CN104894229A - 己糖激酶2作为鼻咽癌放疗预后预测的生物标志物 - Google Patents

Abstract

本发明公开了己糖激酶2作为生物标志物，应用于鼻咽癌病人在接受放射治疗的敏感性诊断及放疗预后预测。本发明的研究发现鼻咽癌细胞中糖酵解途径异常活化，高表达的己糖激酶2(HK2)是鼻咽癌细胞中糖酵解途径异常活化的重要分子基础；抑制HK2能显著抑制鼻咽癌细胞的增值速率，诱导细胞凋亡，并增加鼻咽癌细胞对于放射处理的敏感性；鼻咽癌组织中HK2的表达水平与鼻咽癌患者的放疗预后不良正相关。

Description

己糖激酶2作为鼻咽癌放疗预后预测的生物标志物

技术领域

本发明涉及生物标记物，具体是将介导鼻咽癌中有氧糖酵解异常活化的己糖激酶2作为预测鼻咽癌放射治疗预后的新生物标志物。

背景技术

肿瘤细胞内存在一套有别于正常细胞的异常代谢模式，为其无限增殖、侵袭转移等恶性表型快速而有效的提供生物合成所需的能量及原料，肿瘤细胞代谢异常主要涉及到糖酵解、三羧酸循环、氧化磷酸化、氨基酸代谢、脂肪酸代谢和核酸代谢等，这种异常的代谢模式改变成为为肿瘤细胞的代谢重编程(Metabolic reprogramming)。

糖是一类化学本质为多羟醛或多羟酮及其衍生物的有机化合物，其最主要的生理功能是为生命体提供能量，并且是生物大分子合成过程中碳骨架的重要来源。以葡萄糖的分解代谢为例，多糖类物质经由消化系统分解为葡萄糖等单糖；单糖经由消化道吸收进入细胞内，经糖酵解途径分解成少量ATP和丙酮酸；在氧气充足的情况下，丙酮酸脱羧生成乙酰辅酶A，经过氧化磷酸化途径，最终生成ATP及其他生物合成所需的中间体；但在无氧的状况下，丙酮酸则还原生成乳酸，就此完成葡萄糖代谢全过程。

肿瘤细胞中，细胞主要通过增强有氧酵解途径获得能量(ATP)，葡萄糖代谢至丙酮酸后不再进入三羧酸循环进行有氧氧化，而是通过乳酸脱氢酶，转变成乳酸。肿瘤中的这种有氧糖酵解特征命名为肿瘤细胞瓦伯格效应(Warburg Effect)。

在糖酵解途径中，葡萄糖分子首先通过细胞膜上的葡萄糖转运子(Glucose transporter)将葡萄糖转运至细胞内，葡萄糖在己糖激酶(Hexokinase)的催化下通过消耗ATP磷酸化为6-磷酸葡萄糖。进一步，6-磷酸葡萄糖在磷酸己糖异构酶(Glucose-6-phosphate isomerase)的催化下生成6-磷酸果糖；接着6-磷酸果糖会在磷酸果糖激酶(Phosphofructokinase)的作用下通过消耗ATP磷酸化生成1，6-二磷酸果糖，ATP则转变为ADP。两个磷酸基团可以进一步在醛缩酶(Aldolase)的参与下分解为磷酸二羟丙酮和3-磷酸甘油醛。磷酸二羟丙酮会在磷酸丙糖异构酶(Triose-phosphate isomerase)帮助下转化为3-磷酸甘油醛。两分子3-磷酸甘油醛会被NAD+和3-磷酸甘油醛脱氢酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)氧化生成1，3-二磷酸甘油酸。1，3-二磷酸甘油酸转变为3-磷酸甘油酸，高能磷酸键由1，3-二磷酸甘油酸转移到ADP上，生成两分子ATP。磷酸甘油酸变位酶(Phosphoglycerate)推动3-磷酸甘油酸生成磷酸烯醇式丙酮酸。最后，在丙酮酸激酶的作用下磷酸烯醇式丙酮酸生成ATP和丙酮酸。在糖酵解途径异常活化的肿瘤细胞中，目前的研究证实多个糖酵解相关酶在多种肿瘤组织中高表达，如己糖激酶2(Hexokinase 2)、丙酮酸激酶(Pyruvate Kinase muscle，PKM2)、乳酸脱氢酶(Lactate Dehydrogenase，LDH)等。上述糖酵解相关基因在肿瘤细胞中异常活化，既是肿瘤细胞瓦伯格效应的分子基础，同时也为开发新的肿瘤分子诊断和靶向治疗提供了可能。因此，肿瘤代谢研究作为肿瘤学研究的快速发展的前沿领域，其研究成果已经开始转化成为肿瘤诊断和治疗的新手段和新策略。

