JP2019011365A - 癌治療のための副次的遺伝子不活性化バイオマーカーおよび標的 - Google Patents

癌治療のための副次的遺伝子不活性化バイオマーカーおよび標的 Download PDF

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Abstract

【課題】対象における癌を治療する方法を提供すること。【解決手段】癌を有することが決定された対象を治療するための方法は、遺伝子の阻害剤で対象を治療することによるハウスキーピング遺伝子のヘテロ接合性不活性化（または機能的に冗長なハウスキーピング遺伝子のホモ接合性欠失）を含む。例えば、ＥＮＯ遺伝子欠失を有する癌を有する対象は、エノラーゼ阻害剤等の解糖阻害剤で治療され得る。例えば、いくつかの態様では、ＡＲＳ遺伝子欠失を有する癌を有する対象は、ＡＲＳ阻害剤で治療され得る。【選択図】なし

Description

本出願は、２０１１年１２月１４日に出願された米国仮特許出願第６１／５７０，３６６号、および２０１２年５月２９日に出願された第６１／６５２，７３８号の利益を主張するものであり、これら双方ともに参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる。
本発明は、国立衛生研究所から授与された助成金番号Ｐ０１ＣＡ９５６１６のもと、政府の援助を受けて行われた。米国政府は、本発明においてある権利を有する。
２ＫＢ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）で測定）であり、２０１２年１２月１４日に作成された、“ＵＴＦＣＰ１１３８ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ”という名前のファイルに含まれる配列表は、電子提出により本明細書とともに提出され、参照により本明細書に組み込まれる。
本発明は、概して、分子生物学および腫瘍学の分野に関する。より具体的には、（例えば、他の機序の中で、遺伝子コード配列の全部または一部の欠失または変異、遺伝子座の後成的サイレンシングによって）機能的に不活性化された必須遺伝子の１つのコピーを有する癌を特定および治療するための方法に関する。
癌の功を奏する治療は、近年の当該分野における急速な進歩にもかかわらず、依然として分かりにくい。有効な治療において複雑にする１つの主な要因は、（例えば、病理学検査による）腫瘍特徴付けの従来の診断分析が、どの種類の抗癌治療が任意の所与の癌の治療に功を奏し得るかについての限られた指針しか提供しないことである。実際に、癌細胞は、様々な抗癌治療に対する広範な抵抗性／感受性を呈するため、所与の治療に抵抗性であるか、または感受性があるかを予測することが困難であった。この問題に取り組むために、最近になって腫瘍細胞の遺伝分析を用いて、患者における特定の癌細胞をさらに特徴付けている。しかしながら、そのような分析の結果は、典型的に、癌における過剰な遺伝的変化を示し、治療介入に有用な指針を提供しない場合が多い。例えば、ゲノムの大きな領域のヘテロ接合性欠失は、癌における原型的身体事象である。多くの場合、癌細胞によって呈される遺伝的不安定性は、重要な腫瘍抑制遺伝子の機能を除去することによって、腫瘍形成を推進する。しかしながら、多くの場合欠失は大きく、癌の病因において既知の役割を持たない近傍遺伝子を包含することができる。現在まで、腫瘍細胞中のそのような変異が、癌の診断または治療を改善するためにどのように利用され得るかについての指針は存在しない。
本発明の実施形態は、いくつかの癌が、冗長なハウスキーピング遺伝子中にホモ接合性欠失を有すること、およびこれは、非欠失の冗長な相同体を標的とすることによって、治療的に利用され得るという発見に基づいている。同様に、ハウスキーピング遺伝子中にヘテロ接合性欠失を含む癌もまた、そのハウスキーピング遺伝子の非欠失コピーを標的とする治療的処置に対して感受性になることが認識された。なおもさらなる実施形態では、２つ（以上）のハウスキーピング遺伝子中にヘテロ接合性欠失を含む癌細胞は、そのヘテロ接合性欠失を含むハウスキーピング遺伝子のそれぞれの非欠失コピーを標的とする治療的処置に対して感受性になり、それによって治療され得る。
一態様では、本発明の実施形態は、対象における癌を治療する方法を提供する。癌は、ハウスキーピング遺伝子中にホモ接合性欠失を有し、このハウスキーピング遺伝子は、機能的に冗長な相同体を有する。対象は、細胞を、冗長な相同体の活性を阻害するのに十分な量の冗長な相同体の阻害剤と接触させることによって治療される。
別の態様では、本発明の実施形態は、細胞増殖を障害する、および／または細胞の細胞死を誘導する方法を提供する。この細胞は、ハウスキーピング遺伝子中にホモ接合性欠失を有し、ハウスキーピング遺伝子は、機能的に冗長な相同体を有する。細胞増殖および／または細胞死は、細胞を、冗長な相同体の活性を阻害するのに十分な量の冗長な相同体の阻害剤と接触させることによって誘導される。
任意選択により、細胞は、化学療法薬とさらに接触される。いくつかの実施形態では、化学療法薬は、ＤＮＡホメオスタシスに干渉する。
阻害剤は、例えば、冗長な相同体の発現または活性を阻害する核酸、冗長な相同体に特異的に結合する抗体、または小分子であることができる。阻害剤は、例えば、ホスホノアセトヒドロキサム酸塩、デヒドロエピアンドロステロン、Ｎｐ２ＡＤ、Ｎｐ４ＡＤ、Ｎａｐ４ＡＤ、フルオロクエン酸塩もしくはホパンテン酸塩、またはそれらの誘導体を含む。
いくつかの態様では、ハウスキーピング遺伝子は、エンドラーゼ１（ＥＮＯ１）であり、冗長な相同体は、エンドラーゼ２（ＥＮＯ２）であるか、ハウスキーピング遺伝子は、ヘキソース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｈ６ＰＤ）であり、冗長な相同体は、グルコース−６−デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤ）であるか、ハウスキーピング遺伝子は、キネシンファミリーメンバー１Ｂ（ＫＩＦ１Ｂ）であり、冗長な相同体は、キネシンファミリーメンバー１Ａ（ＫＩＦ１Ａ）もしくはキネシンファミリーメンバー１Ｃ（ＫＩＦ１Ａ）であるか、ハウスキーピング遺伝子は、ニコチンアミドヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼ１（ＮＭＮＡＴ１）であり、冗長な相同体は、ニコチンアミドヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼ２（ＮＭＮＡＴ２）もしくはニコチンアミドヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼ３（ＮＭＮＡＴ３）であるか、ハウスキーピング遺伝子は、ユビキチン化因子Ｅ４Ｂ（ＵＢＥ４Ｂ）であり、冗長な相同体は、ユビキチン化因子４Ａ（ＵＢＥ４Ａ）であるか、ハウスキーピング遺伝子は、アコニターゼ１（ＡＣＯ１）であり、冗長な相同体は、アコニターゼ２（ＡＣＯ２）もしくはアコニターゼ３（ＡＣＯ３）であるか、ハウスキーピング遺伝子は、ｋｅｌｃｈ様９（ＫＬＨＬ９）であり、冗長な相同体は、ｋｅｌｃｈ様１３（ＫＬＨＬ１３）であるか、ハウスキーピング遺伝子は、パントテン酸キナーゼ１（ＰＡＮＫ１）であり、冗長な相同体は、パントテン酸キナーゼ３（ＰＡＮＫ３）であるか、またはハウスキーピング遺伝子は、キナーゼファミリーメンバー２０Ｂ（ＫＩＦ２０Ｂ）であり、冗長な相同体は、キナーゼファミリーメンバー２０Ａ（ＫＩＦ２０Ａ）である。
本発明に従う方法によって治療される対象における治療計画の有効性を、対象における試料中のハウスキーピング遺伝子の代謝経路の１つ以上の代謝産物のレベルを測定することによって評価する方法も本発明の実施形態によって提供される。代謝産物の蓄積は、治療が有効であることを示す。例えば、ハウスキーピング遺伝子はエノラーゼであり、代謝産物はグリセリン酸塩である。
別段に定義されない限り、本明細書に使用される全ての技術および科学用語は、本発明が関係する当該技術分野の当業者によって広く理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載の方法および物質と同様もしくは同等の任意の方法および物質を本発明の実践において使用することができるが、適切な方法および物質は、以下に説明される。本明細書に記述される全ての出版物、特許出願、特許、および他の参考文献は、参照によりそれら全体が明示的に組み込まれる。対立する場合は、定義を含む本明細書が優先する。さらに、本明細書に記載の材料、方法、および実施例は単なる例示であり、限定することを意図されない。
さらなる実施形態では、癌を有する対象を治療するための方法が提供され、少なくとも第１の解糖阻害剤を対象に投与することを含み、癌の細胞が、エノラーゼ１（ＥＮＯ１）遺伝子の１つのコピーを不活性化するヘテロ接合性変異を含むことが決定された。したがって、いくつかの態様では、癌を有する対象を治療するための方法が提供され、（ａ）ＥＮＯ１遺伝子の１つのコピーを不活性化するヘテロ接合性変異を有する癌細胞を含むことが決定される対象を選択することと、（ｂ）少なくとも第１の解糖阻害剤を対象に投与することと、を含む。
さらなる実施形態では、解糖阻害剤治療（すなわち、第１の解糖阻害剤による治療）に癌を有する対象を選択するための方法が提供され、対象の癌細胞が、ＥＮＯ１遺伝子の１つのコピーを不活性化するヘテロ接合性変異を含むかを決定することを含み、癌細胞がヘテロ接合性変異を含む場合、対象は解糖阻害剤治療に選択される。さらなる態様では、解糖阻害剤治療に癌を有する対象を選択するための方法が提供され、（ａ）対象の癌細胞が、ＥＮＯ１遺伝子の１つのコピーを不活性化するヘテロ接合性変異を含むかを決定することと、（ｂ）対象の癌細胞がヘテロ接合性変異を含む場合、解糖阻害剤治療に対象を選択することと、を含む。
なおもさらなる実施形態では、癌を有する対象における解糖阻害剤治療に対する応答を予測するための方法が提供され、対象の癌細胞が、ＥＮＯ１遺伝子の１つのコピーを不活性化するヘテロ接合性変異を含むかを決定することを含み、癌細胞がヘテロ接合性変異を含む場合、対象は、解糖阻害剤治療に対する好ましい応答を有することが予測される。さらなる態様では、癌を有する対象における解糖阻害剤治療に対する応答を予測するための方法が提供され、（ａ）対象の癌細胞が、ＥＮＯ１遺伝子の１つのコピーを不活性化するヘテロ接合性変異を含むかを決定することと、（ｂ）対象に由来する癌細胞がヘテロ接合性変異を含む場合、対象を、解糖阻害剤治療に対する好ましい応答を有することが予測されると特定するか、または対象に由来する癌細胞がヘテロ接合性変異を含まない場合、対象を、解糖阻害剤治療に対する好ましい応答を有することが予測されないと特定することと、を含む。
なおもさらなる実施形態では、癌を有する対象を治療するための方法が提供され、少なくともｔ−ＲＮＡシンテターゼ（ＡＲＳ）阻害剤を対象に投与することを含み、癌の細胞が、ＡＲＳ遺伝子の１つのコピーを不活性化するヘテロ接合性変異を含むことが決定された。したがって、いくつかの態様では、癌を有する対象を治療するための方法が提供され、（ａ）ＡＲＳ遺伝子の１つのコピーを不活性化するヘテロ接合性変異を有する癌細胞を含むことが決定される対象を選択することと、（ｂ）少なくとも第１のＡＲＳ阻害剤を対象に投与することと、を含む。
さらなる実施形態では、ＡＲＳ阻害剤治療（すなわち、第１のＡＲＳ阻害剤による治療）に癌を有する対象を選択するための方法が提供され、対象の癌細胞が、ＡＲＳ遺伝子の１つのコピーを不活性化するヘテロ接合性変異を含むかを決定することを含み、癌細胞がヘテロ接合性変異を含む場合、対象はＡＲＳ阻害剤治療に選択される。さらなる態様では、ＡＲＳ阻害剤治療に癌を有する対象を選択するための方法が提供され、（ａ）対象の癌細胞が、ＡＲＳ遺伝子（または２つ以上のＡＲＳ遺伝子）の１つのコピーを不活性化するヘテロ接合性変異を含むかを決定することと、（ｂ）対象の癌細胞がヘテロ接合性変異を含む場合、ＡＲＳ阻害剤治療に対象を選択することと、を含む。
なおもさらなる実施形態では、癌を有する対象におけるＡＲＳ阻害剤治療に対する応答を予測するための方法が提供され、対象の癌細胞が、ＡＲＳ遺伝子の１つのコピーを不活性化するヘテロ接合性変異を含むかを決定することを含み、癌細胞が、ヘテロ接合性変異を含む場合、対象は、ＡＲＳ阻害剤治療に対する好ましい応答を有することが予測される。さらなる態様では、癌を有する対象におけるＡＲＳ阻害剤治療に対する応答を予測するための方法が提供され、（ａ）対象の癌細胞が、ＡＲＳ遺伝子の１つのコピーを不活性化するヘテロ接合性変異を含むかを決定することと、（ｂ）対象に由来する癌細胞がヘテロ接合性変異を含む場合、対象を、ＡＲＳ阻害剤治療に対する好ましい応答を有することが予測されると特定するか、または対象に由来する癌細胞がヘテロ接合性変異を含まない場合、対象を、ＡＲＳ阻害剤治療に対する好ましい応答を有することが予測されないと特定することと、を含む。
さらなる実施形態では、癌を有する対象を治療するための方法が提供され、少なくとも第１のホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ阻害剤を対象に投与することを含み、癌の細胞が、ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ（ＰＧＤ）遺伝子の１つのコピーを不活性化するヘテロ接合性変異を含むことが決定される。したがって、いくつかの態様では、癌を有する対象を治療するための方法が提供され、（ａ）ＰＧＤ遺伝子の１つのコピーを不活性化するヘテロ接合性変異を有する癌細胞を含むことが決定される対象を選択することと、（ｂ）少なくとも第１のホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ阻害剤（例えば、６−アミノニコチンアミド）を対象に投与することと、を含む。
さらなる実施形態では、ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ阻害剤治療（すなわち、第１のホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ阻害剤での治療）に癌を有する対象を選択するための方法が提供され、対象の癌細胞が、ＰＧＤ遺伝子の１つのコピーを不活性化するヘテロ接合性変異を含むかを決定することを含み、癌細胞がヘテロ接合性変異を含む場合、対象はホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ阻害剤治療に選択される。さらなる態様では、ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ阻害剤治療に癌を有する対象を選択するための方法が提供され、（ａ）対象の癌細胞が、ＰＧＤ遺伝子の１つのコピーを不活性化するヘテロ接合性変異を含むかを決定することと、（ｂ）対象の癌細胞がヘテロ接合性変異を含む場合、ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ阻害剤治療に対象を選択することと、を含む。
なおもさらなる実施形態では、癌を有する対象におけるホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ阻害剤治療に対する応答を予測するための方法が提供され、対象の癌細胞が、ＰＧＤ遺伝子の１つのコピーを不活性化するヘテロ接合性変異を含むかを決定することを含み、癌細胞がヘテロ接合性変異を含む場合、対象は、ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ阻害剤治療に対する好ましい応答を有することが予測される。さらなる態様では、癌を有する対象におけるホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ阻害剤治療に対する応答を予測するための方法が提供され、（ａ）対象の癌細胞が、ＰＧＤ遺伝子の１つのコピーを不活性化するヘテロ接合性変異を含むかを決定することと、（ｂ）対象に由来する癌細胞がヘテロ接合性変異を含む場合、対象を、ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ阻害剤治療に対する好ましい応答を有することが予測されると特定するか、または対象に由来する癌細胞がヘテロ接合性変異を含まない場合、対象を、ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ阻害剤治療に対する好ましい応答を有することが予測されないと特定することと、を含む。
さらなる実施形態では、癌を有する対象を治療するための方法が提供され、少なくとも第１の解糖阻害剤を対象に投与することを含み、癌の細胞が、ＧＡＰＤＨ、ＥＮＯ２、および／またはＴＰＩ遺伝子（それぞれ１２ｐ１３に位置する）の１つのコピーを不活性化するヘテロ接合性変異を含むことが決定される。したがって、いくつかの態様では、癌を有する対象を治療するための方法が提供され、（ａ）ＧＡＰＤＨ、ＥＮＯ２、および／またはＴＰＩ遺伝子の１つのコピーを不活性化するヘテロ接合性変異を有する癌細胞を含むことが決定される対象を選択することと、（ｂ）少なくとも第１の解糖阻害剤を対象に投与することと、を含む。
さらなる実施形態では、解糖阻害剤治療（すなわち、第１の解糖阻害剤による治療）に癌を有する対象を選択するための方法が提供され、対象の癌細胞が、ＧＡＰＤＨ、ＥＮＯ２、および／またはＴＰＩ遺伝子の１つのコピーを不活性化するヘテロ接合性変異を含むかを決定することを含み、癌細胞がヘテロ接合性変異を含む場合、対象は解糖阻害剤治療に選択される。さらなる態様では、解糖阻害剤治療に癌を有する対象を選択するための方法が提供され、（ａ）対象の癌細胞が、ＧＡＰＤＨ、ＥＮＯ２、および／またはＴＰＩ遺伝子の１つのコピーを不活性化するヘテロ接合性変異を含むかを決定することと、（ｂ）対象の癌細胞がヘテロ接合性変異を含む場合、解糖阻害剤治療に対象を選択することと、を含む。
なおもさらなる実施形態では、癌を有する対象における解糖阻害剤治療に対する応答を予測するための方法が提供され、対象の癌細胞が、ＧＡＰＤＨ、ＥＮＯ２、および／またはＴＰＩ遺伝子の１つのコピーを不活性化するヘテロ接合性変異を含むかを決定することを含み、癌細胞がヘテロ接合性変異を含む場合、対象は、解糖阻害剤治療に対する好ましい応答を有することが予測される。さらなる態様では、癌を有する対象における解糖阻害剤治療に対する応答を予測するための方法が提供され、（ａ）対象の癌細胞が、ＧＡＰＤＨ、ＥＮＯ２、および／またはＴＰＩ遺伝子の１つのコピーを不活性化するヘテロ接合性変異を含むかを決定することと、（ｂ）対象に由来する癌細胞がヘテロ接合性変異を含む場合、対象を、解糖阻害剤治療に対する好ましい応答を有することが予測されると特定するか、または対象に由来する癌細胞がヘテロ接合性変異を含まない場合、対象を、解糖阻害剤治療に対する好ましい応答を有することが予測されないと特定することと、を含む。
実施形態のある態様は、必須遺伝子の１つのコピー、例えば、ＥＮＯ１、ＡＲＳ遺伝子、ＰＧＤ遺伝子、ＧＡＰＤＨ遺伝子、ＥＮＯ２遺伝子、および／またはＴＰＩ遺伝子の１つのコピーを不活性化するヘテロ接合性変異を含む癌に関する。本明細書で使用する際、「ヘテロ接合性変異」は、遺伝子の２つのコピーのうちの１つのみにおける変異を指す（２倍体細胞中、または３媒体細胞中の１つの喪失、または倍数体細胞中の１つのコピーを除く全ての喪失）。
例えば、ヘテロ接合性変異は、ＥＮＯ１の１つのコピーを機能的に不活性化した欠失、置換、変換、再配置、または挿入であることができる。いくつかの態様では、変異は、染色体１ｐ３６におけるヘテロ接合性の喪失等の欠失である。したがって、ある態様では、ＥＮＯ１ならびにＲＥＲＥ、ＣＡ６、および／またはＳＬＣ２Ａ７を不活性化する欠失等のヘテロ接合性欠失は、複数のＥＮＯ１遺伝子を包含することができる。例えば、いくつかの態様では、実施形態の方法は、ＥＮＯ１の５’および３’欠失を決定することを必要とし、それによってＥＮＯ１が間接的に不活性化（欠失）されることを決定することができる。ＥＮＯ１に対する５’位遺伝子の例として、ＮＰＨＰ４、ＫＣＮＡＢ２、ＣＨＤ５、ＲＰＬ２２、ＲＮＦ２０７、Ｃ１ｏｒｆ２１１、ＧＰＲ１５３、ＩＣＭＴ、ＨＥＳ３、ＡＣＯＴ７、ＴＮＦＲＳＦ２５、ＰＬＥＫＨＧ５、ＤＮＡＪＣ１１、ＨＥＳ２、ＥＳＰＮ、ＭＩＲ４２５２、ＮＯＬ９、ＴＡＳ１Ｒ１、ＺＢＴＢ４８、ＫＬＨＬ２１、ＰＨＦ１３、ＴＨＡＰ３、ＣＡＭＴＡ１、ＶＡＭＰ３、ＰＥＲ３、ＵＴＳ２、ＴＮＦＲＳＦ９、ＴＲＮＡ＿Ｐｓｅｕｄｏ、ＰＡＲＫ７、ＡＸ７４７１２５、ＥＲＲＦＩ１、ＳＬＣ４５Ａ１、ＲＥＲＥ、およびＢＣ１１３９５８が挙げられるが、これらに限定されない。ＥＮＯ１に対する３’位遺伝子の非限定例として、ＣＡ６、ＳＬＣ２Ａ７、ＳＬＣ２Ａ５、ＧＰＲ１５７、ｍｉｒ−３４、ＭＩＲ３４Ａ、Ｈ６ＰＤ、ＳＰＳＢ１、５Ｓ ｒＲＮＡ、ＳＬＣ２５Ａ３３、ＴＭＥＭ２０１、ＰＩＫ３ＣＤ、Ｃ１ｏｒｆ２００、ＢＣ０３８５４１、ＣＬＳＴＮ１、ＣＴＮＮＢＩＰ１、ＬＺＩＣ、ＮＭＮＡＴ１、ＲＢＰ７、ＵＢＥ４Ｂ、ＫＩＦ１Ｂ、ＡＰＩＴＤ１−ＣＯＲＴ、ＰＥＸ１４、ＣＡＳＺ１、Ｍｉｒ＿５８４、ＰＧＤ、ＡＰＩＴＤ１、ＣＯＲＴ、ＤＦＦＡ、Ｃ１ｏｒｆ１２７、ＴＡＲＤＢＰ、ＭＡＳＰ２、ＳＲＭ、ＭＴＯＲ、ＡＮＧＰＴＬ７、ＥＸＯＳＣ１０、ＵＢＩＡＤ１、ＰＴＣＨＤ２、ＦＢＸＯ２、ＦＢＸＯ４４、ＦＢＸＯ６、ＭＡＤ２Ｌ２、Ｃ１ｏｒｆ１８７、ＡＫ１２５４３７、ＡＧＴＲＡＰ、Ｃ１ｏｒｆ１６７、ＭＴＨＦＲ、ＣＬＣＮ６、ＮＰＰＡ−ＡＳ１、ＮＰＰＡ、ＮＰＰＢ、ＫＩＡＡ２０１３、ＰＬＯＤ１、およびＭＦＮ２が挙げられる。ある態様では、癌は、染色体１の全腕を喪失するヘテロ接合性変異を含む。場合によって、ＥＮＯ１のヘテロ接合性欠失は、ＥＮＯ１遺伝子の上流および下流にあるランダムＤＮＡ断片の細胞遺伝学的染色体の広がり、またはコピー数の分析によって決定され得る。
いくつかの態様では、ヘテロ接合性変異は、ＧＡＰＤＨ、ＥＮＯ２、および／またはＴＰＩ遺伝子の１つのコピーを機能的に不活性化した、欠失、置換、変換、再配置、または挿入であることができる。いくつかの態様では、変異は、染色体１２ｐ１３におけるヘテロ接合性の喪失等の欠失である。したがって、ある態様では、遺伝子の２つまたは３つ全てを不活性化する欠失等のヘテロ接合性欠失は、複数のＧＡＰＤＨ、ＥＮＯ２、および／またはＴＰＩ遺伝子を包含することができる。
さらなる実施例では、ヘテロ接合性変異は、ＡＲＳ遺伝子の１つのコピー、例えば、ＥＰＡＲＳ（ＥＰＲＳとして知られる）、ＶＡＲＳ、ＩＡＲＳ、ＣＡＲＳ、ＳＡＲＳ、ＹＡＲＳ、ＡＡＲＳ、ＫＡＲＳ、ＬＡＲＳ、ＨＡＲＳ、ＲＡＲＳ、またはＴＡＲＳ遺伝子の１つのコピーを機能的に不活性化した欠失、置換、変換、再配置、または挿入であることができる。いくつかの態様では、変異は、その遺伝子を含む染色体座におけるヘテロ接合性の喪失等の欠失である。例えば、癌細胞は、５ｑ１３、１ｑ４１、６ｐ２１、９ｑ２４、１１ｐ１５、１ｐ１３、１ｐ３５、１６ｑ１３、１６ｑ２４、５ｑ３１、５ｑ３２、または５ｑ３５におけるヘテロ接合性の喪失を含むことができる。したがって、ある態様では、ＳＡＲＳならびにＹＡＲＳ；ＡＡＲＳおよびＫＡＲＳ；ＬＡＲＳおよびＨＡＲＳまたはＬＡＲＳ ＨＡＲＳおよびＲＡＲＳを不活性化する欠失等のヘテロ接合性欠失は、複数のＡＲＳ遺伝子を包含することができる。
なおもさらなる実施例では、ヘテロ接合性変異は、ＰＧＤ遺伝子の１つのコピーを機能的に不活性化した欠失、置換、変換、再配置、または挿入であることができる。いくつかの態様では、変異は、遺伝子を含む、例えば、１ｐ３６．２２を含む染色体座におけるヘテロ接合性の喪失等の欠失である。ある態様では、欠失は、染色体１ｐの追加部分を包含することができる。例えば、癌細胞は、ＥＮＯ１およびＰＧＤを含む欠失を含むことができる。したがって、いくつかの態様では、ＥＮＯ１およびＰＧＤ双方の１つのコピーの不活性化を含むと特定された癌は、６−アミノニコチンアミド等のＰＧＤ阻害剤との併用で、少なくとも第１の解糖阻害剤により治療することができる。
実施形態のいくつかの態様は、少なくとも第１の解糖阻害剤を対象（例えば、ＥＮＯ１遺伝子の１つのコピーに変異を有する対象）への投与に関する。解糖阻害剤の例として、ピルビン酸キナーゼ（例えば、ＰＫＬＲ１またはＰＫＭ２）、エノラーゼ（例えば、ＥＮＯ１、ＥＮＯ２、またはＥＮＯ３）、ホスホグリセリン酸ムターゼ（例えば、ＰＧＭ１、ＰＧＭ２、ＰＧＭ２Ｌ１、ＰＧＭ３、またはＰＧＭ５）、ホスホグリセリン酸キナーゼ（例えば、ＰＧＫ１またはＰＧＫ２）、グリセルアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、トリオースリン酸イソメラーゼ（ＴＰＩ）、フルクトース二リン酸アルドラーゼ（例えば、Ａｌｄｏａ、Ａｌｄｏｂ、またはＡｌｄｏｃ）、ホスホフルクトキナーゼ（ＰＦＫＬ、ＰＦＫＭ、またはＰＦＫＰ）、ホスホグルコースイソメラーゼ（ＧＰＩ）、およびヘキソキナーゼ（例えば、ＨＫ１、ＨＫ２、またはＨＫ３）が挙げられるが、これらに限定されない。さらなる態様では、阻害剤は、ミトコンドリア電子伝達鎖の阻害剤である。いくつかの態様では、解糖阻害剤は、阻害性ポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡ）、例えば、ピルビン酸キナーゼをコードする遺伝子の全てまたは一部に相補的な阻害性ポリヌクレオチド、エノラーゼ（例えば、ＥＮＯ１）、ホスホグリセリン酸ムターゼ、ホスホグリセリン酸キナーゼ、グリセルアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、フルクトース二リン酸アルドラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、およびヘキソキナーゼである。なおもさらなる態様では、解糖阻害剤は、小分子阻害剤またはそのプロドラッグである。実施形態に従って使用するための解糖阻害剤の例として、２−デオキシグルコース、６−アミノニコチンアミド、テトロース二リン酸塩、コニンギン酸、およびＭＪＥ３が挙げられるが、これらに限定されない。
ある好適な態様では、治療薬として使用するための解糖阻害剤は、癌において特定されるヘテロ接合性遺伝子の不活性化に基づいて選択される。例えば、癌細胞がＥＮＯ１のヘテロ接合性不活性化を含む場合、解糖阻害剤治療は、エノラーゼ阻害剤を含むことができる。同様に、癌がＧＡＰＤＨ、ＥＮＯ２、またはＴＰＩ遺伝子のヘテロ接合性不活性化を有する場合、解糖阻害剤治療は、ＧＡＰＤＨ、エノラーゼ、またはＴＰＩ阻害剤をそれぞれ含むことができる。ある態様では、癌細胞は、解糖経路中に２つ以上の遺伝子のヘテロ接合性不活性化を含み、解糖阻害剤治療は、ヘテロ接合性欠失に供される遺伝子のそれぞれの阻害剤を含む。
いくつかの好適な態様では、実施形態に従って使用するための解糖阻害剤は、エノラーゼ１阻害剤等のエノラーゼ阻害剤である。例えば、エノラーゼ１阻害剤は、ＥＮＯ１遺伝子の全てまたは一部に相補的なｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡ等の阻害性ポリヌクレオチドであり得る（例えば、ｍＲＮＡをコードするエノラーゼ１の全てまたは一部に相補的、例えば、ＮＣＢＩ受入番号ＮＭ＿００１２０１４８３．１またはＮＭ＿００１４２８．３参照）。なおもさらなる態様では、エノラーゼ阻害剤は、小分子エノラーゼ阻害剤またはそのプロドラッグである。小分子エノラーゼ阻害剤の例として、Ｄ−タルトロン酸セミアルデヒドリン酸塩；３−アミノエノールピルビン酸−２−リン酸塩；ホスホノアセトヒドロキサム酸塩（ＰｈＡＨ）；２−フルオロ−２−ホスホノアセトヒドロキサム酸塩；（３−ヒドロキシ−２−ニトロプロピル）ホスホン酸塩；（ニトロエチル）ホスホン酸塩；ｄ−（ホスホノエチル）ニトロール酸塩；フルオリド、および前述のうちのいずれかのプロドラッグが挙げられるが、これらに限定されない。
