CN111812323A - 己糖激酶2用于体液样本中稀有肿瘤细胞检测及试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物与医学检测领域，具体涉及己糖激酶2用于体液样本中稀有肿瘤细胞检测及试剂盒。本发明基于肿瘤细胞能量代谢异常的原理，使用糖酵解标志物己糖激酶2(HK2)为标志物进行体外检测，通过可寻址的微孔阵列芯片或玻璃片辅助稀有肿瘤细胞定位和挑选，从而实现癌症患者体液样本中高糖酵解活性稀有肿瘤细胞的检测。采用本发明的检测方法，可以检测人体液样本中的高糖酵解活性的稀有肿瘤细胞，尤其是能够用于检测间质来源肿瘤的循环肿瘤细胞以及上皮来源肿瘤中发生上皮间质转化的循环肿瘤细胞，弥补传统基于上皮标志物检测循环肿瘤细胞的不足，为癌症液体活检更好的应用于临床提供技术基础。

Description

己糖激酶2用于体液样本中稀有肿瘤细胞检测及试剂盒
技术领域
本发明涉及生物与医学检测领域。更具体地，本发明涉及检测人体液(如血液、脑脊液、胸腔积液、尿液等)样本中稀有肿瘤细胞的方法。
背景技术
癌症在全球范围内发病率和致死率高，已经严重威胁人类健康。液体活检是近年来出现的肿瘤无创检测新技术。由于肿瘤细胞的高转移能力导致其从原位肿瘤病灶脱落，进而向包括血液、胸腔积液、脑脊液甚至尿液中播散并转移。从这些液体样本检测游离的稀有肿瘤细胞及其分子特征可代替对肿瘤原位病灶的活检，因此被称为液体活检。由于传统活检创伤大且经常难以进行，因此液体活检，尤其是针对血液的液体活检，由于其无创且易于获得样本，所以受到临床很大的欢迎。但其技术难点主要在于如何确定在液体样本中的某一游离细胞的确是肿瘤细胞。目前临床上鉴定恶性组织金标准是通过病理学中的形态学特征。这一方法同样可被用于鉴定液体样本(如胸腔积液、脑脊液、尿液等)中的脱落肿瘤细胞，但由于液体样本中的细胞成分复杂，存在大量与肿瘤细胞形态类似、易于混淆的细胞(如胸腔积液中的反应性间皮细胞)，同时肿瘤细胞数目可能很少，因此常常难以给出明确的结论，导致液体样本中恶性细胞检测的灵敏度较低。在血液中，由于循环肿瘤细胞数目极少，且其他细胞的数目非常大(达到109)，因此更加难以通过形态学的方法来准确检测。
目前在市场上及学术界存在多种不同的检测血液中循环肿瘤细胞(Circulatingtumorcell,CTC)的技术与设备，但核心的CTC鉴定标准基本都采用强生公司获得美国FDA批准的CellSearch系统中所采用的上皮标志物与白细胞标志物相结合的方式，即EpCAM+/CK+/CD45-/DAPI+且符合一定形态学标准的细胞定义为CTC，其中EpCAM与CK(细胞角蛋白)均为上皮标志物，CD45为白细胞标志物，而DAPI为细胞核标志物。因此，上述定义主要依赖上皮标志物，因为大部分肿瘤均为上皮来源，但这一标准无法检测间质来源肿瘤(如骨肉瘤、黑色素瘤等)的CTC以及上皮来源肿瘤中发生了上皮间质转化(Epithelial–MesenchymalTransition)的CTC。根据现有的癌症生物学理论，EMT是肿瘤细胞转移的重要步骤，因此从上皮型转化为间质型的肿瘤细胞与肿瘤转移密切相关，而这部分肿瘤细胞难以通过上皮标志物来检测。所以，这促使我们去研发新的CTC标志物能够更灵敏的检测CTC，尤其是间质来源肿瘤的CTC以及上皮来源肿瘤中不表达上皮标志物(如CK)的CTC。我们主要从癌症的普遍性特征入手寻找新的CTC标志物。