鼻咽癌是中国南方人群高发的恶性肿瘤，每年全球近8万例新发病例，其中50％以上的新发病例来自于中国。鼻咽癌病理类型主要为低分化鳞癌，鼻咽解剖部位的特点及组织特性决定了放射治疗是鼻咽癌的首选治疗方式。临床上发现放疗抵抗、复发、转移是导致治疗失败的主要原因。因此，开发新的用于预测鼻咽癌放疗预后的的分子标志物(Bio-marker)以及放疗增敏的策略是降低鼻咽癌复发、转移、提高病人生存率，降低死亡率的关键。

发明内容

本发明的目的在于确定鼻咽癌中糖酵解途径是否异常活化及其异常活化的分子机制，明确介导鼻咽癌糖酵解异常活化基因与鼻咽癌放疗预后的相关性。

本发明利用代谢组学分析平台，分析了永生化鼻咽上皮细胞和鼻咽癌细胞中的代谢状态。发现乳酸(lactate)和山梨醇(sorbitol)的含量在鼻咽癌细胞中显著增加。乳酸是糖酵解途径(glycolysis pathway)的最终产物，山梨醇是细胞储存葡萄糖的重要代谢物质。乳酸和山梨醇在鼻咽癌细胞中含量增加，提示糖酵解途径可能在鼻咽癌细胞中异常活化，且鼻咽癌细胞中葡萄糖的摄入能力高于永生化鼻咽上皮细胞。进一步我们通过临床生化检测仪证明，鼻咽癌细胞的葡萄糖摄取速率和乳酸生成速率显著增加。

通过PCR array方法筛选在鼻咽癌细胞中异常高表达的糖酵解相关分子，发现鼻咽癌细胞中己糖激酶2(Hexokinase 2，HK2)转录显著增高。Western Blot实验证实HK2在多种鼻咽癌细胞中高表达。抑制HK2能显著抑制鼻咽癌细胞的增值速率，诱导细胞凋亡，并增加鼻咽癌细胞对于放射处理的敏感性。

进一步，我们在鼻咽癌临床组织样本中用免疫组组化学方法检测了HK2，证实约50％的鼻咽癌患者组织中HK2呈高表达水平。对鼻咽癌患者的预后进行回顾性分析发现HK2高表达的鼻咽癌患者的平均生存周期显著低于HK2低表达的患者。因此，鼻咽癌细胞中高表达的HK2是鼻咽癌细胞中糖酵解途径异常活化的重要分子基础。在鼻咽癌组织中HK2的高表达水平，可用于预测鼻咽癌患者的放疗预后。

基于上述研究结果，本发明提出生物标志物HK2(己糖激酶2)可应用在鼻咽癌放疗敏感性诊断试剂和/或鼻咽癌放疗预后预测试剂的制备中。

具体的，该诊断试剂和/或预测试剂通过检测被试者(鼻咽癌患者)组织中HK2的表达水平或基因转录水平，并与正常水平相比较来诊断鼻咽癌放疗敏感性以及预测放疗预后情况，从而为鼻咽癌放射治疗提供参考指标。在一些实施方案中，可以使用定量PCR的方法来检测鼻咽癌组织中HK2基因的转录水平，转录水平与鼻咽癌对放射治疗的敏感性负相关；还可以利用免疫组织化学检测鼻咽癌组织中HK2的表达水平，鼻咽癌组织中HK2的高表达量与鼻咽癌临床预后不良正相关。