実施形態に従って使用するためのＡＲＳ阻害剤の例として、ボレリジンまたはそのプロドラッグが挙げられるが、これらに限定されない。なおもさらなる態様では、ＡＲＳ阻害剤は、ハロフジノン等のフェブリフギン誘導体である（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｓｕｎｄｒｕｄ ｅｔ ａｌ．，２００９、およびＫｅｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１２参照）。いくつかの態様では、ＡＲＳ阻害剤は、抗菌性ＡＲＳ阻害剤である。なおもさらなる態様では、ＡＲＳ阻害剤は、ＡＲＳ遺伝子の全てまたは一部に相補的なｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡ等の阻害性ポリヌクレオチドであり得る。ある態様では、ＡＲＳ阻害剤は、タンパク質合成のさらなる阻害剤、またはアミノ酸飢餓応答の活性剤と併せて投与される。
実施形態に従って使用するためのＰＧＤ阻害剤の例として、例えば、６−アミノニコチンアミドまたはそのプロドラッグが挙げられる。いくつかの態様では、ＰＧＤ阻害剤は、ＰＧＤ遺伝子の全てまたは一部に相補的なｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡ等の阻害性ポリヌクレオチドであり得る（例えば、ＮＣＢＩ受入番号ＮＭ＿００２６３１．２参照）。
実施形態に従って投与するための標的阻害剤治療（例えば、解糖ＰＧＤまたはＡＲＳ阻害剤）は、典型的に、薬学的に許容される担体中で製剤される。そのような治療は、例えば、静脈内、皮内、動脈内、腹腔内、病巣内、頭蓋内、関節内、前立腺内、胸膜内、気管市内、鼻腔内、硝子体内、膣内、直腸内、局所的、腫瘍内、筋内、腹腔内、皮下、結膜下、肺胞内、粘膜内、心膜内、臍帯内、眼球内、経口、局所的、局在的、吸入（例えば、エアロゾル吸入）、注入によるか、または点滴によって送達され得る。送達の経路は、例えば、治療される癌の種類、および使用される阻害剤の種類に依存することができる。さらなる態様では、解糖、ＰＤＧ、またはＡＲＳ阻害剤等の阻害剤は、２回以上投与され得る（例えば、３、４、５、６、７、８、９、または１０回）。そのような治療の投与間隔は変化し得、投与間隔が約１、２、もしくは３日、約１、２、もしくは３週間、または１ヶ月以上が挙げられるが、これらに限定されない。
なおもさらなる実施形態では、癌を有する対象を治療するための方法が提供され、標的阻害剤治療（例えば、解糖、ＰＤＧ、またはＡＲＳ阻害剤治療）を、少なくとも第２の治療との併用で対象に投与することを含む。例えば、第２の治療は、標的阻害剤治療前、治療後、または治療中に投与され得る。標的阻害剤治療と第２の治療との間隔は多様であることができ、治療間が約１、２、もしくは３日、約１、２、もしくは３週間、または１ヶ月以上が挙げられるが、これらに限定されない。第２の抗癌治療は、外科的治療、化学療法、癌細胞標的治療、放射線治療、凍結療法、温熱治療、光線療法、放射線切除治療、ホルモン療法、免疫療法、小分子治療、受容体キナーゼ阻害剤治療、抗血管形成治療、サイトカイン治療、またはモノクローナル抗体、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、または遺伝子治療による治療等の生物学的療法であり得るが、これらに限定されない。なおもさらなる態様では、第２の治療は、第１の解糖阻害剤に対して異なる解糖経路成分を標的とする阻害剤等のさらに異なる解糖阻害剤の投与を含むことができる。さらなる態様では、第２の治療は、ミトコンドリア電子伝達鎖阻害剤（例えば、ムブリチニブもしくはオリゴマイシン）または転写因子Ｈｉｆ１αの阻害剤の投与を含む。
実施形態のいくつかの態様は、癌を有する対象等の対象を必要とする。本明細書において使用する際、対象は、ヒトまたは非ヒト動物対象（例えば、イヌ、ネコ、マウス、ウマ等）であることができる。ある態様では、対象は、口腔癌、口腔咽頭癌、鼻咽頭癌、呼吸器癌、泌尿生殖器癌、胃腸癌、中枢または末梢神経系組織癌、内分泌もしくは神経内分泌癌または造血細胞癌、神経膠腫、肉腫、癌腫、リンパ腫、黒色腫、線維腫、髄膜腫、脳癌、口腔咽頭癌、鼻咽頭癌、腎癌、胆道癌、褐色細胞腫、膵島細胞癌、リ−フラウメニ腫瘍、甲状腺癌、副甲状腺癌、下垂体腫瘍、副腎腫瘍、骨原性肉種、多発性神経内分泌Ｉ型およびＩＩ型腫瘍、乳癌、肺癌、頭頸部癌、前立腺癌、食道癌、気道癌、肝癌、膀胱癌、胃癌、膵癌、卵巣癌、子宮癌、子宮頸癌、精巣癌、大腸癌、直腸癌、または皮膚癌等の癌を有する。いくつかの態様では、癌は、神経膠腫、膠芽細胞腫、希突起神経膠腫、または大細胞神経内分泌肺腫瘍である。さらなる態様では、癌は、眼内／ブドウ膜黒色腫等の黒色腫であることができる。なおもさらなる態様では、癌は、転移癌または少なくとも第１の化学療法に抵抗性の癌である。
実施形態のいくつかの態様は、対象の癌細胞が、ＥＮＯ１遺伝子の１つのコピーを不活性化するヘテロ接合性変異を含むかを決定することに関する。対象の癌細胞が、ヘテロ接合性変異を含むかを決定するために使用され得る方法の例として、ＤＮＡ配列決定、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、核酸ハイブリダイゼーション（例えば、サザンブロットまたはｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション）またはＤＮＡ制限分析、または不活性化変異を検出するＤＮＡ制限分析（例えば、欠失、再配置、置換、挿入、または変換）が挙げられるが、これらに限定されない。さらなる態様では、実施形態の方法は、エノラーゼ発現またはエノラーゼ活性を測定することを含むことができる。例えば、エノラーゼ１ ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現を測定し、基準発現レベルと比較して、対象の癌細胞がＥＮＯ１遺伝子の１つのコピーを不活性化するヘテロ接合性変異を含むかを決定することができる。ＲＮＡ発現を測定するための方法として、核酸ハイブリダイゼーション（例えば、ノーザンブロット、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、またはアレイハイブリダイゼーション）、および定量的逆転写ＰＣＲが挙げられるが、これらに限定されない。エノラーゼ１タンパク質発現を測定するための方法の非限定例として、ＥＬＩＳＡ、免疫測定、放射免疫測定（ＲＩＡ）、免疫組織化学、免疫放射測定、蛍光免疫測定、化学発光測定、生物発光測定、ゲル電気泳動、ウェスタンブロット分析、フローサイトメトリー、陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）、または単光子放射コンピュータ断層撮影（ＳＰＥＣＴ）撮像を行うことが挙げられる。同様に、いくつかの態様では、エノラーゼ１活性を測定し（例えば、基質触媒を測定することによって）、基準発現レベルと比較して、対象の癌細胞がＥＮＯ１遺伝子の１つのコピーを不活性化するヘテロ接合性変異を含むかを決定することができる。
いくつかの態様では、生体試料（例えば、癌細胞もしくは代謝産物、またはそれに由来する核酸を含む試料）は、実施形態に従って分析するために患者から得られる。例えば、生体試料は、血液、組織（例えば、生検）、尿、便、または唾液試料であり得るが、これらに限定されない。いくつかの態様では、試料は、腫瘍生検試料である。
いくつかの態様では、実施形態の方法は、対象の癌細胞が、ＥＮＯ１遺伝子またはＡＲＳ遺伝子の１つのコピーを不活性化するヘテロ接合性変異を含むかを報告することをさらに含む。なおもさらなる態様では、方法は、解糖阻害剤治療（例えば、エノラーゼ阻害剤治療）またはＡＲＳ阻害剤治療に対して好ましい応答を有することが予測されるか、または予測されないと特定されたかを報告することを含むことができる。例えば、そのような報告は、手書き、電子、または口頭報告を提供することによるものであることができる。いくつかの態様では、報告は対象に提供される。なおもさらなる態様では、この報告は、保険会社または医療従事者（例えば、医師もしくは病院）等の第３者に提供される。
実施形態のある態様は、対象が、解糖阻害剤治療またはＡＲＳ阻害剤治療に対して好ましい応答を有するかを予測することに関する。例えば、好ましい応答は、腫瘍サイズまたは負荷の低減、腫瘍成長の阻止、腫瘍関連疼痛の低減、癌関連病変の低減、癌関連の症状の低減、癌の非進行、無病期間の増加、無増悪期間の増加、寛解の誘導、転移の低減、患者の生存率の増加、または抗癌治療に対する腫瘍の感受性の増加であり得る。
なおもさらなる実施形態では、少なくとも第１の解糖阻害剤（例えば、エノラーゼ阻害剤）と、ＥＮＯ１遺伝子の１つのコピーを不活性化するヘテロ接合性変異について細胞を検査するための少なくとも第１の試薬と、を含むキットが提供される。例えば、解糖阻害剤は、当該技術分野において既知であるか、または本明細書に詳述されるもののうちのいずれかであり得る。いくつかの態様では、解糖阻害剤は、エノラーゼ阻害剤である。細胞を検査する際に使用するための試薬の例として、ＥＮＯ１遺伝子内またはそれに隣接して結合する核酸分子（例えば、オリゴヌクレオチドプライマー）、抗エノラーゼ１抗体、およびエノラーゼ酵素基質（標識基質等）が挙げられるが、これらに限定されない。
同様に、さらなる実施形態では、ＡＲＳ阻害剤と、ＡＲＳ遺伝子の１つのコピーを不活性化するヘテロ接合性変異について細胞を検査するための試薬と、を含むキットが提供される。細胞を検査する際に使用するための試薬の例として、ＡＲＳ遺伝子内またはそれに隣接して結合する核酸分子（例えば、オリゴヌクレオチドプライマー）、抗ＡＲＳ抗体、およびＡＲＳ酵素基質（標識基質等）が挙げられるが、これらに限定されない。
なおもさらなる実施形態では、エノラーゼ阻害剤治療の有効性を監視するための方法が提供され、エノラーゼ阻害剤で治療される対象に由来する試料中のグリセリン酸塩または１，３ジヒドロキシアセトンのレベルを測定することを含み、グリセリン酸塩または１，３ジヒドロキシアセトンのレベルが、基準レベルと比較して上昇していない場合に、対象が、追加のエノラーゼ阻害剤治療を必要とし、およびグリセリン酸塩または１，３ジヒドロキシアセトンのレベルが、基準レベルと比較して上昇している場合に、対象が、追加のエノラーゼ阻害剤治療を必要としない。いくつかの態様では、エノラーゼ阻害剤治療の有効性を監視するための方法が提供され、（ａ）エノラーゼ阻害剤で治療される対象に由来する試料中のグリセリン酸塩または１，３ジヒドロキシアセトンのレベルを測定することと、（ｂ）グリセリン酸塩または１，３ジヒドロキシアセトンのレベルが、基準レベルと比較して上昇していない場合に、対象を、追加のエノラーゼ阻害剤治療を必要とすると特定するか、またはグリセリン酸塩または１，３ジヒドロキシアセトンのレベルが、基準レベルと比較して上昇している場合に、対象を、追加のエノラーゼ阻害剤治療を必要としないと特定することと、を含む。いくつかの態様では、実施形態の方法は、グリセリン酸塩または１，３ジヒドロキシアセトンのレベルに基づいて、追加のエノラーゼ阻害剤治療を対象に投与することをさらに含む。いくつかのさらなる態様では、追加のエノラーゼ阻害剤治療は、エノラーゼ阻害剤治療の追加投与、またはより高い用量のエノラーゼ阻害剤の投与である。なおもさらなる態様では、実施形態の方法は、グリセリン酸塩または１，３ジヒドロキシアセトンのレベルを対象に報告するか、または対象が追加のエノラーゼ阻害剤治療を必要とするかを報告することをさらに含む。
本明細書で使用する際、「ａ」または「ａｎ」は１つ以上を意味し得る。請求項（複数可）で使用する際、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という単語と併用されるとき、「ａ」または「ａｎ」は、１つまたは複数を意味し得る。
請求項における「または（ｏｒ）」という用語の使用は、代替のみを指すことが明示されるか、または代替が相互に排他的でない限り、「および／または（ａｎｄ／ｏｒ）」を意味するように使用されるが、本開示は、代替のみを指す定義ならびに「および／または（ａｎｄ／ｏｒ）」を支持する。本明細書で使用する際、「別の（ａｎｏｔｈｅｒ）」は、少なくとも２つ目以上を意味し得る。
本出願全体で、「約（ａｂｏｕｔ）」という用語は、値がデバイスの固有の誤差の変動を含むことを示すように示され、この方法は、研究対象間に存在する値または変動を決定するように用いられる。
本発明の他の目的、特徴、および利点は、以下の詳細な説明から明白となるであろう。しかしながら、本発明の趣旨および範囲内の様々な変化および修正は、この詳細な説明から当業者に明白となるため、詳細な説明および特定の実施例は、本発明の好適な実施形態を示すが、単なる例証として提供されることを理解されたい。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
対象における癌を治療する際に使用するための組成物であって、前記癌が、ハウスキーピング遺伝子中にホモ接合性欠失を有し、前記ハウスキーピング遺伝子が、機能的に冗長な相同体を有し、前記組成物が、前記冗長な相同体の活性を阻害するのに十分な量の前記冗長な相同体の阻害剤を含む、前記組成物。
（項目２）
前記阻害剤が、前記冗長な相同体の発現または活性を阻害する核酸であるか、前記冗長な相同体に特異的に結合する抗体であるか、または前記冗長な相同体の小分子阻害剤である、項目１に記載の組成物。
（項目３）
化学療法薬をさらに含む、項目１に記載の組成物。
（項目４）
前記化学療法薬が、ＤＮＡホメオスタシスに干渉する、項目３に記載の組成物。
（項目５）
ａ）前記ハウスキーピング遺伝子が、エノラーゼ１（ＥＮＯ１）であり、前記冗長な相同体が、エンドラーゼ２（ＥＮＯ２）であるか、
ｂ）前記ハウスキーピング遺伝子が、ヘキソース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｈ６ＰＤ）であり、前記冗長な相同体が、グルコース−６デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤ）であるか、
ｃ）前記ハウスキーピング遺伝子が、キネシンファミリーメンバー１Ｂ（ＫＩＦ１Ｂ）であり、前記冗長な相同体が、キネシンファミリーメンバー１Ａ（ＫＩＦ１Ａ）またはキネシンファミリーメンバー１Ｃ（ＫＩＦ１Ｃ）であるか、
ｄ）前記ハウスキーピング遺伝子が、ニコチンアミドヌクレオチドアデニルリルトランスフェラーゼ１（ＮＭＮＡＴ１）であり、前記冗長な相同体が、ニコチンアミドヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼ２（ＮＭＮＡＴ２）またはニコチンアミドヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼ３（ＮＭＮＡＴ３）であるか、
ｅ）前記ハウスキーピング遺伝子が、ユビキチン化因子Ｅ４Ｂ（ＵＢＥ４Ｂ）であり、前記冗長な相同体が、ユビキチン化因子４Ａ（ＵＢＥ４Ａ）であるか、
ｆ）前記ハウスキーピング遺伝子が、アコニターゼ１（ＡＣＯ１）であり、前記冗長な相同体が、アコニターゼ２（ＡＣＯ２）またはアコニターゼ３（ＡＣＯ３）であるか、
ｇ）前記ハウスキーピング遺伝子が、ｋｅｌｃｈ様９（ＫＬＨＬ９）であり、前記冗長な相同体が、ｋｅｌｃｈ様１３（ＫＬＨＬ１３）であるか、
ｈ）前記ハウスキーピング遺伝子が、パントテン酸キナーゼ１（ＰＡＮＫ１）であり、前記冗長な相同体が、パントテン酸キナーゼ３（ＰＡＮＫ３）であるか、または
ｉ）前記ハウスキーピング遺伝子が、キナーゼファミリーメンバー２０Ｂ（ＫＩＦ２０Ｂ）であり、前記冗長な相同体が、キナーゼファミリーメンバー２０Ａ（ＫＩＦ２０Ａ）である、項目１に記載の組成物。
（項目６）
部分（ａ）の阻害剤が、ホスホノアセトヒドロキサム酸塩、またはその誘導体である、項目５に記載の組成物。
（項目７）
部分（ｂ）の阻害剤が、デヒドロエピアンドロステロン、またはその誘導体である、項目５に記載の組成物。
（項目８）
部分（ｄ）の阻害剤が、Ｎｐ２ＡＤ、Ｎｐ４ＡＤ、もしくはＮａｐ４ＡＤ、またはそれらの誘導体である、項目５に記載の組成物。
（項目９）
部分（ｆ）の阻害剤が、フルオロクエン酸塩、またはその誘導体である、項目５に記載の組成物。
（項目１０）
部分（ｈ）の阻害剤が、ホパンテン酸塩、またはその誘導体である、項目５に記載の組成物。
（項目１１）
細胞増殖を障害する、および／または細胞の細胞死を誘導する生体外方法であって、前記細胞が、ハウスキーピング遺伝子中にホモ接合性欠失を有し、前記ハウスキーピング遺伝子が、機能的に冗長な相同体を有し、前記細胞を、前記冗長な相同体の活性を阻害するのに十分な量の前記冗長な相同体の阻害剤と接触させることを含む、前記生体外方法。
（項目１２）
対象における癌を治療する方法であって、前記癌が、ハウスキーピング遺伝子中にホモ接合性欠失を有し、前記ハウスキーピング遺伝子が、機能的に冗長な相同体を有し、前記冗長な相同体の活性を阻害するのに十分な量の前記冗長な相同体の阻害剤を、前記対象に投与することを含む、前記方法。
（項目１３）
細胞増殖を障害する、および／または細胞の細胞死を誘導する方法であって、前記細胞が、ハウスキーピング遺伝子中にホモ接合性欠失を有し、前記ハウスキーピング遺伝子が、機能的に冗長な相同体を有し、前記細胞を、前記冗長な相同体の活性を阻害するのに十分な量の前記冗長な相同体の阻害剤と接触させることを含む、前記方法。
（項目１４）
項目１に記載の方法によって治療された対象における治療計画の有効性を評価する生体外方法であって、前記対象由来の試料中の前記ハウスキーピング遺伝子の代謝経路の１つ以上の代謝産物のレベルを測定することを含み、前記代謝産物の蓄積が、前記治療が有効であることを示す、前記生体外方法。
（項目１５）
前記ハウスキーピング遺伝子が、エノラーゼであり、前記代謝産物が、グリセリン酸塩である、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
癌を有する対象を治療する際に使用するための組成物であって、前記癌の細胞が前記エノラーゼ１（ＥＮＯ１）遺伝子の１つのコピーを不活性化するヘテロ接合性変異を含むことが決定され、前記組成物が、有効量の解糖阻害剤を含む、前記組成物。
（項目１７）
前記ヘテロ接合性変異が、前記ＥＮＯ１遺伝子の１つのコピーの全てまたは一部の欠失である、項目１６に記載の組成物。
（項目１８）
前記ヘテロ接合性変異が、前記ＥＮＯ１の１つのコピーを不活性化する置換または挿入である、項目１６に記載の組成物。
（項目１９）
前記欠失が、染色体１ｐ３６におけるヘテロ接合性の喪失を含む、項目１７に記載の組成物。
（項目２０）
前記解糖阻害剤が、小分子解糖阻害剤、またはそのプロドラッグを含む、項目１６に記載の組成物。
（項目２１）
前記解糖阻害剤が、エノラーゼ阻害剤である、項目１６に記載の組成物。
（項目２２）
前記エノラーゼ阻害剤が、小分子エノラーゼ阻害剤である、項目２１に記載の組成物。
（項目２３）
前記小分子エノラーゼ阻害剤が、Ｄ−タルトロン酸セミアルデヒドリン酸塩；３−アミノエノールピルビン酸−２−リン酸塩；ホスホノアセトヒドロキサム酸塩（ＰｈＡＨ）；２−フルオロ−２−ホスホノアセトヒドロキサム酸塩；（３−ヒドロキシ−２−ニトロプロピル）ホスホン酸塩；（ニトロエチル）ホスホン酸塩；ｄ−（ホスホノエチル）ニトロール酸塩；またはそれらのプロドラッグを含む、項目１７に記載の組成物。
（項目２４）
前記小分子エノラーゼ阻害剤が、ＰｈＡＨまたはＰｈＡＨプロドラッグである、項目２３に記載の組成物。
（項目２５）
前記解糖阻害剤が、ピルビン酸キナーゼ、エノラーゼ、ホスホグリセリン酸ムターゼ、ホスホグリセリン酸キナーゼ、グリセルアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、フルクトース二リン酸アルドラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、またはヘキソキナーゼ阻害剤である、項目１６に記載の組成物。
（項目２６）
前記解糖阻害剤が、２−デオキシグルコース、６−アミノニコチンアミド、テトロース二リン酸、コニンギン酸、またはＭＪＥ３である、項目１６に記載の組成物。
（項目２７）
前記解糖阻害剤が、ＥＮＯ１遺伝子の全てまたは一部に相補的な阻害性ポリヌクレオチドである、項目２５に記載の組成物。
（項目２８）
前記阻害性ポリヌクレオチドが、ｓｉＲＮＡである、項目２５に記載の組成物。
（項目２９）
前記解糖阻害剤が、少なくとも第２の治療との併用投与を目的とする、項目１６に記載の組成物。
（項目３０）
第２の治療薬をさらに含む、項目２９に記載の組成物。
（項目３１）
前記第２の治療薬が、ホルモン治療薬、癌細胞標的治療薬、または化学療法薬を含む、項目３０に記載の組成物。
（項目３２）
前記第２の治療薬が、ミトコンドリア電子伝達鎖の阻害剤を含む、項目３０に記載の組成物。
（項目３３）
前記第２の治療薬が、ムブリチニブ、アンチマイシンＡ、ロテノン、またはオリゴマイシンを含む、項目３０に記載の組成物。
（項目３４）
前記第２の治療薬が、Ｈｉｆ１α転写因子の阻害剤を含む、項目３０に記載の組成物。
（項目３５）
前記治療薬が、ＰＸ−４７８を含む、項目３０に記載の組成物。
（項目３６）
前記第２の治療薬が、さらなる解糖経路阻害剤を含む、項目３０に記載の組成物。
（項目３７）
前記さらなる解糖経路阻害剤が、２−デオキシグルコース、６−アミノニコチンアミド、テトロース二リン酸、コニンギン酸、またはＭＪＥ３である、項目３６に記載の組成物。
（項目３８）
前記癌が、口腔癌、口腔咽頭癌、鼻咽頭癌、呼吸器癌、泌尿生殖器癌、胃腸癌、中枢または末梢神経系組織癌、内分泌もしくは神経内分泌癌または造血細胞癌、神経膠腫、肉腫、癌腫、リンパ腫、黒色腫、線維腫、髄膜腫、脳癌、口腔咽頭癌、鼻咽頭癌、腎癌、胆道癌、褐色細胞腫、膵島細胞癌、リ−フラウメニ腫瘍、甲状腺癌、副甲状腺癌、下垂体腫瘍、副腎腫瘍、骨原性肉種、多発性神経内分泌Ｉ型およびＩＩ型腫瘍、乳癌、肺癌、頭頸部癌、前立腺癌、食道癌、気道癌、肝癌、膀胱癌、胃癌、膵癌、卵巣癌、子宮癌、子宮頸癌、精巣癌、大腸癌、直腸癌、または皮膚癌である、項目１６に記載の組成物。
（項目３９）
前記癌が、膠芽細胞腫、希突起神経膠腫、または大細胞神経内分泌肺腫瘍である、項目１６に記載の組成物。
（項目４０）
前記癌が、転移性癌である、項目１６に記載の組成物。
（項目４１）
前記癌が、少なくとも第１の化学療法に抵抗性である、項目１６に記載の組成物。
（項目４２）
癌を有する対象を治療するための方法であって、前記癌の細胞が、前記エノラーゼ１（ＥＮＯ１）遺伝子の１つのコピーを不活性化するヘテロ接合性変異を含むことが決定され、前記方法が、解糖阻害剤を前記対象に投与することを含む、前記方法。
（項目４３）
解糖阻害剤治療に癌を有する対象を選択する生体外方法であって、前記対象の癌細胞が、前記エノラーゼ１（ＥＮＯ１）遺伝子の１つのコピーを不活性化するヘテロ接合性変異を含むかを決定することを含み、前記癌細胞が前記ヘテロ接合性変異を含む場合、前記対象が、解糖阻害剤治療に選択される、前記生体外方法。
（項目４４）
解糖阻害剤治療に癌を有する対象を選択する生体外方法であって、
（ａ）前記対象の癌細胞が、前記エノラーゼ１（ＥＮＯ１）遺伝子の１つのコピーを不活性化するヘテロ接合性変異を含むかを決定することと、
（ｂ）前記対象の癌細胞が前記ヘテロ接合性変異を含む場合、解糖阻害剤治療のために対象を選択することと、を含む、前記生体外方法。
（項目４５）
癌を有する対象における解糖阻害剤治療に対する応答を予測する生体外方法であって、前記対象の癌細胞が、前記エノラーゼ１（ＥＮＯ１）遺伝子の１つのコピーを不活性化するヘテロ接合性変異を含むかを決定することを含み、前記癌細胞が前記ヘテロ接合性変異を含む場合、前記対象が解糖阻害剤治療に対する好ましい応答を有することが予測される、前記生体外方法。
（項目４６）
癌を有する対象における解糖阻害剤治療に対する応答を予測する生体外方法であって、（ａ）前記対象の癌細胞が、前記エノラーゼ１（ＥＮＯ１）遺伝子の１つのコピーを不活性化するヘテロ接合性変異を含むかを決定することと、
（ｂ）前記対象由来の癌細胞が前記ヘテロ接合性変異を含む場合、前記対象を、解糖阻害剤治療に対する好ましい応答を有することが予測される対象として特定するか、または前記対象由来の癌細胞が前記ヘテロ接合性変異を含まない場合、前記対象を、解糖阻害剤治療に対する好ましい応答を有することが予測されない対象として特定することと、を含む、前記生体外方法。
（項目４７）
前記解糖阻害剤治療が、エノラーゼ阻害剤治療である、項目４３〜４６のいずれか１項に記載の方法。
（項目４８）
前記ヘテロ接合性変異が、ＥＮＯ１の１つのコピーの全てまたは一部の欠失である、項目４３〜４６のいずれか１項に記載の方法。
（項目４９）
前記対象の癌細胞が、前記エノラーゼ１（ＥＮＯ１）遺伝子の１つのコピーを不活性化するヘテロ接合性変異を含むかを報告することをさらに含む、項目４３〜４６のいずれか１項に記載の方法。
（項目５０）
前記報告が、書面による報告書または電子報告書を提供することを含む、項目４９に記載の方法。
（項目５１）
前記対象が、解糖阻害剤治療に対して好ましい応答を有することが予測される対象または予測されない対象として特定されたかを報告することをさらに含む、項目４６に記載の方法。
（項目５２）
前記報告が、書面による報告書または電子報告書を提供することを含む、項目５１に記載の方法。
（項目５３）
前記対象の癌細胞が前記ヘテロ接合性変異を含むかを決定することが、ＤＮＡ配列決定、ポリメラーゼ連鎖反応、核酸ハイブリダイゼーション、またはＤＮＡ制限分析を含む、項目４３〜４６のいずれか１項に記載の方法。
（項目５４）
前記対象の癌細胞が前記ヘテロ接合性変異を含むかを決定することが、エノラーゼ発現または活性を測定することを含む、項目４３〜４６のいずれか１項に記載の方法。
（項目５５）
解糖阻害剤治療に対する好ましい応答が、腫瘍サイズまたは負荷の低減、腫瘍成長の阻止、腫瘍関連疼痛の低減、癌関連病変の低減、癌関連症状の低減、癌の非進行、無病期間の増加、無増悪期間の増加、寛解の誘導、転移の低減、患者生存率の増加、または抗癌治療に対する腫瘍の感受性の増加を含む、項目４５または４６に記載の方法。
（項目５６）
解糖阻害剤と、前記エノラーゼ１（ＥＮＯ１）遺伝子の１つのコピーを不活性化するヘテロ接合性変異について細胞を試験するための試薬と、を含む、キット。
（項目５７）
前記解糖阻害剤が、エノラーゼ阻害剤である、項目５６に記載のキット。
（項目５８）
前記エノラーゼ阻害剤が、小分子エノラーゼ阻害剤である、項目５７に記載のキット。
（項目５９）
前記エノラーゼ阻害剤が、Ｄ−タルトロン酸セミアルデヒドリン酸塩；３−アミノエノールピルビン酸−２−リン酸塩；ホスホノアセトヒドロキサム酸塩（ＰｈＡＨ）；２−フルオロ−２−ホスホノアセトヒドロキサム酸塩；（３−ヒドロキシ−２−ニトロプロピル）ホスホン酸塩；（ニトロエチル）ホスホン酸塩；ｄ−（ホスホノエチル）ニトロール酸塩、またはそのプロドラッグを含む、項目５８に記載のキット。
（項目６０）
エノラーゼ阻害剤治療の有効性を監視するための生体外方法であって、エノラーゼ阻害剤で治療される対象由来の試料中のグリセリン酸塩または１，３ジヒドロキシアセトンのレベルを測定することを含み、グリセリン酸塩または１，３ジヒドロキシアセトンのレベルが基準レベルと比較して上昇していない場合、前記対象がさらなるエノラーゼ阻害剤治療を必要とし、グリセリン酸塩または１，３ジヒドロキシアセトンのレベルが基準レベルと比較して上昇している場合、前記対象が追加のエノラーゼ阻害剤治療を必要としない、