癌症危害之大且难以攻克，源于恶性肿瘤细胞具有与正常细胞不同的若干特征，包括维持增殖信号(Self-Sufficiency in Growth Signals)，逃避生长抑制(Insensitivity toAntigrowth Signals)，抑制细胞死亡(Resisting Cell Death)，无限自我复制(Limitless Replicative Potential)，诱导血管生成(SustainedAngiogenesis)，激活浸润转移(Tissue Invasion and Metastasis)，避免免疫损伤(Avoiding Immune Destruction)，促进肿瘤炎症(Tumor Promotion Inflammation)，能量代谢异常(Deregulating Cellular Energetics)以及基因组不稳定(GenomeInstability and Mutation)等(见Douglas Hanahan,Robert A.Weinberg,"HallmarksofCancer:The Next Generation",Cell,2011,vol.144,p646-674)。其中肿瘤细胞的能量代谢异常作为癌症的主要标志之一受到越来越多的关注，它为肿瘤检测与治疗提供了新的方法与靶点。肿瘤细胞利用糖酵解作为其主要能量代谢的来源，即使在有氧的情况下也大量摄取葡萄糖，这种现象被称为Warburg效应，是肿瘤的基本特征之一。Otto Warburg也因此获得1931的诺贝尔奖。
我们知道糖酵解是由一系列酶催化的级联反应过程，催化糖酵解的第一个关键限速酶就是己糖激酶(Hexokinases,HKs)。HK催化进入细胞内的葡萄糖磷酸化生成6-磷酸葡萄糖(G-6-P)，并消耗一分子ATP。现已发现的人类HK有4种亚型，分别由HK1、HK2、HK3和HK4基因编码生成。HK1广泛表达于几乎所有的哺乳动物组织中，HK2通常表达于胰岛素敏感组织如脂肪、骨骼和心肌中。HK3则往往低水平表达，HK4的表达则限制于胰腺和肝脏。尚未见有将HK这类激酶作为鉴定人液体样本中稀有肿瘤细胞的标志物的报道与研究。
发明内容
本发明提供了一种检测癌症患者液体样本中的稀有肿瘤细胞的方法、检测试剂盒以及HK2抗体物质的用途，以解决目前的基于上皮标志物的方法无法检测间质来源肿瘤CTC以及上皮来源肿瘤发生上皮间质转化CTC的问题，进一步提高CTC的检测灵敏度。
本发明的第一个方面，提供一种检测人体液样本中稀有肿瘤细胞的方法，包括：用荧光标记的己糖激酶2(HK2)抗体物质对来自人体液样本的细胞进行染色处理，对染色处理后的细胞进行荧光检测，根据荧光信号确定HK2阳性细胞，HK2高表达细胞为稀有肿瘤细胞。
在上述检测人体液样本中稀有肿瘤细胞的方法中，作为一个优选方案，将荧光检测时所有白细胞的HK2荧光值的平均值加五倍标准差作为判断HK2高表达的阈值。
在上述检测人体液样本中稀有肿瘤细胞的方法中，作为一个优选方案，还包括用荧光标记的白细胞标志物抗体对来自体液样本的细胞进行染色处理、和用细胞核染色剂对来自人体液样本的细胞进行染色处理，符合HK2高表达/白细胞标志物阴性/细胞核染色阳性的细胞为稀有肿瘤细胞。
在上述检测人体液样本中稀有肿瘤细胞的方法中，作为一个优选方案，荧光标记的HK2抗体物质是荧光标记的HK2抗体，或者是HK2抗体与荧光标记的HK2二抗的组合。