进一步的，本发明提供一种检测鼻咽癌放疗敏感性和/或预测鼻咽癌放疗预后的试剂盒，包括：

(1)mRNA提取试剂；

(2)逆转录试剂；

(3)定量PCR试剂；

其中，定量PCR试剂中包含所述生物标志物HK2基因的特异性引物。优选的，所述定量PCR试剂中包含的HK2特异性定量PCR引物序列是：

上游引物：5’-GAGCCACCACTCACCCTACT-3’(SEQ ID No：5)；

下游引物：5’-CCAGGCATTCGGCAATGTG-3’(SEQ ID No：6)。

本发明还提供的一种检测鼻咽癌放疗敏感性和/或预测鼻咽癌放疗预后的免疫组化试剂盒，包括特异性针对HK2的抗体。该试剂盒利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂(例如荧光素、酶、金属离子、同位素)显色来确定组织细胞内抗原(HK2)，对其进行定位、定性及定量。

另一方面，生物标志物HK2(己糖激酶2)或其基因可应用于治疗鼻咽癌药物的制备中。途径之一是设计特异性靶向HK2的siRNA，有效干扰鼻咽癌细胞中HK2的表达，由此抑制鼻咽癌细胞的增值和诱导鼻咽癌细胞发生凋亡，增加鼻咽癌细胞对于放射处理的敏感性。

所述特异性靶向HK2的siRNA的序列根据HK2基因的序列设计。在本发明的一个实施例中，选用的siRNA序列如下：

siHR2#1：5’-CCAUCUCCUGUCCAAUGACAU-3’(SEQ ID No：27)；

siHR2#2：5’-CACAACCUGUUUGAGCCUGAA-3’(SEQ ID No：28)；

siHR2#3：5’-UGCUAGAGCUUACUCUGAGAA-3’(SEQ ID No：29)。

综上，本发明的生物标志物HK2用于诊断鼻咽癌病人在接受放射治疗的敏感性以及预测鼻咽癌的放疗预后，为确定鼻咽癌放疗增敏策略及降低鼻咽癌复发、转移，提高病人生存率，降低死亡率具有重要指导意义。

附图说明

图1是利用代谢组学分析平台获得的永生化鼻咽上皮细胞NP69和鼻咽癌细胞C666-1的代谢分析结果，其中A是代谢改变全景图，B显示了相较于永生化鼻咽上皮细胞NP69，鼻咽癌细胞系C666-1中乳酸和山梨醇的含量显著增加(*表示t检验p＜0.05)。

图2显示了永生化鼻咽上皮细胞NP69和鼻咽癌细胞CNE1、CNE1-LMP1、HNE2、HNE2-LMP1、HK1和HK1-LMP1中相对葡萄糖摄取速率(A)和乳酸生成速率(B)，其中*表示t检验p＜0.05，**表示t检验p＜0.01。

图3显示了在永生化鼻咽上皮细胞NP69和鼻咽癌细胞C666-1中PCR ARRAY检测糖酵解相关分子的转录水平。

图4显示了特异性靶向HK2的siRNA能有效干扰鼻咽癌细胞中HK2的表达，由此抑制鼻咽癌细胞的增值和诱导鼻咽癌细胞发生凋亡，其中：A和B显示了HK2的siRNA能显著抑制鼻咽癌细胞系CNE1、CNE1-LMP1、HEN2和HNE2-LMP1中HK2的表达，并能有效降低上述细胞的相对葡萄糖摄取速率和乳酸生成速率；C表明HK2的siRNA抑制鼻咽癌细胞系CNE1、CNE1-LMP1、HEN2和HNE2-LMP1中HK2的表达后，能显著抑制鼻咽癌细胞的增殖；D显示在CNE1-LMP1和HNE2-LMP1中干扰HK2的表达能诱导细胞发生凋亡(*表示t检验p＜0.05，**表示t检验p＜0.01)。

图5显示了HK2与鼻咽癌预后的相关性检测结果，其中A显示了两例鼻咽癌组HK2免疫组织化学检测结果，Case 1为HK2高表达的鼻咽癌组HK2免疫组织化学检测结果，Case 4为HK2高表达的鼻咽癌组HK2免疫组织化学检测结果；B是将鼻咽癌患者根据HK2表达高低分组(HK2HIGH和HK2LOW)后结合临床随访数据对鼻咽癌放射治疗后的总生存时间进行Kaplan-Meier统计结果。