前記生体外方法。
（項目６１）
エノラーゼ阻害剤治療の有効性を監視するための生体外方法であって、
（ａ）エノラーゼ阻害剤で治療された対象由来の試料中のグリセリン酸塩または１，３ジヒドロキシアセトンのレベルを測定することと、
（ｂ）グリセリン酸塩もしくは１，３ジヒドロキシアセトンのレベルが基準レベルと比較して上昇していない場合、前記対象を、追加のエノラーゼ阻害剤治療が必要である対象として特定するか、またはグリセリン酸塩もしくは１，３ジヒドロキシアセトンのレベルが基準レベルと比較して上昇している場合、前記対象を、追加のエノラーゼ阻害剤治療が必要でない対象として特定することと、を含む、前記生体外方法。
（項目６２）
さらなるエノラーゼ阻害剤治療が、エノラーゼ阻害剤治療のさらなる投与、またはより高い用量のエノラーゼ阻害剤治療の投与である、項目６０または６２に記載の方法。
（項目６３）
癌を有する対象を治療するための組成物であって、前記癌の細胞がｔＲＮＡシンテターゼ（ＡＲＳ）遺伝子の１つのコピーを不活性化するヘテロ接合性変異を含むことが決定されており、前記組成物が、有効量のＡＲＳ阻害剤、またはそのプロドラッグを含む、前記組成物。
（項目６４）
前記ヘテロ接合性変異が、ＡＲＳ遺伝子の１つのコピーの全てまたは一部の欠失である、項目６３に記載の組成物。
（項目６５）
前記欠失が、５ｑ１３、１ｑ４１、６ｐ２１、９ｑ２４、１１ｐ１５、１ｐ１３、１ｐ３５、１６ｑ１３、１６ｑ２４、５ｑ３１、５ｑ３２、または５ｑ３５からなる群から選択される領域におけるヘテロ接合性の喪失である、項目６４に記載の組成物。
（項目６６）
前記ヘテロ接合性変異が、ＡＲＳ遺伝子の１つのコピーを不活性化する置換または挿入である、項目６３に記載の組成物。
（項目６７）
前記ＡＲＳ遺伝子が、ＥＰＡＲＳ、ＶＡＲＳ、ＩＡＲＳ、ＣＡＲＳ、ＳＡＲＳ、ＹＡＲＳ、ＡＡＲＳ、ＫＡＲＳ、ＬＡＲＳ、ＨＡＲＳ、またはＲＡＲＳのうちの１つである、項目６３に記載の組成物。
（項目６８）
前記ＡＲＳ遺伝子が、ＴＡＲＳである、項目６３に記載の組成物。
（項目６９）
前記ＡＲＳ阻害剤が、小分子阻害剤である、項目６３に記載の組成物。
（項目７０）
前記小分子阻害剤が、ボレリジン、またはそのプロドラッグを含む、項目６４に記載の組成物。
（項目７１）
タンパク質合成阻害剤をさらに含む、項目６３に記載の組成物。
（項目７２）
癌を有する対象を治療するための方法であって、前記癌の細胞がｔＲＮＡシンテターゼ（ＡＲＳ）遺伝子の１つのコピーを不活性化するヘテロ接合性変異を含むことが決定されており、前記方法が、ＡＲＳ阻害剤、またはそのプロドラッグを前記対象に投与することを含む、前記方法。
（項目７３）
ＡＲＳ阻害剤治療のために癌を有する対象を選択する生体外方法であって、
（ａ）前記対象の癌細胞がＡＲＳ遺伝子の１つのコピーを不活性化するヘテロ接合性変異を含むかを決定することと、
（ｂ）前記対象の癌細胞が前記ヘテロ接合性変異を含む場合、ＡＲＳ阻害剤治療のために対象を選択することと、を含む、前記生体外方法。
（項目７４）
癌を有する対象におけるＡＲＳ阻害剤治療に対する応答を予測する生体外方法であって、前記対象の癌細胞がＡＲＳ遺伝子の１つのコピーを不活性化するヘテロ接合性変異を含むかを決定することを含み、前記癌細胞が前記ヘテロ接合性変異を含む場合、前記対象が、ＡＲＳ阻害剤治療に対する好ましい応答を有することが予測される、前記生体外方法。
（項目７５）
癌を有する対象における解糖阻害剤治療に対する応答を予測する生体外方法であって、（ａ）前記対象の癌細胞がＡＲＳ遺伝子の１つのコピーを不活性化するヘテロ接合性変異を含むかを決定することと、
（ｂ）前記対象に由来する癌細胞が前記ヘテロ接合性変異を含む場合、前記対象を、ＡＲＳ治療に対する好ましい応答を有することが予測される対象として特定するか、または前記対象に由来する癌細胞が前記ヘテロ接合性変異を含まない場合、前記対象を、ＡＲＳ阻害剤治療に対する好ましい応答を有することが予測されない対象として特定すること、を含む、前記生体外方法。
（項目７６）
ＡＲＳ阻害剤と、ＡＲＳ遺伝子の１つのコピーを不活性化するヘテロ接合性変異について細胞を試験するための試薬と、を含む、前記キット。
以下の図面は、本明細書の一部を形成し、本発明のある態様をさらに実証するように含まれる。本発明は、本明細書に提示される特定の実施形態の詳細な説明と併せて、これらの図面の１つ以上を参照することによってより良く理解され得る。
ＧＢＭ中の１ｐ３６遺伝子座のホモ接合性欠失は、原発腫瘍および細胞株中のＥＮＯ１発現の喪失をもたらす。ａ、ＴＣＧＡからのＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ａＣＧＨデータは、−１未満のｌｏｇ２コピー番号（白色の実値）を有する４つの原発ＧＢＭを示し、１ｐ３６遺伝子座のホモ接合性欠失を示す。 ｂ、ＤＮＡコピー数は、原発ＧＢＭ全体のｍＲＮＡ発現と強く相関し、発現は、ＥＮＯ１のｎ＝２コピー（ＷＴ、グレー）の腫瘍中で最高であり、ｎ＝０コピー（ヌル）の腫瘍中で最低である。 ｃ、Ｄ４２３−ＭＧ細胞株は、Ｗｅｌｌｃｏｍｅ Ｔｒｕｓｔ Ｓａｎｇｅｒ ＩｎｓｔｉｔｕｔｅデータセットからのＳＮＰアレイを使用することによって、ホモ接合性欠失したと特定された。 ｄ、Ｄ４２３−ＭＧおよびＧｌｉ５６細胞中のエノラーゼ１タンパク質の完全な不在は、ウェスタンブロットによって確認された。 ｅ、Ｄ４２３−ＭＧ ＥＮＯ１ヌル細胞中のＥＮＯ２のｓｈＲＮＡノックダウンは、頭蓋内腫瘍形成を生体内で切除した。 ＥＮＯ２のｓｈＲＮＡ切除は、ＥＮＯ１−ＷＴ ＧＢＭ細胞ではなく、ＥＮＯ１−ヌルに影響を及ぼす。ａ、ＥＮＯ２（ｓｈＥＮＯ２−３、ｓｈＥＮＯ２−４）に対する２つの独立したドキシサイクリン（Ｄｏｘ）誘導性ＴＲＩＰＺヘアピンによるｓｈＲＮＡ切除は、ＥＮＯ１ ＷＴ（Ａ１２０７、Ｕ８７、ＬＮ３１９）およびＥＮＯ１−ヌル（Ｄ４２３−ＭＧ）細胞株双方中のエノラーゼ２タンパク質レベルの７０％超の低減をもたらした。 ｂ、ＥＮＯ２の切除は、ＥＮＯ１ ＷＴ細胞ではなく、ＥＮＯ１−ヌルの成長を劇的に阻害したが、ルシフェラーゼに対する非標的ｓｈＲＮＡ（ｓｈＬｕｃ）は、任意の細胞株において影響を及ぼさなかった。ｓｈＬｕｃ、ｓｈＥＮＯ２−３、またはｓｈＲＮＯ２−４に感染した細胞の成長の最後の時点における代表的なプレートは、Ｄｏｘ誘導の有無にかかわらず、各細胞株の成長曲線に沿って示される。 ｐａｎ−エノラーゼ阻害剤ＰｈＡＨに対するＥＮＯ１−ヌル細胞の著しい感受性。ａ、ＥＮＯ１ ＷＴ細胞株および正常な星状細胞のいずれでもなく、Ｄ４２３−ＭＧおよびＧｌｉ５６ ＥＮＯ１−ヌルに対して急性毒性を示す、異なる濃度のｐｈＡＨによる治療後の細胞株のクリスタルバイオレット染色プレート。 ｂ、ＰｈＡＨ治療に対するＧＢＭ株の感受性は、それらの全体エノラーゼ活性と広く相関した。１μＭ ＰｈＡＨによる溶解物の予備インキュベーションは、エノラーゼ酵素活性を９５％超阻害した。 ｃ、ＰｈＡＨ治療は、５０μＭより高い濃度の場合を除いて、ＥＮＯ１ ＷＴ ＧＢＭ細胞および正常な星状細胞の成長に対して最小効果を有した。反対に、低濃度のＰｈＡＨであってもＥＮＯ１−ヌル細胞の成長を失速させるのに十分である。ＥＮＯ１ヘテロ接合性細胞（Ｄ５０２−ＭＧおよびＵ３４３）は、ＰｈＡＨ治療に対して中等度の感受性を示した。 ｄ、１５日後の培養物中のＰｈＡＨの不在下（左）または存在下（２５μＭ、右）での追加のＧＢＭ細胞株および正常な星状細胞のクリスタルバイオレット染色プレートの代表的な画像を示す。 ＥＮＯ１ホモ接合性欠失した原発腫瘍中のＥＮＯ１ ｍＲＮＡ発現の劇的な低減にもかかわらず、解糖関連転写の全体的な低減はない。ａ、ＴＣＧＡ ＧＢＭデータセットからのＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｕ１３３マイクロアレイデータ（ｙ軸上にプロットされるｌｏｇ２絶対ｍＲＮＡ発現）は、ＥＮＯ１ホモ接合性欠失した原発腫瘍中で最低のＥＮＯ１発現を示し（赤色の丸）、ヘテロ接合性欠失した腫瘍中で中間体の発現を示す（緑色の四角）。ｂ、主要な解糖遺伝子ＧＡＰＤＨの発現（ｙ軸）対ＥＮＯ１発現（ｘ軸）。ｃ、ｄ、ＥＮＯ３およびＥＮＯ２の発現対ＥＮＯ１発現；ＥＮＯ３発現は、極めて低い（ｙ軸上のスケールの差に留意されたい）。これらのデータからの主要な結論は、ＥＮＯ２またはＥＮＯ３の劇的な代償的上方調節も、ＥＮＯ１欠失腫瘍中のＧＡＰＤＨの腫瘍な変化もないことである。この発見は、主要な生体エネルギーリモデリングがＥＮＯ１−ヌル腫瘍中で発生しないことを示唆する。 同上 ＥＮＯ２のノックダウンは、ＥＮＯ１−ヌルＧＢＭ細胞の成長を失速させるが、ＥＮＯ１ ＷＴ ＧＢＭ細胞の成長に影響を及ぼさない。ａ、ｐＬＫＯ．１ベクターを通してレンチウイルス的に送達される２つの独立したヘアピンは、低減するエノラーゼ２タンパク質レベルにおいて、Ｄ４２３−ＭＧ、ＥＮＯ１−ヌルＧＢＭ細胞株中の非標的ヘアピン（ｓｈＮＴ）と比較して、８０％超有効である。 ｂ、同様レベルのＥＮＯ２ノックダウンは、Ｄ５０２−ＭＧ、ＥＮＯ１ ＷＴ ＧＢＭ細胞株中の同じ２つのヘアピンを使用して達成される。２つのヘアピンは、標的エノラーゼ２において選択的であり、エノラーゼ１タンパク質レベルを低減しない。 ｃ、１００時間の発光生存性測定を使用して得られる細胞増殖データは、双方の独立したヘアピンを使用してＥＮＯ２をノックダウンすることが、ｓｈＮＴと比較して、ＥＮＯ１−ヌル細胞の成長を著しく減速させることを示す。 ｄ、同じヘアピンで治療され、同じ条件下で培養されたＥＮＯ１ ＷＴ細胞は、ＥＮＯ２ノックダウンの有無にかかわらず、同様の速度で増殖する。 ＥＮＯ２のノックダウンは、ＥＮＯ１−ヌルＧＢＭ細胞の成長を失速させ、生体外および生体内双方の腫瘍形成能力を減少させる。ａ、ｐＧＩＰＺベクターを通してレンチウイルス的に送達されたヘアピン（ｓｈＥＮＯ２−３）は、細胞株Ｄ４２３−ＭＧ（ＥＮＯ１−ヌル）およびＤ５０２−ＭＧ（ＥＮＯ１ ＷＴ）中の非標的ヘアピン（ｓｈＮＴ）と比較して、ＥＮＯ２の発現を７０％超低減した。 ｂ、細胞増殖は、ＥＮＯ１ゲノム欠失の状況においてのみ劇的に減速した。 ｃ、軟寒天コロニー形成（ｃ）および生体内腫瘍形成特性（図２ｅ）もまた、ｓｈＮＴと比較して、ｓｈＥＮＯ２−３によってＤ４２３−ＭＧ ＥＮＯ１−ヌル細胞中で劇的に減少した。親細胞株が軟寒天コロニーまたは頭蓋内腫瘍を形成することができなかったため、軟寒天コロニー形成または生体内腫瘍形成特性を、Ｄ５０２−ＭＧ細胞中のＥＮＯ２切断のために回収することができなかった。 ヘアピン抵抗性ＥＮＯ２ ｃＤＮＡ構成体の発現は、エノラーゼ活性を回復し、ＥＮＯ１−ヌル細胞中のｓｈＥＮＯ２およびＰｈＡＨの有害作用を防ぐ。ａ、ｂ、ヘアピン抵抗性ＥＮＯ２（または対照としてＧＦＰ）を発現する構成体を使用して、ｐＴＲＩＰＺ ｓｈＥＮＯ２−４で既に形質導入したＤ４２３−ＭＧ細胞を感染させたところ、ドキシサイクリンによるヘアピン活性化とは無関係のエノラーゼ２タンパク質の強力な発現（ａ）ならびに全体エノラーゼ活性の強力な増加（ｂ）をもたらした。 同上 ｃ、ｄ、ＧＦＰではなくヘアピン抵抗性ＥＮＯ２の再発現が、ドキシサイクリンによるｓｈＥＮＯ２−４誘導の有害作用を防いだ。対照ＧＦＰ実験におけるｓｈＥＮＯ２−４による成長阻害の程度は、ｐＣＭＶ ＧＦＰ感染前の以前の実験（図３）において同じ細胞クローンによって産生されたものよりいくらか低いことに留意されたい。これは、連続培養中のＥＮＯ２ノックダウンの喪失に起因する（（ａ）のＥＮＯ２ノックダウンのレベルを図３と比較する）。ＥＮＯ２の再発現もまた、（全体エノラーゼ活性をＷＴ細胞中のそれよりさらに高いレベルに回復させることによって）エノラーゼ阻害剤ＰｈＡＨに対する完全な抵抗性を付与した。 同上 ＥＮＯ１ヌル細胞株Ｄ４２３−ＭＧ中のエノラーゼ１の異所性発現は、エノラーゼ２ノックダウンの毒性作用を防ぐ。ａ、ＥＮＯ１またはＧＦＰを発現するｐＣＭＶレンチウイルス構成体を使用して、エノラーゼ２を標的とする２つのｐＴＲＩＰＺドキシサイクリン誘導性ｓｈＲＮＡ（ｓｈＥＮＯ２−３＋４）を既に発現しているＤ４２３−ＭＧ細胞を感染させた。ｓｈＥＮＯ２−３＋４のドキシサイクリン誘導は、エノラーゼ２タンパク質レベルの約８０％の減少をもたらした。 ｂ、ｃ、ＧＦＰではなくＥＮＯ１の異所性発現は、ｓｈＲＮＡのドキシサイクリン媒介性誘導によって引き起こされる毒性作用を防ぐ。ｂ、各治療群４重複での飽和プレートのクリスタルバイオレット染色。 ｃ、平均合流を示すＩｎｃｕＣｙｔｅ生成長曲線（４重複＋／−標準誤差）。 同上 ＥＮＯ１−ヌル細胞株中のＥＮＯ１およびＥＮＯ２の異所性発現によるＰｈＡＨ毒性の用量依存性救済。ａ、Ｇｌｉ５６ＥＮＯ１−ヌル細胞を、ＧＦＰ、ＥＮＯ１、またはＥＮＯ２を含むｐＣＭＶレンチウイルス構成体で感染させたところ、ＧＢＭ株（Ｕ８７）中で示されるレベルに相当するＥＮＯ１発現、およびＥＮＯ２の強力な過剰発現を生じた。 ｂ、エノラーゼ１の発現およびエノラーゼ２の過剰発現は、Ｇｌｉ５６細胞をＰｈＡＨの有害作用から著しく保護した。 ｃ、同じ実験を、Ｄ４２３−ＭＧＥＮＯ１−ヌル株中、異なるレベルのウイルス価で行った。６つの異なる力価のｐＣＭＶ ＥＮＯ１および２つの異なる力価のｐＣＭＶ ＥＮＯ２は、段階的なレベルのエノラーゼ発現および活性を生じた。 ｄ、エノラーゼ１の導入は、これらの細胞をＰｈＡＨの毒性作用から保護し、（１４日間のインキュベーション後に）致死性を達成するために必要な阻害剤の濃度は、エノラーゼ１発現および酵素活性のレベルと直接比例して増加した。２つのレベルのエノラーゼ２過剰発現について、同じパターンが得られた。 １ｐ３６ホモ接合性欠失したＥＮＯ１−ヌル細胞は、受容体チロシンキナーゼ阻害剤に敏感でない。異なる濃度の受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）阻害剤ソラフェニブ、ラパチニブ、およびＰＨＡ６６５７５２の組み合わせの存在下での各細胞株の相対成長を、ＰｈＡＨ実験と平行して測定した（図４）。ＥＮＯ１−ヌルＤ４２３−ＭＧ細胞（赤線およびマーカー）は、ＲＴＫ阻害剤の組み合わせに対して、ＥＮＯ１ ＷＴ ＧＢＭ細胞株と同様に敏感でなかった。 ＥＮＯ１ヘテロ接合性細胞のｐａｎ−エノラーゼ阻害剤ＰｈＡＨに対する感受性。増加した濃度のＰｈＡＨでの治療後のＷＴ（ＬＮ３１９）またはＥＮＯ１ヘテロ接合性（５０２もしくはＵ３４３）細胞株のクリスタルバイオレット染色プレート。低濃度のＰｈＡＨであっても、ＥＮＯ１ヘテロ接合性細胞（Ｄ５０２−ＭＧおよびＵ３４３）の成長を阻害するのに十分である。 ＰｈＡＨのＵ３４３の感受性は、低減したＥＮＯ１発現に起因する。ａ、ＥＮＯ１ヘテロ接合性細胞（Ｕ３４３）のＰｈＡＨに対する感受性は、異所性ＥＮＯ１またはＥＮＯ２発現によって部分的に可逆的であった。 ｂ、ＥＮＯ１ヘテロ接合性細胞（Ｕ３４３）のＰｈＡＨに対する感受性は、ＡＴＰシンターゼ阻害剤オリゴマイシン（１０ｎＭ）の存在下で強化された。オリゴマイシン自体は最小効果を有したが、ＰｈＡＨとの組み合わせは、Ｕ３４３細胞に対して高度に毒性であった。再度この作用は、異所性ＥＮＯ１またはＥＮＯ２発現との相補性によって大きく逆転した。 正常なヒト星状細胞と比較した、オリゴマイシンの有無にかかわらず増加したＵ３４３細胞の感受性。Ｕ３４３ ＥＮＯ１ヘテロ接合性細胞は、（ａ）漸増用量のＰｈＡＨに応答する正常なヒト星状細胞およびＵ３４３の成長曲線、および（ｂ）ミトコンドリア電子伝達鎖阻害、オリゴマイシン（２．５ｎＭ）との組み合わせで、正常なヒト星状細胞と比較して、同様の成長阻害を達成するために、約８倍低い用量のＰｈＡＨを必要とする。 同上 同上 同上 ＥＮＯ１欠失腫瘍がエノラーゼ２阻害剤で治療されるとき、様々な代謝産物は、治療の有効性を監視するための潜在的バイオマーカーである。細胞溶解物のメタボロミクス分析は、エノラーゼ阻害剤ＰｈＡＨによる治療時に、ＥＮＯ１ヌル細胞Ｄ４２３ＭＧ中のグリセリン酸塩およびエタノールアミンレベルが増加するが、それらのレベルは、ＥＮＯ１野生型（パネルａおよびｂ）であるＵ８７細胞中では変化しないことを明らかにした。これらの代謝産物は、治療中に患者の血清中に蓄積し得、疾患の退行を評価するための非侵襲的方法として使用することができる。エノラーゼ２が、２つの独立したヘアピン（パネルｃ）を使用して、ＥＮＯ１ヌル細胞（Ｄ４２３ＭＧ）中でノックダウンされるとき、乳酸レベルは減少する。乳酸は、治療応答を監視するために使用される別の潜在的バイオマーカーである。腫瘍中の乳酸レベルは、ＭＲ分光撮像を使用して検出され得、乳酸ピークの減少は、腫瘍細胞死と相関し得る。 同上 同上 同上 エノラーゼ阻害剤ＰｈＡＨは、オリゴマイシン、アンチマイシンＡ、およびロテノン等のミトコンドリア代謝の阻害剤とともに、ＥＮＯ１ヌル細胞死に対して相乗効果を及ぼす。ＥＮＯ１ヌル細胞は、ＰｈＡＨおよびミトコンドリア阻害剤による治療に対してヒト星状細胞より感受性が高い。Ｄ４２３ＭＧ株の細胞生存性は、ルシフェラーゼ測定によって測定されるように、ミトコンドリア阻害剤がＰｈＡＨと併用されるとき、それらのいずれかが単独で使用されるときよりも大幅に低い。この作用は、ＥＮＯ１ヌル細胞中のエノラーゼ２の過剰発現によって救済される。この作用は、ヒト星状細胞中でも見られない。この発見は、エノラーゼ阻害剤をミトコンドリア阻害剤と併用して、ＥＮＯ１ホモ接合性欠失を有する腫瘍を治療する興味深い可能性を提議する。各治療において検査された細胞は、４２３ ｐＣＭＶ ＧＦＰ（ＥＮＯ１ヌル）；４２３ ｐＣＭＶ ＥＮＯ２（エノラーゼ活性が、ＥＮＯ２の高度な過剰発現によって回復されたＥＮＯ１ヌル細胞）；および星状細胞（左から右）であった。 必須代謝性／ハウスキーピング遺伝子中のホモ接合性欠失は、腫瘍を冗長な相同体の分子標的に対して敏感にする。多くの必須代謝過程は、冗長な遺伝子によって実行され、１つのメンバーの腫瘍成長中の偶発的ホモ接合性欠失は、システムに最小限の妨害を引き起こす（パネルａ）。それにもかかわらず、第２の冗長な相同体が、特定の阻害剤によって標的される場合、必須代謝過程は欠失を有する腫瘍中で障害されるが、腫瘍特異的に欠失した相同体が依然として機能するため、正常な遺伝的無傷の組織は影響を受けない（パネルｂ）。この一般概念の特定例は、膠芽腫中のＥＮＯ１ホモ接合性欠失の場合である。ＥＮＯ１ホモ接合性欠失は、ＥＮＯ２が依然として発現されるため、腫瘍に耐容できるが（パネルｃ）、ＥＮＯ２の特定の阻害剤は、ＥＮＯ１ヌル腫瘍細胞中のエノラーゼ活性を完全に無効にする（したがって、解糖およびＡＴＰ合成を阻止する）一方で、ゲノム的に無傷の正常組織が影響を受けないようにする必要がある（パネルｄ）。 同上 同上 同上 主要な腫瘍抑制因子を標的とするホモ接合性欠失は、必須代謝／ハウスキーピング遺伝子を含むことができる。１０ｑ２３（ＰＴＥＮ）および９ｐ２１（Ｉｎｋ／ａｒｆ）を含むいくつかの遺伝子座が、多数の異なる癌において、頻繁かつ再発性のホモ接合性欠失を呈することは周知である。図は、複数の原発腫瘍中の１０ｑ２３遺伝子座の周りのＳＮＰアレイ（コピー数）変化を示す。欠失は、大きさおよび境界が多種多様であるが、全てＰＴＥＮ上に係留される。この種類のパターン「最小共通領域」は、欠失によって標的とされる重要な腫瘍抑制遺伝子のフラッグとして広く研究されている（Ｍａｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００７）。これらの欠失のいくつかが、比較的大きく、多数の非標的、非腫瘍抑制遺伝子（「パッセンジャー」）を除去することができ、細胞中で重要な重複する役割を果たし得ることはほとんど注目されていない。これらのパッセンジャー欠失遺伝子の大部分は無関係であり、腫瘍組織中で発現されないが（例えば、インターフェロン、デフェンシン）、多数の遍在的に発現した代謝遺伝子は、ＰＴＥＮによる共欠失され、頻度を減少させるとともに、ＰＴＥＮからの距離を増加させる。これらは、ＡＴＡＤ１（高度に保存されたミトコンドリアＡＡＡ ＡＴＰａｓｅの未知の機能）、ＭＩＮＰＰ１（解糖、リボフラビン、および炭水化物代謝において役割を果たすイノシトールポリリン酸ホスファターゼ、Ｃｈｏ ｅｔ ａｌ．，２００８）、およびＰＡＮＫ１（パントテン酸キナーゼ、コエンザイムＡの生合成の第１段階、アセチル転移反応の必須共因子、脂肪酸酸化および脂質生合成、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｌｅｏｎａｒｄｉ ｅｔ ａｌ．，２０１０ａおよびＬｅｏｎａｒｄｉ ｅｔ ａｌ．，２０１０ｂ参照）。 主要な腫瘍抑制因子により欠失される必須冗長ハウスキーピング遺伝子の別の実施例。この図は、主要な腫瘍抑制因子、ＩＮＫ／ＡＲＦ遺伝子座の周りの染色体９上のコピー数変化を示す。この場合、ＴＣＡサイクル酵素アコニターゼ１をコードする遺伝子ＡＣＯ１は、ＩＮＫ４ａ／ＡＲＦと一緒に欠失される。パネルａは、２つの別個の黒色腫データセットにおいて、ＡＣＯ１が２つの患者試料中でホモ接合性欠失することを示す。パネルｂは、このホモ接合性欠失が、３５６人中２人の膠芽腫患者においても発生したことを示す。アコニターゼ１は、治療戦略の有望な標的である、別の重要なハウスキーピング遺伝子である。 同上 ゲノムコピー数はＴＡＲＳの発現と相関する。ｃ、Ｓａｎｇｅｒ ＣＯＳＭＩＣウェブサイトから検索されたゲノムコピー数データ（ａ）、および実験的研究によって確認されたゲノムコピー数データ（ｃ）、ＳＫ−ＭＥＬ−２細胞株中のＴＡＲＳのヘテロ接合性欠失を示す。（ａ）の数は、ＤＮＡコピー数を示す。ｂ、ＤＮＡコピー数は、ＴＡＲＳのｍＲＮＡ発現と相関する。黒色の枠は、ＳＫ−ＭＥＬ−２細胞株を示す。 同上 同上 ＴＡＲＳ欠乏黒色腫細胞中のＴＡＲＳ阻害剤ボレリジンに対する感受性の増加。ａ、ＳＫ−ＭＥＬ２細胞株は、ＴＡＲＳについてヘテロ接合性欠失を有すると特定され、４５１ Ｌｕ細胞株は、ＴＡＲＳについて欠乏していると特定され、ＳＫ−ＭＥＬ−５およびＨＭＥＬ細胞株は、ＴＡＲＳ遺伝子について野生型であると特定された（ＣＣＬＥ−Ｂｒｏａｄウェブサイトから検索されたデータ）。 ｂ、ボレリジン治療は、低濃度のＨＭＥＬおよびＳＫ−ＭＥＬ−５細胞の成長に対して最小効果を有した。反対に、低濃度のボレリジンは、ＳＫ−ＭＥＬ−２細胞の成長を失速させた。４５１Ｌｕ細胞は、ボレリジン治療に対する中等度の感受性を示した。 ｃ、ＴＡＲＳの発現レベルは、ウェスタンブロットによって確認され、ボレリジンに対する感受性との強い相関を示す。 ＴＡＲＳ欠乏黒色腫細胞中のＴＡＲＳ阻害剤ボレリジンに対する感受性の増加を示す生成長曲線（ＳＫ−ＭＥＬ−２の低初期細胞密度）。ＳＫ−ＭＥＬ−２（ＴＡＲＳ Ｈｅｔ）；ＳＫ−ＭＥＬ−５（ＴＡＲＳ ＷＴ）；４５１ Ｌｕ（ＴＡＲＳ欠乏）；ＨＭＥＬ（ＴＡＲＳ ＷＴ）。 同上 ＴＡＲＳ欠乏黒色腫細胞中のボレリジンの細胞毒性の増加を示す生成長曲線（ＳＫ−ＭＥＬ−２の高初期細胞密度）。ＳＫ−ＭＥＬ−２（ＴＡＲＳ Ｈｅｔ）；ＳＫ−ＭＥＬ−５（ＴＡＲＳ ＷＴ）；４５１ Ｌｕ（ＴＡＲＳ欠乏）；ＨＭＥＬ（ＴＡＲＳ ＷＴ）。 同上 ボレリジンに対する感受性の増加は、ＴＡＲＳ欠乏黒色腫細胞中のＴＡＲＳの異所性過剰発現によって逆転する。ａ、ｂ、ＧＦＰまたはＣＨＥＫ１ではなくＴＡＲＳの異所性発現は、ＳＫ−ＭＥＬ−２細胞中でボレリジンによって引き起こされる毒性作用を防ぐ。ａ、ＧＦＰを発現するｐＣＭＶレンチウイルス構成体を使用して、ＳＫ−ＭＥＬ−２細胞を感染させた。 ｂ、ＴＡＲＳを発現するｐＣＭＶレンチウイルス構成体を使用して、ＳＫ−ＭＥＬ−２細胞を感染させた。 ｃ、ボレリジンに対するＳＫ−ＭＥＬ−２細胞の感受性は、ＧＦＰまたはＣＨＥＫ１ではなくＴＡＲＳの異所性発現によって逆転した。 ｄ、ＴＡＲＳを含むｐＣＭＶレンチウイルス構成体の感染が、高レベルのＳＫ−ＭＥＬ−２細胞中のＴＡＲＳ発現をもたらすことを示すウェスタンブロット。 ボレリジンに対する感受性を有するＴＡＲＳコピー数とｍＲＮＡ発現との間の強い相関。癌細胞株のパネルのボレリジンに対する感受性（ＩＣ５０、ｌｏｇ１０Ｍ、ｙ軸）を、ＮＣＩ−６０データベースから取り、ＣＣＬＥ−Ｂｒｏａｄデータセットから得られるＴＡＲＳゲノムコピー数（Ａ、ｘ軸）またはｍＲＮＡ発現（Ｂ、ｘ軸）の関数としてプロットした。ＳＫ−ＭＥＬ−２細胞株（濃い陰影）は、ＴＡＲＳ ｍＲＮＡの最低コピー数および２番目に低い発現と、したがって、ボレリジンに対する最低ＩＣ５０（最大感受性）と、を有する。ａｄｄｙｍｅｔｒｉｘ ａＣＧＨデータ生成した実験研究に基づくコピー数は、ＳＫ−ＭＥＬ−２（Ｃ）中のＴＡＲＳのコピー数の喪失を確認する。 同上 同上 ゲノムコピー数は、広範なＡＲＳ遺伝子の発現レベルと相関する。グラフは、ＤＮＡコピー数が、ＡＡＲＳ（ａ）、ＫＡＲＳ（ｂ）、ＨＡＲＳ（ｃ）、およびＬＡＲＳ（ｄ）のｍＲＮＡ発現と相関することを示す。 同上 同上 同上 ＣＨＥＫ１タンパク質の発現は、ゲノムコピー数と相関せず、ＣＨＥＫ１の過剰発現は、ＣＨＥＫ１阻害剤ＡＺＤ７７６２に対する抵抗性を付与しない。Ａ、ＣＯＭＩＣ（Ｓａｎｇｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ）からのゲノムコピー数は、染色体１１上のＣＨＥＫ１（枠内）は、細胞株ＳＫ−ＭＥＬ−２中のに１つのみのコピーを有する。 Ｂ、マイクロアレイ発現およびアレイＣＧＨコピー数データは、約９００細胞株中のｍＲＮＡレベルとＣＨＥＫ１のゲノムコピー数との間の良好な相関を示す（ＳＫ−ＭＥＬ−２は、枠によって示される）。 Ｃ、しかしながら、ＳＫ−ＭＥＬ−２細胞は、ウェスタンブロットによって、より低いレベルのＣＨＥＫ１タンパク質を発現しない。 Ｄ、ＳＫ−ＭＥＬ−２細胞中のＣＨＥＫ１の過剰発現は、ＣＨＥＫ１阻害剤ＡＺＤ７７６２に対する抵抗性を付与しない。
Ｉ．本発明
ゲノムの大きな領域の欠失（例えば、ヘテロ接合性欠失）は、癌における原型的身体事象であり、重要な腫瘍抑制遺伝子の機能を切断することによって腫瘍形成を促す。これらの欠失は、癌の病因において既知の役割を持たない近傍遺伝子を包含する場合が多く、多くの例では、必須代謝酵素をコードする必須遺伝子を含む。しかしながら、腫瘍細胞中の酵素活性の一部分の喪失（例えば、５０％喪失）は、典型的に、必須ハウスキーピング遺伝子の場合でも耐容される。この１つの理由は、大部分の代謝酵素が非常に過剰に存在し、毒性が臨界閾値以下の発現の喪失に依存するためである。典型的に、活性の５０％超の喪失は、癌細胞に対する任意の効果を有するために必要である。
ここで提示される研究は、ＥＮＯ１遺伝子の１つのコピーのヘテロ接合性不活性化が、癌細胞を解糖経路阻害剤に対して非常に敏感にすることを実証する。反対に、ＥＮＯ１の双方のコピーを保持する癌細胞では、癌細胞の成長に対する任意の作用を有するために非常に高いレベルの解糖阻害剤が必要である。したがって、ヘテロ接合性ＥＮＯ１不活性化を有する癌細胞は、別の方法で必要とされるよりもはるかに低い濃度の解糖阻害剤で有効に治療され得る。例えば、ＥＮＯ１のヘテロ接合性欠失を示す膠芽腫細胞（Ｕ３４３およびＤ５０２−ＭＧ）は、ＥＮＯ１−ＷＴ膠芽腫細胞株および正常なヒト星状細胞と比較して、エノラーゼ阻害剤ホスホアセトヒドロキサム酸塩（ＰｈＡＨ）に対して２〜８倍敏感である（図３ｂ〜ｃおよび図１１参照）。この作用は、ＥＮＯ１またはＥＮＯ２の発現のためのベクターで細胞を補完することによって、少なくとも部分的に可逆的であり、この作用が、癌細胞中のエノラーゼ発現のレベルの低減に起因することを実証する。重要なことに、ＰｈＡＨに対する細胞の感受性は、オリゴマイシンによる共治療によってさらに強化され得る（図１２）。
