WO2020009189A1 - Ｂｒａｆ阻害剤によるがん細胞の逆説的増殖を抑制する薬剤 - Google Patents

Ｂｒａｆ阻害剤によるがん細胞の逆説的増殖を抑制する薬剤 Download PDF

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WO2020009189A1
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braf
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braf inhibitor
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洋司郎 新津
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洋司郎 新津
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    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing

Definitions

  • the present invention relates to an agent for suppressing paradoxical growth of cancer cells by a BRAF inhibitor.
  • the RAS / RAF / MEK / ERK signal cascade transmits signals essential for cell proliferation and inhibition of apoptosis.
  • Gain-of-function mutations in components of this pathway such as the KRAS gene mutation (mKRAS) and the BRAF gene mutation (mBRAF, such as BRAF with an amino acid substitution at the valine at position 600), have been reported for pancreatic cancer, colon cancer, lung cancer, melanoma. It is known to cause many cancers such as (Non-Patent Documents 1 and 2).
  • Non-Patent Document 2 Anti-cancer drugs using KRAS inhibitors and BRAF inhibitors have been developed, but many of them have failed. For example, it has been pointed out that mKRAS silencing cannot sufficiently regress mKRAS cancer and prolong survival. Moreover, despite the fact that mBRAF mutations have been found in various cancers, the efficacy of BRAF inhibitors is almost limited to some patients with mBRAF metastatic melanoma (Non-Patent Document 2).
  • BRAF inhibitors such as Vemurafenib (also called PLX4032) and PLX4720, show high therapeutic efficacy in patients with advanced mBRAF melanoma, but are resistant to cancer cells with continued administration There is a problem of causing acquisition. Furthermore, long-term administration of BRAF inhibitors promotes the growth of cancer cells, such as RAS mutant cells, and induces tumor formation despite being an anticancer drug, causing paradoxical growth. It is also known to bring about (Non-Patent Document 3). In order to use BRAF inhibitors more safely and for long-term treatment of cancer, it is desirable to develop a method for suppressing paradoxical proliferation by BRAF inhibitors.
  • Glutathione-S-transferase is an enzyme that catalyzes glutathione conjugation, which adds glutathione to substances such as drugs.
  • GST plays an important role in vivo, for example, in biosynthesis or drug metabolic degradation.
  • GST is classified into a plurality of classes (for example, ⁇ , ⁇ , ⁇ , ⁇ , etc.) based on the homology of the primary structure and the substrate specificity.
  • GST- ⁇ glutthione S-transferase pi, also known as GSTP1 expression is upregulated in various cancer cells, suggesting that this may contribute to resistance to some anticancer drugs. Have been.
  • Patent Document 1 discloses a cytostatic agent for a cell having a BRAF gene mutation, which comprises a drug that inhibits GST- ⁇ as an active ingredient, wherein the cytostatic agent has a BRAF gene mutation having resistance to a BRAF inhibitor. It discloses that cell death can be induced also in cells. However, it is unclear whether such cytostatics are also effective in overcoming other problems caused by BRAF inhibitors.
  • An object of the present invention is to provide an agent for suppressing paradoxical growth of cancer cells by a BRAF inhibitor.
  • the present inventors have conducted intensive studies to solve the above problems, and as a result, have found that a drug that suppresses GSTP1 can significantly suppress paradoxical growth of cancer cells by a BRAF inhibitor, and thus complete the present invention. Reached.
  • the present invention includes the following.
  • [1] A cell growth inhibitor containing a drug that suppresses GSTP1 to suppress the promotion of cancer cell growth by a BRAF inhibitor.
  • [2] The cell growth inhibitor according to [1], wherein the cancer cell is a KRAS mutant cell.
  • [3] The cell growth inhibitor according to [1] or [2], wherein the drug that suppresses GSTP1 is siRNA or shRNA against GSTP1.
  • [4] The cell growth inhibitor according to any of [1] to [3], wherein promotion of cancer cell growth by the BRAF inhibitor is caused by exposure of the cancer cells to 5 ⁇ M or less of the BRAF inhibitor.
  • [5] The cell growth suppression according to any of [1] to [4], wherein the promotion of cancer cell proliferation by the BRAF inhibitor is caused by exposure of the lung cancer cells to 0.1 to 1.0 ⁇ M or less of the BRAF inhibitor.
  • Agent [6] The cell growth inhibitor according to any of [1] to [5], wherein the cancer cell is a cell having no mutation in the BRAF gene.
  • [8] The medicament according to [7], wherein the tumor formation is tumor formation of a KRAS mutant cell.
  • FIG. 1 shows the inhibitory effect of siGSTP1 on (A) paradoxical growth of mKRAS cells by a BRAF inhibitor and (B) paradoxical growth of a BRAF inhibitor.
  • FIG. 2 is a diagram showing the promotion of CRAF dimer formation in mKRAS cells treated with a BRAF inhibitor and the suppressive effect of siGSTP1 on it.
  • FIG. 3 shows the effect of the BRAF inhibitor PLX4032 on the interaction between GSTP1 and CRAF.
  • the present invention relates to a cell growth inhibitor based on the effect of a drug that inhibits GSTP1 to suppress the promotion of cancer cell growth by a BRAF inhibitor.
  • GSTP1 refers to the GSTP1 gene or a protein encoded by the GSTP1 gene (GSTP1 protein).
  • GSTP1 protein has glutathione conjugation catalytic activity.
  • GSTP1 is present in various animals including humans, and its sequence information is also known.
  • GSTP1 sequence information can be obtained from public databases, such as the NCBI database.
  • GSTP1 may be derived from animals, particularly humans, gorillas, primates such as chimpanzees, and mammals including dogs, cats, mice, rats, rabbits, horses, cows, sheep, goats, etc. It may be derived from the same genus, species or variety as the cell whose growth is to be inhibited.
  • the GSTP1 gene may be, for example, a gene consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 (NCBI accession number NM_000852) or encoded by the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 (the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1) GSTP1 protein encoding a human GSTP1 protein.
  • the GSTP1 gene may be a gene encoding a GSTP1 variant having an activity equivalent to that of the GSTP1 protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or a GSTP1 ortholog of another species.
  • the GSTP1 gene may be natural from animals.
  • the GSTP1 gene is, for example, a gene encoding a protein having a catalytic activity for conjugating glutathione, and (i) a base sequence in which one or more bases are deleted, substituted or added in the base sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • the GSTP1 protein As an example of the GSTP1 protein, a protein (human GSTP1 protein) consisting of the amino acid sequence of 210 residues shown in SEQ ID NO: 2 (NCBI accession number NP_000843) can be mentioned.
  • the GSTP1 protein may be a GSTP1 variant having an activity equivalent to that of the GSTP1 protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, or a GSTP1 ortholog of another species.
  • the GSTP1 protein has glutathione conjugation catalytic activity. Methods for measuring glutathione conjugation catalytic activity are known to those skilled in the art.
  • the GSTP1 protein has 90% of the amino acid sequence represented by (i) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 in which one or more amino acids have been deleted, substituted or added, or (ii) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2. % Or more, 95% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more sequence identity.
  • pluriality relating to deletion, substitution or addition of amino acids or bases includes, for example, 2 to 20, 2 to 15, 2 to 10, 2 to 7, 2 to 5, 2 to 4 or 2 to 3
  • Conservative amino acid substitution refers to substitution between amino acids having similar properties such as charge, side chain, polarity, and aromaticity.
  • Amino acids having similar properties include, for example, basic amino acids (arginine, lysine, histidine), acidic amino acids (aspartic acid, glutamic acid), uncharged polar amino acids (glycine, asparagine, glutamine, serine, threonine, cysteine, tyrosine), nonpolar Amino acids (leucine, isoleucine, alanine, valine, proline, phenylalanine, tryptophan, methionine), branched-chain amino acids (leucine, valine, isoleucine), aromatic amino acids (phenylalanine, tyrosine, tryptophan, histidine), etc. it can.
  • sequence identity refers to identity between two base sequences or between two amino acid sequences. Sequence identity is determined by comparing two sequences aligned optimally (typically with the highest percent identity) over the region of the sequence being compared. The nucleic acid or protein to be compared may have additions or deletions (eg, gaps, etc.) in the optimal alignment of the two sequences. Sequence identity can be calculated using BLAST, FASTA, ClustalW, and the like.
  • the term “drug that suppresses GSTP1” refers to a drug that suppresses the production or activity of GSTP1 protein or promotes the degradation or inactivation of GSTP1 protein.
  • Examples of the drug that suppresses the production of GSTP1 include, but are not limited to, an inhibitory nucleic acid for the GSTP1 gene, such as an RNAi molecule, a ribozyme, an antisense nucleic acid, a DNA / RNA chimeric polynucleotide, and a vector expressing the same. No. Such an inhibitory nucleic acid and a vector expressing the same are preferable because of their high specificity and low possibility of side effects.
  • an RNAi molecule refers to any molecule that causes RNA interference, and is not limited to the following, but is not limited to siRNA (small interfering RNA), miRNA (micro RNA), shRNA (short hairpin RNA), ddRNA (DNA-directed RNA), piRNA (Piwi-interacting RNA), rasiRNA (repeat-associated siRNA), and other double-stranded RNAs and modified products thereof.
