种表面修饰都通过非共价键结合(疏水结合，亲水结合，二硫键，氢键或范德华力)来达到吸附蛋白的目的。基于硝酸纤维膜芯片吸附蛋白的技术方法上，一般采用两种细胞蛋白提取液配方进行蛋白提取及蛋白定量检测。一种是以非离子型表面活性剂Triton X-100或离子型表面活性剂SDS为基础的细胞裂解及蛋白水溶解系统。另一类是基于商用的Qproteome EXB Plus裂解缓冲液系统(QIAGEN)。在基于SAM单分子层技术的芯片系统上，目前主要采用PWG技术进行检测，其运用的细胞裂解液方法是基于高浓度尿素的裂解缓冲液系统。上述裂解液的问题在于其通用性较差，需要根据不同的应用环境选择不同的溶液系统。且裂解液配置费用高昂，使用成本高。此外，在将使用上述商用裂解液CLB1(Zeptosens)得到的蛋白应用于一系列平行试验确认，上述商用裂解液和真实数据之间存在一定差异，影响了实验效果。
发明内容
本发明针对现有商用裂解液通用性不高的缺点，提供了一种用于蛋白微阵列检测的多效性细胞蛋白提取液以及其制备方法。
为实现上述目的，本发明可采取下述技术方案：
一种用于蛋白微阵列检测的多效性细胞蛋白提取液，包括十二烷基硫酸钠、二硫苏糖醇、Tris缓冲液系统、二甲亚砜、亚精胺、氯化钠、氯化镁以及蛋白酶抑制剂。
进一步地，在本申请的实施例中，作为一种可选的方案，还包括磷酸酶抑制剂。
进一步地，在本申请的实施例中，作为一种可选的方案，所述十二烷基硫酸钠的质量比占全部细胞蛋白提取液的总质量的0.1-5％。
进一步地，在本申请的实施例中，作为一种可选的方案，所述二硫苏糖醇的摩尔质量比为0.01-1M。
进一步地，在本申请的实施例中，作为一种可选的方案，Tris缓冲液系统的摩尔质量比为0.01-1M。
进一步地，在本申请的实施例中，作为一种可选的方案，所述二甲亚砜的质量比占全部细胞蛋白提取液的总质量的1-10％。
进一步地，在本申请的实施例中，作为一种可选的方案，所述亚精胺的质量比占全部细胞蛋白提取液的总质量的1-5％。
进一步地，在本申请的实施例中，作为一种可选的方案，所述氯化钠的摩尔质量比为10-100mM。
进一步地，在本申请的实施例中，作为一种可选的方案，所述氯化镁的摩尔质量比为0.1-10mM。
进一步地，在本申请的实施例中，作为一种可选的方案，所述十二烷基硫酸钠是指包含十二烷基硫酸钠的裂解液系统。
一种用于蛋白微阵列检测的多效性细胞蛋白提取液的制备方法，在包含十二烷基硫酸钠的溶液中加入定量的二硫苏糖醇以及Tris缓冲液系统；在上述混合溶液中加入定量的二甲亚砜、亚精胺、氯化钠、氯化镁以及蛋白酶抑制剂；将上述混合溶液过滤或者零下低温冻存。
进一步地，在本申请的实施例中，作为一种可选的方案，在上述的混合溶液中先加入磷酸酶抑制剂后过滤且零下20度低温冻存。
现有的基于SAM单分子层的反相蛋白微阵列技术所采用的裂解液系统价格昂贵(50毫升需2500人民币左右)，制约了其潜在的应用推广，而其存在的问题不仅仅于此，我们通过实验证实，证实了商用裂解液对实验结果产生的影响，导致结果的偏倚。例如，在进行一些细胞蛋白磷酸化水平分析的过程中，我们运用自行开发的裂解液系统进行的针对体外培养细胞LNCaP(前列腺癌)进行处理，在加入人表皮生长因子受体调节蛋白HRG后通过时间序列上分析我们发现在HRG加入15分钟后，HER3络氨酸1289位点磷酸化水平显著提高，这在蛋白免疫印迹上也得到证实，而在同样实验条件下运用商用裂解液进行处理并没有显著变化，如图6所示，其中，A为使用下述实施例1记载组分制备的蛋白提取液/裂解液得到的实验结果，B为上述基于SAM单分子层的反相蛋白微阵列技术所采用的商用裂解液系统得到的结果。