具体实施方式

以下通过实施例进一步详细描述本发明，但不以任何方式限制本发明的范围。

本发明所用永生化鼻咽上皮细胞NP69为香港大学所建；鼻咽癌细胞系HK1、C666-1为香港中文大学建系；鼻咽癌细胞系CNE1为中国医学院科学院肿瘤研究所建系；鼻咽癌细胞系CNE1-LMP1、HNE2、HNE2-LMP1、HK1-LMP1为中南大学肿瘤所建系。

实施例1.鼻咽癌细胞中有氧糖酵解活化

代谢组学分析方法是对特定细胞过程遗留下的特殊化学指纹的系统研究，更具体地说，是对小分子代谢物组的整体研究。代谢组学的核心技术包括气象色谱-质谱联用、液相色谱-质谱联用和核磁共振波谱技术。采用代谢组学方法分析鼻咽癌细胞中的代谢变化谱，明确鼻咽癌细胞中的有氧糖酵解状态。

实验方法如下：永生化鼻咽上皮细胞及鼻咽癌细胞系在75cm²细胞培养瓶中培养三天后，胰酶消化后用含10％胎牛血清的RPMI-1640终止消化，细胞悬液离心后用预冷PBS重悬两次。最后将细胞悬液离心后弃尽PBS，将细胞沉淀和细胞培养上清放入液氮中急速冷却固定后置于-80℃保存。细胞样品解冻，在全自动MicroLab STAR系统(Hamilton Company)中进行代谢物质抽提。首先通过一系列的有机法和水剂法去除样品中的蛋白质，保留小分子物质。将获得的小分子代谢物质等分成两份，置于TurboVap(Zymark)中去除有机溶剂低温冻干。其中一份用于气象色谱-质谱联用分析，一份用于液相色谱-质谱联用分析。

代谢组学数据分析发现相较于永生化鼻咽上皮细胞，糖酵解途径的终产物乳酸(lactate)的含量在鼻咽癌细胞中显著增加(p＜0.05)。此外，山梨醇(sorbitol)的含量在鼻咽癌细胞中显著增加(p＜0.05)。这提示鼻咽癌细胞中有氧糖酵解途径和葡萄糖摄取能力显著增加。结果见图1。

实施例2.鼻咽癌细胞的葡萄糖摄取能力和乳酸生成能力增强

利用临床全自动生物化学分析仪检测不同培养阶段的鼻咽癌细胞培养基中葡萄糖和乳酸的含量，计算鼻咽癌细胞葡萄糖摄取能力和乳酸生成能力。

实验方法如下：取5×10⁵个细胞种于6孔板，待细胞贴壁后，更换新鲜培养基，继续培养8小时后收集细胞培养上清并离心。利用全自动临床生化检测仪(Automatic BiochemicalAnalyzer，7170A，HITACHI，Japan)使用标准品进行校正后，用于检测培养上清中葡萄糖及乳酸的浓度，利用细胞蛋白质浓度归一化后计算单位时间内永生化的鼻咽上皮细胞和鼻咽癌细胞的葡萄糖摄取速率和乳酸生成速率。

经过计算分析发现，鼻咽癌细胞的葡萄糖摄取速率和乳酸生成速率显著高于永生化的鼻咽上皮细胞(p＜0.05)。上述结果与代谢组学分析结果一致，提示鼻咽癌细胞的有氧糖酵解处于异常活化状态。结果见图2。

实施例3.HK2是鼻咽癌细胞中异常高表达的糖酵解分子

为明确鼻咽癌细胞中糖酵解异常活化的分子机制，通过收集鼻咽癌细胞的信使RNA(mRNA)，逆转录成cDNA后，利用实时荧光定量PCR技术检测糖酵解途径的多个糖酵解相关分子的转录水平，明确HK2是鼻咽癌细胞中糖酵解高表达分子。