  • siRNA small interfering RNA
  • miRNA miRNA
  • micro RNA miRNA
  • shRNA short hairpin RNA
  • ddRNA DNA-directed RNA
  • piRNA piRNA
  • rasiRNA repeat-associated siRNA
  • antisense nucleic acid refers to an antisense oligonucleotide having a base sequence complementary to a transcription product (sense strand) of a target gene.
  • the antisense nucleic acid may be composed of RNA, DNA, PNA (peptide nucleic acid), LNA (locked nucleic acid), or a complex thereof.
  • the DNA / RNA chimeric polynucleotide is not limited, and includes, for example, a double-stranded polynucleotide consisting of DNA and RNA that inhibit the expression of a target gene described in JP-A-2003-219893. .
  • the expression vector is not limited, and any known vector such as a plasmid vector, a phage vector, a phagemid vector, a cosmid vector, and a virus vector can be used.
  • the vector preferably contains at least a promoter that enhances the expression of the nucleic acid carried, in which case the nucleic acid is preferably operably linked to such a promoter.
  • operably linked to a nucleic acid means that the nucleic acid and the promoter are arranged such that the protein encoded by the nucleic acid is appropriately produced by the action of the promoter.
  • the vector may be capable of replicating in the host cell. Transcription of the gene from the vector may be performed outside the nucleus of the host cell, or within the nucleus (eg, when the nucleic acid is integrated into the genome of the host cell).
  • Drugs that suppress the activity of GSTP1 include, but are not limited to, for example, substances that bind to GSTP1, for example, glutathione, glutathione analogs (e.g., WO 95/08563, WO 96/40205, No. 99/54346, or Nakajima et al., J Pharmacol Exp Ther. 2003; 306 (3): 861-9, etc.), ketoprofen (Takahashi and Niitsu, Gan To Kagaku Ryoho. 1994; 21 (7) ): 945-51), indomethacin (Hall et al., Cancer49Res.
  • the suppression of GSTP1 can be determined by suppressing the expression (expression amount) and / or activity of GSTP1 in cells as compared to the case where a drug that suppresses GSTP1 was not acted on.
  • GSTP1 can be determined by any known method, including, but not limited to, a method using an anti-GSTP1 antibody, such as immunoprecipitation, EIA (enzyme-immunoassay) (eg, ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay), and RIA.
  • EIA enzyme-immunoassay
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • Radioimmunoassay eg, IRMA (immunoradiometric assay), RAST (radioallergosorbent assay), RIST (radioimmunosorbent assay), Western blotting, immunohistochemistry, immunocytochemistry or flow cytometry, or GSTP1 gene transcription
  • a nucleic acid that specifically hybridizes to a product (e.g., mRNA) or a spliced product or a fragment thereof, for example, various hybridization methods such as a Northern blot method or a Southern blot method, or various PCR methods (e.g., , Real-time RT-PCR method) and the like.
  • the activity of GSTP1 is not limited to the known activity of GSTP1, but includes, for example, any known methods such as binding to a protein such as CRAF (particularly phosphorylated CRAF) or EGFR (particularly phosphorylated EGFR), For example, it can be evaluated by analyzing by immunoprecipitation, Western blotting, mass spectrometry, pull-down, surface plasmon resonance (SPR), or the like.
  • CRAF particularly phosphorylated CRAF
  • EGFR particularly phosphorylated EGFR
  • SPR surface plasmon resonance
  • an RNAi molecule against GSTP1 preferably siRNA or shRNA against GSTP1
  • the siRNA or shRNA against GSTP1 is a GSTP1 mRNA sequence or protein coding sequence (for example, 90% or more, 95% or more, 97% or more with respect to the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 or the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1).
  • a target sequence typically 13 to 28 nucleotides in length, for example, 16 to 23 or 19 to 21 nucleotides in length
  • a target sequence typically 13 to 28 nucleotides in length, for example, 16 to 23 or 19 to 21 nucleotides in length
  • a sense sequence (sense strand) containing the target sequence.
  • the sense sequence is complementary to the antisense sequence.
  • “complementary” means completely complementary to a predetermined base sequence or complementary to such an extent that a stable double strand can be formed (for example, a base consisting of only one or two bases). (Including non-pairing bases and / or having a short terminal sequence of 1, 2, or 3 bases consisting of non-base pairing bases).
  • the antisense sequence is completely complementary to the target sequence.
  • the sense sequence (sense strand) and antisense sequence (antisense strand) are each typically 15-30 nucleotides in length, and may be, for example, 18-25 or 21-23 nucleotides in length.
  • the sense sequence (sense strand) and antisense sequence (antisense strand) contained in the siRNA for GSTP1 have a protruding sequence at either the 5 ′ end or the 3 ′ end when they form a duplex. And, for example, each may have a protruding sequence at the 3 ′ end.
  • the overhang sequence may be usually 1-3 nucleotides in length, typically 2 nucleotides in length.
  • Examples of siRNA against GSTP1 include siGSTP1B (Thermo Fisher Scientific, # 2385).
  • the shRNA for GSTP1 has a loop sequence between the sense sequence (sense strand) and the antisense sequence (antisense strand) (between the target sequence of each strand).
  • the shRNA against GSTP1 is typically degraded by Dicer in cells to become siRNA.
  • a drug that inhibits GSTP1 can suppress the promotion of cancer cell growth by a BRAF inhibitor.
  • mutant BRAF refers to a substance that inhibits the signaling activity of mutant BRAF.
  • the "BRAF inhibitor” in the present invention causes paradoxical growth of cancer cells.
  • Mutant BRAF may be one in which the amino acid sequence of the BRAF protein has been altered by a mutation in the BRAF gene, particularly a so-called gain-of-function mutation, and the function of the protein has been altered, for example, a BRAF protein in which serine threonine kinase activity has been enhanced by the mutation. It may be.
  • mutant BRAF protein examples include a BRAF protein in which the valine (V) at position 600 is mutated, for example, V600E in which valine (V) at position 600 is substituted with glutamic acid (E), and V600D, V600G, V600K, V600M, Examples include, but are not limited to, BRAF proteins having mutations such as V600R and V600L.
  • the mutant BRAF may have enhanced BRAF gene expression.
  • BRAF inhibitors Vemurafenib (Vemurafenib; PLX4032; Cas.
  • the promotion of cancer cell growth by a BRAF inhibitor, which is suppressed in the present invention is, for example, the promotion of cancer cell growth, which is a cell having a mutation in the RAS gene (RAS mutant cell). It promotes the growth of cancer cells that are cells having a mutation in the gene (KRAS mutant cells).
  • the cancer cells may not have a BRAF mutation.
  • RAS refers to a RAS gene or a protein encoded by the RAS gene (RAS protein).
  • RAS protein has binding properties to small GTP.
  • RAS exists in various animals including humans, and its sequence information is also known.
  • RAS sequence information can be obtained from public databases such as the NCBI database, for example.
  • RAS includes KRAS, NRAS and HRAS.
  • an unmutated (wild-type) KRAS protein there is a human KRAS protein consisting of an amino acid sequence of 189 residues shown in SEQ ID NO: 4 (NCBI accession number NP_203524).
  • the unmutated KRAS protein may be a KRAS variant having an activity equivalent to that of the KRAS protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, or a KRAS ortholog of another species.
  • KRAS protein has GTP hydrolysis activity, and a method for measuring the activity is known to those skilled in the art.
  • the unmutated KRAS protein is obtained by adding (i) an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, or (ii) an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4.
  • the protein may have a sequence identity of 90% or more, 95% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more.
  • KRAS gene is a gene that encodes KRAS protein.
  • specific examples of the unmutated KRAS gene include a human KRAS gene encoding human KRAS consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4.
  • the unmutated KRAS gene may be a gene consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3 (NCBI accession number NM_033360).
  • the unmutated KRAS gene may be a KRAS variant having an activity equivalent to that of a human KRAS protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, or a KRAS gene encoding a KRAS ortholog of another species.
  • the unmutated KRAS gene is, for example, a gene encoding a protein having GTP hydrolysis activity, and (i) one or more bases are deleted, substituted or added in the base sequence represented by SEQ ID NO: 3. (Ii) a gene having 90% or more, 95% or more, 97% or more, 98% or more or 99% or more sequence identity to the base sequence represented by SEQ ID NO: 3, (iii) A) a gene encoding a protein consisting of an amino acid sequence in which one or more amino acids have been deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, or (iv) an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4. It may be a gene encoding a protein having a sequence identity of 90% or more, 95% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more.
  • RAS A RAS mutant cell such as a KRAS mutant cell, which is a cancer cell whose growth is promoted by a BRAF inhibitor, has a gene mutation that changes the amino acid sequence of a RAS protein, for example, the KRAS protein, and changes the function of the protein.
  • a KRAS mutant cell has a gene mutation that causes a mutation (typically, an amino acid substitution) at one or more of the 12th, 13th, and 61st amino acids of a KRAS protein (eg, the protein of SEQ ID NO: 4). It may be.