在同样的条件下我们还分析了Akt信号通路下游蛋白S6激酶丝氨酸位点235/236的变化，并通过调整样本起始浓度在0.2毫克/毫升,0.1毫克/毫升,0.05毫克/毫升均可得到可靠的相似数据，相关度达到0.95以上。并于蛋白免疫印迹得到的结果一致，如图6所示。而在平行试验中我们使用了商用裂解液进行同样实验，其得到的结果与使用现有的蛋白免疫印迹法得到的结果不一致。并且其浓度梯度上的相关性也不理想。如图7所示，为芯片结果与蛋白免疫印迹的对比，1-15列为同一批样本三种不同起始浓度的时间序列上的变化(0，5,15,30,60分钟HRG处理)。
目前基于平面玻璃基质芯片的反相蛋白微阵列技术主要通过利用高浓度尿素裂解细胞进行蛋白提取，并将样本以高密度阵列形式制备在平面芯片载体上进行分析。高浓度尿素本身对抗原抗体亲和反应会产生一定影响，并且会在一定程度上妨碍抗体本身的工作理化性质，因此造成如上述例子所呈现的结果偏倚，大大影响实验结果。在未来的基于反相芯片的检测技术开发上，会产生不可避免的技术瓶颈。我们通过大量研究及验证，开发了此套裂解液系统，有效地进行细胞及组织的裂解并有效提取蛋白(包括膜蛋白，胞浆蛋白以及核蛋白)，并且开发了相应的操作流程。配合蛋白提取液的定量操作及后续碱性磷酸酶处理反应。此反应主要配合进行抗体工作效率的实时监控及磷酸化抗体特异性验证。并可配合反相蛋白微阵列操作流程，保证实验的匹配性。此系统亦可适用于SDS-PAGE凝胶电泳法进行各类蛋白检测，包括蛋白免疫印迹法及各类蛋白染色法。大大提高了不同实验方法间数据可对比性，并简化操作，易于推广。
目前众多的研究方法中，对磷酸化抗体的验证主要依靠体外细胞学实验对培养细胞进行处理，例如加入生长因子，或相应的靶向药物拮抗剂，如在受体络氨酸激酶表皮生长因子受体(EGFR)的磷酸化研究中，加入各类广谱或特异性激酶抑制剂(TKI)，并通过传统的蛋白免疫印迹法来判断抗体是否能特异性结合磷酸化靶点。通过了第一阶段的验证，研究者再通过反向蛋白微阵列来进行验证，已确保抗体的适用性。此类方法最大的一个缺点是必须找到针对每一种磷酸化位点适用的拮抗剂或激动剂来达到抑制或激发磷酸化的效果。并且实验周期长消耗大，方法不统一，不大适用于各类实验室之间的评估。另外这类方法仅仅只能在一种或几种细胞内进行同时验证，并且不适用于组织来源样本的抗体特异性检测(组织来源样本无法在体外处理进行激活和抑制)。因此限制了同一种抗体适用范围。研究者们也提出了利用碱性磷酸酶来处理样本，并比对抗体对处理前后同一样本的效果，但目前还未有文献记录记载此方法的可操作性，其主要原因是蛋白裂解液的组成很难同时达到有效提取蛋白，包括膜蛋白，胞浆蛋白及核蛋白(其中包括组蛋白等)，并同时满足蛋白定量及后续碱性磷酸酶反应。也很难适合再将处理过的样本制备于反相蛋白微阵列上进行一系列基于抗原抗体的免疫反应。目前在市面上还未有此类试剂可以通过将所有实验步骤整合来达到在反相蛋白微阵列上筛选特异性磷酸化抗体的目的。而我们开发的这套系统，将裂解液，蛋白提取缓冲液，蛋白定量，碱性磷酸酶反应，及蛋白微阵列制备及检测整合在一起，不仅突破了此类分析的瓶颈，简化了实验步骤，同时提高了实验结果的重复性及保真性，为高通量蛋白组学分析研究及应用提供了便利。
本发明具有以下的显著技术效果：
通用性较强，可以适用于不同的细胞来源，包括体外培养细胞，新鲜组织样本，石蜡样本的蛋白提取，各种细胞内蛋白的提取，提取效率高。价格相对廉价，制备方便快捷，制备成本较为低廉。
附图说明
图1为蛋白免疫印迹法分析蛋白提取物的实验结果图。
图2为应用蛋白免疫印迹法以及考马氏亮蓝染色法检测石蜡组织样本蛋白提取结果的实验结果图。
图3为磷酸化处理后效果对比图。
图4为商用裂解液及自制裂解液在实验效果上的对比图。
图5为用碱性磷酸酶处理组织提取液样本并与未处理样本进行对比的实验结果图。
图6为商用裂解液及自制裂解液在数据真实性上的平行验证比对图。
图7为检测结果和蛋白免疫印迹法的比对图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。
实施例1