これらの研究を考慮して、ＡＲＳ、ＰＤＧ、またはＥＮＯ１等のハウスキーピング遺伝子のヘテロ接合性不活性化は、抗癌治療の指針となるようにバイオマーカーとして機能することができる。例えば、そのようなＥＮＯ１のヘテロ接合性欠失を有すると決定された癌患者は、解糖阻害剤（例えば、エノラーゼ阻害剤）またはそのような阻害剤のプロドラッグで治療され得る。同様に、そのようなＡＲＳ遺伝子のヘテロ接合性欠失を有すると決定された患者は、ＡＲＳ阻害剤で治療され得る。好ましくは、これらの患者は、第２の治療と併せて治療され（例えば、ＥＮＯ１の場合は第２の解糖阻害剤もしくはミトコンドリア伝達阻害剤、またはＡＲＳの場合はタンパク質合成阻害剤）、それによって癌細胞に対する特定阻害剤の有効性を強化する。同様に、患者に由来する癌細胞は、ＥＮＯ１またはＡＲＳのヘテロ接合性不活性化について分析し、その患者が特定の阻害剤治療に対して応答する可能性があるかを予測するか、または適用されるべき治療の投与量を推定することもできる。これらの方法は、抗癌治療を特定の患者およびその患者の特定の癌に対して調整されるのを可能にする。したがって、治療はより有効であることを証明すべきであるだけでなく、多くの副作用および未検証の有効性を有する「標準」治療を単に適用するよりも有効な治療を特定することによって、副作用が著しく低減され得る。
本発明の実施形態は、正常組織と癌組織との間の遺伝的に決定された代謝差を利用して、癌細胞の特定治療を生成する。具体的に、本発明の態様は、冗長な必須ハウスキーピング遺伝子のホモ接合性欠失が癌特異的な脆弱性を形成するという驚くべき発見に一部基づく。これらの遺伝子および細胞死によってコードされるタンパク質の活性の完全な喪失は、非欠失相同体の選択的阻害剤、または欠失組織と非欠失組織とを区別する用量で、双方の相同体を標的とする化合物を投与することによって得られる。この方法を使用すると、双方の遺伝子が正常であり発現される正常細胞の健康は影響を受けない。
癌ゲノムは、それぞれ、駆動癌遺伝子および腫瘍抑制遺伝子を標的とする多数の増幅および欠失を特徴とする。癌遺伝子を標的とするこれらのコピー数の変化は、常に腫瘍形成過程において直接の役割を有しない近傍遺伝子のコピー数の変化を必要とする。ここで、これらの副次的事象は、必須のハウスキーピング遺伝子のホモ接合性欠失を発生した癌細胞中の潜在的な固有の脆弱性を評価するように設計された戦略において利用される。脊椎動物ならびにマウスにおける遺伝的相互作用研究の大半は、多くの必須細胞性ハウスキーピング機能が、１つの相同体の喪失に直面して細胞生存性を可能にするが、多数の相同体の喪失時に完全な致死性を可能にする、重複機能をコードする多数の相同体遺伝子によって行われることを示す（例えば、それぞれが参照により本明細書に組み込まれる、図１６およびＤｅｕｔｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００６；ＤｅＬｕｎａ ｅｔ ａｌ．，２００８；Ｃｏｓｔａｎｚｏ ｅｔ ａｌ．，２０１０；Ｖａｖｏｕｒｉ ｅｔ ａｌ．，２００８；およびＢｒｏｏｋｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，１９９７参照）。この概念的枠組みに関して、冗長な必須ハウスキーピング遺伝子のホモ接合性欠失が、癌特異的脆弱性を形成し得ることが想定され、それによって、第２の非欠失相同体の薬理的不活性化は、欠失を運ぶ腫瘍細胞中の活性の完全喪失をもたらすが、双方の遺伝子が正常であり発現される正常細胞の健康を低下させないと想定された（図１６ａ）。そのような遺伝子を検索するために、ＧＢＭの高解像度統合ＴＣＧＡデータセットを調べた（表１およびＴｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｎｅｔｗｏｒｋ ２００８）。
「副次的脆弱性」アプローチの概念の遺伝的および薬理学的証拠は、ＣＨＤ５およびＣＡＭＴＡ１を含むいくつかの候補腫瘍抑制遺伝子を有するＧＢＭａ中の頻繁な欠失に供される領域である、１ｐ３６遺伝子座に存在するＥＮＯ１遺伝子を用いて本明細書に提示される（図１ａ；Ｈｅｎｒｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，２０１１およびＢａｇｃｈｉ ｅｔ ａｌ．２００８）。１ｐ３６遺伝子座は、１〜５％のＧＢＭ（ならびに希突起神経膠腫および大細胞神経分泌肺腫瘍、例えば、Ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｎｅｔｗｏｒｋ ２００８；Ｙｉｎ ｅｔ ａｌ．，２００９；Ｄｕｎｃａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１０；Ｋｏｔｉｌａｒｏｖ ｅｔ ａｌ．，２００６；およびＰｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００５）中でホモ接合性欠失され、多くの場合、ＥＮＯ１遺伝子のホモ接合性欠失を必要とする。３つの相同性遺伝子によってコードされるエノラーゼは、解糖の第２〜最後の工程を触媒する必須酵素であり、２−ホスホグリセリン酸をホスホエノールピルビン酸塩に変換する（Ｐｏｙｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９２）。哺乳類では、エノラーゼ活性は３つの遺伝子、遍在的に発現されるＥＮＯ１、神経組織中で独占的に発現されるＥＮＯ２、および筋組織中で発現されるＥＮＯ３によってコードされる（表２）。したがって、正常細胞および特に腫瘍細胞中のエネルギー生成に対する解糖の決定的重要性を考慮して（Ｗｉｓｅ ｅｔ ａｌ．，２０１０）、ＥＮＯ１のＧＢＭ腫瘍ホモ接合性ヌルは、エノラーゼ２の阻害に対して高度に敏感であることが予測されるが、正常な神経組織は、エノラーゼ１の機能的冗長性によって救済される（図１６ｂ）。対応して、Ｅｎｏ２ノックアウトマウスは生存可能かつ繁殖性であり、エノラーゼ２の薬理阻害が十分に耐容される可能性があることを示唆する（表２）。さらに、いくつかのエノラーゼ相同体を有する出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）は、単一変異体を有する弱い表現型を示し、全ての相同体が欠失されたときのにみ細胞致死性をもたらす（Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００６；ＤｅＬｕｎａ ｅｔ ａｌ．，２００８；およびＣｏｓｔａｎｚｏ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。線虫およびショウジョウバエは、エノラーゼ活性をコードす遺伝子を１つのみ有し、その欠失は致死的である（Ｂｕｓｚｃｚａｋ ｅｔ ａｌ．，２００７、およびＳｏｎｎｉｃｈｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００５）。
本明細書に記載される遺伝学的および薬理学的結果は、エノラーゼ２阻害が、ＥＮＯ１の副次的喪失を有する１ｐ３６ホモ接合性欠失を有する細胞中で致死的であるが、ＥＮＯ１正常細胞は、エノラーゼ１に依存して解糖を受け、生存を支援できることを実証する。いくつかのホモ接合性欠失したハウスキーピング遺伝子は、１ｐ３６上の同じ「欠失」において発生することができることを考慮して（例えばＨ６ＰＤ、表１）、ＥＮＯ２の阻害を同時に欠失したハウスキーピング遺伝子の別の相同体のそれと組み合わせることによって、有効性および癌細胞特異的死滅をさらに増加させることが可能であり得る。
実際に、副次的脆弱性は、ＥＮＯ１以外に他のパッセンジャーホモ接合性欠失したハウスキーピング遺伝子に拡大され得る。ＧＢＭ中の主要なホモ接合性欠失した遺伝子座９ｐ２１（ＣＤＫＮ２Ａ）および１０ｑ２３（ＰＴＥＮ）は、機能的に冗長なハウスキーピング遺伝子ファミリーのメンバーである多数の欠失したパッセンジャー遺伝子を包含する（表１、図１７）。重要なことに、これらの化合物の多くは、癌の治療に関して完全に新規の分子実体である。１つの推定によって、ヒトゲノム中の全てのタンパク質コーディング遺伝子の１１％は、ヒト癌中で欠失される（Ｂｉｇｎｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。したがって、何百もの遺伝子に広がる多くの異なる癌にわたる多数のホモ接合性欠失を考慮して（Ｂｉｇｎｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，２０１０；Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，２０１０；Ｃｏｘ ｅｔ ａｌ．，２００５；およびＴｏｎｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００５）、ＧＢＭについて本明細書に記載されるパラダイムは、多くの追加の癌種の個人化された治療の開発に適用可能であるべきである。
非欠失相同体の特定阻害剤は、既に使用可能なＰＡＮ酵素阻害剤（表３）の化学修飾または使用可能な小分子ライブラリーを使用する高スループットスクリーニングのいずれかによって見出され得る。阻害は、特定の活性測定を使用して、各酵素について検出され得る。例えば、エノラーゼの場合、これは、ピルビン酸キナーゼおよびＬＤＨ共役測定を使用する以下のＮＡＤＨ酸化を必要とする。Ｈ６ＰＤの場合、これは、ＮＡＤＰＨ生産を測定することによって行うことができる（参照により本明細書に組み込まれる、Ｃｌａｒｋｅ ｅｔ ａｌ．，２００３）。アコニターゼ活性は、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ共役反応中のＮＡＰＤ＋還元を監視することによって測定され得る（参照により本明細書に組み込まれる、Ｂｕｌｔｅａｕ ｅｔ ａｌ．，２００５）。パントテン酸キナーゼ活性は、１４Ｃ標識パントテン酸塩で酵素をインキュベートすること、およびシンチレーション計測によって放射活性生成物を定量化することによって測定され得る（参照により本明細書に組み込まれる、Ｚｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００８）。ＫＩＦ活性は、ＡＴＰａｓｅ測定を使用して測定され得る。
必須代謝ハウスキーピング遺伝子中のホモ接合性欠失を有する腫瘍は、腫瘍組織のコピー数分析または酵素測定を使用して、手術または生検後診断され得る。エノラーゼの場合、例えば、腫瘍組織および正常組織上でエノラーゼ１および２活性測定を行うことが可能である（Ｐｏｙｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９２）。適切な治療標的である腫瘍は、正常なエノラーゼ２活性とともに、ほぼ未検出のエノラーゼ１活性を有すると特定される。これは、他の代謝酵素に広げることができる。そのような容易に使用可能な酵素測定を有しないタンパク質の場合、腫瘍試料のコピー数分析は、診断方法として使用され得る。本研究では、エノラーゼ１の場合、コピー数に基づいてホモ接合性欠失を示す試料も、ほぼ未検出レベルのエノラーゼ１発現を有するため、これは真のホモ接合性欠失を検出するために有効な方法であることを示した。
治療中、非侵襲性撮像または代謝プロファイリングのいずれかによって、応答を監視することができる。膠芽腫中のエノラーゼ阻害の場合、例えば、ＭＲ分光撮像（ＭＲＳＩ）が使用に有効なツールであり得る。この技術は、脳腫瘍の種類を区別するために使用されており、病期決定および予後を予測するための潜在用途も有する（Ｎｅｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．）。ＭＲＩとＮＭＲ分光法とを組み合わせて、様々な代謝産物、特にコリン、クレアチン、Ｎ−アセチルアスパラギン酸塩、乳酸塩、および脂質のレベルおよび空間分布を検出することによって、組織代謝プロファイルに関する情報を提供する（Ｎｅｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．）。乳酸塩ピークは、嫌気性代謝産物の領域に対応し、複数の研究では、膠芽細胞腫中で著しく顕著であることが分かった（Ｍｏｌｌｅｒ−Ｈａｒｔｍａｎｎ ｅｔ
ａｌ．；Ｌａｗ）。ここに提示されるデータは、乳酸塩レベルが、生体外のＥＮＯ１欠失細胞中のエノラーゼ２阻害後に著しく減少することを示す（図１４ｃ）。これは、治療に対して良好な応答を呈する患者が、基準値と比較して、減少した腫瘍乳酸塩レベルを有することを示し得る。あるいは、治療前後に血清代謝産物を分析することが可能であり得る。以前の研究は、それらの血清または尿代謝プロファイルに基づいて、癌患者を良性状態の健常な患者から区別できることを示した。これは、卵巣癌から肝細胞癌まで多種多様な癌に当てはまる（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．；Ｏｄｕｎｓｉ；Ｓｐｒａｔｌｉｎ ｅｔ ａｌ．）。治療時の腫瘍代謝変化は、特に標的タンパク質の上流または下流にある、血清代謝産物中の変化として検出され得る。このように、特定のバイオマーカーが見出され、治療の有効性を監視するために使用することができる。ＰｈＡＨで治療したＤ４２３ＭＧ ＥＮＯ１ヌル細胞の初期代謝特徴付けは、グリセリン酸塩の顕著な上方調節を示す（図１４ａ）。グリセリン酸塩は、２−ホスホグリセリン酸塩および３−ホスホグリセリン酸塩の同時加水分解の結果として生成される可能性があり、その中間体は、エノラーゼブロックの直ぐ上流に蓄積することが予想される（図１４ｃ）。グリセリン酸塩は、正常な血清および脳脊髄液中で安定かつ少量であり、したがって、阻害剤有効性の潜在的マーカーであり得る。
さらに、ホモ接合性欠失ハウスキーピング遺伝子の阻害剤は、他の化学療法治療と併用され得る。細胞死に対する相乗効果をもたらす類似経路上で作用する２つの化合物を使用することが可能であり得る。データは、例えば、ＥＮＯ１ヌル細胞中で、エノラーゼ阻害剤が、オリゴマイシン、アンチマイシンＡ、およびロテノン等のミトコンドリア代謝産物の阻害剤との相乗作用を有することを示す（図１５）。この作用は、ＥＮＯ１野生型である細胞中では見られず、ＥＮＯ１ヌル細胞中のエノラーゼ２の過剰発現によって救済される。推定相乗相互作用の追加の一覧は、表３に示される。
したがって、本発明は、冗長な相同体の阻害剤もしくは双方の相同体の阻害剤を適切な用量で対象に投与するか、または細胞を接触させることによって、癌を治療するか、または機能的に冗長な相同体を有するハウスキーピング遺伝子中にホモ接合性欠失を有する細胞中の細胞死を誘導する方法を提供し、それによって、２つの相同体のうちの１つを欠失する細胞は、経路の治療上関連する阻害レベルに達するために、（健常なゲノム的に正常な場合）より低レベルの阻害剤を必要とする。
ＩＩ． 定義
「ハウスキーピング遺伝子」は、基本的細胞機能の維持に必要な遺伝子を意味する。
「ホモ接合性欠失」は、本明細書で使用されるとき、遺伝子の対立遺伝子の双方が欠失されることを意味する。
「ヘテロ接合性欠失」は、本明細書で使用されるとき、遺伝子の対立遺伝子の一方が欠失されることを意味する。
本明細書で使用されるとき、所与の遺伝子の「機能的に冗長な相同体（ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ）」または「機能的に冗長な相同体（ｈｏｍｏｌｏｇ）」は、所与の遺伝子と実質的に同じ機能を行うことができる遺伝子を指す。例えば、酵素をコードする遺伝子の場合、機能的に冗長な相同体は、代謝経路における同じ工程において同じ基質（複数可）上で作用する酵素をコードする（例えば、同じＥＣ番号を有する酵素）。
「治療」は、疾患の進行を防ぐか、または病理もしくは症状を変えるという意図で行われる介入である。したがって、「治療」は、治療的処置および予防的もしくは予防性手段の両方を指す。治療を必要とする者は、既に疾患を有する者ならびに疾患が予防される者を含む。腫瘍（例えば、癌）治療では、治療薬は、腫瘍細胞の病理を直接減少させ得るか、または腫瘍細胞を他の治療薬による治療、例えば、放射線および／または化学療法の影響を受け易くし得る。本明細書で使用するとき、「改善された」または「治療」は、正規化値（例えば、健常な患者または個人において得られる値）に近づく症状を指し、例えば、正規化値から５０％未満異なり、好ましくは、正規化値から約２５％未満異なり、より好ましくは、正規化値から１０％未満異なり、さらにより好ましくは、日常的な統計的検定を使用して決定される正規化値から著しく異ならない。
したがって、治療は、抑制、阻害、予防、治療、またはそれらの組み合わせを含み得る。治療は、とりわけ、持続的な無増悪期間の増加、寛解の促進、寛解の誘導、寛解の増強、回復の加速化、代替治療の有効性の増加もしくはそれに対する抵抗性の減少、またはそれらの組み合わせを指す。「抑制」または「阻害」は、とりわけ、症状の発症の遅延、疾患の再発の予防、再発エピソードの回数または頻度の減少、症候性エピソード間の潜伏期間の増加、症状の重症度の低減、急性エピソードの重症度の低減、症状の回数の低減、疾患関連症状の発生の低減、症状の潜伏期間の低減、症状の軽減、二次症状の低減、二次感染の低減、患者の生存の延長、またはそれらの組み合わせを指す。症状は一次的であるが、別の実施形態では、症状は二次的である。「一次的」は、増殖性疾患の直接結果である症状を指し、二次的は、主因に由来するか、またはその結果である症状を指す。症状は、疾患または病理状態の任意の提示であり得る。
「癌または腫瘍細胞の治療」は、本明細書全体に記載される、以下の作用のうちの１つ以上を起動することができる、小分子または核酸の量を指す：（１）（ｉ）減速および（ｉｉ）完全な成長停止を含む、腫瘍成長の阻害；（２）腫瘍細胞数の低減；（３）腫瘍サイズの維持；（４）腫瘍サイズの低減；（５）（ｉ）低減、（ｉｉ）減速、または（ｉｉｉ）完全な予防を含む、末梢器官への腫瘍細胞浸潤の阻害：（６）（ｉ）低減、（ｉｉ）減速、または（ｉｉｉ）完全な予防を含む、転移の阻害；（７）（ｉ）腫瘍サイズを維持するか、（ｉｉ）腫瘍サイズを低減するか、（ｉｉｉ）腫瘍の成長を減速させるか、（ｉｖ）侵襲を低減、減速、または予防し得る、抗腫瘍免疫応答の強化、および／または（８）疾患と関連付けられる１つ以上の症状の重症度または数のある程度の軽減を指す。
本明細書で使用するとき、「改善された症状」または「治療された症状」は、正規化値に近づく症状を指し、例えば、正規化値から５０％未満、好ましくは、正規化値から約２５％未満、より好ましくは、正規化値から１０％未満異なり、さらにより好ましくは、日常的な統計的検定を使用して決定される正規化値から著しく異ならない。
本明細書で使用するとき、「薬学的に許容される」成分は、適度な利益／リスク比に比例する過度の副作用（例えば、毒性、刺激、およびアレルギー応答）なしに、ヒトおよび／または動物に使用するのに適したものである。
本明細書で使用するとき、「安全かつ有効な量」または「治療量」という用語は、本発明の様式で使用されるとき、適度な利益／リスク比に比例する過度の副作用（例えば、毒性、刺激、またはアレルギー応答）なしに、所望の治療応答をもたらすのに十分な成分の量を指す。「治療上有効な量」は、所望の治療応答をもたらすのに有効な本発明の化合物の量を意味する。例えば、癌の成長を遅延させるか、もしくは収縮させるか、または転位を予防するのに有効な量である。特定の安全かつ有効な量、または治療上有効な量は、治療される特定の条件、患者の身体条件、治療される哺乳類または動物の種類、治療の期間、併用療法の性質（存在する場合）、および用いられる特定の製剤と、化合物またはその誘導体の構造等の因子によって異なる。
本明細書で使用されるとき、「癌」は、限定されないが、白血病、リンパ腫、黒色腫、癌腫、および肉腫を含む、哺乳類において見出される全ての種類の癌または新生物または悪性腫瘍を指す。癌の例は、脳癌、乳癌、膵臓癌、頸癌、結腸癌、頭頸部癌、腎癌、肺癌、非小肺細胞癌、黒色腫、中皮腫、卵巣癌、肉腫、胃癌、子宮癌、および髄芽腫である。追加の癌として、例えば、ホジキンス病、非ホジキンスリンパ腫、多発性骨髄腫、神経芽細胞腫、乳癌、卵巣癌、肺癌、横紋筋肉腫、原発性血小板血症、原発性マクログロブリン血症、小細胞肺腫瘍、原発性脳腫瘍、胃癌、結腸癌、悪性膵島細胞腫、悪性カルチノイド、尿道癌、前癌性皮膚病変、精巣癌、リンパ腫、甲状腺癌、神経膠腫、神経芽細胞腫、食道癌、尿生殖路癌、悪性高カルシウム血症、子宮頸癌、子宮内膜癌、副腎皮質癌、および前立腺癌が挙げられる。
「増殖性疾患」は、正常細胞より速く成長する細胞、すなわち、腫瘍細胞によって引き起こされる疾患または状態である。増殖性疾患は、良性腫瘍および悪性腫瘍を含む。腫瘍の構造によって分類されるとき、増殖性疾患は、固体腫瘍および造血器腫瘍を含む。
「患者」、「対象」、または「個人」という用語は、本明細書で同義的に使用され、治療される哺乳類対象を指すが、ヒト患者が好ましい。場合によって、本発明の方法は、実験動物、獣医学的適用、および疾患の動物モデルの開発における利用を見出し、限定されないが、マウス、ラット、およびハムスターを含むげっ歯類、ならびに霊長類を含む。
本明細書で使用するとき、「細胞に投与する」という用語（例えば、発現ベクター、核酸、送達媒体、薬剤等）は、細胞を分子で形質導入、形質転換、顕微注入、電気穿孔、または衝撃することを指す。場合によって、分子は、標的細胞を送達細胞と接触させることによって、（例えば、細胞融合によるか、または標的細胞の近位にあるときに送達細胞を溶解することによって）標的細胞に導入される。
ＩＩＩ．さらなるハウスキーピング遺伝子
本発明の文脈におけるハウスキーピング遺伝子は、基本的細胞機能の維持に必要な任意の遺伝子である。脊椎動物ならびにマウスにおける遺伝的相互作用研究の大半は、多くの必須細胞性ハウスキーピング機能が、１つの相同体の喪失に直面して細胞生存性を可能にするが、多数の相同体の喪失時に完全な致死性を可能にする、重複機能をコードする多数の相同体遺伝子（すなわち、冗長な相同体）によって行われることを示す。（Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．２００６；Ｃｏｓｔａｎｚｏ ｅｔ ａｌ．２０１０；Ｖａｖｏｕｒｉ ｅｔ ａｌ．２００８；Ｂｒｏｏｋｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．１９９７）
例示的に、本発明の方法において有用なハウスキーピング遺伝子およびそれらの冗長な相同体は、表１に記載される。ハウスキーピング遺伝子として、例えば、限定されないが、エノラーゼ１（ＥＮＯ１）、ヘキソース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｈ６ＰＤ）、キネシンファミリーメンバー１Ｂ（ＫＩＦ１Ｂ）、ニコチンアミドヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼ１（ＮＭＮＡＴ１）、ユビキチン化因子Ｅ４Ｂ（ＵＢＥ４Ｂ）、アコニターゼ１（ＡＣＯ１）、ｋｅｌｃｈ様９（ＫＬＨＬ９）、パントテン酸キナーゼ１（ＰＡＮＫ１）、およびキナーゼファミリーメンバー２０Ｂ（ＫＩＦ２０Ｂ）が挙げられる。
表１は、必須性ならびに冗長性について無脊椎動物に基づく証拠が存在する、膠芽細胞腫中でホモ接合性欠失した代謝性／ハウスキーピング遺伝子の精選された一覧を示す。ＧＢＭ−ＴＣＧＡデータセット（ｌｏｇ２コピー数＜−１）中のホモ接合性欠失した遺伝子の完全な一覧から開始して、いくつかのフィルターを提供して、該欠失遺伝子が必須の冗長なハウスキーピング遺伝子であるか、すなわち最終的に、相同体の薬理阻害が、腫瘍特異的細胞機能不全をもたらすかを決定した。欠失遺伝子がハウスキーピング機能を果たすかを決定するために、最初に、腫瘍および正常組織中の発現強度およびパターン、ならびに遺伝子の一般機能を照会した。第２に、遺伝子が系統にわたってどのように保存されるか、およびノックアウトデータが脊椎動物モデルにおいて使用可能であるかを質問した（サッカロミセスゲノムデータベース（ＳＧＤ）、Ｗｏｒｍｂａｓｅ（ＷＢ）、Ｆｌｙｂａｓｅ（ＦＢ））。第３に、細胞生存不能をもたらす既知の遺伝子相互作用が、（データベースＳＧＤ、Ｗｏｒｍｂａｓｅ、Ｆｌｙｂａｓｅ、ＭＧＩを使用して）脊椎動物またはマウスにおいて既に文書化されているかを質問した。第４に、１つの相同体が他の相同体を越えて選択的にヒットするように修正され得る、小分子阻害剤が使用可能であるかを質問した。第５に、冗長性仮説を試験するために、欠失遺伝子を有する使用可能な細胞株を検索した。最後に、潜在的な薬物がどの程度良好に患者によって耐容されるかについていくつかの考えを有するために、ＭＧＩを検索して薬物標的相同体のノックアウトが有害であるかを決定した。この分析から出現する最強候補は、漸減順序で、ＥＮＯ１／ＥＮＯ２；ＰＡＮＫ１／ＰＡＮＫ３、ＡＣＯ１／ＡＣＯ３、およびより少ない程度でＫＩＦ２０Ｂ／ＫＩＦ２０Ａの対である。
パントテン酸キナーゼは、コエンザイムＡの生合成、アセチル転移反応の必須共因子、脂肪酸酸化および脂質生合成における最初の工程である。コエンザイムＡは、輸送され得ないため、細胞自律的方法で合成されなければならない。酵母、ハエ、および虫では、酵素の同位体が１つのみ存在し、ノックアウトは致死であり（Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．２００１）、それが必須遺伝子であることを示す。マウスおよびヒトでは、ＰＡＮＫ活性をコードする３つの遺伝子が存在し、最も広く発現するのはＰＡＮＫ１およびＰＡＮＫ３である（Ｌｅｏｎａｒｄｉ ｅｔ ａｌ．２０１０ａ；Ｌｅｏｎａｒｄｉ ｅｔ ａｌ．２０１０ｂ）。ＰＡＮＫ１または３のいずれかのノックアウトは、生存能力のあるマウスをもたらすが、ＰＡＮＫ１／３ダブルノックアウトマウスは、極めて早期の胚発生の間に死に至る（Ｓ．Ｊａｃｋｏｗｓｋｉ，Ｓｔ Ｊｕｄｅ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｍｅｍｐｈｉｓ，ＴＮ，私信）。ＰＡＮＫ３にいくらかの選好を示すＰＡＮＫの阻害剤、ホパンテン酸塩は既に存在し、ヒトにおいて臨床的に使用されている（Ｚｈａｎｇ ２００７）。したがって、ＰＡＮＫ１ヌル腫瘍中のＰＡＮＫ３の阻害（ホパンテン酸塩の誘導体を用いる）は、腫瘍細胞成長を重度に低下させるが、（ＰＡＮＫ３ヌルマウスは生存能力があり、概ね正常であると考えると）正常な組織はそのままにしておくべきである。
アコニターゼ１（ＡＣＯ１）は、鉄代謝およびクエン酸からのイソクエン酸の生成を介する燃料ミトコンドリア呼吸の双方において必須であるが、冗長な役割を果たす二重機能酵素である。ＡＣＯ２は、鉄代謝を制御しないが、Ｋｒｅｂｓサイクルにおいてクエン酸をイソクエン酸に変換することに関与する、ミトコンドリア同位体である。酵母、ＡＣＯ１、およびＡＣＯ２では、単一ヌル変異体は生存能力があり、致死である二重ヌルのみを有する（Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．２００６）。Ａｃｏ２−／−マウスは報告されていないが、Ａｃｏ１−／−およびＡｃｏ３−／−マウスは、生存能力および繁殖性がある。ＡＣＯ３は、酵素的に不活性であるが、ＡＣＯ１のように、ｍＲＮＡ中のＩＲＥの結合を介して鉄代謝を調節する。Ａｃｏ１−／−Ａｃｏ３−／−ヌルマウスは、大規模な鉄欠乏の結果として、Ｅ６．５を越えて生存することはできない（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．２００６）。したがって、ＡＣＯ１ホモ接合性欠失は、腫瘍を２つの脆弱性：ａ）生体エネルギーおよび脂肪酸生成の双方に影響を持つクエン酸／イソクエン酸変換の不可能性につながるＡＣＯ２の特異的阻害（Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．２００６）およびｂ）鉄飢餓につながるＡＣＯ３／ＩＲＥＢ２の特異的阻害（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．２００６）に曝す。