  • the promotion of growth of the cancer cells by the BRAF inhibitor is caused by exposure of the cancer cells to a relatively low concentration of the BRAF inhibitor.
  • the cancer cells By exposing the cancer cells to, for example, 5 ⁇ M or less, 2 ⁇ M or less, 0.01 to 2 ⁇ M, 0.1 to 2 ⁇ M, or 0.1 to 1.0 ⁇ M of a BRAF inhibitor, the proliferation (abnormal proliferation) of the cells is promoted.
  • the promotion of cancer cell proliferation by such a relatively low concentration of the BRAF inhibitor can be suppressed.
  • the promotion of cancer cell growth by the BRAF inhibitor is caused by exposure of the lung cancer cells to no more than 0.1-1.0 ⁇ M of the BRAF inhibitor.
  • GSTP1 interacts with CRAF in the RAS / RAF / MEK / ERK cascade and independently of the pathway from the upstream RAS, CRAF / MEK / Promotes the ERK cascade.
  • High concentrations of BRAF inhibitors inhibit BRAF protein activity in cells that strongly express GSTP1, such as KRAS mutant cells (mostly cancer cells, but rarely some normal cells also express GSTP1)
  • KRAS mutant cells mostly cancer cells, but rarely some normal cells also express GSTP1
  • it suppresses the interaction between GSTP1 and CRAF in the cells, thereby suppressing the autocrine loop of the RAS / RAF / MEK / ERK cascade, and is thought to induce almost complete apoptosis of the cells.
  • a relatively low concentration of BRAF inhibitor inhibits BRAF in these cells but cannot sufficiently suppress the interaction between GSTP1 and CRAF, and cells with increased CRAF homodimer expression selectively survive It is believed that results will be obtained, which will promote the growth of these cells.
  • the drug that suppresses GSTP1 in the present invention inhibits the binding between GSTP1 and CRAF, and consequently suppresses the formation of CRAF dimer, thereby suppressing the promotion of proliferation of these cells by a BRAF inhibitor. it can.
  • a drug that inhibits GSTP1 can be used as an active ingredient of a cell growth inhibitor for suppressing the promotion of cancer cell growth by a BRAF inhibitor.
  • the present invention relates to a cell growth inhibitor comprising a drug that inhibits GSTP1, for suppressing the promotion of cancer cell growth by a BRAF inhibitor.
  • the cytostatic agent according to the present invention may contain a drug that inhibits GSTP1 in an effective amount.
  • the cell growth inhibitor according to the present invention may be a composition.
  • the cell growth inhibitor according to the present invention may be used as a medicine as described below, or may be used as a research reagent.
  • the cell growth inhibitor of the present invention can be used, for example, in vivo or in vitro.
  • in vivo refers to use in an individual organism
  • in vitro refers to use in an organ, tissue, or cell isolated from an individual.
  • the present invention also provides a drug that suppresses GSTP1 or a medicament containing the above-mentioned cell growth inhibitor containing the same.
  • the medicament according to the present invention can be used for suppressing tumor formation induced by a BRAF inhibitor, based on the inhibitory effect of a BRAF inhibitor on the promotion of cancer cell proliferation.
  • the tumor formation induced by a BRAF inhibitor can be, for example, tumor formation of a RAS mutant cell, for example, a KRAS mutant cell.
  • the cell growth inhibitor or medicament according to the present invention can further contain a pharmaceutically acceptable additive in addition to the drug that inhibits GSTP1.
  • Pharmaceutically acceptable additives include, for example, carriers (such as solid and liquid carriers), excipients, surfactants, binders, disintegrants, lubricants, solubilizing agents, suspending agents, and coating agents. , A colorant, a flavoring agent, a preservative, a buffer, a pH adjuster, a diluent, a stabilizer, a propellant, and the like, but are not limited thereto.
  • the cell growth inhibitor or medicament according to the present invention can be formulated into any dosage form according to the administration route, drug release mode and the like.
  • the cytostatic or medicament according to the invention may be formulated into a drug coated with a suitable material, for example an enteric coating or a time-degradable material, or incorporated into a suitable drug release system.
  • the cytostatic or medicament of the present invention may be administered by various routes, including both oral and parenteral, including, but not limited to, oral, intravenous, intramuscular, subcutaneous, topical, intratumoral, rectal, intraarterial
  • the drug may be administered by a route such as intraportal, intraventricular, transmucosal, transdermal, intranasal, intraperitoneal, intrapulmonary, and intrauterine routes, or may be formulated into a dosage form suitable for each administration route. Any known dosage form and formulation method can be appropriately adopted.
  • dosage forms suitable for oral administration include, but are not limited to, powders, granules, tablets, capsules, solutions, suspensions, emulsions, gels, syrups, and the like.
  • Suitable dosage forms for parenteral administration include, but are not limited to, injections such as solution injections, suspension injections, emulsion injections, and ready-to-use injections.
  • Formulations for parenteral administration may be in the form of aqueous or non-aqueous isotonic sterile solutions or suspensions.
  • the drug, cytostatic or pharmaceutical agent that suppresses GSTP1 according to the present invention desirably suppresses the promotion of cancer cell growth by a BRAF inhibitor and / or suppresses tumor formation induced by a BRAF inhibitor.
  • a subject may be, but is not limited to, a subject who has been or has been administered a BRAF inhibitor.
  • the subject can be, for example, a patient who has or has suffered from a cancer (eg, a BRAF mutant cancer).
  • the subject to which the drug, cytostatic or pharmaceutical agent for suppressing GSTP1 according to the present invention is administered is any animal, preferably a human, a gorilla, a primate such as a chimpanzee, a dog, a cat, a mouse, a rat, a rabbit, and a horse. , Cattle, sheep, goats and other mammals.
  • a cytostatic or a drug that suppresses GSTP1 according to the present invention is a subject to which a BRAF inhibitor has been administered, the subject is preferably 30 mg / kg or less in total, more preferably The subject may be administered a total of 15 mg / kg or less, more preferably a total of 10 mg / kg or less of the BRAF inhibitor. This dose is relatively low and may cause growth of cancer cells to be promoted by BRAF inhibitors.
  • a cell growth inhibitor or a medicament for example, lung adenocarcinoma, mucosal gland type, adenocarcinoma such as pancreatic duct adenocarcinoma, colon cancer , Breast cancer, fibrosarcoma, lung cancer, cutaneous squamous cell carcinoma, melanoma and the like, but not limited thereto.
  • the present invention also provides a method for suppressing tumor formation induced by a BRAF inhibitor, which comprises administering a drug that suppresses GSTP1 according to the present invention, a cytostatic agent, or a medicament to a subject in need thereof. provide.
  • This method can also be used to prevent tumorigenesis (cancer) induced by BRAF inhibitors.
  • the dose of the drug that suppresses GSTP1 according to the present invention, a cytostatic agent, or a medicament depends on various conditions relating to the subject, for example, the severity of symptoms, general health of the subject, age, body weight, sex of the subject, Those skilled in the art can appropriately determine the diet, the timing and frequency of administration, the concomitant drug, the response to the treatment, the dosage form, the compliance with the treatment, and the like.
  • the dose of the drug that inhibits GSTP1 may be 0.0000001 mg / kg / day to 1000 mg / kg / day or 0.0001 mg / kg / day to 1 mg / kg / day.
  • Administration may be performed only once, or may be performed multiple times regularly or irregularly.
  • the administration frequency is, for example, once a day, multiple times a day (for example, 2, 3, 4, or 5 or more times a day), every few days (for example, every 2, 3, 4, 5, 6, 7, etc.) ), Every week, every few weeks (eg, every 2, 3, 4 weeks, etc.), or every few months (eg, every 2, 3, 4, 5, 6, 7 months, etc.).
  • the drug, cytostatic or pharmaceutical agent that suppresses GSTP1 according to the present invention may be used in combination with another cytostatic or anticancer agent.
  • the preparation When used in combination, the preparation may be a combination preparation for simultaneous administration, or may be a separate preparation for independent administration. Combinations include simultaneous and sequential administration.
  • Example 1 Paradoxical growth of mKRAS cells by BRAF inhibitor
  • mKRAS cell a human lung cancer-derived cell line A549 (RIKEN BRC CELL BANK, # RCB2095) was used.
  • A549 cells have a mutant KRAS gene that causes the substitution of glycine (G) at position 12 of serine (S) in the KRAS protein.
  • the A549 cell is a cell having no mutation in the BRAF gene.
  • PLPLX4032 (Vemurafenib) was used as the BRAF inhibitor.
  • PLX4032 has been used as an effective agent for suppressing the growth of tumors having a V600E mutation in the BRAF protein.
  • A549 cells were exposed to 0.1 ⁇ M, 1 ⁇ M, or 10 ⁇ M PLX4032 in D-MEM medium supplemented with 10% FBS (fetal calf serum) and 2 mM glutamine for 72 hours, and then the cell number was counted.
  • FBS fetal calf serum
  • 2 mM glutamine As a control, a similar experiment was performed by adding 0.05% DMSO to a D-MEM medium supplemented with 10% FBS and 2 mM glutamine.