一种用于蛋白微阵列检测的多效性细胞蛋白提取液，适用于各种细胞来源的蛋白提取液/裂解液，可同时适用于体外培养细胞，新鲜组织样本，石蜡样本的蛋白提取，还可以适用于其它多种细胞来源，具体组分包括十二烷基硫酸钠SDS、二硫苏糖醇DTT、Tris缓冲液系统、二甲亚砜DMOS、亚精胺、氯化钠、氯化镁以及蛋白酶抑制剂，这些组分通过溶解于适量的溶剂，例如符合实验要求的水中得到，此外，上述的部分或者全部的组分可以通过自行制备得到，也可以通过在市场上购买得到，但应当保证其具有符合要求的纯度，尽可能避免其它杂质的掺入。组分的添加顺序无特殊要求，或者作为一种优选方案，按照以下实施例2记载的步骤进行制备。
进一步地，作为一种可选的方案，还包括磷酸酶抑制剂。本申请中记载的磷酸酶抑制剂以及蛋白抑制剂分别为市场上购买得到的罗氏蛋白抑制剂以及罗氏磷酸酶抑制剂，其中，本申请的实施例中使用的蛋白抑制剂的型号为(Roche cOmplete Tablets EDTA-free04693132001)，实施例中使用的磷酸酶抑制剂的型号为(Roche PhosStop Tablets4906845001)。
进一步地，作为一种可选的方案，所述十二烷基硫酸钠的质量比占全部细胞蛋白提取液的总质量的0.1-5％。
进一步地，作为一种可选的方案，所述二硫苏糖醇的摩尔质量比为0.01-1M。
进一步地，作为一种可选的方案，Tris缓冲液系统的摩尔质量比为0.01-1M。该缓冲液系统是指主要成分为三羟甲基氨基甲烷(TRIS)的缓冲液缓冲体系。通常可以自行调配得到，调配后的Tris缓冲液系统的pH值应当符合实验要求，在满足组分摩尔质量比的要求下，不会对蛋白提取液中的其它组分的效果造成影响。
进一步地，作为一种可选的方案，所述二甲亚砜的质量比占全部细胞蛋白提取液的总质量的1-10％。
进一步地，作为一种可选的方案，所述亚精胺的质量比占全部细胞蛋白提取液的总质量的1-5％。
进一步地，作为一种可选的方案，所述氯化钠的摩尔质量比为10-100mM。
进一步地，作为一种可选的方案，所述氯化镁的摩尔质量比为0.1-10mM。
进一步地，作为一种可选的方案，所述十二烷基硫酸钠是指包含十二烷基硫酸钠的裂解液系统。所述裂解液系统可以通过在市场上购买得到，在实施例中使用的裂解液系统的市售型号为CLB1(Zeptosens)，通常还包括有其它的一些组分。在使用时，满足十二烷基硫酸钠的比例需求，即可以达到最低限度的使用要求。购买的裂解液系统中其它组分一般不对本申请的蛋白提取液的效果造成干扰。需要指出的是，购买的裂解液中可能含有本实施例中记载的其它成分，这些其它成分应当被计算到本实施例记载的组分总含量中予以考虑。
其中，蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂(1片/10毫升)的用量均为适量，可以根据需要进行适量调整，通常其质量比大于溶液的总质量的0.001％即可，一般使用量为市售试剂的最小计量单位即可。
实施例2
一种用于蛋白微阵列检测的多效性细胞蛋白提取液的制备方法，可以在上述实施例1的基础上进一步提高混合液的稳定性以及提取效果，具体步骤为：在包含十二烷基硫酸钠的溶液中加入定量的二硫苏糖醇以及Tris缓冲液系统；在上述混合溶液中加入定量的二甲亚砜、亚精胺、氯化钠、氯化镁以及蛋白酶抑制剂；将上述混合溶液过滤或者零下低温冻存。进一步地，作为一种可选的方案，在上述的混合溶液中先加入磷酸酶抑制剂后过滤或者零下低温冻存。
验证例
按照上述实施例1、2的配比和制备方法制备定量的细胞蛋白提取液，具体比例为：
0.1％十二烷基硫酸钠、0.05M二硫苏糖醇、0.05M的Tris缓冲液系统、2％二甲亚砜、2％亚精胺、15mM氯化钠、3mM氯化镁以及0.003％蛋白酶抑制剂。
将上述制备得到的蛋白提取液分别应用于细胞提取，并通过蛋白免疫印迹分析进行检测。图1由左至右依次为针对疏水性强的细胞膜蛋白(EGFR，HER2)以及核蛋白(图1中使用的是组蛋白HistoneH3)进行的蛋白提取，其提取的方法使用现有的步骤。可以看到印迹清晰，说明提取效果良好。