ＫＩＦ２０Ｂ（Ｍ相リンタンパク質１として知られる）は、当初細胞質分裂の完了に必要であると考えられたキネシンモーター酵素である（Ａｂａｚａ ｅｔ ａｌ．２００３）。哺乳類には２つのＫＩＦ２０ファミリーメンバーが存在するが（ＫＩＦ２０ＡおよびＫＩＦ２０Ｂ）、酵母において直接１：１相同体はない。線虫およびショウジョウバエでは、遺伝的欠失を有するＫＩＦ２０の１つの直接１：１相同体が存在し、早期の幼虫致死をもたらし（Ｍｏｏｒｅ ｅｔ ａｌ．１９９４）、大規模な細胞死の証拠は、哺乳類相同体ＫＩＦ２０ＡおよびＢが冗長的に作用し得ることを示唆する。実際に、ＫＩＦ２０Ｂのように、ＫＩＦ２０Ａもまた、細胞質分裂に必須であると考えられ（Ｈｉｌｌ ｅｔ ａｌ．２０００）、いずれも有糸分裂の間に高度に上方調節される。キネシンは、「ドラッガブル」であることが知られるＡＴＰ依存性酵素であり、癌治療に関して探求されている（Ｐａｒｒｉｓｈ ｅｔ ａｌ．２００７）。ＫＩＦ２０Ａの特定阻害剤、パプロトレインは、最近説明された（Ｔｃｈｅｒｎｉｕｋ ｅｔ ａｌ．２０１０）。さらに、ＫＩＦ２０Ａは、膵癌におけるｓｉＲＮＡによる「一般的な」癌薬物標的として探求されている（Ｔａｎｉｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．２００５）。
ＡＲＳ遺伝子は必須であり、（ヒトにおいて）タンパク質合成に必要な非冗長な遺伝子である。具体的に、遺伝子は、ポリペプチド鎖延長のためにリボソームによって利用され得るアミノ酸負荷したｔＲＮＡの生成に必要である。癌細胞中でヘテロ接合的に不活性化され得るＡＲＳ遺伝子の例として、限定されないが、ＴＡＲＳ（５ｑ１３）；ＥＰＡＲＳ（１ｑ４１）；ＶＡＲＳ（６ｐ２１）；ＩＡＲＳ（９ｑ２４）；ＣＡＲＳ（１１ｐ１５）；ＳＡＲＳ（１ｐ１３）；ＹＡＲＳ（１ｐ３５）；ＡＡＲＳ（１６ｑ２３）；ＫＡＲＳ（１６ｑ２４）；ＬＡＲＳ（５ｑ３１）；ＨＡＲＳ（５ｑ３２）；およびＲＡＲＳ（５ｑ３５）が挙げられる（括弧内の表記は、遺伝子の染色体位置を示す）。したがって、場合によっては、実施形態による治療のための癌細胞は、２つ以上のＡＲＳ遺伝子のヘテロ接合性欠失を含み得る（例えば、ＳＡＲＳおよびＹＡＲＳ；ＡＡＲＳおよびＫＡＲＳ；またはＬＡＲＳ、ＨＡＲＳ、およびＲＡＲＳ）。
他の適切なハウスキーピング遺伝子および冗長な相同体は、当業者によって容易に特定可能である（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｎｉｊｉｈａｗａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１２参照）。
ＩＶ．変異の検出
ある実施形態は、生体内または試料中のいずれかで、ＥＮＯ１またはＡＲＳ等の遺伝子の１つのコピーのヘテロ接合性不活性化を検出することに関する。例えば、いくつかの実施形態では、不活性化は、癌細胞の核酸配列中の変化（変異）を検出または測定することによって検出され得る。なおもさらなる態様では、遺伝子の不活性化は、癌細胞と関連付けられる発現の低減またはエノラーゼ活性の低減を検出することによって間接的に検出される。
Ａ．核酸検出
いくつかの実施形態では、ヘテロ接合性変異の存在を評価することは、遺伝子生成物（例えば、ＡＲＳまたはＥＮＯ１）をコードするＲＮＡまたはＤＮＡ等のコーディング核酸を検出または定量することを必要とし得る。例えば、いくつかの態様では、癌細胞ゲノムの全てまたは一部は、遺伝子の１つのコピー中の変異の存在を検出するように配列決定される（例えば、置換、欠失、変換、または挿入）。いくつかの態様では、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）は、ＥＮＯ１またはＡＲＳ配列の全てまたは一部を増幅するように使用され得る。
さらなる実施形態では、遺伝子をコードする配列中の変異は、コーディングＲＮＡの全てまたは一部の配列を決定することによって検出され得る。例えば、逆転写ＰＣＲは、ＥＮＯ１またはＡＲＳコード配列の配列を決定するように用いられることができる。なおもさらなる態様では、定量的ＰＣＲまたはＲＴ ＰＣＲは、細胞が、減少量のエノラーゼ１コード配列を含むかを決定するように用いられることができる（例えば、遺伝子の１つのコピーの不活性化に対応する）。
いくつかの実施形態では、上記のＰＣＲ生成物は、配列分析に供され、標準配列分析技術を使用して、特定種類の変動を特定し得る。ある方法では、遺伝子の網羅的な分析は、最適配列決定のために設計されるプライマーセットを使用する配列分析によって行われる。本実施形態は、これらの種類の分析のいずれかまたは全てが使用され得る方法を提供する。ヒトゲノム（またはそれに由来するｃＤＮＡ）の既知の配列を使用して、オリゴヌクレオチドプライマーは、ＥＮＯ１遺伝子（またはＡＲＳ遺伝子）および周囲配列の増幅を可能にするように設計され得る。同様に、場合によって、ＤＮＡ配列決定を使用して、核酸をコードするエノラーゼ１を検出および／または定量化してもよい。そのような配列の方法は、限定されないが、可逆的終止方法（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）およびＨｅｌｉｃｏｓ（登録商標）ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ）、パイロシーケンス（例えば、Ｒｏｃｈｅからの４５４配列決定）、およびライゲーションによる配列決定（例えば、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（商標）ＳＯＬｉＤ（商標）配列決定）が挙げられる。
ＰＣＲ（商標）では、増幅した標的ＤＮＡの分子の数は、いくらかの試薬が制限的になるまで、反応の各サイクルで２に近付く係数で増加する。その後、増幅率は、サイクル間で増幅した標的の増加がなくなるまで漸増的に減少する。サイクル数がＸ軸上であり、増幅した標的ＤＮＡの濃度のログがＹ軸上であるグラフがプロットされる場合、特徴的形状の曲線は、プロットされた点を接続することによって形成される。第１のサイクルから開始し、線の傾斜は正であり一定である。これは、曲線の直線部分であると言われる。試薬が制限的になった後、線の傾斜は減少し始め、最終的にゼロになる。この時点で、増幅された標的ＤＮＡの濃度は、ある固定値に漸近的になる。これは、曲線のプラトー部分であると言われる。
ＰＣＲ（商標）増幅の直線部分の標的ＤＮＡの濃度は、反応が開始する前の標的の開始濃度に直接比例する。同数のサイクルを完了し、それらの直線範囲内にあるＰＣＲ（商標）反応における標的ＤＮＡの増幅生成物の濃度を決定することによって、元のＤＮＡ混合物中の特定の標的配列の相対濃度を決定することが可能である。したがって、これらの方法は、細胞中でヘテロ接合性欠失されるＥＮＯ１またはＡＲＳ配列を検出するか、またはエノラーゼ１コード配列の減少した全体発現を検出するように用いられることができる。
いくつかの実施形態では、核酸が検出または定量化され、続いてゲル分離および臭化エチジウムで染色して、紫外線下で可視化される。いくつかの実施形態では、完全放射標識または蛍光標識ヌクレオチドを使用して、合成または増幅から（例えば、ＰＣＲによって）核酸が生じる場合、生成物は、ｘ線フィルムに曝露され得るか、または適切な刺激スペクトル下で可視化され得、続いて分離される。
いくつかの実施形態では、可視化は間接的に達成される。核酸の分離に続いて、標識核酸を標的配列と接触させる。プローブは、発色団または放射標識に共役される。別の実施形態では、プローブは、抗体またはビオチン等の結合パートナーに共役され、結合対の他のメンバーは、検出可能な部分を担持する。前述の一例は、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，２７９，７２１号に記載され、自動電気穿孔のための装置および方法、ならびに核酸の移動を開示する。この装置は、ゲルの外部操作なしに電気穿孔およびブロッティングを可能にし、本実施形態による方法を実行するのに理想的に適している。
遺伝子中の変異は、ハイブリダイゼーション技術によってさらに評価され得る。ノーザンブロットおよびサザンブロット技術は、例えば、当業者に周知である。ノーザンブロットおよびサザンブロットは、標的として、それぞれＲＮＡまたはＤＮＡの使用を必要とする。つまり、プローブを使用して、多くの場合ニトロセルロースのフィルターである適切なマトリクス上に固定化されたＲＮＡまたはＤＮＡ種を標的とする。異なる種を空間的に分離して分析を促進する必要がある。これは、多くの場合、核酸種のゲル電気穿孔に続いて、フィルターの上に「ブロットする」ことによって達成される。後次に、ブロットされた標的は、変性および再ハイブリダイゼーションを促進する条件下で、プローブ（標識プローブ等）でインキュベートされる。プローブは、標的と塩基対合するように設計されるため、プローブは、復元条件下で標的配列の一部分を結合する。次に非結合プローブが除去され、検出が達成される。同様に、標識プローブをｉｎ ｓｉｔｕハイブリダーゼーションに使用され、ＥＮＯ１またはＡＲＳ中（またはその１つのコピーの不在下）でヘテロ接合性変異の存在を検出することができる。例えば、蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）が用いられてよい。
Ｂ．減少したエノラーゼ１タンパク質発現または活性の検出
いくつかの態様では、実施形態の方法は、エノラーゼ１タンパク質の発現または活性の検出に関する。例えば、エノラーゼ１タンパク質を結合、精製、除去、定量、および／または他の方法で一般に検出するための免疫検出法を用いることができる。本実施形態により調製される抗体は、対象または試料、例えば、腫瘍生検中のエノラーゼ１を検出および／または定量化するように用いられ得る。いくつかの免疫検出法として、酵素結合免疫吸着測定（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫測定（ＲＩＡ）、免疫放射測定、蛍光免疫測定、化学発光測定、生物発光測定、およびウェスタンブロット分析がほんの数例として挙げられる。様々な有用な免疫検出法の工程は、それぞれ参照により本明細書に組み込まれる、例えば、Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ ＭＨ ａｎｄ Ｂｅｎ−Ｚｅｅｖ Ｏ，１９９９；Ｇｕｌｂｉｓ Ｂ ａｎｄ Ｇａｌａｎｄ Ｐ，１９９３；Ｄｅ Ｊａｇｅｒ Ｒ ｅｔ ａｌ．，１９９３；およびＮａｋａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，１９８７に記載されている。
１．ＥＬＩＳＡ
上述のように、免疫測定は、それらの最も簡潔および／または直接的な意味において結合測定である。ある好ましい免疫測定は、当該技術分野において既知の様々な種類の酵素結合免疫吸着測定（ＥＬＩＳＡ）および／または放射免疫測定（ＲＩＡ）である。組織切片を使用する免疫組織化学的検出も特に有用である。
いくつかの実施形態では、実施形態の抗エノラーゼ１抗体は、ポリスチレンマイクロタイタープレート中のウェル等のタンパク質親和性を呈する選択表面の上に固定される。次に、臨床試料等のタンパク質抗原を含むことが疑われる試験組成物をウェルに添加する。非特異的に結合された免疫複合体を除去するように結合および／または洗浄した後、結合したタンパク質抗原が検出され得る。検出は、概して、検出可能な標識に連結される別の抗エノラーゼ１抗体の添加によって達成される。この種類のＥＬＩＳＡは、単純な「サンドウィッチＥＬＩＳＡ」である。検出および定量は、第２の抗エノラーゼ１抗体の添加によって、続いて第２の抗体について結合親和性を有する第３の抗体の添加によって達成されてもよく、第３の抗体は、検出可能な標識に連結されている。
いくつかの実施形態では、エノラーゼ１タンパク質抗原を含むことが疑われる試料は、壁表面の上に固定化され、および／または実施形態の抗エノラーゼ１抗体と接触される。結合および／または洗浄して非特異的結合免疫複合体を除去した後、結合された抗エノラーゼ１抗体は検出および定量化される。最初の抗エノラーゼ１抗体が検出可能な標識に連結される場合、この免疫複合体は直接検出され得る。再度、免疫複合体は、第１の抗エノラーゼ１抗体に対する結合親和性を有する第２の抗体を使用して検出され得、第２の抗体は、検出可能な標識に連結される。
いくつかの実施形態では、エノラーゼ１タンパク質、ポリペプチド、および／またはペプチドは固定化される。いくつかの実施形態では、ＥＬＩＳＡは、検出において抗体競合の使用を必要とする。このＥＬＩＳＡでは、エノラーゼ１抗原に対する標識抗体は、ウェルに添加され、それらの標識によって結合および／または検出されるのを可能にする。次に、未知の試料中の野生型または変異体エノラーゼ１抗原の量は、コーティングされたウェルを用いたインキュベーション前および／またはその間に抗原に対する標識抗体と試料を混合することによって測定される。試料中のエノラーゼ１抗原の存在は、ウェルに結合するために使用可能な野生型または変異体タンパク質に対する抗体の量を減少させるように作用し、したがって最適シグナルを減少させる。これも未知の試料中のエノラーゼ１抗原に対する抗体を検出するために適切であり、非標識抗体は、抗原コーティングされたウェルに結合し、標識抗体を結合するために使用可能な抗原の量も減少させる。
用いられる形式にかかわらず、ＥＬＩＳＡは、非特異的に結合した種をコーティング、インキュベートおよび結合、洗浄し、結合した免疫複合体を検出する等の共通する、ある特徴を有する。これらは、熟練者に周知の工程である。
２．免疫組織化学
本実施形態の抗エノラーゼ１抗体は、免疫組織化学（ＩＨＣ）による研究のために調製された新鮮−凍結および／またはホルマリン固定され、パラフィンに埋め込まれた組織ブロックと併用されてもよい。これらの粒子標本から組織ブロックを調製する方法は、様々な予後診断因子の以前のＩＨＣ研究において良好に使用され、および／または当業者に周知である（Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．，１９９０；Ａｂｂｏｎｄａｎｚｏ ｅｔ ａｌ．，１９９０；Ａｌｌｒｅｄ ｅｔ ａｌ．，１９９０）。
つまり、凍結切片（例えば、血管組織切片）は、５０ｎｇの凍結「微粉炭」組織を室温で、小さなプラスチックカプセル中のリン酸干渉生理食塩水（ＰＢＳ）中で再水和すること；遠心分離によって粒子をペレット成形すること；それらを粘性包埋媒質（ＯＣＴ）中で再懸濁すること；カプセルを変換する、および／または遠心分離によって再度ペレット成形すること；７０℃イソペンタン中でスナップ凍結すること；プラスチックカプセルを切断する、および／または組織の凍結シリンダーを除去すること；クリオスタットミクロトームチャンク上に組織シリンダーを固定すること；２０〜５０個の連続切片を切断することによって調製され得る。
永久切片は、プラスチック微量遠心管中の５０ｍｇ試料の再水和；ペレット形成；１０％ホルマリン中４時間の再懸濁；固定；洗浄／ペレット成形；温かい２．５％寒天中の再懸濁；ペレット成形；寒天を硬化させるための氷水中での冷却；組織／寒天ブロックの管からの除去；ブロックの浸潤および／またはパラフィンへの包埋；ならびに／または最大５０個の連続永久切片の切断を必要とする同様の方法によって調製され得る。
３．免疫電子顕微鏡法
本実施形態の抗体は、細胞内組織成分を特定するように、電子顕微鏡法と併用されてもよい。つまり、電子密度標識は、抗エノラーゼ１抗体に直接または間接的に共役される。実施形態による電子密度標識の例は、フェリチンおよび金である。電子密度標識は、電子を吸収し、電子顕微鏡法によって可視化され得る。
４．免疫検出キット
いくつかの態様では、本実施形態は、上記の免疫検出法とともに使用するための免疫検出キットに関する。抗エノラーゼ１抗体は、一般にそのような抗原を検出するように使用されるため、抗体は、好ましくはキットに含まれる。しかしながら、そのような構成要素の双方を含むキットが提供され得る。したがって、免疫検出キットは、適切な容器手段に、タンパク質、ポリペプチド、および／またはペプチドに結合する第１の抗体（例えば、抗エノラーゼ１抗体）、および／または任意選択により、免疫検出試薬、および／またはさらに任意選択により、精製もしくは組み換えタンパク質、ポリペプチド、および／もしくはペプチドを含む。
いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体が使用される。ある実施形態では、抗原タンパク質、ポリペプチド、および／またはペプチドに結合する第１の抗体は、コラムマトリクスおよび／またはマイクロタイタープレートのウェル等の固体支持体に予備結合され得る。
キットの免疫検出試薬は、所与の抗体と関連付けられる、および／またはそれに連結されるそれらの検出可能な標識を含む、多様な形態のうちの任意の１つを取り得る。二次結合リガンドと関連付けられる、および／またはそれに付着される検出可能な標識も企図される。例示の二次リガンドは、第１の抗体に対して結合親和性を有するそれらの二次抗体である。
本キットにおいて使用するためのさらに適切な免疫検出試薬は、第１の抗体に対して結合親和性を有する二次抗体を含む、二成分試薬を、第２の抗体に対して結合親和性を有する第３の抗体とともに含み、第３の抗体は、検出可能な標識に連結される。上記のとおり、多数の例示の標識は、当該技術分野において既知であり、および／または全てのそのような標識は、本実施形態に関連して用いられ得る。
本実施形態によるキットは、標識および／または非標識にかかわらず、エノラーゼ１抗原の適切に分割された組成物をさらに含んでよく、検出測定について標準曲線を調製するように使用され得る。提供されるキットは、完全に共役された形態、中間体の形態、および／またはキットのユーザにより共役される別個の部分としてのいずれかで抗体標識共役体を含み得る。キットの構成要素は、水性媒質中および／または凍結乾燥形態のいずれかでパッケージ化され得る。
キットの容器手段は、一般に少なくとも１つのバイアル、試験管、フラスコ、ボトル、シリンジおよび／または他の容器手段を含み、その中に抗体が置かれ、および／または好ましくは適切に分割される。本実施形態のキットは、典型的に、商業販売のための厳重な管理下で、抗体、抗原、および／または任意の他の試薬容器を含むための手段を含む。そのような容器は、所望のバイアルが中に保持される、射出および／またはブロー成形プラスチック容器を含み得る。
Ｖ．阻害剤
阻害剤は、必須ハウスキーピング遺伝子の冗長な相同体の発現または活性を減少させる化合物である。発現または活性の減少は、必須ハウスキーピング遺伝子の冗長な相同体の生物学的機能の低減によって定義される。阻害剤は、当該技術分野において既知であるか、または本明細書に記載の方法を使用して特定される。ハウスキーピング遺伝子の活性は、当該技術分野において既知の方法によって測定される。
本発明の方法において有用な例示の阻害剤は、表１に記載される。他の適切な阻害剤は、既知の方法によって当業者により容易に特定可能である。
例えば、ハウスキーピング遺伝子がエノラーゼであるとき、阻害剤は、ホスホノアセトヒドロキサム酸塩である。ハウスキーピング遺伝子がヘキソース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｈ６ＰＤ）であり、冗長な相同体がグルコース−６デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤ）であるとき、阻害剤は、例えば、デヒドロエピアンドロステロンを含むことができる。
ハウスキーピング遺伝子がニコチンアミドヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼ１（ＮＭＮＡＴ１）であり、冗長な相同体が、ニコチンアミドヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼ２（ＮＭＮＡＴ２）またはニコチンアミドヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼ３（ＮＭＮＡＴ３）であるとき、阻害剤は、例えば、Ｎｐ３ＡＤ、Ｎｐ４Ａｓ、およびＮａｐ４ＡＤである。ハウスキーピング遺伝子がアコニターゼ１（ＡＣＯ１）であり、冗長な相同体がアコニターゼ２（ＡＣＯ２）またはアコニターゼ３（ＡＣＯ３）であるとき、阻害剤は、例えば、フルオロクエン酸塩である。ハウスキーピング遺伝子がパントテン酸キナーゼ１（ＰＡＮＫ１）であり、冗長な相同体がパントテン酸キナーゼ３（ＰＡＮＫ３）であるとき、阻害剤は、例えばホパンテン酸塩である。
Ａ．解糖阻害剤
本発明の実施形態は、解糖の阻害剤を用いて癌細胞を有効に治療することを目的とする組成物および方法に関する。例えば、解糖阻害剤は、ピルビン酸キナーゼ（例えば、ＰＫＬＲ１またはＰＫＭ２）、エノラーゼ（例えば、ＥＮＯ１、ＥＮＯ２、またはＥＮＯ３）、ホスホグリセリン酸ムターゼ（例えば、ＰＧＭ１、ＰＧＭ２、ＰＧＭ２Ｌ１、ＰＧＭ３、またはＰＧＭ５）、ホスホグリセリン酸キナーゼ（例えば、ＰＧＫ１またはＰＧＫ２）、グリセルアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、トリオースリン酸イソメラーゼ（ＴＰＩ）、フルクトース二リン酸アルドラーゼ（例えば、Ａｌｄｏａ、Ａｌｄｏｂ、またはＡｌｄｏｃ）、ホスホフルクトキナーゼ（ＰＦＫ１）、ホスホグルコースイソメラーゼ（ＧＰＩ）、およびヘキソキナーゼ（例えば、ＨＫ１、ＨＫ２、またはＨＫ３）の阻害剤であり得る。
いくつかの態様では、解糖阻害剤は、核酸またはポリペプチド阻害剤である。例えば、阻害剤は、ピルビン酸キナーゼ、エノラーゼ、ホスホグリセリン酸ムターゼ、ホスホグリセリン酸キナーゼ、ＧＡＰＤＨ、ＴＰＩ、フルクトース二リン酸アルドラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、ＧＰＩ、またはヘキソキナーゼ等の解糖酵素に結合する抗体またはその断片であり得る。さらなる態様では、阻害剤は、解糖酵素をコードする核酸分子の全てまたは一部に結合する、阻害性核酸であり得る。例えば、阻害性核酸は、ＰＫＬＲ１、ＰＫＭ２、ＥＮＯ１、ＥＮＯ２、ＥＮＯ３、ＰＧＭ１、ＰＧＭ２、ＰＧＭ２Ｌ１、ＰＧＭ３、ＰＧＭ５、ＰＧＫ１、ＰＧＫ２、ＧＡＰＤＨ、ＴＰＩ、Ａｌｄｏａ、Ａｌｄｏｂ、Ａｌｄｏｃ、ＰＦＫ１、ＧＰＩ、ＨＫ１、ＨＫ２、またはＨＫ３をコードするｍＲＮＡの全てまたは一部に相補的なＲＮＡであり得る。
なおもさらなる態様では、解糖阻害剤は、小分子阻害剤またはそのプロドラッグである。例えば、小分子阻害剤は、ピルビン酸キナーゼ、エノラーゼ、ホスホグリセリン酸ムターゼ、ホスホグリセリン酸キナーゼ、ＧＡＰＤＨ、ＴＰＩ、フルクトース二リン酸アルドラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、ＧＰＩ、またはヘキソキナーゼの阻害剤であり得る。例示の解糖阻害剤化合物として、２−デオキシグルコース、６−アミノニコチンアミド、テトロース二リン酸塩、コニンギン酸、およびＭＪＥ３が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、例示の解糖阻害剤は、ピルビン酸塩に関する組成物を含む。例えば、ピルビン酸塩誘導体は、米国特許出願公開第２００３／００１３６５６号、第２００３／００１３８４７号、第２００３／００１３６５７号、および第２００３／００１３８４６号に記載される。
いくつかの好適な態様では、解糖阻害剤は、エノラーゼ阻害剤である。そのようなエノラーゼ阻害剤の例として、Ｄ−タルトロン酸セミアルデヒドリン酸塩；３−アミノエノールピルビン酸−２−リン酸塩；ホスホノアセトヒドロキサム酸塩（ＰｈＡＨ）；２−フルオロ−２−ホスホノアセトヒドロキサム酸塩；（３−ヒドロキシ−２−ニトロプロピル）ホスホン酸塩；（ニトロエチル）ホスホン酸塩；ｄ−（ホスホノエチル）ニトロール酸塩；フルオリド、およびそれらのプロドラッグが挙げられるが、これらに限定されない。
Ｂ．ＡＲＳ阻害剤
ある実施形態では、本発明は、１つ以上のＡＲＳ遺伝子（複数可）のヘテロ接合性不活性化を有する癌を治療する際に使用するためのＡＲＳ阻害剤、およびその投与に関する。いくつかの態様では、ＡＲＳ阻害剤は、好ましくは真核アミノアシルｔＲＮＡを阻害する。例えば、ＡＲＳ阻害剤は、プロリルｔＲＮＡシンテターゼ、システイニルｔＲＮＡシンテターゼ、グリシルｔＲＮＡシンテターゼ、アラニルｔＲＮＡシンテターゼ、アスパルチルｔＲＮＡシンテターゼ、グルタミルｔＲＮＡシンテターゼ、アスパラギルｔＲＮＡシンテターゼ、グルタミニルｔＲＮＡシンテターゼ、セリルｔＲＮＡシンテターゼ、アルギニルｔＲＮＡシンテターゼ、ヒスチジルｔＲＮＡシンテターゼ、チロシルｔＲＮＡシンテターゼ、またはグルタミル−プロリル−ｔＲＮＡシンテターゼ（例えば、ハロフジノン）を阻害する薬剤であり得る。ＡＲＳ阻害剤の例として、ＴＡＲＳ阻害剤、ボレリジン、ならびに抗菌ＡＲＳ阻害剤（およびその誘導体）、例えばムピロシン；ＳＢ−２３４７６４；インドールマイシン；ＡＮ−２６９０；ＣＢ−４３２；イコフンジペン；ＲＥＰ８８３９；シスペンタシン：チャンギシンマイシン；ミクロシンＣ（または加工されたミクロシンＣ）；ホスミドシン；アスカマイシン；アグロシン；ＳＢ−２１７４５２；またはアルボマイシンが挙げられるが、これらに限定されない。本実施形態の方法により使用され得る追加の阻害剤は、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許公開第２０１２００５８１３３号に提供される。
Ｃ．プロドラッグ
本発明の化合物は、プロドラッグ形態でも存在し得る。プロドラッグは、多くの望ましい品質の医薬品を強化することが知られているため（例えば、可溶性、生物活性、製造等）、本発明のいくつかの方法において用いられる化合物は、必要に応じてプロドラッグ形態で送達され得る。一般に、そのようなプロドラッグは、実施形態の解糖阻害剤の機能的誘導体であり、生体内で活性解糖阻害剤に容易に変換可能である。適切なプロドラッグ誘導体の選択および調製の従来の手順は、例えば、″Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ Ｐｒｏｄｒｕｇｓ″，ｅｄ．Ｈ．Ｂｕｎｄｇａａｒｄ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，１９８５；Ｈｕｔｔｕｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１１；およびＨｓｉｅｈ ｅｔ ａｌ．，２００９に記載され、それぞれ参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
プロドラッグは、活性薬物を放出するために体内で形質転換を必要とし、送達特性を親薬物分子よりも改善した、生物学的に活性な解糖阻害剤（「親薬物」または「親分子」）の薬学的に不活性な誘導体であり得る。生体内形質転換は、例えば、いくつかの代謝過程、例えば、カルボン酸、ホスホル酸、または硫酸エステルの化学的もしくは酵素的加水分解、または感受性機能の還元もしくは酸化の結果であり得る。したがって、実施形態において用いられる化合物のプロドラッグは、修飾が、ルーチン操作または生体内のいずれかで親化合物に開裂されるような方法で、化合物中に存在する官能基を修飾することによって調製され得る。プロドラッグとして、例えば、ヒドロキシ、アミノ、またはカルボキシ基が、プロドラッグが対象に投与されると、ヒドロキシ、アミノ、またはカルボン酸をそれぞれ形成するように開裂する任意の基に結合された、本明細書に記載される化合物が挙げられる。したがって、本発明は、本発明の化合物のプロドラッグならびにプロドラッグを送達する方法を企図する。