实验方法如下：永生化的鼻咽上皮细胞和鼻咽癌细胞以PBS洗2遍，然后加入含有350μl的20mM DTT的RA1buffer，反复吹打震荡；将消化液转移至分离柱12,000rpm离心1分钟，向过滤后的液体中加入350μl 70％的乙醇反复吹打震荡；将液体转移至吸附柱中，12,000rpm离心1分钟；再向吸附柱中加入350μl的MDB buffer，12,000rpm离心1分钟；再向吸附柱中加入100μl含有DNase的DNA消化buffer，室温消化20分钟；加入200μl RA2buffer终止DNase消化，12,000rpm离心1分钟，加入650μl RA3buffer洗涤两次后，用20～40μl无核酶水溶解RNA，50-60℃促溶10分钟后，收集RNA并测定RNA的浓度及纯度。取5μg RNA每个样本，并加入4μl RT-PCR buffer及2μl逆转录酶，并用无核酶水将反应体积补全至20μl，在PCR仪(Veriti，Applied biosystem)中按照20℃10分钟，50℃30分钟，85℃10分钟的实验程序进行逆转录。逆转录完成后，cDNA用水稀释50倍后利用实时荧光定量PCR验证策略筛选受LMP1调控的糖酵解相关基因(引物序列如表1所示)，以β-actin为内参基因。

结果显示相对于永生化鼻咽上皮细胞，己糖激酶2(Hexokinase 2)作为是糖酵解途径的第一个关键限速酶在鼻咽癌细胞中表达增加。结果见图3。

表1.用于PCRARRAY筛选的PCR引物列表

实施例4.HK2是鼻咽癌细胞糖酵解异常活化的关键分子，干扰鼻咽癌细胞中HK2可抑制有氧糖酵解和细胞增殖，诱导细胞凋亡

通过特异性靶向HK2的RNA干扰技术，抑制鼻咽癌细胞中的HK2表达后，通过检测鼻咽癌细胞的葡萄糖摄取速率和乳酸生成速率，明确HK2在调控鼻咽癌有氧糖酵解的功能。进一步通过MTS和Western Blot实验检测抑制HK2后，对鼻咽癌细胞增殖及凋亡的影响。

实验方法如下：鼻咽癌细胞系经转染HK2的siRNA后继续培养48h后，重新消化细胞分别按照5×10⁵细胞/孔重新接种到6孔板和2×10³细胞/孔重新接种到96孔板中。实验中用到的特异性靶向HK2的siRNA的序列如下：

siHR2#1：5’-CCAUCUCCUGUCCAAUGACAU-3’(SEQ ID No：27)

siHR2#2：5’-CACAACCUGUUUGAGCCUGAA-3’(SEQ ID No：28)

siHR2#3：5’-UGCUAGAGCUUACUCUGAGAA-3’(SEQ ID No：29)

待六孔板中的细胞贴壁后，更换新鲜培养基，继续培养8小时后收集细胞培养上清并离心，同时抽提细胞总蛋白。利用全自动临床生化检测仪(Automatic Biochemical Analyzer，7170A，HITACHI，Japan)使用标准品进行校正后，用于检测培养上清中葡萄糖及乳酸的浓度，利用细胞蛋白质浓度归一化后计算单位时间内永生化的鼻咽上皮细胞核鼻咽癌细胞的葡萄糖摄取速率和乳酸生成速率。抽提的总蛋白通过Western Blot实验检测HK2以及凋亡相关分子(PARP和Caspase9剪切提)的表达。

96孔板中的细胞贴壁后，分别在贴壁后0小时、24小时、48小时和72小时在每孔中加入20μl的CellTiterAQueous One Solution，37°孵育60分钟后，检测570nm的吸光光度值，从而计算细胞增殖速率。

结果显示，特异性靶向HK2的siRNA能有效干扰鼻咽细胞中HK2的表达。干扰HK2的表达后能显著抑制鼻咽癌细胞的葡萄糖摄取速率和乳酸生成速率(p＜0.05)。同时发现抑制鼻咽癌细胞中HK2的表达后，能显著增加鼻咽癌细胞中PARP和Caspase9的表达，提示抑制HK2的表达能诱导鼻咽癌细胞发生凋亡。结果见图4。

实施例5鼻咽癌临床样本中HK2的表达水平与鼻咽癌放疗预后存在相关性

进一步我们在鼻咽癌临床样本中用免疫组织化学法检测HK2的表达，利用鼻咽癌临床样本的随访数据进行回顾性分析，明确HK2与鼻咽癌预后的相关性。

免疫组化是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素)显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究。