在上述检测人体液样本中稀有肿瘤细胞的方法中，作为一个优选方案，所述白细胞标志物抗体为针对细胞膜表面蛋白CD45的抗体，所述细胞核染色剂是细胞核荧光染料；将荧光检测时CD45阳性细胞的HK2荧光值的平均值加五倍标准差作为判断HK2高表达的阈值。
在上述检测人体液样本中稀有肿瘤细胞的方法中，作为一个优选方案，所述体液样本为血液、胸腔积液、脑脊液或尿液样本，所述体液样本选择性地进行富集处理后，制成细胞悬液，并以单细胞形式铺展于可寻址的微孔阵列芯片或玻璃片以进行染色处理，所述富集处理包括减少体液样本中红细胞和/或白细胞的数量。
在上述检测人体液样本中稀有肿瘤细胞的方法中，作为一个优选方案，还包括如下步骤：(a)对人体液样本进行预处理与富集；(b)将富集后的样本中的所有细胞分散于可寻址微孔阵列芯片或玻璃片上；(c)对微孔阵列芯片或玻璃片上的所有细胞进行基于标志物的荧光染色与成像；(d)根据荧光信号的阈值或采用人工智能方式识别疑似肿瘤细胞并经人工审核后计数。(e)利用显微操作技术回收识别出的肿瘤细胞，进行单细胞测序进行验证或检测其用药靶点；注：这一步如无须检测用药靶点的话则非必需步骤。
本发明的第二个方面，提供一种用于稀有肿瘤细胞检测的试剂盒，其包含：荧光标记的HK2抗体物质、荧光标记的白细胞标志物抗体、和细胞核染色剂。
本发明的第三个方面，提供HK2抗体物质的用途，用于：
a)非诊断目的检测稀有肿瘤细胞；或
b)制备稀有肿瘤细胞检测试剂盒；或
c)作为肿瘤细胞标志物检测稀有肿瘤细胞；或
在上述HK2抗体物质的用途中，作为一个优选方案，将人体液样本中HK2高表达/白细胞标志物阴性/细胞核染色阳性的细胞鉴定为稀有肿瘤细胞；将人体液样本中上皮细胞标志物阴性的所述稀有肿瘤细胞鉴定为上皮间质转化的肿瘤细胞或间质来源肿瘤细胞；HK2高表达的细胞是指HK2荧光染色处理后荧光信号值达到预定阈值的细胞。
本发明的第四个方面，提供HK2抗体物质和上皮细胞标志物抗体物质的组合用途，用于制备鉴定CTC特征的检测试剂盒，所述HK2抗体物质为荧光标记的HK2抗体、或者是HK2抗体与荧光标记的HK2二抗的组合，所述上皮细胞标志物抗体物质为荧光标记的CK抗体，所述CTC特征是指区分CTC细胞是否为上皮来源肿瘤细胞、上皮间质转化的肿瘤细胞、或间质来源肿瘤细胞；所述试剂盒还包括用荧光标记的白细胞标志物抗体、细胞核染色剂、以及说明书，所述说明书记载以下内容：CTC细胞中上皮细胞标志物阳性细胞确定为上皮来源肿瘤细胞，上皮细胞标志物阴性细胞确定为上皮间质转化的肿瘤细胞、或间质来源肿瘤细胞。
本发明采用了HK2作为标志物，并通过HK2、CD45(白细胞标志物)、DAPI(细胞核染料)的标志物组合来鉴定稀有肿瘤细胞，这一新的方法能够检测传统上皮标志物无法检测到的间质来源肿瘤的CTC以及上皮来源肿瘤中发生了上皮间质转化的CTC，从而提高检测灵敏度。另一方面，HK2与肿瘤普遍的能量代谢异常，即高糖酵解有关，因此能用于鉴定细胞的恶性程度，从而确保了检测的特异性。我们也进一步通过单细胞测序来验证通过这一新标志物所检测到的疑似肿瘤细胞的可靠性。
本发明所描述的方法能够适用于癌症患者的多种液体活检样本，包括血液、胸腔积液、脑脊液、尿液等，但是实施专利过程中，由于不同的体液样本中所含的总细胞数目不同，因此需采用不同的样本富集方法。比如脑脊液中所含的细胞数目也最少(少于10万个)，因此无需进行任何样本富集步骤，可直接将样本中所有细胞直接分散于可寻址的微孔阵列芯片或玻璃片上进行染色与成像。尿液中细胞数目稍多，但一般少于100万个，因此也无需采用任何富集步骤。胸腔积液、尤其是血性胸腔积液中红细胞数目较多，需进行简单的细胞富集，即裂解并除去红细胞，除此之外一般无需再进行其他的富集步骤。血液中细胞数目最多(每毫升血液中含有红细胞50亿个，白细胞数百万个)，因此往往需要进行一步或多步的富集，比如针对目标细胞的正选，或通过负选除去非目标细胞(如红细胞、白细胞)，或将正选与负选相结合。以上的对不同体液样本处理、富集以及针对标志物的染色、成像与单细胞测序验证在实施例中均有展现。