  • FIG. 1A The results are shown in FIG. 1A. Treatment with higher concentrations (10 ⁇ M) of PLX4032 inhibited the growth of A549 cells, whereas treatment with lower concentrations (0.1-1.0 ⁇ M) of PLX4032 reversed the growth of A549 cells. This indicated that the BRAF inhibitor PLX4032 promoted paradoxical proliferation of mKRAS cells at low concentrations.
  • siRNA against GSTP1 was used.
  • siGSTP1B Thermo Fisher Scientific, # 2385
  • AllStars Negative Control siRNA # S103650318, Qiagen
  • siControl was used as a control siRNA (hereinafter referred to as siControl).
  • RNAiMAX Lipofectamine (R) RNAiMAX (Thermo Fisher Scientific ) were performed according to the manufacturer's instructions. Specifically, first, A549 cells treated with 1 ⁇ M PLX4032 or 0.05% DMSO according to Example 1 were cultured in a normal medium (D-MEM + 10% FBS) containing no antibiotic, and the To bring the cell density to 20-30% confluent. Opti-MEM TM I and siRNA solution containing serum-free medium (Opti-MEM TM I Reduced Serum Medium) siRNA in, mixed Lipofectamine (R) RNAiMAX, 5 hours by adding it to the cells at a final siRNA concentration 50nM Transfection was performed by incubation.
  • D-MEM + 10% FBS normal medium
  • Opti-MEM TM I and siRNA solution containing serum-free medium Opti-MEM TM I Reduced Serum Medium
  • Transfected cells were cultured in normal medium without antibiotics for 2 hours, then subcloned into 60 mm dishes, and the total number of cells was counted for 5 days.
  • siGSTP1 can not only suppress the growth of mKRAS cells, but also suppress paradoxical growth (promotion of growth) caused by BRAF inhibitors.
  • R Lipofectamine
  • pcDNA3.1-FLAG-CRAF and pcDNA3.1-V5-His-CRAF encode a fusion protein obtained by adding tag FLAG (R) or V5-His to human CRAF protein.
  • the transfected cells were lysed in 0.5% NP-40 lysis buffer (0.5% NP-40, 20 mM HEPES, pH 7.4, 150 mM NaCl, 1 mM MgCl 2 , 1 mM EGTA, 10% glycerol, Complete Mini (Roche), Phos STOP (Roche)) for 30 minutes to dissolve on ice, and centrifuged at 13000 ⁇ g for 10 minutes at 4 ° C. to obtain a protein lysate.
  • Dynabeads (R) Protein A (Thermo Fisher Scientific) -conjugate antibody or anti-FLAG M2 magnetic beads (SIGMA) is added to the obtained protein lysate, and the mixture is incubated at 4 ° C to co-immunize CRAF dimer Settled. The obtained precipitate was washed four times with 0.5% NP-40 lysis buffer, and then analyzed by immunoblotting. The precipitate (protein) was fractionated by SDS-PAGE, transferred to a PVDF membrane, incubated with the addition of a primary antibody, and further detected with the addition of a secondary anti-rabbit or mouse IgG goat antibody.
  • R Dynabeads
  • SIGMA anti-FLAG M2 magnetic beads
  • an anti-FLAG antibody (# F3165; Sigma-Aldrich), an anti-V5 tag antibody (# R960-25; Thermo Fisher Scientific), an anti-GST ⁇ antibody (# 312; MBL), or an anti- ⁇ -actin antibody (# A5441; Sigma-Aldrich) was used.
  • the detection signal was visualized using ECL or ECL prime western blotting detection system (GE healthcare).
  • protein lysates were similarly analyzed by immunoblotting without co-immunoprecipitation.
  • the BRAF inhibitor PLX4032 was used at a final concentration of 10 ⁇ M.
  • Buffer 25 mM Tris-HCl, pH 7.3, 100 mM glycine, 10% glycerol
  • Analysis with the BLItz system was performed with a baseline measurement of 300 seconds, immobilization of 300 seconds, blocking of 120 seconds, equilibration of 30 seconds, binding of 120 seconds, and dissociation of 120 seconds.
  • the efficacy of an anticancer therapeutic agent based on a BRAF inhibitor can be enhanced by suppressing the induction of tumor formation by a BRAF inhibitor.

Abstract

本発明の課題は、BRAF阻害剤によるがん細胞の逆説的増殖を抑制する薬剤の提供である。　本発明は、GSTP1を抑制する薬物を含む、BRAF阻害剤によるがん細胞の増殖促進を抑制するための細胞増殖抑制剤、及びそれを含む医薬を提供する。

Description

ＢＲＡＦ阻害剤によるがん細胞の逆説的増殖を抑制する薬剤
　本発明は、BRAF阻害剤によるがん細胞の逆説的増殖を抑制する薬剤に関する。
　RAS/RAF/MEK/ERKシグナルカスケードは、細胞増殖及びアポトーシス阻止に必須のシグナルを伝達する。この経路の構成要素における機能獲得型変異、例えばKRAS遺伝子変異（mKRAS）及びBRAF遺伝子変異（mBRAF、例えば600番目のバリンのアミノ酸置換を有するBRAF）は、膵臓がん、大腸がん、肺がん、メラノーマ等の多くのがんの原因となることが知られている（非特許文献１及び２）。
　KRAS阻害剤やBRAF阻害剤を用いた抗がん剤の開発が行われてきたが、その多くは失敗に終わっている。例えば、mKRASサイレンシングはmKRASがんを十分に退縮できず、生存期間を延ばせないという指摘がある。また、様々ながんにおいてmBRAF変異が見出されているにもかかわらず、BRAF阻害剤の有効性はmBRAF転移性メラノーマの一部の患者にほぼ限定されている（非特許文献２）。
　ベムラフェニブ（Vemurafenib; PLX4032とも称される）やPLX4720等のBRAF阻害剤は、進行期のmBRAFメラノーマの患者において高い治療上の有効性を示すが、一方で継続的な投与により、がん細胞における耐性獲得を引き起こすという問題がある。さらに、BRAF阻害剤の長期投与は、RAS変異細胞などのがん細胞の増殖を促進し、抗がん剤であるにもかかわらず腫瘍形成を誘導してしまうという逆説的増殖（paradoxical growth）をもたらすことも知られている（非特許文献３）。BRAF阻害剤をより安全に長期にわたるがん治療に用いるためには、BRAF阻害剤による逆説的増殖を抑制する方法を開発することが望まれる。
　グルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST）は、グルタチオンを薬物などの物質に付加するグルタチオン抱合を触媒する酵素である。GSTは生体内で、例えば生合成又は薬物代謝分解において、重要な役割を果たす。GSTは一次構造の相同性及び基質特異性に基づいて複数のクラス（例えば、α、μ、π、θなど）に分類されている。GST-π（glutathione S-transferase pi、GSTP1ともいう）の発現が、種々のがん細胞において増大しており、これが一部の抗がん剤に対する耐性の一因となっている可能性が指摘されている。特許文献１は、GST-πを抑制する薬物を有効成分として含む、BRAF遺伝子変異を有する細胞の細胞増殖抑制剤を開示し、当該細胞増殖抑制剤が、BRAF阻害剤に対する耐性を有するBRAF遺伝子変異細胞に対しても細胞死を誘導できることを開示している。しかしそのような細胞増殖抑制剤がBRAF阻害剤によって引き起こされる他の問題の克服にも有効かどうかは不明である。
特開２０１６－２０４３６５号公報
Pylayeva-Gupta et al., Nat. Rev. Cancer, (2011) 11, 761-774 Holderfield et al., Nat. Rev. Cancer, (2014) 14, 455-467 Gibney et al., Nat. Rev. Clin. Oncol., (2013) 10(7): 390-399
　本発明は、BRAF阻害剤によるがん細胞の逆説的増殖を抑制する薬剤を提供することを課題とする。
　本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、GSTP1を抑制する薬物が、BRAF阻害剤によるがん細胞の逆説的増殖を顕著に抑制できることを見出し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は以下を包含する。
［1］　GSTP1を抑制する薬物を含む、BRAF阻害剤によるがん細胞の増殖促進を抑制するための細胞増殖抑制剤。
［2］　がん細胞が、KRAS変異細胞である、［1］に記載の細胞増殖抑制剤。
［3］　GSTP1を抑制する薬物が、GSTP1に対するsiRNA又はshRNAである、［1］又は［2］に記載の細胞増殖抑制剤。
［4］　BRAF阻害剤によるがん細胞の増殖促進が、5μM以下のBRAF阻害剤へのがん細胞の曝露によって引き起こされる、［1］～［3］のいずれかに記載の細胞増殖抑制剤。
［5］　BRAF阻害剤によるがん細胞の増殖促進が、0.1～1.0μM以下のBRAF阻害剤への肺がん細胞の曝露によって引き起こされる、［1］～［4］のいずれかに記載の細胞増殖抑制剤。
［6］　前記がん細胞が、BRAF遺伝子に変異を有さない細胞である、［1］～［5］のいずれかに記載の細胞増殖抑制剤。
［7］　［1］～［6］のいずれかに記載の細胞増殖抑制剤を含む、BRAF阻害剤によって誘導される腫瘍形成を抑制するための医薬。
［8］　腫瘍形成が、KRAS変異細胞の腫瘍形成である、［7］に記載の医薬。
［9］　BRAF阻害剤を投与されたか又は投与されている対象に投与するための、［7］又は［8］に記載の医薬。
［10］　BRAF阻害剤がベムラフェニブである、［7］～［9］のいずれかに記載の医薬。
［11］　合計30ｍｇ／ｋｇ以下のBRAF阻害剤を投与された対象に投与するための、［7］～［10］のいずれかに記載の医薬。
　本発明によれば、BRAF阻害剤によるがん細胞の逆説的増殖を効果的に抑制することができる。
図１は、(A) BRAF阻害剤によるmKRAS細胞の逆説的増殖（paradoxical growth）及び(B) BRAF阻害剤による逆説的増殖に対するsiGSTP1の抑制効果を示す図である。 図２は、BRAF阻害剤で処理されたmKRAS細胞におけるCRAF二量体形成促進、及びそれに対するsiGSTP1の抑制効果を示す図である。 図３は、BRAF阻害剤PLX4032の、GSTP1とCRAFの相互作用に及ぼす影響を示す図である。
　以下、本発明を詳細に説明する。
　本発明は、GSTP1を抑制する薬物の、BRAF阻害剤によるがん細胞の増殖促進を抑制する効果に基づく、細胞増殖抑制剤に関する。
　本明細書において、「GSTP1」は、GSTP1遺伝子、又はGSTP1遺伝子によりコードされるタンパク質（GSTP1タンパク質）を指す。GSTP1タンパク質は、グルタチオン抱合触媒活性を有する。GSTP1はヒトを含む種々の動物に存在し、その配列情報も公知である。GSTP1の配列情報は、例えば、NCBIデータベースなどの公のデータベースから入手できる。GSTP1は、動物由来、特に、ヒト、ゴリラ、チンパンジー等の霊長類の他、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウサギ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ等を含む哺乳動物に由来するものであってよく、増殖抑制される細胞と同じ属、種又は品種に由来するものであってよい。
　GSTP1遺伝子は、例えば、配列番号１で示される塩基配列（NCBIアクセッション番号NM_000852）からなる遺伝子であってよいし、配列番号２で示されるアミノ酸配列（配列番号１で示される塩基配列によってコードされる）からなるヒトGSTP1タンパク質をコードする遺伝子であってもよい。あるいはGSTP1遺伝子は、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるGSTP1タンパク質と機能的に同等の活性を有するGSTP1バリアント又は他生物種のGSTP1オルソログをコードする遺伝子であってもよい。GSTP1遺伝子は、動物由来の天然のものであってよい。GSTP1遺伝子は、例えば、グルタチオン抱合触媒活性を有するタンパク質をコードする遺伝子であって、(i)配列番号１で示される塩基配列において1若しくは複数個の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列を有する遺伝子、(ii)配列番号１で示される塩基配列に対して90％以上、95％以上、97％以上、98％以上又は99％以上の配列同一性を有する遺伝子、(iii)配列番号２で示されるアミノ酸配列において1若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子、又は(iv)配列番号２で示されるアミノ酸配列に対して90％以上、95％以上、97％以上、98％以上又は99％以上の配列同一性を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。
　GSTP1タンパク質の例として、配列番号２で示される210残基のアミノ酸配列（NCBIアクセッション番号NP_000843）からなるタンパク質（ヒトGSTP1タンパク質）が挙げられる。あるいは、GSTP1タンパク質は、配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するGSTP1タンパク質と機能的に同等の活性を有するGSTP1バリアント又は他生物種のGSTP1オルソログであってもよい。GSTP1タンパク質はグルタチオン抱合触媒活性を有する。グルタチオン抱合触媒活性の測定方法は当業者には知られている。GSTP1タンパク質は、(i)配列番号２で示されるアミノ酸配列において1若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列、又は(ii)配列番号２で示されるアミノ酸配列に対して90％以上、95％以上、97％以上、98％以上又は99％以上の配列同一性を有するタンパク質であってもよい。
　本明細書において、アミノ酸若しくは塩基の欠失、置換又は付加に関する「複数個」とは、例えば、2～20個、2～15個、2～10個、2～7個、2～5個、2～4個又は2～3個をいう。
　アミノ酸の置換は、保存的アミノ酸置換が望ましい。「保存的アミノ酸置換」とは、電荷、側鎖、極性、芳香族性等の性質の類似するアミノ酸間の置換をいう。性質の類似するアミノ酸は、例えば、塩基性アミノ酸（アルギニン、リジン、ヒスチジン）、酸性アミノ酸（アスパラギン酸、グルタミン酸）、無電荷極性アミノ酸（グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン）、無極性アミノ酸（ロイシン、イソロイシン、アラニン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン）、分枝鎖アミノ酸（ロイシン、バリン、イソロイシン）、芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、ヒスチジン）等に分類することができる。
　本明細書において、「配列同一性」とは、2つの塩基配列間又は2つのアミノ酸配列間の同一性をいう。配列同一性は、比較対象の配列の領域全体にわたって、最適な状態（典型的には同一性％が最高になる状態）にアラインメントされた2つの配列を比較することにより決定される。比較対象の核酸又はタンパク質は、2つの配列の最適なアラインメントにおいて、付加又は欠失（例えばギャップ等）を有していてもよい。配列同一性は、BLAST、FASTA、ClustalW等を用いて算出することができる。
　本明細書において、「GSTP1を抑制する薬物」は、GSTP1タンパク質の産生若しくは活性を抑制するか、又はGSTP1タンパク質の分解又は不活性化を促進する薬物を指す。
　GSTP1の産生を抑制する薬物としては、以下に限定されないが、例えばGSTP1遺伝子に対する阻害性核酸、例えばRNAi分子、リボザイム、アンチセンス核酸、DNA/RNAキメラポリヌクレオチド等、及びこれを発現するベクター等が挙げられる。このような阻害性核酸及びこれを発現するベクターは、特異性が高く、副作用の可能性が低いために好ましい。