实验方法如下：将鼻咽癌组织芯片及鼻咽癌组织切片在室温中放置60分钟或60℃恒温箱中烘烤20分钟。再将鼻咽癌组织芯片及鼻咽癌组织切片置于二甲苯中浸泡10分钟，更换二甲苯后再浸泡10分钟；无水乙醇中浸泡5分钟；95％乙醇中浸泡5分钟；70％乙醇中浸泡5分钟。在微波炉里加热0.01M柠檬酸钠缓冲溶液(pH6.0)至沸腾后将组织芯片放入进行抗原修复。然后将鼻咽癌组织芯片及鼻咽癌组织切片置于H₂O+3％H₂O₂侵泡3-5分钟；PBS浸泡5分钟；甩去PBS，蜡笔画标本范围，滴加羊血清封闭液，37℃孵育10分钟；甩去血清，加入特异性针对HK2的抗体4℃孵育过夜；PBS洗去一抗3次，加入鼠兔通二抗37℃孵育20分钟；PBS洗去二抗3次。加入链霉素抗生物素-过氧化物酶溶液37℃孵育15分钟；用PBS洗去链霉素抗生物素-过氧化物酶溶液3次，然后加新配制的DAB溶液显色。DAB染色完成后用苏木素复染细胞核1分钟，超纯水反蓝，盐酸酒精分色。最后，将切片脱水后用中性树胶和二甲苯封片后进行病理阅片，并将阅片结果结合鼻咽癌临床样本的随访数据进行回顾性统计分析。

结果显示，HK2在部分鼻咽癌组织中高表达，且其高表达与EB病毒编码的致瘤蛋白LMP1存在相关性。将鼻咽癌样本根据HK2的表达量高低进行分组，结合鼻咽癌临床样本的随访数据统计分析患者总生存时间，发现HK2高表达的鼻咽癌患者的平均生存时间为62.29月，HK2低表达的鼻咽癌患者的平均生存时间为93.60月，说明鼻咽癌组织中HK2的高表达量与鼻咽癌临床预后不良正相关(p＜0.05)。因此，HK2可以作为鼻咽癌放疗预后预测的新生物标志物。结果见图5。

Claims (10)

1.己糖激酶2作为生物标志物在制备鼻咽癌放疗敏感性诊断试剂和/或鼻咽癌放疗预后预测试剂中的用途。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述诊断试剂和/或预测试剂通过检测鼻咽癌组织中己糖激酶2的表达水平或基因转录水平，并与正常水平相比较，从而诊断鼻咽癌放疗敏感性和/或预测鼻咽癌放疗预后情况。

3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述诊断试剂使用定量PCR的方法来检测鼻咽癌组织中己糖激酶2基因的转录水平，或者利用免疫组织化学检测鼻咽癌组织中己糖激酶2的表达水平；所述转录水平或表达水平与鼻咽癌对放射治疗的敏感性负相关。

4.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述预测试剂使用定量PCR的方法来检测鼻咽癌组织中己糖激酶2基因的转录水平，或者利用免疫组织化学检测鼻咽癌组织中己糖激酶2的表达水平；所述转录水平或表达水平与鼻咽癌放疗预后不良正相关。

5.一种检测鼻咽癌放疗敏感性和/或预测鼻咽癌放疗预后的试剂盒，包括：mRNA提取试剂、逆转录试剂和定量PCR试剂，其中所述定量PCR试剂中包含生物标志物己糖激酶2基因的特异性引物。

6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述特异性引物中的上游引物序列如SEQ IDNo：5所示，下游引物序列如SEQ ID No：6所示。

7.一种检测鼻咽癌放疗敏感性和/或预测鼻咽癌放疗预后的免疫组化试剂盒，其特征在于，包括特异性针对己糖激酶2的抗体。

8.生物标志物己糖激酶2或其基因在制备治疗鼻咽癌药物中的应用。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述治疗鼻咽癌药物中包含特异性靶向己糖激酶2的siRNA。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述特异性靶向己糖激酶2的siRNA是序列表中SEQ ID No：27、28和29所示序列的一种或多种。