附图说明
附图1：本发明所述的实验步骤流程图。
附图2：本发明所述的可寻址微孔阵列芯片的照片与芯片上一个编号区域的显微镜放大图片，通过细胞所在微孔中的位置，该微孔在编号区域中的位置以及该区域的编号可对细胞进行定位，以便于单细胞操纵与分离。
附图3：一肺腺癌初治患者5毫升血液样本中CTC检测情况，其中CD45阴性/DAPI阳性/HK2阳性的细胞被定义为CTC，HK2及CK阳性阈值为白细胞HK2或CK荧光值的平均值加五倍标准差，图中标注了四个HK2及CK阳性阈值所分割的四个象限的CTC数目。
附图4：图3所涉及肺腺癌患者CTC的荧光分通道图，根据HK2与CK的表达情况可进一步为HK2阳性/CK阳性/CD45阴性/DAPI阳性、HK2阳性/CK阴性/CD45阴性/DAPI阳性和HK2阴性/CK阳性/CD45阴性/DAPI阳性等三个细胞子群。
附图5：图3所涉及肺腺癌患者CTC的单细胞拷贝数变异检测结果，这一结果可证实基于HK2标志物鉴定出的CTC确实为肿瘤细胞。
附图6：24名初治肺腺癌患者血液中CTC的检测结果与基于CK表达的分型结果。
附图7：一骨肉瘤患者血液中检测到的CTC的荧光分通道图。
附图8：多名骨肉瘤患者所检测到CTC的单细胞拷贝数变异检测结果，表明HK2作为标志物可检测间质来源肉瘤的CTC。
附图9：一肺癌患者脑脊液中检测到的稀有肿瘤细胞的荧光分通道图，根据HK2与CK的表达情况可进一步为HK2阳性/CK阳性/CD45阴性/DAPI阳性、HK2阳性/CK阴性/CD45阴性/DAPI阳性和HK2阴性/CK阳性/CD45阴性/DAPI阳性等三个细胞子群。
附图10：图9所涉及肺腺癌患者脑脊液中稀有肿瘤细胞的单细胞拷贝数变异检测结果，可证实基于HK2标志物鉴定出的稀有肿瘤细胞为肿瘤细胞。
附图11：一肺腺癌患者胸腔积液样本中稀有肿瘤细胞检测情况，其中CD45阴性/DAPI阳性/HK2阳性的细胞被定义为稀有肿瘤细胞，HK2及CK阳性阈值为白细胞荧光值的平均值加五倍标准差。
附图12：图11所涉及肺腺癌患者胸腔积液中HK2阳性/CK阳性的稀有肿瘤细胞与HK2阳性/CK阴性的稀有肿瘤细胞的尺寸比较，其中尺寸使用细胞在荧光扫描图片上的绝对面积衡量的。
附图13：图11所涉及肺腺癌患者胸腔积液中稀有肿瘤细胞的单细胞拷贝数变异检测结果，图中所展示的细胞经单细胞测序均具有EGFR L858R驱动突变，因此均为肿瘤细胞，但其中HK2阳性/CK阳性与HK2阳性/CK阴性的肿瘤细胞的单细胞拷贝数变异特征不同。
附图14：图13中六个带星号细胞的Sanger测序图，显示该六个细胞带有EGFRL858R突变，可以明确是肿瘤细胞。
附图15：一膀胱癌患者尿液中检测到的稀有肿瘤细胞的单细胞拷贝数变异检测结果，可证实基于HK2标志物鉴定出的稀有肿瘤细胞为肿瘤细胞。
具体实施方式
下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