　本明細書において、RNAi分子は、RNA干渉をもたらす任意の分子を指し、以下に限定されないが、siRNA（small interfering RNA）、miRNA（micro RNA）、shRNA（short hairpin RNA）、ddRNA（DNA-directed RNA）、piRNA（Piwi-interacting RNA）、rasiRNA（repeat associated siRNA）等の二重鎖RNA及びこれらの改変体等を包含する。これらのRNAi分子は市販されているものであってもよく、公知の配列情報、例えば、配列番号１に示した塩基配列の情報に基づいて設計及び作製することが可能である。
　本明細書において、アンチセンス核酸は、標的遺伝子の転写産物（センス鎖）に対して相補的な塩基配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを指す。アンチセンス核酸は、RNA、DNA、PNA（ペプチド核酸）、LNA（ロックド核酸）又はこれらの複合物で構成されていてもよい。
　本明細書において、DNA/RNAキメラポリヌクレオチドは、限定されないが、例えば、特開2003-219893号公報に記載の、標的遺伝子の発現を阻害するDNAとRNAとからなる2本鎖ポリヌクレオチドを含む。
　本明細書において、発現ベクターとしては、限定されないが、プラスミドベクター、ファージベクター、ファージミドベクター、コスミドベクター、ウイルスベクター等の公知の任意のベクターを利用することができる。ベクターは、担持する核酸の発現を増強するプロモーターを少なくとも含んでいることが好ましく、この場合、該核酸は、かかるプロモーターと作動可能に連結されていることが好ましい。核酸がプロモーターに作動可能に連結されているとは、プロモーターの作用により、該核酸のコードするタンパク質が適切に産生されるように、該核酸とプロモーターとが配置されていることを意味する。ベクターは、宿主細胞内で複製可能であってよい。ベクターからの遺伝子の転写は、宿主細胞の核外で行われても、核内で（例えば、核酸が宿主細胞のゲノムに組み込まれて）行われてもよい。
　GSTP1の活性を抑制する薬物としては、限定されないが、例えば、GSTP1に結合する物質が挙げられ、例えば、グルタチオン、グルタチオンアナログ（例えば、国際公開第95/08563号、同第96/40205号、同第99/54346号、又はNakajima et al., J Pharmacol Exp Ther. 2003;306(3):861-9等に記載のもの）、ケトプロフェン（Takahashi and Niitsu, Gan To Kagaku Ryoho. 1994;21(7):945-51）、インドメタシン（Hall et al., Cancer Res. 1989;49(22):6265-8）、エタクリン酸、ピリプロスト（Tew et al., Cancer Res. 1988;48(13):3622-5）、抗GSTP1抗体、GSTP1のドミナントネガティブ変異体等が挙げられる。これらの薬物は市販されているか、公知の技術に基づいて適宜製造することができる。
　GSTP1の抑制は、GSTP1を抑制する薬物を作用させなかった場合に比べ、細胞においてGSTP1の発現（発現量）及び/又は活性が抑制されていることにより決定することができる。
　GSTP1の発現は、公知の任意の手法、例えば限定されないが、抗GSTP1抗体を利用した手法、例えば、免疫沈降法、EIA（enzyme immunoassay）（例えば、ELISA（enzyme-linked immunosorbent assay）等）、RIA（radioimmunoassay）（例えば、IRMA（immunoradiometric assay）、RAST（radioallergosorbent test）、RIST（radioimmunosorbent test）等）、ウェスタンブロッティング法、免疫組織化学法、免疫細胞化学法又はフローサイトメトリー法、あるいはGSTP1遺伝子の転写産物(例えば、mRNA)若しくはスプライシング産物又はそれらの断片に特異的にハイブリダイズする核酸を利用した手法、例えば、種々のハイブリダイゼーション法、例えばノーザンブロット法若しくはサザンブロット法、又は種々のPCR法(例えば、リアルタイムRT-PCR法)等により評価することができる。
　GSTP1の活性は、GSTP1の公知の活性、以下に限定されないが、例えば、CRAF（特にリン酸化CRAF）又はEGFR（特にリン酸化EGFR）等のタンパク質との結合性等を、公知の任意の方法、例えば、免疫沈降法、ウェスタンブロッティング法、質量分析法、プルダウン法、表面プラズモン共鳴（SPR）法等により解析することによって評価することができる。
　一実施形態では、GSTP1を抑制する薬物として、GSTP1に対するRNAi分子、好ましくはGSTP1に対するsiRNA又はshRNAを好適に用いることができる。GSTP1に対するsiRNA又はshRNAは、GSTP1のmRNA配列又はタンパク質コード配列（例えば、配列番号１で示される塩基配列、あるいは配列番号１で示される塩基配列に対して90％以上、95％以上、97％以上、98％以上又は99％以上の配列同一性を有する塩基配列）の少なくとも一部である標的配列（典型的には13～28ヌクレオチド長、例えば16～23又は19～21ヌクレオチド長）に相補的な配列を含むアンチセンス配列（アンチセンス鎖）と、その標的配列を含むセンス配列（センス鎖）とを含む。センス配列はアンチセンス配列に対して相補的である。本発明において「相補的」とは、所定の塩基配列に対して完全に相補的であるか又は安定した二重鎖を形成できる程度に相補的である（例えば、1塩基又は2塩基のみの塩基対形成しない塩基を含むか、及び／又は塩基対形成しない塩基からなる1、2、又は3塩基長のような短い末端配列を有する）ことを意味する。但しアンチセンス配列（アンチセンス鎖）は、標的配列に対して完全に相補的である。センス配列（センス鎖）及びアンチセンス配列（アンチセンス鎖）は、それぞれ、典型的には15～30ヌクレオチド長であり、例えば18～25又は21～23ヌクレオチド長であってよい。GSTP1に対するsiRNAに含まれる前記センス配列（センス鎖）及びアンチセンス配列（アンチセンス鎖）は、それらが二重鎖を形成したときに、5'末端又は3'末端のいずれかに突出配列を有していてもよく、例えば3'末端に突出配列をそれぞれ有していてもよい。突出配列は、通常は1～3ヌクレオチド長、典型的には2ヌクレオチド長であってよい。GSTP1に対するsiRNAとしては、例えば、siGSTP1B（Thermo Fisher Scientific、#2385）が挙げられる。GSTP1に対するshRNAは、センス配列（センス鎖）とアンチセンス配列（アンチセンス鎖）の間（各鎖の標的配列と標的配列の間）にループ配列を有する。GSTP1に対するshRNAは、典型的には、細胞内でDicerによる分解を受けてsiRNAとなる。
　本発明では、GSTP1を抑制する薬物により、BRAF阻害剤によるがん細胞の増殖促進を抑制することができる。
　本明細書において、「BRAF阻害剤」とは、変異型BRAFのシグナル伝達制御活性を阻害する物質をいう。本発明における「BRAF阻害剤」は、がん細胞の逆説的増殖を引き起こす。変異型BRAFは、BRAF遺伝子の変異、特にいわゆる機能獲得変異によりBRAFタンパク質のアミノ酸配列が変化し、そのタンパク質の機能が変化したものであってよく、例えば変異によりセリンスレオニンキナーゼ活性が亢進したBRAFタンパク質であってもよい。変異型BRAFタンパク質の具体例としては、600番目のバリン（V）が変異したBRAFタンパク質、例えば600番目のバリン（V）がグルタミン酸（E）に置換したV600E、またV600D、V600G、V600K、V600M、V600R、V600L等の変異を有するBRAFタンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。あるいは変異型BRAFは、BRAF遺伝子の発現が亢進したものであってもよい。BRAF阻害剤としては、ベムラフェニブ（Vemurafenib; PLX4032; Cas. No.:918504-65-1、N-[3-[5-(4-クロロフェニル)-1H-ピロロ[2,3-b]ピリジン-3-カルボニル]-2,4-ジフルオロフェニル]プロパン-1-スルホンアミド）、ダブラフェニブ（Cas. No.:1195765-45-7、N-{3-[5-(2-アミノ-4-ピリミジニル)-2-(1,1-ジメチルエチル)-1,3-チアゾール-4-イル]-2-フルオロフェニル}-2,6-ジフルオロベンゼンスルホンアミド）等が挙げられ、これらはがん細胞の逆説的増殖を引き起こすことが知られている。
　本発明において抑制される、BRAF阻害剤によるがん細胞の増殖促進は、例えば、RAS遺伝子に変異を有する細胞（RAS変異細胞）であるがん細胞の増殖促進であり、典型的には、KRAS遺伝子に変異を有する細胞（KRAS変異細胞）であるがん細胞の増殖促進である。そのがん細胞は、BRAF変異を有しないものであってよい。
　本明細書において、「RAS」とは、RAS遺伝子、又はRAS遺伝子によりコードされるタンパク質（RASタンパク質）を指す。RASタンパク質は、低分子GTPとの結合性を有する。RASはヒトを含む種々の動物に存在し、その配列情報も公知である。RASの配列情報は、例えば、NCBIデータベース等の公のデータベースから入手できる。RASには、KRAS、NRAS及びHRASが含まれる。
　未変異（野生型）のKRASタンパク質の例として、配列番号４で示される189残基のアミノ酸配列（NCBIアクセッション番号NP_203524）からなるヒトKRASタンパク質が挙げられる。あるいは、未変異のKRASタンパク質は、配列番号４で示されるアミノ酸配列を有するKRASタンパク質と機能的に同等の活性を有するKRASバリアント及び他生物種のKRASオルソログであってもよい。KRASタンパク質は、GTP加水分解活性を有し、当該活性の測定方法は当業者には知られている。未変異のKRASタンパク質は、(i)配列番号４で示されるアミノ酸配列において1若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列、又は(ii)配列番号４で示されるアミノ酸配列に対して90％以上、95％以上、97％以上、98％以上又は99％以上の配列同一性を有するタンパク質であってもよい。