ＶＩ．併用療法
本実施形態の解糖阻害剤の有効性を増加させるために、これらの組成物を、癌の治療に有効な他の薬剤と複合することが望ましい場合がある。非限定例として、癌の治療は、他の抗癌剤と一緒に解糖阻害剤によって実装され得る。「抗癌」剤は、例えば、癌細胞を死滅させること、癌細胞中のアポトーシスを誘導すること、癌細胞の増殖率を低減すること、転移の発生または数を低減すること、腫瘍サイズを低減すること、腫瘍成長を阻害すること、腫瘍または癌細胞への血液供給を低減すること、癌細胞または腫瘍に対する免疫応答を促進すること、癌の侵攻を防止もしくは阻害すること、または癌を有する対象の寿命を増加させることによって、対象における癌に負の影響を及ぼすことができる。より一般的に、これらの他の組成物は、細胞を死滅させるか、または増殖を阻害するのに有効な複合量で提供される。これは、双方の薬剤を含む単一組成物または医薬製剤と細胞を接触させること（または対象に投与すること）によるか、または２つの別個の組成物または製剤と細胞を接触させることによって達成され得、同時に、１つの組成物は、解糖阻害剤を含み、もう一方は、第２の薬剤（複数可）を含む。
解糖阻害剤による治療は、数分〜数週間の範囲の間隔で他の薬剤または治療に先行し得るか、またはそれに続き得る。他の薬剤および解糖阻害剤が細胞に別個に適用される実施形態では、一般に、薬剤および解糖阻害剤が依然として細胞に対して有益に複合された作用を及ぼすことができるように、各送達時間の間に長期間が経過しないことを保証する。そのような例では、細胞を双方の方法と互いに約１２〜２４時間以内、より好ましくは互いに約６〜１２時間以内に接触させてよいことが企図される。いくつかの状況では、治療期間を著しく延長することが望ましい場合があり、数日（例えば、２、３、４、５、６、または７日）〜数週間（例えば、１、２、３、４、５、６、７、または８週間）がそれぞれの投与間で経過する。
様々な組み合わせが用いられてよく、解糖阻害剤治療は「Ａ」であり、放射線治療、化学療法、またはミトコンドリア電子伝達阻害剤等の二次薬剤または治療は「Ｂ」である：
Ａ／Ｂ／Ａ Ｂ／Ａ／Ｂ Ｂ／Ｂ／Ａ Ａ／Ａ／Ｂ Ａ／Ｂ／Ｂ Ｂ／Ａ／Ａ Ａ／Ｂ／Ｂ／Ｂ Ｂ／Ａ／Ｂ／Ｂ Ｂ／Ｂ／Ｂ／Ａ Ｂ／Ｂ／Ａ／Ｂ Ａ／Ａ／Ｂ／Ｂ Ａ／Ｂ／Ａ／Ｂ Ａ／Ｂ／Ｂ／Ａ Ｂ／Ｂ／Ａ／Ａ Ｂ／Ａ／Ｂ／Ａ Ｂ／Ａ／Ａ／Ｂ Ａ／Ａ／Ａ／Ｂ Ｂ／Ａ／Ａ／Ａ Ａ／Ｂ／Ａ／Ａ Ａ／Ａ／Ｂ／Ａ
ある実施形態では、本実施形態の解糖阻害剤治療の患者への投与は、阻害剤の毒性が存在する場合はそれを考慮して、化学療法薬の投与のための一般的なプロトコルに従う。治療サイクルは、必要に応じて繰り返されることが予想される。様々な標準療法、ならびに外科的介入は、記載される過剰増殖性細胞治療と併せて適用され得ることも企図される。
Ａ．化学療法
化学療法も多様な併用療法を含む。いくつかの態様では、実施形態の解糖阻害剤は、化学療法薬と併せて投与される（または製剤される）。複合化学療法として、例えば、チオテパおよびシクロスホスファミド等のアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン、およびピポスルファン等のアルキルスルホン酸塩；ベンゾドーパ、カルボクオン、メツレドーパ、およびウレドーパ等のアジリジン；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホルアミド、およびトリメチルオロメラミンを含むエチレンイミンおよびメチルアメラミン；アセトゲニン（特にブラタシンおよびブラタシノン）；カンプトテシン（合成類似体トポテカンを含む）；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ−１０６５（そのアドゼレシン、カルゼレシン、およびビゼレシン合成類似体を含む）；クリプトフィシン（特にクリプトフィシン１およびクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（合成類似体ＫＷ−２１８９およびＣＢ１−ＴＭ１を含む）；エレウテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチイン；スポンジスタチン；クロラムブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イフォスファミド、メコロレタミン、塩酸メクロレタミンオキシド、メルファラン、ノヴェムビチン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロフォスファミド、ウラシルマスタード等のニトロゲンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、およびラニムスチン等のニトロソウレア；エネジイン抗生物質等の抗生物質（例えば、カリケアミシン、特にカリケアミシンγＩＩ、およびカリケアミシンωＩＩ；ダイネミシンＡを含むダイネミシン；クロドロン酸塩等の二リン酸塩；エスペラミシン；ならびにネオカルジノスタチン発色団および関連色素エネジイン抗生物質発色団、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アウトラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン（モルホリノ−ドキソルビシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシン、およびデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、ミトマイシンＣ等のミトマイシン、マイコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、クエラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベリシジン、ウベニメックス、ジノスタチン、ゾルビシン；メトトレキサートおよび５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）等の抗代謝産物；デノプテリン、プテロプテリン、トリメトレキサート等の葉酸類似体；フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン等のプリン類似体；アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロキシウリジン等のピリミジン類似体；カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン等のアンドロゲン；ミトタン、トリロスタン等の抗アドレナル；フロリン酸等の葉酸補充薬；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラキセート；デフォファミン；デメコルシン；ジアジクオン；エルフォルミチン；酢酸エリプチニウム；エポチロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシウレア；レンチナン；ロニダイニン；マイタンシンおよびアンサミトシン等のマイタンシノイド；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダンモール；ニトラエリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ロソキサントロン；ポドフィリン酸；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫポリサッカリド複合体；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン；２，２’，２”−トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（特にＴ−２毒素、ヴェラクリンＡ、ロリジンＡ、およびアングイジン）；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（″Ａｒａ−Ｃ″）；シクロホスファミド；タキソイド、例えば、パクリタキセルおよびドセタキセルゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；シスプラチン、オキサリプラチン、およびカルボプラチン等の白金配位錯体；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イフォスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ノバントロン；テニポシド；エダトレキセート；ダウノマイシン；アミノプテリン；キセローダ；イバンドロン酸塩；イリノテカン（例えば、ＣＰＴ−１１）；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノール酸等のレチノイド；カペシタビン；カルボプラチン、プロカルバジン、プリコマイシン、ゲムシタビエン、ナベルビン、ファルネシル−タンパク質トランスフェラーゼ阻害剤、トランス白金、および上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸、または誘導体が挙げられる。ある実施形態では、本明細書に提供される組成物が、ゲフィチニブと併用され得る。他の実施形態では、本実施形態は、Ｇｌｅｅｖａｃと併せて実施され得る（例えば、約４００〜約８００ｍｇ／日のＧｌｅｅｖａｃが患者に投与され得る）。ある実施形態では、１つ以上の化学療法薬が、本明細書に提供される組成物と併用され得る。
Ｂ．放射線療法
癌治療に有効であり、広く使用されている他の要素は、γ線、Ｘ線、および／または放射性同位体の腫瘍細胞への配向送達として一般に知られているものを含む。電磁波およびＵＶ照射等のＤＮＡ損傷因子の他の形態も企図される。これらの因子の全てが、ＤＮＡ、ＤＮＡの前駆体、ＤＮＡの複製および修復、および染色体の組立および維持に対して広範な損傷を及ぼす可能性が高い。Ｘ線の投与範囲は、長期間（３〜４週間）の場合、５０〜２００レントゲンの日用量から２０００〜６０００レントゲンの単一用量の範囲である。放射性同位体の投与範囲は、広く異なり、同位体の半減期、放射される放射線の強度および種類、ならびに腫瘍性細胞による取り込みに依存する。
「接触される」および「曝露される」という用語は、細胞に適用されるとき、治療的組成物および化学療法薬または放射線治療薬が、標的細胞に送達され、その標的細胞との直接並置に置かれる過程を説明するように本明細書において使用される。細胞死滅または停止を達成するために、双方の薬剤を、細胞を死滅させるか、または分割するのを防ぐのに有効な複合量で細胞に送達する。
Ｃ．免疫療法
免疫療法は、概して、癌細胞を標的および破壊するための免疫エフェクター細胞および分子の使用に依存する。免疫エフェクターは、例えば、腫瘍細胞の表面上のいくつかのマーカーに特異的な抗体であり得る。抗体単独で、治療のエフェクターとして機能し得るか、または他の細胞を採用して細胞死滅に実際に作用し得る。抗体は、薬物または毒素（化学療法薬、放射性核種、リシンＡ鎖、コレラ毒素、百日咳毒素等）に共役されてもよく、単に標的薬剤として機能し得る。あるいは、エフェクターは、腫瘍細胞標的と直接または間接的に相互作用する表面分子を担持するリンパ球であり得る。様々なエフェクター細胞は、細胞毒性Ｔ細胞およびＮＫ細胞を含む。
したがって、免疫療法は、本実施形態の解糖阻害剤治療と併せて、併用療法の一部として使用することができる。併用療法の一般的な手法は、以下に論じられる。一般に、腫瘍細胞は、標的の影響を受け易いいくつかのマーカーを担持しなければならず、すなわち、他の細胞の大半に存在しない。多くの主要マーカーが存在し、これらのうちのいずれかは、本実施形態の文脈において標的に適し得る。一般的な腫瘍マーカーとして、癌胎児性抗原、前立腺特異的抗原、泌尿器腫瘍関連抗原、胎児抗原、チロシナーゼ（ｐ９７）、ｇｐ６８、ＴＡＧ−７２、ＨＭＦＧ、Ｓｉａｌｙｌ Ｌｅｗｉｓ抗原、ＭｕｃＡ、ＭｕｃＢ、ＰＬＡＰ、エストロゲン受容体、ラミニン受容体、ｅｒｂ Ｂおよびｐ１５５が挙げられる。
Ｄ．遺伝子治療
さらに別の実施形態では、二次治療は、治療的ポリヌクレオチドが、治療組成物の前、後、または同時に投与される遺伝子治療である。遺伝子生成物の発現のためのウイルスベクターは、当該技術分野において周知であり、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、レンチウイルス、ワクシニアウイルスを含むポックスウイルス、およびＳＶ４０を含むパピローマウイルス等の真核発現系を含む。あるいは、発現構成体の投与は、リポソームまたはＤＯＴＡＰ：コレステロール小胞等の脂質系ベクターにより達成され得る。これらの方法の全ては、当該技術分野において周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９；Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９８；Ａｕｓｕｂｅｌ，１９９６）。
以下の遺伝子のうちの１つをコードするベクターの送達は、標的組織に対して複合された抗過剰増殖作用を有する。多様なタンパク質は、本実施形態に包含され、それらのいくつかを以下に説明する。
１．細胞増殖の阻害
上記のとおり、腫瘍抑制癌遺伝子は、過剰な細胞増殖を阻害するように機能する。これらの遺伝子の不活性化は、それらの阻害性活性を破壊し、無秩序な増殖をもたらす。
本実施形態による二次治療として用いられ得る遺伝子として、ｐ５３、ｐ１６、Ｒｂ、ＡＰＣ、ＤＣＣ、ＮＦ−１、ＮＦ−２、ＷＴ−１、ＭＥＮ−Ｉ、ＭＥＮ−ＩＩ、ｚａｃ１、ｐ７３、ＶＨＬ、ＭＭＡＣ１／ＰＴＥＮ、ＤＢＣＣＲ−１、ＦＣＣ、ｒｓｋ−３、ｐ２７、ｐ２７／ｐ１６融合、ｐ２１／ｐ２７融合、抗血栓遺伝子（例えば、ＣＯＸ−１、ＴＦＰＩ）、ＰＧＳ、Ｄｐ、Ｅ２Ｆ、ｒａｓ、ｍｙｃ、ｎｅｕ、ｒａｆ、ｅｒｂ、ｆｍｓ、ｔｒｋ、ｒｅｔ、ｇｓｐ、ｈｓｔ、ａｂｌ、Ｅ１Ａ、ｐ３００、血管新生に必要な遺伝子（例えば、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ、トロンボスポンジン、ＢＡＩ−１、ＧＤＡＩＦ、またはそれらの受容体）、ＭＣＣ、および表ＩＶに列挙される他の遺伝子が挙げられる。
２．プログラム細胞死の調節因子
アポトーシス、またはプログラム細胞死は、正常な胚の発育に必須の過程であり、成体組織中のホメオスタシスを維持し、発癌を抑制する（Ｋｅｒｒ ｅｔ ａｌ．，１９７２）。Ｂｃｌ−２ファミリーのタンパク質およびＩＣＥ様プロテアーゼは、他の系中のアポトーシスの重要な調節因子およびエフェクターであることが実証された。濾胞性リンパ腫と関連して発見されたＢｃｌ−２タンパク質は、アポトーシスを制御すること、および多様なアポトーシス性刺激に応答して細胞生存を強化することにおいて顕著な役割を果たす（Ｂａｋｈｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，１９８５；Ｃｌｅａｒｙ ａｎｄ Ｓｋｌａｒ，１９８５；Ｃｌｅａｒｙ ｅｔ ａｌ．，１９８６；Ｔｓｕｊｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，１９８５；Ｔｓｕｊｉｍｏｔｏ ａｎｄ Ｃｒｏｃｅ，１９８６）。進化的に保存されたＢｃｌ−２タンパク質は、現在、関連タンパク質のファミリーメンバーであることが認識されており、デスアゴニストまたはデスアンタゴニストとして分類され得る。
その発見に続いて、Ｂｃｌ−２が多様な刺激によって引き起こされる細胞死を抑制するように作用することが示された。また、現在、共通の構造および配列相同性を共有する、Ｂｃｌ−２細胞死調節タンパク質のファミリーが存在することは明らかである。これらの異なるファミリーメンバーは、Ｂｃｌ−２（例えば、ＢｃｌＸＬ、ＢｃｌＷ、ＢｃｌＳ、Ｍｃｌ−１、Ａ１、Ｂｆｌ−１）と同様の機能を有するか、またはＢｃｌ−２機能に対抗し、細胞死を促進するかのいずれかであることが示された（例えば、Ｂａｘ、Ｂａｋ、Ｂｉｋ、Ｂｉｍ、Ｂｉｄ、Ｂａｄ、Ｈａｒａｋｉｒｉ）。
Ｅ．手術
癌を有する個人の約６０％は、予防的、診断的または段階的、治癒的、および緩和的手術を含む、いくつかの種類の手術を受ける。治癒的手術は、本明細書において提供される治療、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、遺伝子治療、療法免疫、および／または代替療法等の他の治療と併用され得る癌治療である。
治癒的手術として、癌性組織の全てまたは一部が、物理的に除去される、切除される、および／または破壊される切除術が挙げられる。腫瘍切除術は、腫瘍の少なくとも一部の物理的除去を指す。腫瘍切除術に加えて、手術による治療として、レーザー手術、冷凍手術、電気手術、および顕微鏡制御された手術（Ｍｏｈｓ手術）が挙げられる。本実施形態は、表面癌、前癌、または偶発量の正常組織の除去と併用されてもよいことがさらに企図される。
癌性細胞、組織、または腫瘍の一部または全てを切除する際、体内に空洞が形成され得る。治療は、追加の抗癌治療とともに、領域の穿孔、直接注入、または局所適用によって達成される。そのような治療は、例えば、１、２、３、４、５、６、または７日毎、または１、２、３、４、および５週間毎、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、もしくは１２ヶ月毎に繰り返され得る。これらの治療は、変動する投与量であってもよい。
Ｆ．他の薬剤
治療の治療的有効性を改善するために、他の薬剤が本明細書に提供される組成物と併用され得ることが企図される。これらの追加の薬剤として、免疫調製剤、細胞表面受容体およびＧＡＰ接合の上方調節に作用する薬剤、細胞増殖抑制剤および分化剤、細胞接着の阻害剤、またはアポトーシス誘導剤に対する過剰増殖性細胞の感受性を増加させる薬剤が挙げられる。免疫調節剤として、腫瘍壊死因子；インターフェロンα、β、およびγ；ＩＬ−２および他のサイトカイン；Ｆ４２Ｋおよび他のサイトカイン類似体；またはＭＩＰ−１、ＭＩＰ−１β、ＭＣＰ−１、ＲＡＮＴＥＳ、および他のケモカインが挙げられる。細胞表面受容体またはそれらのリガンド、例えば、Ｆａｓ／Ｆａｓリガンド、ＤＲ４またはＤＲ５／ＴＲＡＩＬの上方調節が、過剰増殖性細胞に対する自己分泌または傍分泌作用を確立することによって、本明細書に提供される組成物のアポトーシス誘導能力を強化することがさらに企図される。ＧＡＰ接合の数を上昇させることによる細胞間シグナル伝達の増加は、近傍の過剰増殖性細胞集団に対する抗過剰増殖作用を増加させる。他の実施形態では、細胞増殖抑制剤または分化剤は、治療の抗過剰増殖作用を改善するために、本明細書に提供される組成物と併用され得る。細胞接着の阻害剤は、本発明の有効性を改善するように企図される。細胞接着阻害剤の例は、焦点接着キナーゼ（ＦＡＫ）阻害剤およびロバスタチンである。抗体ｃ２２５等のアポトーシスに対する過剰増殖性細胞の感受性を増加させる他の薬剤は、治療の有効性を改善するために、本明細書に提供される組成物と併用され得ることがさらに企図される。
ある実施形態では、ホルモン療法が、本実施形態と併用され得るか、または以前に記載された任意の他の癌治療と併用されてもよい。ホルモンの使用は、レベルを低下させるか、またはテストステロンもしくはエストロゲン等のあるホルモンの作用を阻止するように、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、または子宮頸癌等のある癌の治療において用いられ得る。この治療は、多くの場合、治療オプションとして少なくとも１つの他の癌治療と併用されるか、または転移のリスクを低減するように用いられる。
ＶＩＩ．治療方法
細胞の成長は阻害され、例えば、低減されるか、または細胞死は、阻害剤を含む組成物と細胞を接触させることによって誘導される。細胞成長の阻害とは、組成物に曝露されていない細胞と比較して、細胞がより低い速度で増殖するか、または生存性が減少したことを意味する。細胞成長は、クリスタルバイオレット、トリパンブルー等の当該技術分野において既知の方法、またはＡＴＰ、ＮＡＤＨ、カパーゼ、ＬＤＨ、またはＭＴＴの測定によって測定される。
細胞は、阻害剤と直接接触される。あるいは、阻害剤は、全身的に投与される。阻害剤は、細胞増殖を減少（例えば、阻害）するか、または細胞死を誘導するのに十分な量で投与される。
任意選択により、細胞は化学療法化合物と接触される。特に、この化学療法化合物は、ハウスキーピング遺伝子の代謝経路を標的とする。例えば、化学療法化合物は、ＤＮＡホメオスタシスを標的とする。例示の化学療法化合物は、ゲムシタビンを含む。
細胞は、癌腫、腺癌、芽細胞腫、白血病、骨髄腫、または肉腫等の腫瘍細胞である。特に、癌は膠芽細胞腫である。
様々な態様では、細胞は、冗長な相同体を有する１つ以上のハウスキーピング遺伝子のホモ接合性欠失を有する。ホモ接合性欠失は、当該技術分野において既知の方法によって特定される。
これらの方法は、多様な癌の症状を軽減するために有用である。冗長な相同体を有するハウスキーピング遺伝子中にホモ接合性欠失を含む任意の癌は、本発明の方法による治療に対して修正可能である。いくつかの態様では、対象は、膠芽細胞腫を患っている。
治療が、対象における腫瘍のサイズ、普及、または転位の可能性の減少等の臨床利益をもたらす場合、その治療は有効である。治療が予防的に適用されるとき、「有効な」とは、その治療が、腫瘍が形成するのを遅延もしくは予防するか、または腫瘍の臨床症状のうちの症状を予防もしくは軽減することを意味する。有効性は、特定の腫瘍型を診断または治療するための任意の既知の方法に関連して決定される。
本発明の治療方法によって治療の有効性を決定する方法も本発明に含まれる。治療の有効性は、対象に由来する試料中のハウスキーピング遺伝子の代謝経路の１つ以上の代謝産物のレベルを測定することによって決定される。細胞中の経路を失速させることは、代謝産物の蓄積をもたらし、ハウスキーピング遺伝子の生成を進行させる。この代謝産物の蓄積は、治療が有効であることを示す。
例えば、エノラーゼ２の阻害時に、細胞中の解糖経路の失速は、代謝産物の蓄積をもたらし、エノラーゼ、最も即時的には２−ホスホグリセリン酸塩の生成を進行させる。効果的に治療される腫瘍は、エノラーゼ阻害の有効性の割合と相関する割合で、血流中にこれらの代謝産物を放出すると予想される。これらの代謝産物の血清レベルを測定することは、腫瘍標的の有効性を監視するのを可能にする。特定の阻害剤で治療された細胞株のメタボロンプロファイリングも行い、どの追加の代謝産物が蓄積し、血清プロファイリングまたはさらなる精練治療において最も有用であり得るかを決定する。
ＶＩＩＩ．治療的投与
本発明は、阻害剤を含む組成物を対象に投与することを含む。
治療化合物の有効な量は、好ましくは約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１５０ｍｇ／ｋｇである。有効な用量は、当業者に認識されているように、投与経路、賦形剤の使用、および癌の症状を治療、予防、または軽減するための他の抗増殖剤または治療薬剤の使用を含む、他の治療的処置との共投与に応じて異なる。治療計画は、必須ハウスキーピング遺伝子のホモ接合性欠失を有する癌を患う哺乳類、例えば、ヒト患者を、標準方法を使用して特定することによって行われる。
医薬化合物は、当該技術分野において既知の方法を使用して、そのような個人に投与される。好ましくは、この化合物は、経口、直腸、鼻腔、局所、または非経口的に投与され、例えば、皮下、腹腔内、筋肉内、および静脈内投与される。阻害剤は、任意選択により、癌を治療する治療薬のカクテルの成分として製剤される。非経口投与に適した製剤の例として、等張生理食塩水中の活性薬剤の水性溶液、５％グルコース溶液、または別の標準の薬学的に許容される賦形剤が挙げられる。ＰＶＰまたはシクロデキストリン等の標準可溶化剤もまた、治療化合物の送達のための薬学的賦形剤として利用される。
本明細書に記載される治療化合物は、従来の方法を利用する投与の他の経路のための組成物に製剤される。例えば、治療化合物は、経口投与のためのカプセルまたは錠剤に製剤される。カプセルは、ゼラチンまたはセルロース等の任意の標準の薬学的に許容される材料を含み得る。錠剤は、固体担体および潤滑剤と治療化合物の混合物を圧縮することによって、従来の手順により製剤され得る。固体担体の例として、スターチよび糖ベントナイトが挙げられる。化合物は、結合剤、例えば、ラクトースまたはマンニトール、従来の充填剤、および錠剤化剤を含む、硬殻錠剤またはカプセルの形態で投与される。他の製剤として、軟膏、坐薬、ペースト、スプレー、パッチ、クリーム、ゲル、吸収性スポンジ、または泡が挙げられる。そのような製剤は、当該技術分野において周知の方法を使用して生成される。
治療化合物は、罹患組織と化合物との直接接触時に有効である。したがって、化合物は局所投与される。あるいは、治療化合物は全身投与される。例えば、化合物は吸入により投与される。化合物は、加圧容器、または適切な推進剤、例えば、二酸化炭素等の気体を含む注入器、または噴霧器からエアロゾルスプレーの形態で送達される。
加えて、化合物は、対象の組織に隣接および周囲に化合物をゆっくり放出する、固体または吸収性マトリクスを（器官の中に直接または皮下的に）移植することによって投与され得る。
ＩＸ．実施例
以下の実施例は、本発明の好適な実施形態を実証するために含まれる。発明者によって発見された代表技術に従う実施例において開示される技術は、本発明の実施において良好に機能するため、その実践の好適な形態を構成すると考えられ得ることは、当業者に理解されるはずである。しかしながら、当業者であれば、本開示に照らして、本発明の趣旨または範囲を逸脱することなく、開示される特定の実施形態に多くの変更を行うことができ、なおも同様または類似の結果を得ることができることを理解するであろう。
実施例１−ホモ接合性欠失を有する癌細胞中のハウスキーピング遺伝子の標的化が癌細胞死をもたらす
癌細胞の増殖および／または死は、癌がハウスキーピング遺伝子中にホモ接合性欠失を有し、このハウスキーピング遺伝子が、冗長な相同体の活性を阻害するのに十分な量で冗長な相同体の阻害剤を対象に投与するか、またはそれと細胞を接触させることによって、機能的に冗長な相同体を有する場合に誘導される。
一般的な方法
細胞培養
ホモ接合性欠失を有する細胞株は、既知の方法を使用して培養する。（１ｐ３６比較目的で、細胞株Ｕ８７、ＬＮ３１９、ＳＷ１０８８、Ｕ３４３、Ｕ３７３、およびＡ１２０７は、同じ条件下で成長される）。
ハウスキーピング遺伝子発現のｓｈＲＮＡノックダウン
ハウスキーピング遺伝子を標的とするヘアピンを調製し、ハウスキーピング遺伝子のタンパク質レベルを低減する能力についてスクリーニングする。
ＧＩＰＺベクター中のヘアピンは、製造者により提供されるプロトコルを使用して、ＴＲＩＰＺベクターにクローン化した。ＴＲＩＰＺベクターは、ドキシサイクリン誘導時にのみ発現される、赤色蛍光タンパク質レポーターを有するドキシサイクリン誘導系である。組み換えレンチウイルスは、標準プロトコルに従い、２９３Ｔ細胞の一時的形質導入によって生成される。つまり、７２μｇのｓｈＲＮＡプラスミド、５４μｇのデルタ８．９、および１８μｇのＶＳＶＧプラスミドは、Ｆｕｇｅｎｅ（登録商標）（Ｒｏｃｈｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を使用して、２４５ｍｍ２皿に置かれた２９３Ｔ細胞に形質導入される。形質導入から７２時間後にウイルス上清を回収し、２３，０００ｒｐｍで遠心分離により濃縮して、細胞成長培地中に再懸濁する。形質導入の場合、ウイルス溶液を、４μｇ／ｍＬポリブレンを含む細胞培養培地に添加し、感染から４８時間後、２μｇ／ｍＬピューロマイシンを使用して細胞を選択し、ウェスタンブロットによってハウスキーピング遺伝子のノックダウンについて試験する。