当本发明未做特别的说明，以下实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规技术手段，且所用的原料、试剂也均为市售可购买得到的商品。
如图1所示，所述人体液(如血液、脑脊液、胸腔积液、尿液等)样本中稀有肿瘤细胞的检测方法主要包括以下具体步骤：
(a)取癌症患者体液样本：在获得患者知情同意的前提下，按照手册规定的常规步骤，抽取癌症患者的体液样本；
(b)预处理与富集：由于不同的体液样本中所含的总细胞数目不同，因此针对不同的样本需采用不同的样本预处理与富集方法。
(c)细胞铺片：将细胞铺展在可寻址的微孔阵列芯片或玻璃片上；
(d)细胞固定、透膜、染色：对细胞进行固定、透膜后进行染色处理以鉴定人体液中的稀有肿瘤细胞，其中染色试剂为一定浓度的荧光标记的HK2抗体物质、CD45抗体物质和细胞核染色剂DAPI。注：对于肺腺癌体液样本等，染色试剂中还增加了一定浓度的CK抗体物质，用于比较HK2检测结果与基于CK表达的分型结果；
(e)成像与图像分析：进行荧光分析初步判定CD45阴性/DAPI阳性/HK2或CK阳性的细胞为稀有肿瘤细胞，其中HK2及CK阳性阈值为白细胞荧光值的平均值加五倍标准差；
(f)取出目的细胞：通过显微操作仪等多种设备获取目标细胞；
(g)基因扩增与测序：进行单细胞测序或本领域已知的其他判断稀有肿瘤细胞的检测手段以确定是否为肿瘤细胞。
其中所述荧光标记的HK2/CD45/CK抗体物质为由荧光素或其他荧光物质(如量子点)直接标记的HK2/CD45/CK抗体、或由非标记HK2/CD45/CK一抗与荧光素或其他荧光物质标记的二抗形成的组合。
进一步地，为了减少或排除检测样本中或处理过程引入的一些对HK2的荧光标记抗体物质有吸附作用的非细胞杂质(如细胞碎片、气泡、非细胞的颗粒等)对荧光分析的干扰，本发明方法的具体实施例中还包括在进行HK2染色的同时、之前或之后使用细胞核染料，例如细胞核荧光染料(DAPI或Hoechst系列染色)对样本细胞进行染色。在这种情况下，可以将同时呈细胞核染色阳性的HK2阳性细胞初步判定为稀有肿瘤细胞。
综上，这些结果提示了该方法具有较高的灵敏度和可靠性，可用于检测肺腺癌患者胸腔积液样本中的高糖酵解活性的稀有肿瘤细胞，尤其是能够用于检测上皮来源肿瘤中发生上皮间质转化的稀有肿瘤细胞，为癌症的液体活检提供新的检测手段和重要的生物学信息。
通过后文展示的大量试验表明，对于检测稀有肿瘤细胞的目的而言，无需利用上皮细胞标志物(例如CK)来实施本发明，或者说本发明不必判定样本细胞是否上皮细胞标志物阳性。本发明可以同时将样本中上皮来源的肿瘤细胞、上皮来源肿瘤中发生上皮间质转化的肿瘤细胞、以及间质来源肿瘤的循环肿瘤细胞均检测为肿瘤细胞，当然也不排除部分凋亡或代谢活性很低的肿瘤细胞无法通过本发明检测到。
另一方面，如果有区分CTC特征的实际需求，比如CTC中多大比例的肿瘤细胞已经发生了上皮间质转化，在本发明的优选实施例中则可以利用将HK2与CK联用。在本发明中可以将检出的肿瘤细胞中上皮细胞标志物阳性细胞确定为上皮来源肿瘤细胞，上皮细胞标志物阴性细胞确定为上皮间质转化的肿瘤细胞、或间质来源肿瘤细胞。
下面实施例详细阐述采用上述检测方法进行具体的人体液稀有肿瘤细胞的鉴定全过程和分析结果，以说明本发明的有效性和优越性。
实施例1：肺腺癌患者血液样本中CTC的检测
本实施例中，具体方法包括以下步骤：
(1)在5毫升肺癌患者外周血中加入75微升针对红细胞、白细胞以及血小板抗原的抗体混合液(STEMCELL公司)，室温下孵育20分钟，再加入15毫升含有2％胎牛血清(FBS)的Hank平衡盐溶液(HBSS)，混匀；