　「KRAS遺伝子」は、KRASタンパク質をコードする遺伝子である。未変異のKRAS遺伝子の具体例として、配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるヒトKRASをコードするヒトKRAS遺伝子が挙げられる。未変異のKRAS遺伝子は、配列番号３で示される塩基配列（NCBIアクセッション番号NM_033360）からなる遺伝子であってよい。未変異のKRAS遺伝子は、配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるヒトKRASタンパク質と機能的に同等の活性を有するKRASバリアント又は他生物種のKRASオルソログをコードするKRAS遺伝子であってもよい。未変異のKRAS遺伝子は、例えば、GTP加水分解活性を有するタンパク質をコードする遺伝子であって、(i)配列番号３で示される塩基配列において1若しくは複数個の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列を有する遺伝子、(ii)配列番号３で示される塩基配列に対して90％以上、95％以上、97％以上、98％以上又は99％以上の配列同一性を有する遺伝子、(iii)配列番号４で示されるアミノ酸配列において1若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子、又は(iv)配列番号４で示されるアミノ酸配列に対して90％以上、95％以上、97％以上、98％以上又は99％以上の配列同一性を有するタンパク質をコードする遺伝子、であってもよい。
　BRAF阻害剤により増殖が促進されるがん細胞であるRAS変異細胞、例えばKRAS変異細胞は、RASタンパク質、例えばKRASタンパク質のアミノ酸配列を変化させ、そのタンパク質の機能を変化させる遺伝子変異を有する。例えばKRAS変異細胞は、KRASタンパク質（例えば配列番号４のタンパク質）の12番目、13番目、及び61番目のアミノ酸の１つ以上に変異（典型的には、アミノ酸置換）を生じる遺伝子変異を有するものであってよい。
　一実施形態では、BRAF阻害剤によるがん細胞の増殖促進は、比較的低濃度のBRAF阻害剤へのがん細胞の曝露によって引き起こされる。がん細胞を、例えば5μM以下、2μM以下、0.01～2μM、0.1～2μM、又は0.1～1.0μMのBRAF阻害剤に曝露することにより、当該細胞の増殖（異常増殖）が促進される。本発明では、そのような比較的低濃度のBRAF阻害剤によるがん細胞の増殖促進を抑制することができる。
　好ましい一実施形態では、BRAF阻害剤によるがん細胞の増殖促進は、0.1～1.0μM以下のBRAF阻害剤への肺がん細胞の曝露によって引き起こされる。
　RAS変異細胞（特に、KRAS変異細胞）において、GSTP1は、RAS/RAF/MEK/ERKカスケード中のCRAFと相互作用し、上流のRASからの経路とは独立してオートクラインループによりCRAF/MEK/ERKカスケードを促進する。高濃度のBRAF阻害剤は、KRAS変異細胞等GSTP1を強く発現している細胞（多くはがん細胞だが、まれにある種の正常細胞でもGSTP1を発現している）におけるBRAFタンパク質の活性を阻害するとともに、細胞内のGSTP1とCRAFの相互作用を抑制し、それによりRAS/RAF/MEK/ERKカスケードのオートクラインループが抑制されることから、当該細胞のほぼ完全なアポトーシスを誘導すると考えられる。一方で比較的低濃度のBRAF阻害剤は、これらの細胞のBRAFは阻害するがGSTP1とCRAFの相互作用を十分抑制できず、CRAFホモ二量体の発現量が増加した細胞が選択的に生き残る結果をもたらし、その結果、これらの細胞の増殖が促進されると考えられる。そして、本発明におけるGSTP1を抑制する薬物は、GSTP1とCRAFとの結合を阻害し、結果としてCRAF二量体形成を抑制することにより、BRAF阻害剤によるこれらの細胞の増殖促進を抑制することができる。
　GSTP1を抑制する薬物は、BRAF阻害剤によるがん細胞の増殖促進を抑制するための細胞増殖抑制剤の有効成分として用いることができる。したがって本発明は、GSTP1を抑制する薬物を含む、BRAF阻害剤によるがん細胞の増殖促進を抑制するための細胞増殖抑制剤に関する。本発明に係る細胞増殖抑制剤は、GSTP1を抑制する薬物を有効量で含み得る。本発明に係る細胞増殖抑制剤は、組成物であってもよい。
　本発明に係る細胞増殖抑制剤は、後述するように医薬として使用してもよいし、又は研究用試薬として使用してもよい。本発明に係る細胞増殖抑制剤は、例えば、in vivo又はin vitroで使用することができる。本明細書において、「in vivo」とは、生物個体内で使用することを指し、「in vitro」とは、個体から単離された臓器、組織、又は細胞において使用することを指す。
　本発明は、GSTP1を抑制する薬物、又はそれを含む上記細胞増殖抑制剤を含む医薬も提供する。本発明に係る医薬は、BRAF阻害剤によるがん細胞の増殖促進に対する抑制作用に基づき、BRAF阻害剤によって誘導される腫瘍形成を抑制するために用いることができる。BRAF阻害剤によって誘導される腫瘍形成は、例えば、RAS変異細胞、例えば、KRAS変異細胞の腫瘍形成であり得る。
　本発明に係る細胞増殖抑制剤又は医薬は、GSTP1を抑制する薬物に加えて、製薬上許容される添加剤をさらに含むことができる。製薬上許容される添加剤としては、例えば、担体（固体や液体担体等）、賦形剤、界面活性剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、溶解補助剤、懸濁化剤、コーティング剤、着色剤、矯味矯臭剤、保存剤、緩衝剤、pH調整剤、希釈剤、安定化剤、噴射剤等が挙げられるが、これらに限定されない。
　本発明に係る細胞増殖抑制剤又は医薬は、投与経路又は薬物放出様式等に応じた任意の剤形に製剤化することができる。本発明に係る細胞増殖抑制剤又は医薬は、適切な材料、例えば、腸溶性のコーティング又は時限崩壊性の材料で被覆した薬剤に製剤化してもよく、又は適切な薬物放出システムに組み込んでもよい。
　本発明に係る細胞増殖抑制剤又は医薬は、経口及び非経口の両方を包含する種々の経路、例えば、限定されないが、経口、静脈内、筋肉内、皮下、局所、腫瘍内、直腸、動脈内、門脈内、心室内、経粘膜、経皮、鼻内、腹腔内、肺内及び子宮内等の経路で投与してもよく、各投与経路に適した剤形に製剤化してもよい。かかる剤形及び製剤方法は任意の公知のものを適宜採用することができる。
　例えば、経口投与に適した剤形としては、限定されないが、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、液剤、懸濁剤、乳剤、ゲル剤、シロップ剤等が挙げられる。非経口投与に適した剤形としては、限定されないが、溶液性注射剤、懸濁性注射剤、乳濁性注射剤、用時調製型注射剤等の注射剤が挙げられる。非経口投与用製剤は、水性又は非水性の等張性無菌溶液又は懸濁液の形態であり得る。
　本発明に係るGSTP1を抑制する薬物、細胞増殖抑制剤又は医薬は、BRAF阻害剤によるがん細胞の増殖促進を抑制し、及び／又はBRAF阻害剤によって誘導される腫瘍形成を抑制することが望まれる対象に投与するのに適している。そのような対象は、以下に限定するものではないが、BRAF阻害剤を投与されたか又は投与されている対象であってよい。対象は、例えば、がん（例えば、BRAF変異がん）に罹患しているか又は罹患していた患者であってよい。本発明に係るGSTP1を抑制する薬物、細胞増殖抑制剤又は医薬を投与する対象は、任意の動物、好ましくは、ヒト、ゴリラ、チンパンジー等の霊長類、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウサギ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ等を始めとする哺乳動物であってよい。
　本発明に係るGSTP1を抑制する薬物、細胞増殖抑制剤又は医薬を投与される対象が、BRAF阻害剤を投与された対象である場合、該対象は、好ましくは合計30ｍｇ／ｋｇ以下、より好ましくは合計15ｍｇ／ｋｇ以下、さらに好ましくは合計10ｍｇ／ｋｇ以下のBRAF阻害剤を投与された対象であってもよい。この投与量は、相対的に低い量であり、BRAF阻害剤によるがん細胞の増殖促進を引き起こし得る。
　本発明に係るGSTP1を抑制する薬物、細胞増殖抑制剤又は医薬により抑制される上記の腫瘍形成は、例えば、肺腺がん、粘膜腺種、膵管腺がん等の腺がん、大腸がん、乳がん、線維肉腫、肺がん、皮膚扁平上皮がん、メラノーマ等のがんの腫瘍形成であり得るが、これらに限定されない。
　本発明は、本発明に係るGSTP1を抑制する薬物、細胞増殖抑制剤、又は医薬を、それを必要とする対象に投与することを含む、BRAF阻害剤によって誘導される腫瘍形成を抑制する方法も提供する。この方法は、BRAF阻害剤によって誘導される腫瘍形成（がん）の予防のために用いることもできる。
　本発明に係るGSTP1を抑制する薬物、細胞増殖抑制剤、又は医薬の投与量は、対象に関する種々の条件、例えば、症状の重篤度、対象の一般健康状態、年齢、体重、対象の性別、食事、投与の時期及び頻度、併用している医薬、治療への反応性、剤形、及び治療に対するコンプライアンス等を考慮して当業者が適宜決定することができる。例えば、GSTP1を抑制する薬物が0.0000001mg／体重kg／日～1000mg／体重kg／日又は0.0001mg／体重kg／日～1mg／体重kg／日となる量で投与してもよい。
　投与は、1回のみ行ってもよいし、定期的又は不定期に複数回行ってもよい。投与頻度は、例えば、1日1回、1日複数回（例えば、1日2、3、4回又は5回以上）、数日毎（例えば、2、3、4、5、6、7日毎等）、1週間毎、数週間毎（例えば、2、3、4週間毎等）、又は数ヶ月毎（例えば、2、3、4、5、6、7ヶ月毎等）であってもよい。
　本発明に係るGSTP1を抑制する薬物、細胞増殖抑制剤、又は医薬は、他の細胞増殖抑制剤又は抗がん剤と併用してもよい。併用する場合は、同時に投与するための配合剤としてもよいし、あるいは独立して投与するための別個の製剤としてもよい。併用は、同時投与及び連続投与を含む。
　以下、実施例を用いて本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
［実施例１］BRAF阻害剤によるmKRAS細胞の逆説的増殖（paradoxical growth）