ｓｈＲＮＡ抵抗性ハウスキーピング遺伝子構成体の生成
細胞中のハウスキーピング遺伝子をノックダウンする表現型効果の救済は、ｓｈＲＮＡ抵抗性形態のハウスキーピング遺伝子を過剰発現することによって行われる。つまり、６個のサイレント変異は、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ）に従って、部位配向された突然変異を使用して、ｓｈＲＮＡにより標的されるハウスキーピング遺伝子コード領域に導入される。ｓｈＲＮＡ抵抗性ハウスキーピング遺伝子コード領域は、ｐＨＡＧＥ−ＣＭＶレンチウイルスベクターにクローン化され、ドキシサイクリンの存在または不在下で、ｓｈＲＮＡを運ぶ細胞株中で過剰発現される。対照として、同じ細胞株は、ＧＦＰ遺伝子を運ぶレンチウイルスベクターによって感染される。
増殖測定
ｓｈＲＮＡまたはＰｈＡＨ治療された細胞株の細胞成長は、クリスタルバイオレット染色によって、またはＰｒｏｍｅｇａ Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏ（登録商標）増殖キット（Ｒｏｃｈｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を使用するかのいずれかで測定される。クリスタルバイオレット測定の場合、各時点で１０，０００個の細胞を６ウェルプレートに播種する。指示される時点で、細胞を１０％ホルマリンで固定し、クリスタルバイオレット溶液で１時間染色する。染色抽出は、１０％酢酸溶液を使用して行い、５９０ｎｍで吸光度を読み取った。Ｃｅｌｌ ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏ（登録商標）実験は、製造者により指示されるように行う。１ウェル当たり１０００個の細胞を、各時点で９６ウェルプレートに置き、２４時間毎に発光値を記録する。全ての実験は、３重複で行う。
ハウスキーピング遺伝子活性測定
ハウスキーピング遺伝子の活性は、当該技術分野において既知の方法を使用して測定する。
ウェスタンブロット
２回のＰＢＳ洗浄後に、細胞をＲＩＰＡ緩衝液中で１５分間、軽く振動させてインキュベートする。次に溶解物を回収し、超音波処理して、１４０００ＲＰＭで１０分間４℃で遠心分離する。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロットは、以前の（Ｍａｓｅｒｅｔ
ａｌ．，２００７）のように行った。
実施例２−ＥＮＯ２活性の阻害がＥＮＯ１のホモ接合性欠失を有する細胞株中で細胞死を誘導する
一般的な方法
細胞培養
細胞株Ｄ４２３−ＭＧ（ＥＮＯ１を含む１ｐ３６ホモ接合性欠失）およびＤ５０２−ＭＧ（１ｐ３６ホモ接合性欠失、ＥＮＯ１を含まない）を得て、ＤＭＥＭ培地中で２０％ＦＢＳを用いて培養した（Ｄｕｎｃａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１０；Ｄ４２３およびＤ５０２は、Ｄｕｎｃａｎ ｅｔ ａｌ．，においてＨ４２３およびＨ５０２と称されるが、Ｓａｎｇｅｒ データベースではＤ４２３−ＭＧおよびＤ５０２−ＭＧと称され、ここではその命名を採用する）。比較目的で、細胞株Ｕ８７、ＬＮ３１９、ＳＷ１０８８、Ｕ３４３、Ｕ３７３、およびＡ１２０７は、同じ条件下で成長させた。ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）から得られた正常なヒト胚星状細胞は、製造者により提供される媒質中で成長させた。
ＥＮＯ２発現のｓｈＲＮＡノックダウン
エノラーゼ２を標的とする２２個のヘアピンをスクリーニングし、４つの独立したヘアピンがタンパク質レベルを５０％超低減させたことが分かった。これらのヘアピンのうち２つは、ｐＬＫＯ．１ベクター（ＳｈＥＮＯ２−１およびｓｈＥＮＯ２−２）中に存在し、残りの２つは、発現停止ＧＩＰＺ（ｓｈＥＮＯ２−３）およびＴＲＩＰＺ（ｓｈＥＮＯ２−４）ｓｈＲＮＡｍｉｒベクター（Ｏｐｅｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ）中に存在した。ＧＩＰＺベクター中のヘアピンは、製造者により提供されるプロトコルを使用して、ＴＲＩＰＺベクターにクローン化した。ＴＲＩＰＺベクターは、ドキシサイクリン誘導時にのみ発現される、赤色蛍光タンパク質レポーターを有するドキシサイクリン誘導系である。組み換えレンチウイルスは、標準プロトコルに従い、２９３Ｔ細胞の一時的形質導入によって生成した。つまり、７２μｇのｓｈＲＮＡプラスミド、５４μｇのデルタ８．９、および１８μｇのＶＳＶＧプラスミドは、Ｆｕｇｅｎｅ（登録商標）（Ｒｏｃｈｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を使用して、２４５ｍｍ２皿に置かれた２９３Ｔ細胞に形質導入した。形質導入から７２時間後にウイルス上清を回収し、２３，０００ｒｐｍで遠心分離により濃縮して、細胞成長培地中に再懸濁した。形質導入の場合、ウイルス溶液を、４μｇ／ｍＬポリブレンを含む細胞培養培地に添加し、感染から４８時間後、２μｇ／ｍＬピューロマイシンを使用して細胞を選択し、ウェスタンブロットによってＥＮＯ２のノックダウンについて試験した。
ｓｈＲＮＡ抵抗性ＥＮＯ２構成体の生成
細胞株Ｄ４２３−ＭＧ中のＥＮＯ２をノッキングする表現型効果の救済は、ＥＮＯ２のｓｈＲＮＡ抵抗性形態を過剰発現することによって行った。つまり、６個のサイレント変異は、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ）に従って、部位配向された突然変異を使用して、ｓｈＥＮＯ２−４により標的されるＥＮＯ２コード領域に導入した。ｓｈＲＮＡ抵抗性ＥＮＯ２コード領域は、ｐＨＡＧＥ−ＣＭＶレンチウイルスベクターにクローン化され、ドキシサイクリンの存在または不在下で、ｓｈＥＮＯ２−４を運ぶＤ４２３−ＭＧ細胞株中で過剰発現された。対照として、同じ細胞株は、ＧＦＰ遺伝子を運ぶレンチウイルスベクターによって感染した。
増殖測定
ｓｈＲＮＡまたはＰｈＡＨ治療された細胞株の細胞成長は、クリスタルバイオレット染色によって、またはＰｒｏｍｅｇａ Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏ（登録商標）増殖キット（Ｒｏｃｈｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を使用するかのいずれかで測定した。クリスタルバイオレット測定の場合、各時点で１０，０００個の細胞を６ウェルプレートに播種した。指示される時点で、細胞を１０％ホルマリンで固定し、クリスタルバイオレット溶液で１時間染色した。染色抽出は、１０％酢酸溶液を使用して行い、５９０ｎｍで吸光度を読み取った。Ｃｅｌｌ ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏ（登録商標）実験は、製造者により指示されるように行った。１ウェル当たり１０００個の細胞を、各時点で９６ウェルプレートに置き、２４時間毎に発光値を記録した。全ての実験は、３重複で行う。
軟寒天コロニー形成測定
アンカレッジ非依存性成長測定は、６ウェルプレート中で２重複または３重複で行った。１ウェル当たり１０４の指示細胞を、１％低融点アガロースＤＭＥＭ＋１０％ ＦＢＳを含む底部寒天の上の０．４％低融点アガロースを含むＤＭＥＭ＋１０％ ＦＢＳ中に播種した。１４〜２１日後、コロニーをヨードニトロテトラゾリウムクロリド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で染色し、計数した。
同所性腫瘍形成測定
Ｄ４２３−ＭＧ細胞の注入は、以前に記載されるとおり行い（Ｚｈｅｎｇ ｅｔａｌ．，２００８）、６〜１２週齢のＳＣＩＤマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）を、Ｚ軸を備えた定位装置（Ｓｔｏｅｌｔｉｎｇ）の中に置いた。歯科用ドリルを使用して、頭蓋骨のブレグマの前方０．５ｍｍ、後方３．０ｍｍに穴を開けた。Ｈａｎｋｓ緩衝食塩溶液中の１００，０００個の細胞を、非斜角３０ゲージ針を用いて、１０μＬハミルトンシリンジを使用して、脳の表面の３ｍｍ下の右尾状核の中に注入した。９ｍｍ Ａｕｔｏｃｌｉｐアプライヤーを使用して、頭皮を閉合した。動物は、神経障害の発生について毎日追跡した。
動物は、神経障害の発生について毎日追跡した。全てのマウス実験は、ハーバードおよびダナ−ファーバー癌研究所の研究機関の動物管理使用委員会（Ｈａｒｖａｒｄ ａｎｄ Ｄａｎａ−Ｆａｒｂｅｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）の承認により行った。
エノラーゼ活性測定
エノラーゼ活性は、Ｊｏｓｅｐｈ ｅｔ ａｌ．，１９９６において前述されるように、ピルビン酸キナーゼ−乳酸デヒドロゲナーゼ連結測定においてＮＡＤＨ酸化に続いて測定した。つまり、細胞を、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣＬ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、および１ｍＭ β−メルカプトエタノール ｐＨ７．４中に溶解し、ポリトロンホモジナイザーを使用して１０秒間３回均質化した後、超音波処理した。エノラーゼ活性は、３４０ｎｍでの吸光度により分光光度的、または３４０ｎｍでの励起および４６０ｎｍでの放出により蛍光標識的のいずれかでＮＡＤＨの酸化を測定することにより記録した。
ウェスタンブロット
２回のＰＢＳ洗浄後に、細胞をＲＩＰＡ緩衝液中で１５分間、軽く振動させてインキュベートした。次に溶解物を回収し、超音波処理して、１４，０００ＲＰＭで１０分間４℃で遠心分離した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロットは、以前のＭａｓｅｒｅｔ ａｌ．（２００７）のように行った。以下の抗体を使用した：Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ）からのエノラーゼ１ ＣＳＴ＃３８１０；エノラーゼ２ ＃９５３６；ＧＡＰＤＨ ＣＳＴ＃３６８３、およびＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）からのＶｉｎｃｕｌｉｎ。
阻害剤研究
ホスホノアセトヒドロキサム酸リチウム塩（ＰｈＡＨ）は、ＴＣＲＳ ＬＬＣ（Ｂｒｉｓｔｏｌ，ＰＡ）により、Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８４のプロトコルに従ってカスタム合成した。構造および精度をＮＭＲにより検証した。ＰｈＡＨを５０ｍＭストックでＰＢＳ中に溶解し、使用するまで−８０℃で凍結保存した。化合物の不安定性を考慮して、媒質を５日毎に置き換え、新鮮な阻害剤を新鮮な媒質とともに添加した。ラパマイシン、ソラフェニブ、ラパチニブ、およびＰＨＡ６６５７５２は、それぞれＬＣ Ｌａｂｓ（Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ）およびＴｏｃｒｉｓ（Ｅｌｌｉｓｖｉｌｌｅ，ＭＯ）から得た。
結果
ＴＣＧＡ Ａｇｉｌｅｎｔ ＳＮＰアレイデータおよびＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘアレイＣＧＨデータデータベース（Ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｎｅｔｗｏｒｋ、２００８）の分析は、３５９個のＧＢＭ試料中５つがＥＮＯ１のホモ接合性欠失を有することを明らかにし、他のゲノムデータセットは、最大５％ １６、１９、２０のＥＮＯ１ホモ接合性欠失頻度を示す。遺伝子発現分析は、これらの試料中のエノラーゼ１発現のほぼ完全な不在を示す（図１ｂ、図１８）。ＧＢＭ細胞株、Ｄ４２３−ＭＧ２０は、ＣＡＭＴＡ１、ＶＡＭＰ３、ＰＥＲ３、ＵＴＳ２、ＴＮＦＲＳＦ９、ＰＡＲＫ７、ＥＲＲＦＩ１、ＳＬＣ４５Ａ１、ＲＥＲＥ、ＥＮＯ１、ＣＡ６、ＳＬＣ２Ａ５、ＧＰＲ１５７、ＭＩＲ３４Ａ、Ｈ６ＰＤ、ＳＰＳＢ１、およびＳＬＣ２５Ａ３３遺伝子にわたって１ｐ３６．２３ホモ接合性欠失を有すると特定された。第２のＧＢＭ細胞株、Ｄ５０２−ＭＧもまた、この遺伝子座のホモ接合性欠失を被るが、ＳＬＣ２５Ａ３３遺伝子を通して正常なＥＮＯ１を残す（図１ｃ）。これらの株のウェスタンブロット分析は、Ｄ４２３−ＭＧ中のエノラーゼ１タンパク質の喪失およびエノラーゼ２の正常発現、ならびにＤ５０２−ＭＧおよび試験した全ての他のグリア／膠芽腫細胞株中の双方のタンパク質の存在を示す（図１ｄ）。
これらの２つの細胞株を、他のＥＮＯ１正常対照（Ｕ８７、Ａ１２０７、ＬＮ３１９）とともに使用して、野生型またはヌルＥＮＯ１の文脈における、エノラーゼ２のｓｈＲＮＡ媒介性ノックダウンの影響を評価した。ドキシサイクリン誘導系を使用して、２つの独立したｓｈＲＮＡは、エノラーゼ２タンパク質を７０％超低減させることにおいて有効であり（図２ａ）、エノラーゼ１レベルに対する効果を示さなかった。このＥＮＯ２の切除は、ＥＮＯ１ヌルＤ４２３−ＭＧ中のみで細胞増殖の著しい阻害をもたらした（図２ｂ）。非誘導系において２つの追加の非依存性エノラーゼ２ ｓｈＲＮＡを使用して、同じ結果が得られた（図５）。ヘアピン抵抗性ＥＮＯ２構成体の発現は、ｓｈＥＮＯ２ヘアピンの欠失効果を完全に逆転させることをさらに示し（図７）、ヘアピンの効果が、実際にＥＮＯ２発現の下方調節に特異的であったことを示す。
次に、ＥＮＯ１野生型およびヌル細胞中のエノラーゼ活性の阻害の薬理作用を評価した。以前の研究は、特に抗菌および抗寄生目的で、エノラーゼの薬理阻害に注目し（Ｇｕｈａ−Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ ｅｔ ａｌ．，１９９７；ｄｅ，Ａ．Ｓ．Ｎ．Ｍ．Ｖ．ｅｔ ａｌ．，２００７）、多くの化合物が特徴付けられており、それらの大部分は、反応中間体類似体として作用する（表４）。大部分の有力なエノラーゼ阻害剤は、ホスホノアセトヒドロキサム酸化合物であり（ＰｈＡＨ；Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８４）、１５ｐＭの阻害性定数を有する遷移状態類似体として作用すると考えられる。ＰｈＡＨは、ヒトエノラーゼに関して試験されていないが、以前の研究は、遠縁の有機体に由来するエノラーゼに対する阻害効果を実証し（Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８４；ｄｅ，Ａ．Ｓ．Ｎ．Ｍ．Ｖ．ｅｔ ａｌ．，２００７）、大きな系統発生的距離にわたるその潜在的使用を示唆する。ＰｈＡＨは、膠芽腫細胞株の天然溶解物中で、エノラーゼを生体外で有力に阻害した（図３ｂ）。０．６２５〜５０μＭの範囲の濃度でＰｈＡＨを用いたところ、ＥＮＯ１ヌル細胞中で著しい毒性（図３ａ、ｃ、ｄ）およびＥＮＯ１正常対照に対する最小減の影響を観測し、ＥＮＯ１ヌル細胞に対して少なくとも１０倍大きなエノラーゼ活性を示す（図３Ｂ；ＥＮＯ１は、ＧＢＭ中の主要なエノラーゼ同位体であり、細胞エノラーゼ活性の７５〜９０％を占める；Ｊｏｓｅｐｈ ｅｔ ａｌ．，１９９６）。特に、ＥＮＯ１ヌル細胞は、受容体チロシンキナーゼ阻害剤等の他の分子標的治療に対する任意の優れた感受性を示さない（Ｓｔｏｍｍｅｌ ｅｔ ａｌ．，２００７）（ラパチニブ、ソラフェニブ、ＰＨＡ６６５７５２）（図１０）。これらのデータは、Ｄ４２３−ＭＧ細胞は、他の抗癌剤の影響を広く受けにくいこと、およびＰｈＡＨがＥＮＯ１ヌルＧＢＭ細胞を選択的に標的とすることを示す。特筆すべきは、１ｐ３６のホモ接合性欠失を有するが、ＥＮＯ１遺伝子を保持するＤ５０２−ＭＧ細胞は、ＥＮＯ１ヌルＤ４２３−ＭＧ細胞よりＰｈＡＨに対してはるかに高い抵抗性があることである。さらに、中等度のレベルのエノラーゼ活性を示すＵ３４３およびＤ５０２細胞は、ＰｈＡＨに対する中等度のレベルの感受性を示し、エノラーゼ阻害に対する相対感受性を示唆する。最後に、ヘアピン抵抗性ＥＮＯ２の再発現によるＥＮＯ２活性の上昇は、ＥＮＯ１ヌルＤ４２３−ＭＧ細胞のＰｈＡＨ感受性を逆転させた（図７）。
実施例３−ＥＮＯ１の欠失は、細胞を解糖阻害剤に対して感受性にする
癌ゲノムは、多数のコピー数増幅および欠失を特徴とし、それぞれ、ドライバー発癌遺伝子および腫瘍抑制遺伝子を標的とする。多くの場合、これらのゲノム変化は、意図される標的（複数可）に加えて多くの他の遺伝子に作用する、大きな地域事象である。そのような広域ゲノム変化が癌細胞中で否定的に選択されないという事実は、それら自体が、これらの近傍パッセンジャーのコピー数変化が、任意の有害生物学的影響を及ぼしてはならないことを含意する。つまり、これらのパッセンジャーゲノム事象は、例えば、共欠失されるパッセンジャーが、ヒッスハウスキーピング機能を果たす冗長な多重遺伝子ファミリーのメンバーであるとき、それらの細胞に固有の意図されない（副次的）脆弱性を形成することができることが企図される。脊椎動物ならびにマウスにおける遺伝的相互作用研究の大半は、多くの必須細胞性ハウスキーピング機能が、１つの相同体の喪失に直面して細胞生存性を可能にするが、多数の相同体の喪失時に完全な致死性を可能にする、重複機能をコードする多数の相同体遺伝子（Ｖａｖｏｕｒｉ ｅｔ ａｌ．，２００８；Ｃｏｓｔａｎｚｏ ｅｔ ａｌ．，２００８；Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００６）によって行われることを示す。この概念的枠組みでは、冗長な必須ハウスキーピング遺伝子のホモ接合性欠失が、癌特異的脆弱性を形成し得ることが仮定され、それによって、第２の非欠失相同体の薬理的不活性化は、欠失を運ぶ腫瘍細胞中の活性の完全喪失をもたらすが、双方の遺伝子が正常であり発現される正常細胞の健康を低下させないと想定された。
必須細胞活性に必要とされる遺伝子を標的とするホモ接合性欠失についてＣａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ）ＧＢＭデータを調べることによって（Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｎｅｔｗｏｒｋ，２００８）、ＥＮＯ１遺伝子は、１ｐ３６腫瘍抑制遺伝子座に存在する候補として特定された。３つの相同性遺伝子によってコードされるエノラーゼは、解糖の第２〜最後の工程を触媒する必須酵素であり、２−ホスホグリセリン酸をホスホエノールピルビン酸塩に変換する。哺乳類では、エノラーゼ活性は３つの遺伝子、遍在的に発現されるＥＮＯ１（Ｊｏｓｅｐｈ ｅｔ ａｌ．，１９９６；Ｓｔｅｆａｎｉｎｉ，１９７２）；、神経組織中で独占的に発現されるＥＮＯ２（Ｊｏｓｅｐｈ ｅｔ ａｌ．，１９９６；Ｋｏｂａｙａｋａｗａ ｅｔ ａｌ．，２００７）；および筋組織中で発現されるＥＮＯ３（Ｃｏｍｉ ｅｔ ａｌ．，２００１）によってコードされる。ＥＮＯ１は、ＧＢＭ中の主要なエノラーゼ同位体であり、細胞エノラーゼ活性の７５〜９０％を占める（Ｊｏｓｅｐｈ ｅｔ ａｌ．，１９９６）。正常細胞および特に腫瘍細胞中のエネルギー生成および同化作用に対する解糖の決定的重要性を考慮して（Ｗｉｓｅ ａｎｄ Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，２０１０）、ＥＮＯ１のＧＢＭ腫瘍ホモ接合性ヌルは、エノラーゼ２の阻害に対して高度に敏感であることが予測されるが、正常な神経組織は、エノラーゼ１の機能的冗長性のために影響されないはずである。対応して、ＥＮＯ２ノックアウトマウスは生存性かつ繁殖性であり、エノラーゼ２の薬理阻害が十分に耐容される可能性があることを示唆する。さらに、いくつかのエノラーゼ相同体を有する出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）は、単一変異体を有する弱い表現型を示し、全ての相同体が欠失されたときのにみ細胞致死性をもたらすが（Ｃｏｓｔａｎｚｏ ｅｔ ａｌ．，２００８；Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００６）、シノラブディスエレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ）およびショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）は、エノラーゼ活性をコードする１つのみの遺伝子を有し、その欠失は致死的である（Ｓｏｎｎｉｃｈｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００５）。
いくつかの候補腫瘍抑制遺伝子（Ｂａｇｃｈｉ ａｎｄ Ｍｉｌｌｓ，２００８）を含む１ｐ３６遺伝子座は、ＧＢＭ中の頻繁な欠失を維持する（図１ａ）（Ｊｏｓｅｐｈ ｅｔ ａｌ．，１９９６）。１ｐ３６遺伝子座は、１〜５％のＧＢＭ中でホモ接合性欠失され（Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｎｅｔｗｏｒｋ，２００８；Ｄｕｎｃａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１０）（ならびに希突起神経膠腫（Ｋｏｔｉｌａｒｏｖ ｅｔ ａｌ．，２００６）、大細胞神経分泌肺腫瘍（Ｐｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００５））およびＥＮＯ１は、多くの場合、欠失に含まれる。ＴＣＧＡコピー数の切除（単一ヌクレオチド多型［ＳＮＰ］およびアレイ比較ゲノムハイブリダイゼーション［ａＣＧＨ］データ）（Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｎｅｔｗｏｒｋ，２００８）および発現プロファイルを調べることによって、３５９個のＧＢＭ試料中５つがＥＮＯ１のホモ接合性欠失を有することが特定され、その発現のほぼ完全な不在と関連付けられた（図１ｂおよび図４）。２つのＧＢＭ細胞株、Ｄ４２３−ＭＧ（Ｄｕｎｃａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１０）およびＧｌｉ５６（Ｍｕｅｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００７）は、ＥＮＯ１にわたる１ｐ３６遺伝子座におけるホモ接合性欠失を有することが特定された。第３のＧＢＭ細胞株、Ｄ５０２−ＭＧ（Ｄｕｎｃａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１０）もまた、この遺伝子座にある多くの遺伝子のホモ接合性欠失を被るため、優れた対照として機能する（図１ｃ）。ウェスタンブロット分析は、Ｄ４２３−ＭＧおよびＧｌｉ５６中のエノラーゼ１タンパク質の喪失およびエノラーゼ２の保持を確認したが、双方のタンパク質は、Ｄ５０２−ＭＧおよび試験した全ての他の膠芽腫および正常なグリア細胞株中に存在した（図１ｄ）。
Ｄ５０２−ＭＧ（ＥＮＯ１野生型［ＷＴ］）およびＤ４２３−ＭＧ（ＥＮＯ１−ヌル）細胞株を使用して、ＥＮＯ１ ＷＴまたはヌル文脈におけるＥＮＯ２のｓｈＲＮＡ媒介性ノックダウンの影響を評価した。２つの独立したＥＮＯ２ ｓｈＲＮＡ（ｐＬＫＯ．１ベクター）は、着実なタンパク質低減をもたらし、ＥＮＯ１ゲノム欠失の文脈においてのみ、細胞成長の著しい阻害をもたらした（図５）。追加の独立したＥＮＯ２ ｓｈＲＮＡ（ｐＧＩＰＺベクター）を使用して、同じ結果が得られた（図６ａ、ｂ）。さらに、ＥＮＯ１−ヌル細胞中のＥＮＯ２のｓｈＲＮＡ切除は、減少した軟寒天コロニー形成ももたらし、頭蓋内注入された細胞の生体内腫瘍発生能力を阻止した（図１ｅおよび図６ｃ）。最後に、ＥＮＯ１−ヌル細胞に対するＥＮＯ２切除の選択的毒性は、ドキシサイクリン誘導性ＴＲＩＰＺベクターを使用して、同質遺伝子の文脈において実証された。このドキシサイクリン誘導系をＥＮＯ１ ＷＴ細胞株（Ｕ８７、Ａ１２０７、ＬＮ３１９）中で使用したとき、２つの独立したｓｈＲＮＡは、エノラーゼ２タンパク質レベルを７０％超低減し（図２ａ）、エノラーゼ１レベルに対する影響はなかった（データ図示せず）。ＥＮＯ２のこの切除は、ＥＮＯ１−ヌルＤ４２３−ＭＧ細胞株中のみで細胞増殖の著しい阻害をもたらした（図２ｂ）。さらに、ヘアピン抵抗性ＥＮＯ２ ｃＤＮＡの強制発現は、ｓｈＥＮＯ２ヘアピンの欠失作用を完全に逆転させ（図７）、ヘアピンの阻害作用が、実際に消滅したＥＮＯ２発現に特異的であり、オフターゲット効果ではなかったことを示す。最後に、ＥＮＯ１がＥＮＯ１−ＷＴ ＧＢＭ下部中で観測されるものと同様のレベルで、Ｄ４２３−ＭＧ（ＥＮＯ１ヌル）細胞株中で局所的に再発現したとき、ＥＮＯ２のｓｈＲＮＡ切除の欠失作用は、完全に無効にされた（図８）。
次に、ＥＮＯ１ ＷＴおよびヌル細胞中のエノラーゼ活性の薬理阻害の影響を評価した。以前の研究は、特に抗寄生目的で、エノラーゼの薬理阻害に注目し（Ｎａｖａｒｒｏ ｅｔ ａｌ．，２００７）、多くの化合物が特徴付けられており、それらの大部分は、反応中間体類似体として作用する（表５）。
表５：公開されたエノラーゼ阻害剤の一般特性。ｐａｎ−エノラーゼ阻害剤の大きな団は、酵素の機序を研究するためのツールとして過去に合成されており、ＰｈＡＨが最大能力を示す。大部分の阻害剤は、反応物質（２−ホスホグリセリン酸塩）および生成物（ホスホエノールピルビン酸塩）の中間体構成を示す、遷移状態類似体として作用すると考えられる。これらの阻害剤の有効なＩＣ５０は、阻害剤として作用するイオン化形態であるため表に列挙されるものよりも低く、ｐＫａｓは８〜１２の間で変動する。ＰｈＡＨの場合、ｐＫａは１０．２であり、生理学的ｐＨで、ＩＣ５０は約１５ｎＭであることが予想される（Ｎａｖａｒｒｏ ｅｔ ａｌ．，２００７）。