(2)从密度梯度离心管(STEMCELL公司)隔层中间的小孔中加入15毫升密度梯度离心液(STEMCELL公司)，加入过程中避免气泡的产生；
(3)将步骤(1)中的混合液沿管壁加入到步骤(2)中的密度梯度离心管内，防止层与层之间的混合，准确配平后离心20分钟(室温1200g，离心机刹车：加速9，减速6)，弃去密度梯度离心管中最上层的上清液(约10毫升)，然后将剩下的上清液(约10毫升)一次性倒入至新离心管中，再次离心(室温600g，8分钟，离心机刹车：加速6，减速6)，弃去上清液后加入1毫升红细胞裂解液(BD公司)在室温下避光裂解5分钟；
(4)离心(4℃，250g，5分钟)，弃去大部分上清液，剩余100微升液体重悬细胞，将这100微升细胞悬液滴加在微孔阵列芯片上，静置30分钟，芯片的显微镜明场图片如图2所示，本实施例中微孔阵列芯片共包含400个编号区域，共包含约14万个可寻址的微孔用于容纳细胞并给细胞定位，其中每个微孔的直径为30微米，使细胞均匀分布于芯片并沉入芯片微孔中；
(5)利用HBSS清洗芯片表面两遍，吸去芯片表面溶液，在芯片上加100微升2％多聚甲醛(PFA)在室温下对细胞进行固定(10分钟)，利用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗芯片表面五遍，吸去芯片表面溶液，在芯片上加30微升0.5％聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-100)处理15分钟，增加细胞膜对抗体的通透性，利用PBS清洗芯片表面五遍，吸去芯片表面溶液，在芯片上加100微升3％牛血清蛋白(BSA)和10％山羊血清混合液，室温下封闭1小时；
(6)利用PBS清洗芯片表面两遍，吸去芯片表面溶液，在芯片上加入100微升抗体混合液：其中包含有1％APC标记的CD45抗体(鼠源，Thermo Fisher公司)、1％PE标记的CK抗体(鼠源，BD公司)以及1％HK2一抗(兔源，Abcam公司)，4℃孵育过夜；
(7)利用PBS清洗芯片八遍，吸去芯片表面溶液，在芯片上加100微升3％BSA和10％山羊血清混合液，室温下封闭1小时，利用PBS清洗芯片表面两遍，吸去芯片表面溶液，在芯片上加100微升0.25％FITC标记的羊抗兔二抗(Thermo Fisher公司)，室温孵育1小时，用PBS清洗芯片五遍，吸去芯片表面溶液，在芯片上加100微升DAPI原液，室温孵育10分钟，孵育结束后用PBS清洗芯片五遍；
(8)高速荧光成像设备成像，并分析扫描结果，其中HK2及CK阳性阈值为芯片上白细胞荧光值的平均值加五倍标准差。CD45阳性和DAPI阳性的判断标准是显色的即为阳性。
如图3为一肺腺癌初治患者5毫升血液样本中CTC检测情况，其中CD45阴性/DAPI阳性/HK2或CK阳性的细胞被定义为CTC，图中标注了四个HK2及CK阳性阈值所分割的四个象限的CTC数目。
如图4为图3所涉及肺腺癌患者CTC的荧光分通道图，根据HK2与CK的表达情况可进一步为HK2阳性/CK阳性/CD45阴性/DAPI阳性、HK2阳性/CK阴性/CD45阴性/DAPI阳性和HK2阴性/CK阳性/CD45阴性/DAPI阳性等三个细胞子群。