此外，还将上述制备得到的蛋白提取液应用于组织样本蛋白进行验证。具体步骤包括：从少量的组织样本中(一片常规组织样本：厚度约为4微米，覆盖面积约为1平方厘米)提取蛋白，并将蛋白浓度稳定在1-3微克每微升浓度，适合进行下游芯片分析检测，图2分别为通过蛋白免疫印迹(左图，使用GAPDH作为蛋白内参)以及考马式亮蓝染色法(右图)检测由组织样本中提取的蛋白的结果，其具体的提取步骤均使用现有步骤，可以看到蛋白保存完整。说明上述蛋白提取液可以适用于不同的分析检测方法，适用性较好。
进一步地，我们将使用下述三种蛋白提取液由上述组织样本中提取的蛋白进行了碱性磷酸酶处理，并将处理与未处理样本同时制备在芯片上，通过比对不同蛋白提取液的工作效率，我们确定了基于我们所开发的蛋白提取液具有在其它条件下所不具备的优越性，如图3所示。其中使用的三种自制蛋白提取液的浓度比例为：
Figure BDA0001505140010000081
表1
可以看到，在碱性磷酸酶处理后大大降低磷酸化抗体的信号(对比左侧框和右侧框)。可以确认了信号减弱的确来自于磷酸酶作用的结果。
图4记载了使用现有的商用裂解液/蛋白提取液和本验证例记载的上述自制裂解液/蛋白提取液处理同一组织细胞后得到的结果，图6下图则显示了实际的实验效果。
图5记载了使用本申请的实施例1记载的临床前列腺组织蛋白提取液对50种经验证的磷酸化抗体的评价实验，其中，左侧竖轴记载了使用的抗体的名称，图示左侧的横条为使用了碱性磷酸酶处理后的蛋白的检测结果，右侧较浅的横条显示了未使用碱性磷酸酶处理的蛋白的检测结果，上述两种蛋白均经过实施例1记载的蛋白提取液处理组织样本后得到，由对比看区别明显，蛋白提取液对组织样本的去磷酸化同样有较好的效果。
进一步地，为了能够进一步地对上述看蛋白提取液的效果进行验证，我们还制备了通过应用以下比例的组分混合得到的蛋白提取液：
表2
Figure BDA0001505140010000082
Figure BDA0001505140010000091
表2
将上述表2记载的组分比例通过上述实施例2记载的配置方法制备得到的蛋白提取液，将上述得到的蛋白提取液使用以上验证方法进行验证，结果和上述验证结果较为接近，此处不再敷述。
总之，以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所作的均等变化与修饰，皆应属本发明专利的涵盖范围。

Claims (4)

1.一种用于蛋白微阵列检测的多效性细胞蛋白提取液，其特征在于，包括十二烷基硫酸钠、二硫苏糖醇、Tris缓冲液系统、二甲亚砜、亚精胺、氯化钠、氯化镁以及蛋白酶抑制剂；
还包括磷酸酶抑制剂；
所述十二烷基硫酸钠的质量占全部细胞蛋白提取液的总质量的0.1-5％；
所述二硫苏糖醇的摩尔浓度为0.01-1M；
Tris缓冲液系统的摩尔浓度为0.01-1M；
所述二甲亚砜的质量占全部细胞蛋白提取液的总质量的1-10％；
所述亚精胺的质量占全部细胞蛋白提取液的总质量的1-5％；
所述氯化钠的摩尔浓度为10-100mM；
所述氯化镁的摩尔浓度为0.1-10mM。
2.根据权利要求1所述的用于蛋白微阵列检测的多效性细胞蛋白提取液，其特征在于，所述十二烷基硫酸钠是指包含十二烷基硫酸钠的裂解液系统。
3.一种权利要求1-2中任一项所述的用于蛋白微阵列检测的多效性细胞蛋白提取液的制备方法，其特征在于，在包含十二烷基硫酸钠的溶液中加入定量的二硫苏糖醇以及Tris缓冲液系统；在得到的混合溶液中加入定量的二甲亚砜、亚精胺、氯化钠、氯化镁、蛋白酶抑制剂以及磷酸酶抑制剂；将得到的混合溶液过滤或者零下低温冻存。
4.根据权利要求3所述的用于蛋白微阵列检测的多效性细胞蛋白提取液的制备方法，其特征在于，将得到的混合溶液过滤后零下20度低温冻存。
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