最も有力なエノラーゼ阻害剤は、ＰｈＡＨであり（Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８４）、酵母エノラーゼ上で１５ｐＭの阻害定数を有する遷移状態類似体として作用すると考えられる。ＰｈＡＨは、ヒトエノラーゼに関して試験されていないが、以前の研究は、遠縁の有機体に由来するエノラーゼに対する阻害効果を実証し（Ｎａｖａｒｒｏｅｔ ａｌ． ２００７；Ａｎｄｅｒｓｏｎｅｔ ａｌ．，１９８４；Ｄｕｎｃａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１０）、大きな系統発生距離にわたるその潜在的な使用を示唆する。ＰｈＡＨは、実際に、ヒトＧＢＭ細胞株の天然溶解物中でエノラーゼを生体外で有力に阻害することができ、ＩＣ５０は約２０ｎＭである（図３ｂ）。０．６２５〜５０μＭの範囲の濃度でＰｈＡＨを用いたところ、ＥＮＯ１−ヌル細胞中で著しい毒性（図３ａ、ｃ、ｄ、および図９）およびＥＮＯ１−ＷＴ対照に対する最小の影響を観測し、ＥＮＯ１−ヌル細胞に対して少なくとも１０倍大きなエノラーゼ活性を示す（ＥＮＯ１は総細胞エノラーゼ活性の９０％を占めるため（Ｊｏｓｅｐｈ ｅｔ ａｌ．，１９９６）、図３ｂ）。ＰｈＡＨのＩＣ５０は、生体外でＥＮＯ１およびＥＮＯ２に類似するが（データ図示せず）、ＥＮＯ１ヌル細胞（Ｇｌｉ５６、Ｄ４２３−ＭＧ）に対する阻害剤の優れた毒性は、これらの細胞中で、エノラーゼ活性が、ＥＮＯ１−ＷＴ細胞株と比較して、既に９０％低く（事実上９０％「予備阻害され」）、結果として総エノラーゼ活性を毒性閾値以下に減少させるために、はるかに低い用量が必要とされるという事実に由来する。さらなるデータは、エノラーゼ活性のレベルと、異なる細胞株にわたる、および異なるレベルの強制エノラーゼ発現を有する同じ細胞株中のＰｈＡＨに対する感受性との間の直接的な関係を示す。第１に、他の細胞株と比較して中等度のレベルのエノラーゼ活性（およびエノラーゼ１タンパク質発現、図１ｄ）を有するＵ３４３およびＤ５０２−ＭＧ細胞は、ＰｈＡＨに対して中等度のレベルの感受性を有し（図３）、Ｕ３４３の場合、ＥＮＯ１またはＥＮＯ２の異所性過剰発現によって救済され得る（データ図示せず）。異なるレベルの強制ＥＮＯ１またはＥＮＯ２発現を有するＤ４２３−ＭＧ細胞株中のＰｈＡＨの系統的な滴定は、エノラーゼ発現／活性のレベルと、ＰｈＡＨに対するその後の抵抗性との間の直接的な関係を示す（図９）。ＰｈＡＨ毒性は、Ｇｌｉ５６ ＥＮＯ１−ヌル細胞中でも、生理学的レベルのＥＮＯ１の異所性発現またはＥＮＯ２の過剰発現によって無効にされた（図９）。毒性の機序に関して、細胞周期およびアポトーシス分析は、４８時間のＰｈＡＨ治療が、ＥＮＯ１ ＷＴＵ３７３細胞中ではなく、Ｄ４２３−ＭＧ中で、Ｓ相の顕著な減少を誘導し、続いてアポトーシスの顕著な増加を誘導すること実証した。この作用は、ＥＮＯ２過剰発現によって完全に救済される。この成長阻害および後次のアポトーシスが、エネルギー危機に起因するという事実は、ホスホリル化ＡＭＰＫ（Ｔｈｒ１７２）の強力な誘導によって立証され、ＥＮＯ１ ＷＴ細胞株ではなく、Ｄ４２３−ＭＧ中で観測された（データ図示せず）。このエネルギー応力応答が、保護作用を及ぼし、したがって、ＡＭＰＫ阻害剤とＰｈＡＨとの同時添加は、さらなる毒性をもたらすと推測したくなる。最後に、ＥＮＯ１−ヌル細胞は、ＥＮＯ１ ＷＴ細胞と比較して、受容体チロシンキナーゼ阻害剤（Ｓｔｏｍｍｅｌ ｅｔ ａｌ．，２００７）（ラパチニブ、ソラフェニブ、ＰＨＡ６６５７５２）（図１０）およびラパマイシン等の他の分子標的両方に対する任意の優れた感受性を示さない。これらのデータは、Ｄ４２３−ＭＧ細胞は、他の抗癌剤の影響を広く受けにくいこと、およびＰｈＡＨが ＥＮＯ１−ヌルＧＢＭ細胞を選択的に標的することを示す。
まとめると、これらの遺伝学的および薬理学的結果は、エノラーゼ２阻害が、ＥＮＯ１の副次的喪失を有する１ｐ３６ホモ接合性欠失を有する細胞中で致死的であるが、ＥＮＯ１正常細胞は、エノラーゼ１に依存して解糖を受け、生存を支援できることを実証する。これらの発見は、無脊椎動物からの遺伝データと一致する（Ｃｏｓｔａｎｚｏ ｅｔ ａｌ．，２００８；Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００６）。いくつかのホモ接合性欠失したハウスキーピング遺伝子は、１ｐ３６上の同じ欠失において発生することができることを考慮して（例えば、Ｈ６ＰＤ）、ＥＮＯ２の阻害を同時に欠失したハウスキーピング遺伝子の別の相同体のそれと組み合わせることによって、有効性および癌細胞特異的死滅をさらに増加させることが可能であり得る。
さらに、研究は、ＥＮＯ１遺伝子座においてヘテロ接合性であるＵ３４３等の細胞が、野生型膠芽細胞腫細胞株および正常な星状細胞と比較して、ホスホノアセトヒドロキサム酸塩等のエノラーゼ阻害剤による毒性に対してより敏感である。図１、３、および１１は、これらのデータを強調する。図１ｄは、Ｄ５０２−ＭＧおよびＵ３４３細胞の双方が、ＥＮＯ１のヘテロ接合性欠失に対応する、エノラーゼ１の発現の低減を示すことを示す。図３および１１の用量応答性研究によって示されるとおり、これらの細胞は、野生型細胞株よりもＰｈＡＨの毒性作用に対して著しく敏感である。この作用は、細胞中のＥＮＯ１またはＥＮＯ２の過剰発現によって部分的に可逆的となることが分かった。興味深いことに、ヘテロ接合性細胞はまた、オリゴマイシンでの治療によって、ＰｈＡＨの作用に対してさらに敏感にされた。したがって、ＥＮＯ１ヘテロ接合性癌細胞は、解糖阻害剤に基づく治療の有望な標的である。
実施例４−実施例３の材料および方法
２０％ウシ胎仔血清を含むダルベッコ変法イーグル培地中で標準技術を使用して細胞を培養した。ｓｈＲＮＡ実験は、２９３Ｔ細胞の一次的な形質転換を介したレンチウイルス生成に続いて、４μｇ／ｍＬのポリブレンを含む培地中の形質導入および２μｇ／ｍＬのピューロマイシンによる選択によって行った。ｓｈＲＮＡ発現は、１μｇ／ｍＬのドキシサイクリンを用いて誘導し、ノックダウンをウェスタンブロットによって試験した。ｓｈＲＮＡ抵抗性ＥＮＯ２クローンは、ＳｔｒａｔａｇｅｎｅからのＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ部位配向突然変異キットを用いてサイレント変異を導入した後、ｐＨＡＧＥ−ＣＭＶレンチウイルスベクターにクローン化することによって形成した。細胞増殖実験は、クリスタルバイオレット染色、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ測定（Ｒｏｃｈｅ）を使用し、ＩｎｃｕＣｙｔｅ（Ｅｓｓｅｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して合流を測定することによって行った。ＳＣＩＤマウス中のＥＮＯ２ノックダウンの有無にかかわらず、Ｄ−４２３ＭＧ細胞の同所性頭蓋内注入は、以前に記載のとおり行った（Ｚｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００８）。上記細胞の軟寒天コロニー形成測定は、６ウェルプレート中に１０４細胞を播種することによって、標準技術を使用して行った。阻害剤研究の場合、ＰｈＡＨリチウム塩は、Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８４）のプロトコルに従い、ＴＣＲＳによってカスタム合成した。エノラーゼ活性測定の場合、ＮＡＤＨ酸化は、以前に記載のとおりピルビン酸キナーゼ−乳酸デヒドロゲナーゼ連結反応において測定した（Ｊｏｓｅｐｈ ｅｔ ａｌ．，１９９６）。細胞周期研究の場合、ＰｈＡＨの有無にかかわらず、細胞を４８時間インキュベートし、ヨウ化プロピジウムで染色して、フローサイトメトリー分析を介して分類した。Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ／７−ＡＡＤ測定の場合、ＰｈＡＨの有無にかかわらず、細胞を９６時間処理し、Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ−ＰＥおよび７−ＡＡＤで染色して、製造者のプロトコルに従い、フローサイトメトリーによってアポトーシスについて評価した（Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ）。
細胞培養
細胞株Ｄ４２３−ＭＧは、１ｐ３６ホモ接合性欠失され、ＥＮＯ１を含み、Ｄ５０２−ＭＧは、１ｐ３６ホモ接合性欠失され、ＥＮＯ１を含まない（Ｄｕｎｃａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。細胞Ｄ４２３およびＤ５０２は、Ｄｕｎｃａｎ ｅｔ ａｌ．においてＨ４２３およびＨ５０２と称されるが、Ｗｅｌｌｃｏｍｅ Ｔｒｕｓｔ Ｓａｎｇｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅデータベースでは、Ｄ４２３−ＭＧおよびＤ５０２−ＭＧと称され、ここではその命名を採用した（ワールドワイドウェブ上のｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ）。Ｇｌｉ５６は、Ｍｕｅｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ． （２００７）に記載される。Ｄ４２３−ＭＧの欠失は、ＣＡＭＴＡ１、ＶＡＭＰ３、ＰＥＲ３、ＵＴＳ２、ＴＮＦＲＳＦ９、ＰＡＲＫ７、ＥＲＲＦＩ１、ＳＬＣ４５Ａ１、ＲＥＲＥ、ＥＮＯ１、ＣＡ６、ＳＬＣ２Ａ５、ＧＰＲ１５７、ＭＩＲ３４Ａ、Ｈ６ＰＤ、ＳＰＳＢ１、およびＳＬＣ２５Ａ３３遺伝子にわたるが、Ｇｌｉ５６中の欠失は、ＵＴＳ２、ＴＮＦＲＳＦ９、ＰＡＲＫ７、ＥＲＲＦＩ１、ＳＬＣ４５Ａ１、ＲＥＲＥ、ＥＮＯ１、ＣＡ６、ＳＬＣ２Ａ５、ＧＰＲ１５７、ＭＩＲ３４Ａ、Ｈ６ＰＤ、ＳＰＳＢ１、ＳＬＣ２５Ａ３３、ＴＭＥＭ２０１、Ｃ１ｏｒｆ２００、ＰＩＫ３ＣＤ、ＣＬＳＴＮ１、ＣＴＮＮＢＩＰ１、ＬＺＩＣ、ＮＭＮＡＴ１、ＲＢＰ７、およびＵＢＥ４Ｂ遺伝子座にわたる。２０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含むダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で細胞を培養した。比較のために、細胞株Ｕ８７、ＬＮ３１９、ＳＷ１０８８、Ｕ３４３、Ｕ３７３、およびＡ１２０７は、同じ条件下で成長させた。正常なヒト星状細胞は、ＳｃｉｅｎＣｅｌｌから得た。
ＥＮＯ２発現のｓｈＲＮＡノックダウン
ＥＮＯ２を標的とする２２個のヘアピンをスクリーニングし、４つの独立したヘアピンがタンパク質レベルを５０％未満まで低減させたことが分かった。これらのヘアピンのうち２つは、ｐＬＫＯ．１ベクター（ＳｈＥＮＯ２−１およびｓｈＥＮＯ２−２）中に存在し、残りの２つは、発現停止ＧＩＰＺ（ｓｈＥＮＯ２−３）およびＴＲＩＰＺ（ｓｈＥＮＯ２−４）ｓｈＲＮＡｍｉｒベクター（Ｏｐｅｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）中に存在した。ＥＮＯ２ ｓｈＲＮＡ配列は以下のとおりであった。
ｓｈＥＮＯ２−１：５’−ＣＡＡＧＧＧＡＧＴＣＡＴＣＡＡＧＧＡＣＡＡ−３’（配列番号１）；
ｓｈＥＮＯ２−２：５’−ＣＧＣＣＴＧＧＣＴＡＡＴＡＡＧＧＣＴＴＴＡ−３’（配列番号２）；
ｓｈＥＮＯ２−３：５’−ＣＧＧＣＣＴＴＣＡＡＣＧＴＧＡＴＣＡＡ−３’（配列番号３）；
ｓｈＥＮＯ２−４：５’−ＧＧＧＡＣＴＧＡＧＡＡＣＡＡＡＴＣＣＡ−３’（配列番号４）。
ＧＩＰＺベクター中のヘアピンは、製造者により提供されるプロトコルを使用して、ＴＲＩＰＺベクターにクローン化した。ＴＲＩＰＺベクターは、ドキシサイクリン誘導時にのみ発現される、赤色蛍光タンパク質レポーターを有するドキシサイクリン誘導系である。組み換えレンチウイルス粒子は、標準プロトコルに従い、２９３Ｔ細胞の一時的形質導入によって生成した。つまり、７２μｇのｓｈＲＮＡプラスミド、５４μｇのデルタ８．９、および１８μｇのＶＳＶＧプラスミドは、ＦｕＧｅｎｅ（Ｒｏｃｈｅ）を使用して、２４５ｍｍ２皿に置かれた２９３Ｔ細胞に形質導入した。形質導入から７２時間後にウイルス上清を回収し、２３，０００ｒｐｍで遠心分離により濃縮して、細胞成長培地中に再懸濁した。形質導入の場合、ウイルス溶液を、４μｇ／ｍＬポリブレンを含む細胞培養培地に添加し、感染から４８時間後、２μｇ／ｍＬピューロマイシンを使用して細胞を選択し、ウェスタンブロットによってＥＮＯ２のノックダウンについて試験した。
ＥＮＯ１、ＥＮＯ２、およびｓｈＲＮＡ抵抗性ＥＮＯ２の異所性発現
細胞株Ｄ４２３−ＭＧ中のＥＮＯ２をノックダウンする表現型効果の救済は、ＥＮＯ２のｓｈＲＮＡ抵抗性形態を過剰発現することによって行った。つまり、６個のサイレント変異は、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ部位配向された突然変異キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用して、ｓｈＥＮＯ２−４により標的とされるＥＮＯ２コード領域に導入された。ｓｈＲＮＡ抵抗性ＥＮＯ２コード領域は、ｐＨＡＧＥ−ＣＭＶレンチウイルスベクターにクローン化され（Ｄ．Ｎ．Ｋｏｔｔｏｎからの寛大な寄贈）、ドキシサイクリンの存在または不在下で、ｓｈＥＮＯ２−４を運ぶＤ４２３−ＭＧ細胞株中で過剰発現された。対照として、同じ細胞株は、緑色発光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子を運ぶレンチウイルスベクターによって感染された。ＥＮＯ１またはＥＮＯ２の異所性再発現の場合、配列決定された検証ｃＤＮＡクローンは、ｐＨＡＧＥ−ＣＭＶレンチウイルスベクターにゲートウェイクローン化され、上記の膠芽腫細胞株にレンチウイルス的に形質導入された。
増殖測定およびアンカレッジ非依存性成長
ｓｈＲＮＡまたはＰｈＡＨ治療された細胞株の細胞成長は、クリスタルバイオレット染色によって、またはＰｒｏｍｅｇａ ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ増殖キット（Ｒｏｃｈｅ）、あるいは生体内でＩｎｃｕＣｙｔｅ（Ｅｓｓｅｎ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ）との合流を測定するかのいずれかで測定した。ＩｎｃｕＣｙｔｅを使用する成長曲線は、２時間毎に撮像することによって４重複の複製とともに生成した。クリスタルバイオレット測定の場合、各時点に１０４個の細胞を６ウェルプレートに播種した。指示される時点で、細胞は、１０％ホルマリンで固定され、クリスタルバイオレット溶液で１時間染色した。染色抽出は、１０％酢酸溶液を使用して行い、５９０ｎｍで吸光度を読み取った。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ実験を製造者の指示に従って行い、１ウェル当たり１０３個の細胞を、各時点で９６ウェルプレートに置き、２４時間毎に発光値を記録した。全ての実験は、３重複で行う。軟寒天（アンカレッジ非依存性）成長は、指示された遺伝子型の１０４個の細胞を播種した６ウェルプレート中で監視した。培地は１０％ ＦＢＳを含むＤＭＥＭを含み、上部寒天は、０．４％低融点アガロースを含むが、底部寒天は、１％低融点アガロースを含んだ。発光（ＧＦＰ）によって成長を監視し、２８日後にコロニーをヨードニトロテトラゾリウムクロリド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で染色し、計数した。
同所性脳腫瘍形成
非標的ヘアピンを形質導入されたＤ４２３−ＭＧ細胞、またはｐＧＩＰＺを通して送達されたｓｈＥＮＯ２−３の生体内腫瘍形成能は、以前に記載のとおり決定した（Ｚｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００８）。深い麻酔下にあるＳＣＩＤマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）を、ｚ軸を備える定位装置（Ｓｔｏｅｌｔｉｎｇ）の中に置いた。次に、３×１０５個の細胞を、非斜角３０ゲージ針を用いて、１０μＬハミルトンシリンジを使用して、脳の表面の３ｍｍ下の右尾状核の中に頭蓋内注入した。動物は、神経障害の発生について毎日追跡した。全てのマウス実験は、ハーバードおよびダナ−ファーバー癌研究所の研究機関の動物管理使用委員会（Ｈａｒｖａｒｄ ａｎｄ Ｄａｎａ−Ｆａｒｂｅｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）の承認により行った。
エノラーゼ活性測定
エノラーゼ活性は、前述されるように（Ｊｏｓｅｐｈ ｅｔ ａｌ．，１９９６）、ピルビン酸キナーゼ−乳酸デヒドロゲナーゼ連結測定においてＮＡＤＨ酸化を介して測定した。つまり、細胞を、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣＬ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、および１ｍＭ β−メルカプトエタノール（ｐＨ７．４）中に溶解し、ポリトロンホモジナイザーを使用して１０秒間３回均質化した後、超音波処理した。エノラーゼ活性は、３４０ｎｍでの吸光度により分光高度的、または３４０ｎｍでの励起および４６０ｎｍでの放出により蛍光標識的のいずれかでＮＡＤＨの酸化を測定することにより記録した。
ウェスタンブロット
２回のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）での洗浄後に、細胞をＲＩＰＡ緩衝液中で１５分間、軽く振動させてインキュベートした。次に溶解物を回収し、超音波処理して、１４，０００ｒｐｍで１０分間４℃で遠心分離した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロットは、前述のように行った（Ｔａｎｉｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，２００５）。以下の抗体を使用した：Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからのエノラーゼ１ ＣＳＴ＃３８１０；エノラーゼ２ ＃９５３６；およびＧＡＰＤＨ ＣＳＴ＃３６８３；ホスホル−ＡＭＰＫ Ｔｈｒ１７２ ＣＳＴ＃２５３５ 、ならびにＳｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈからのＶｉｎｃｕｌｉｎ。
阻害剤研究
ＰｈＡＨリチウム塩は、Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８４）のプロトコルに従って、ＴＣＲＳによってカスタム合成した。構造および精度をＮＭＲにより検証した。ＰｈＡＨを５０ｍＭストックでＰＢＳ中に溶解し、使用するまで−８０℃で凍結保存した。化合物の不安定性を考慮して、媒質を５日毎に置き換え、新鮮な阻害剤を新鮮な媒質とともに添加した。ラパマイシン、ソラフェニブ、ラパチニブ、およびＰＨＡ６６５７５２は、ＬＣ ＬａｂｓおよびＴｏｃｒｉｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅからそれぞれ得た。
細胞周期分析
Ｄ４２３−ＭＧおよびＵ３７３細胞株は、ＰｈＡＨ（２５μＭ）の存在下または不在下で４８時間処理し、７５％エタノール中−２０℃で一晩固定した。翌日、細胞を冷たいＰＢＳで洗浄し、１００μｇのＲＮａｓｅ Ａ（Ｑｉａｇｅｎ）で処理し、５０μｇのヨウ化プロピジウム（Ｒｏｃｈｅ）で染色した。フローサイトメトリー取得は、３色ＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーターおよびＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用して行った。各試料の場合、１０４事象をゲートした。データ分析は、ＭｏｄＦｉｔ ＬＴ（Ｖｅｒｉｔｙ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｈｏｕｓｅ）を使用して行った。
アポトーシスについてのＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ／７−ＡＡＤ測定
Ｄ４２３−ＭＧおよびＵ３７３細胞株は、ＰｈＡＨ（２５μＭ）の存在下または不在下で４８時間処理し、７５％エタノール中−２０℃で一晩固定した。Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ／７−ＡＡＤ測定の場合、細胞を、Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ−ＰＥおよび７−ＡＡＤで染色して、製造者のプロトコルに従い、フローサイトメトリーによってアポトーシスについて評価した（Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ）。アポトーシス細胞は、Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＦＡＣＳｃａｎサイトメーターを使用して決定した。早期アポトーシス（ａｎｎｅｘｉｉｎ Ｖ−陽性、７−ＡＡＤ−陰性）および後期アポトーシス（ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ−陽性および７−ＡＡＤ−陽性）細胞を、細胞死の決定に含めた。
実施例５−トレオニル−ｔＲＮＡシンテターゼ（ＴＡＲＳ）ヘテロ接合性欠失は、細胞をＴＡＲＳ阻害剤に対して敏感にする。
発明者は、ＴＡＲＳ阻害剤ボレリジンに対する細胞の感受性に対するＴＡＲＳ欠乏の影響を決定するための研究を行った。第１に、ゲノムコピー数とＴＡＲＳの発現との間の相関を定義するために分析を行った（図１９）。ＴＡＲＳ遺伝子コピー数は、いくつかの細胞株中で測定し（図１９ａ）、これらのデータを、同じ細胞株中のＴＡＲＳのｍＲＮＡ発現レベルに対してプロットした。黒色腫細胞株の中で、ＳＫ−ＭＥＬ−２細胞は、ＴＡＲＳのヘテロ接合性欠失を有すると特定され、４５１ Ｌｕ細胞は、ＴＡＲＳ欠乏であると特定され、ＳＫ−ＭＥＬ−５およびＨＥＭＬ細胞は、ＴＡＲＳの野生型であると特定された（図２０ａ）。ＴＡＲＳタンパク質の発現レベルが、遺伝子コピー数およびｍＲＮＡ発現レベルに基づいて予想されるレベルに対応することを確認するために、ウェスタンブロットを行った（図２０ｃ）。
ＳＫ−ＭＥＬ−２、４５１ Ｌｕ、ＳＫ−ＭＥＬ−５、およびＨＭＥＬ細胞の成長に対するボレリジン治療の効果を決定した。低濃度で、ボレリジン治療は、ＴＡＲＳの野生型である、ＨＭＥＬおよびＳＫ−ＭＥＬ−５細胞の成長に対して最小の効果を有するか、または効果を有しなかった（図２０ｂ）。反対に、低濃度のボレリジンは、ＳＫ−ＭＥＬ−２細胞の成長を失速させた。ＴＡＲＳ欠乏４５１ Ｌｕ細胞は、ボレリジン治療に対して中等度の感受性を示した。
４つの黒色腫細胞の成長に対する様々な濃度のボレリジンの効果も経時的に研究した（図２１）。ＨＭＥＬ細胞株は、試験した最高濃度６２．５ｎＭにおいてもボレリジン治療に対して抵抗性であることが分かった。ＴＡＲＳの野生型であるＳＫ−ＭＥＬ−２細胞株は、６２．５ｎＭボレリジンに対して部分的に敏感であるが、３１．２５ｎＭ未満の濃度に対して広く抵抗性である。ＴＡＲＳヘテロ接合性ＳＫ−ＭＥＬ−２細胞株の成長は３１．２５ｎＭのボレリジンによって完全に阻害され、３．９ｎＭという低い濃度で少なくとも部分的に敏感であった。ＴＡＲＳ欠乏４５１ Ｌｕ細胞株の成長は、６２．５ｎＭボレリジンによってほぼ阻害され、試験した全ての濃度で一貫してＴＡＲＳヘテロ接合性ＳＫ−ＭＥＬ−２細胞とＴＡＲＳ野生型細胞との間の中間であった。
成長測定において試験したボレリジンの最高濃度が、ＳＫ−ＭＥＬ−２細胞株の成長を完全に阻害したことで、発明者らは、ＳＫ−ＭＥＬ−２細胞に対するボレリジンの細胞毒性作用について試験を試みた。この目的を達成するために、発明者らは、ゼロ時点でのＳＫ−ＭＥＬ−２細胞の高合流で開始することを除いて、同じ生成長測定を行った。これらの条件下で、１５ｎＭ以上のボレリジン濃度が、ＳＫ−ＭＥＬ−２細胞に対して細胞毒性であるが、それより低い濃度は、成長阻害性であることが明らかになった（図２２）。
４つの黒色腫細胞株に対するボレリジンの異なる作用が、実際はＴＡＲＳの相対発現レベルに起因することを確認するために、発明者らは、レンチウイルスｐＣＭＶベクターを使用して、ＳＫ−ＭＥＬ−２細胞中でＴＡＲＳを異所的に発現させた。対照として、ＧＦＰおよびＣＨＥＫ１発現ｐＣＭＶベクターで細胞を形質導入し、形質導入中のＴＡＲＳタンパク質発現レベルをウェスタンブロットによって確認した（図２３ｄ）。ＳＫ−ＭＥＬ−２細胞の成長に対するボレリジンの作用は、ＳＫ−ＭＥＬ−２細胞中の外因性ＴＡＲＳの発現によって逆転することが分かり（図２３ｂ、ｃ）、一方ＧＦＰまたはＣＨＥＫ１の発現は、ボレリジンに対するＳＫ−ＭＥＬ−２細胞の応答に対して効果を有しなかった（図２３ａ、ｃ）。図２４に示される研究は、ＴＡＲＳ遺伝子コピー数およびｍＲＮＡ発現レベルが、細胞中のボレリジン感受性と直接相関することをさらに確立する。
最後に、追加のＡＲＳ遺伝子は、発現レベルがＤＮＡ遺伝子コピー数と相関したかを決定するために研究した。図２５に示されるように、ＡＡＲＳ、ＨＡＲＳ、ＬＡＲＳ、およびＫＡＲＳ発現の場合に著しい相関が認められ、ＡＲＳ遺伝子が一般に、抗癌治療に対して優れた標的およびバイオマーカーであることを示す。
実施例６−免疫組織化学を使用して、ホモ接合性ＥＮＯ１不活性化を正確に検出することができる
ＥＮＯ１ホモ接合性不活性化（例えば、欠失）が、抗体結合研究を使用して検出され得るかを確認するように研究を行った。つまり、ヒト癌細胞株、ＥＮＯ１ホモ接合性欠失（Ｄ４２３−ＭＧ）またはＷＴ（Ｕ８７）を、ヌードマウスの脳に注入し、腫瘍を形成させた。標準組織病理手順に従って、腫瘍担持脳を固定し、パラフィン切片を切断した。ヘマトキシリン／イオシンで染色したＤ４２３−ＭＧ ＥＮＯ１ヌル腫瘍細胞は、形態学によって容易に検出され得、マウス細胞ではなくヒト細胞のみを標識する、ＮＵＭＡに対する抗体（ＥｐｉｔｏｍｉｃｓからのＳ２８２５）で染色することによって検証された。ＥＮＯ１に対する抗体（ＰｒｏｔｅｉｎＴｅｃｈからの１１２０４−１−ＡＰ）での染色は、広く発現したハウスキーピング遺伝子から予想されるように、正常なマウス脳において強い免疫反応性を示した。予想のとおり、Ｄ４２３−ＭＧ ＥＮＯ１ヌル腫瘍中で染色は認められなかったが、Ｕ８７ ＥＮＯ１ ＷＴ腫瘍では強い染色が認められた。これらの結果は、ＥＮＯ１タンパク質に対して配向された免疫組織化学によって、ＥＮＯ１ヌル腫瘍を特定することが可能であること、およびこの手法が例えば、ＥＮＯ２阻害剤から利益を得る患者のスクリーニングに使用され得ることを示す。
実施例７−ＣＨＥＫ１タンパク質発現は、ゲノムコピー数と相関せず、ＣＨＥＫ１の過剰発現は、ＣＨＥＫ１阻害剤に対する抵抗性を付与しない。
上に示されるＡＲＳ遺伝子およびエノラーゼ遺伝子についての結果とは反対に、研究は、ＣＨＥＫ１タンパク質発現が、ゲノムコピー数と相関しないことを示す。ＣＯＭＩＣ（Ｓａｎｇｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ）からのゲノムコピー数は、染色体１１上のＣＨＥＫ１が、細胞株ＳＫ−ＭＥＬ−２中に１つのみのコピーを有することを示す（図２６Ａ）。実際に、マイクロアレイ発現およびアレイＣＧＨコピー数データは、ＣＨＥＫ１のｍＲＮＡレベルとゲノムコピーとの間に良好な相関を示す（図２６Ｂ）。しかしながら、ＳＫ−ＭＥＬ−２細胞は、ウェスタンブロットによって、より低レベルのＣＨＥＫ１タンパク質を発現しない（図２６Ｃ）。同様に、ＳＫ−ＭＥＬ−２細胞中のＣＨＥＫ１の過剰発現は、ＡＺＤ７７６２、ＣＨＥＫ１阻害剤に対する抵抗性を付与しない（図２６Ｄ）。これらの結果は、ＣＨＥＫ１の一次発現対照が転写後事象であること、およびＣＨＥＫ１遺伝子座におけるヘテロ接合性の喪失がＣＨＥＫ１タンパク質の発現を著しく低減するのに不十分であることを示し得る。
＊＊＊
本明細書に開示および請求される方法の全ては、本開示に照らして過剰な実験なしに形成および実行され得る。本発明の組成物および方法は、公的な実施形態に関して説明されたが、本明細書に記載される方法、その工程、または工程のシーケンスに変形が適応され得ることは、本発明の概念、趣旨、および範囲から逸脱することなく当業者には明白である。より具体的に、化学的かつ生理学的に関連するある薬剤が、本明細書に記載される薬剤に置き換えられ得る一方で、同じ結果または同様の結果が達成されることは明白である。当業者に明白であるそのような同様の置換および修正は全て、添付の請求項によって定義されるように、本発明の趣旨、範囲、および概念の範囲内であると見なされる。
参考文献
以下の参考文献は、それらが例示の手順または本明細書に記載されるものを相補する他の詳細を提供する限りにおいて、参照により本明細書に特異的に組み込まれる。
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