　KRAS変異を有する細胞（mKRAS細胞）として、ヒト肺がん由来細胞株A549（RIKEN BRC CELL BANK, #RCB2095）を使用した。A549細胞はKRASタンパク質の12番目のグリシン（G）のセリン（S）への置換を引き起こす変異型KRAS遺伝子を有している。なお、該A549細胞はBRAF遺伝子に変異を有さない細胞である。
　BRAF阻害剤としては、PLX4032（ベムラフェニブ）を使用した。PLX4032は、BRAFタンパク質にV600E変異を有する腫瘍の増殖抑制に有効な薬剤として使用されている。
　A549細胞を、10％FBS（ウシ胎児血清）及び2mMグルタミンを添加したD-MEM培地中、0.1μM、1μM、又は10μMのPLX4032に72時間にわたって曝露した後、細胞数をカウントした。対照として、10％FBS及び2mMグルタミンを添加したD-MEM培地に0.05％ DMSOを添加して同様の実験を行った。
　その結果を図１Ａに示す。より高濃度（10μM）のPLX4032での処理はA549細胞の増殖を抑制したが、より低濃度（0.1～1.0μM）のPLX4032での処理はA549細胞の増殖を逆に促進した。このことから、BRAF阻害剤PLX4032は、低濃度では、mKRAS細胞の逆説的増殖を促進することが示された。
［実施例２］siGSTP1の、BRAF阻害剤による逆説的増殖の抑制効果
　mKRAS細胞におけるGSTP1の発現を抑制するため、GSTP1に対するsiRNAを用いた。GSTP1に対するsiRNA（以下、siGSTP1と称する）としては、siGSTP1B（Thermo Fisher Scientific, #2385）を用いた。AllStars Negative Control siRNA（#S103650318、Qiagen）を対照siRNA（以下、siControlと称する）として用いた。
　siRNAのトランスフェクションは、リポフェクタミン(R)RNAiMAX（Thermo Fisher Scientific）を用いて、製造業者の指示書に従って行った。具体的には、まず、実施例１に従って1μMのPLX4032又は0.05％ DMSOで処理したA549細胞を、抗生物質を含まない通常培地（D-MEM+10%FBS）中で培養し、トランスフェクションの時点で細胞密度を20～30％コンフルエントとした。Opti-MEMTMI無血清培地（Opti-MEMTMI Reduced Serum Medium）中にsiRNAを含むsiRNA溶液と、リポフェクタミン(R)RNAiMAXを混合し、それを最終siRNA濃度50nMで細胞に添加して5時間インキュベートすることによりトランスフェクションした。
　トランスフェクションした細胞を、抗生物質を含まない通常の培地中で2時間培養し、次いで60 mmディッシュにサブクローニングし、細胞の総数を5日間カウントした。
　結果を図１Ｂに示す。siGSTP1の投与により、BRAF阻害剤PLX4032によって促進されたmKRAS細胞の増殖はほとんど完全に抑制された。
　したがってsiGSTP1は、GSTP1をサイレンシングすることにより、単にmKRAS細胞の増殖を抑制するだけでなく、BRAF阻害剤によって引き起こされる逆説的増殖（増殖促進）も抑制できることが示された。
［実施例３］siGSTP1のCRAF二量体形成に対する影響
　BRAF阻害剤により逆説的増殖が促進されたmKRAS細胞における、siGSTP1のCRAF二量体形成への影響を調べた。
　実施例１に従って1μMのPLX4032又は0.05％ DMSOで処理したA549細胞に、リポフェクタミン(R)RNAiMAX（Thermo Fisher Scientific）を用いて、siGSTP1B（Thermo Fisher Scientific, #2385）又はsiControlを、最終siRNA濃度50nMでトランスフェクションし、24時間培養し、さらにリポフェクタミン(R)3000（Thermo Fisher Scientific）を用いて、ベクターpcDNA3.1-FLAG-CRAF及びpcDNA3.1-V5-His-CRAFを共トランスフェクションした。pcDNA3.1-FLAG-CRAF及びpcDNA3.1-V5-His-CRAFはヒトCRAFタンパク質にタグFLAG(R)又はV5-Hisを付加した融合タンパク質をコードしている。16時間後、トランスフェクションした細胞を、0.5％ NP-40溶解バッファー（0.5％ NP-40、20 mM HEPES, pH 7.4、150 mM NaCl、1 mM MgCl2、1 mM EGTA、10％グリセロール、Complete Mini（Roche）、Phos STOP（Roche））中で氷上に30分間置いて溶解させ、13000×gで10分間、4℃で遠心分離することによりタンパク質溶解物を取得した。
　得られたタンパク質溶解物に、Dynabeads(R)プロテインA（Thermo Fisher Scientific）-コンジュゲート抗体又は抗FLAG M2磁性ビーズ（SIGMA）を加えて4℃でインキュベートすることにより、CRAF二量体を共免疫沈降させた。得られた沈降物を0.5% NP-40溶解バッファーで4回洗浄し、次いで免疫ブロッティングによる解析を行った。沈降物（タンパク質）をSDS-PAGEで分画し、PVDF膜に転写した後、一次抗体を添加してインキュベートし、さらに抗ウサギ又はマウスIgGヤギ二次抗体を添加して検出を行った。一次抗体としては、抗FLAG抗体（#F3165; Sigma-Aldrich）、抗V5タグ抗体（#R960-25; Thermo Fisher Scientific）、抗GSTπ抗体（#312; MBL）、又は抗β-アクチン抗体（#A5441; Sigma-Aldrich）を用いた。検出シグナルは、ECL or ECL prime western blotting detection system（GE healthcare）を使用して可視化した。
　対照として、タンパク質溶解物を、共免疫沈降せずに、免疫ブロッティングによって同様に解析した。
　結果を図２に示す。BRAF阻害剤PLX4032によって処理されたmKRAS細胞（siControlを導入）では、抗FLAG抗体で共免疫沈降させたタンパク質における抗V5抗体での検出シグナルが大きく増加し、CRAFの二量体形成が促進されていた。一方、BRAF阻害剤PLX4032によって処理されたmKRAS細胞にsiGSTP1を導入したところ、抗FLAG抗体によりCRAFの存在は確認されたが、抗V5抗体での検出シグナルは消失し、CRAFの二量体形成が顕著に抑制された。この結果は、GSTP1の抑制が、CRAF二量体形成の抑制を介して、BRAF阻害剤による逆説的細胞増殖をほぼ完全に抑制することを示す。
［実施例４］
　PLX4032がGSTP1とCRAFの相互作用に及ぼす影響を調べるため、PLX4032の存在下でGSTP1とCRAFの解離速度を調べた。
　BLItzシステム（ForteBio Inc.）を製造業者の指示書に従って使用し、固定化、ブロッキング、平衡化、結合、及び解離ステップを実施することにより、GSTP1とCRAFの間の解離定数（Kd）を決定した。具体的には、まず、カルボキシル基を有するバイオセンサーチップ（Amine Reactive Second-Generation (AR2G) Biosensor, ForteBio Inc.）を、水中での実験に先立ち、一晩水和させた。組換えGSTP1（Sigma-Aldrich）を酢酸バッファー（pH 3.0）中、バイオセンサーチップ上に固定化した。固定化後、余剰の活性化カルボキシル基をエタノールアミンでブロッキングした。組換えCRAFはOrigene Technologies, Inc.から購入し、結合ステップにおいて希釈無しで使用した。BRAF阻害剤PLX4032は最終濃度10μMで使用した。バッファー（25 mM Tris-HCl, pH 7.3、100 mMグリシン、10％グリセロール）を、平衡化及び解離ステップに使用した。BLItzシステムによる解析は、ベースライン測定300秒、固定化300秒、ブロッキング120秒、平衡化30秒、結合120秒、及び解離120秒で実施した。
　結果を図３及び表１に示す。BRAF阻害剤PLX4032の存在下では、解離定数Kdが大きく上昇したことから、PLX4032処理により、GSTP1タンパク質とCRAFタンパク質の相互作用（結合）が弱まることが示された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　本発明によれば、BRAF阻害剤による腫瘍形成の誘導を抑制することにより、BRAF阻害剤に基づく抗がん治療剤の有効性を高めることができる。

Claims (11)

  1. 　GSTP1を抑制する薬物を含む、BRAF阻害剤によるがん細胞の増殖促進を抑制するための細胞増殖抑制剤。
  2. 　がん細胞が、KRAS変異細胞である、請求項１に記載の細胞増殖抑制剤。
  3. 　GSTP1を抑制する薬物が、GSTP1に対するsiRNA又はshRNAである、請求項１又は２に記載の細胞増殖抑制剤。
  4. 　BRAF阻害剤によるがん細胞の増殖促進が、5μM以下のBRAF阻害剤へのがん細胞の曝露によって引き起こされる、請求項１～３のいずれか１項に記載の細胞増殖抑制剤。
  5. 　BRAF阻害剤によるがん細胞の増殖促進が、0.1～1.0μM以下のBRAF阻害剤への肺がん細胞の曝露によって引き起こされる、請求項１～４のいずれか１項に記載の細胞増殖抑制剤。
  6. 　前記がん細胞が、BRAF遺伝子に変異を有さない細胞である、請求項１～５のいずれか１項に記載の細胞増殖抑制剤。
  7. 　請求項１～６のいずれか１項に記載の細胞増殖抑制剤を含む、BRAF阻害剤によって誘導される腫瘍形成を抑制するための医薬。
  8. 　腫瘍形成が、KRAS変異細胞の腫瘍形成である、請求項７に記載の医薬。
  9. 　BRAF阻害剤を投与されたか又は投与されている対象に投与するための、請求項７又は８に記載の医薬。
  10. 　BRAF阻害剤がベムラフェニブである、請求項７～９のいずれか１項に記載の医薬。
  11. 　合計30ｍｇ／ｋｇ以下のBRAF阻害剤を投与された対象に投与するための、請求項７～１０のいずれか１項に記載の医薬。
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