(9)借助显微操作平台准确回收目标肿瘤单细胞，使用商业试剂盒MALBAC(亿康基因，中国)完成单细胞全基因组扩增。因为临床上有较成熟的靶向治疗方案，肿瘤单细胞全基因组扩增产物首先进行BRAF、EGFR和KRAS靶基因突变检测，PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳确认后，借助一代测序检测基因突变；剩下的肿瘤单细胞扩增产物用于全基因组测序文库构建。使用
Figure BDA0002023053520000091
AMPure XP beads(Beckman Coulter，美国)纯化回收剩下的单细胞扩增产物，纯化后的核酸用于全基因组测序文库构建，全基因组测序文库构建使用
Figure BDA0002023053520000092
UltraTMDNA Library Prep Kit(New EnglandBiolabs，英国)完成，测序文库浓度和质量分别使用Qubite 3.0(Thermo Fisher Scientific，美国)和Agilent2100Bioanalyzer(Agilent，美国)进行评估，全基因组测序使用Hiseq Xten(Illumina，美国)测序平台，采取PE150测序策略。
如图5为图3所涉及肺腺癌患者CTC的单细胞拷贝数变异检测结果，这一结果证实基于HK2标志物鉴定出的CTC确实为肿瘤细胞。
结果
所有肺腺癌患者血液样本实验中，约有67％的样本检测到了稀有肿瘤细胞。如图3和4所示，根据HK2及CK的表型，这些稀有肿瘤细胞可分为三个子群：HK2阳性/CK阳性/CD45阴性/DAPI阳性细胞子群、HK2阳性/CK阴性/CD45阴性/DAPI阳性细胞子群和HK2阴性/CK阳性/CD45阴性/DAPI阳性细胞子群。
借助显微操作平台准确回收目标单细胞并对其进行单细胞扩增和测序研究，结果如图5所示，HK2阳性/CK阳性/CD45阴性/DAPI阳性细胞子群被证实为上皮来源的肿瘤细胞；HK2阳性/CK阴性/CD45阴性/DAPI阳性细胞子群则可能是发生了上皮间质转化的肿瘤细胞；HK2阴性/CK阳性/CD45阴性/DAPI阳性细胞则可能包含了正常的上皮来源及间皮细胞，而非肿瘤细胞。图6为24名初治肺腺癌患者血液中CTC的检测结果与基于CK表达的分型结果，证明该检测方法具有较高的灵敏度和准确性。
综上，约67％的肺腺癌血液样本中都检测到了一定数目的目标细胞，提示了该方法的灵敏度较高，对目标细胞进行单细胞测序的验证实验可以说明该方法同时具有较高的准确性，可以用于检测肺腺癌患者血液中的高糖酵解活性的循环肿瘤细胞，尤其是能够用于检测上皮来源肿瘤中发生上皮间质转化的循环肿瘤细胞，为癌症的液体活检提供新的检测手段和重要的生物学信息。
实施例2：骨肉瘤患者血液样本中CTC的检测
本实施例中，方法包括以下步骤：
(1)5毫升骨肉瘤患者外周血样本，采用与实施例1相同的方法对CTC进行富集；
(2)将富集得到的细胞悬液滴加在微孔阵列芯片上，静置30分钟使细胞进入到微孔内，利用HBSS清洗芯片表面两遍，吸去芯片表面溶液，在芯片上加100微升2％PFA在室温下对细胞进行固定(10分钟)，利用PBS清洗芯片表面五遍，吸去芯片表面溶液，在芯片上加30微升0.5％Triton X-100处理15分钟，增加细胞膜对抗体的通透性，利用PBS清洗芯片表面五遍，吸去芯片表面溶液，在芯片上加100微升3％BSA和10％山羊血清混合液，室温下封闭1小时；
(3)利用PBS清洗芯片表面两遍，吸去芯片表面溶液，在芯片上加入100微升抗体混合液：其中包含有1％APC标记的CD45抗体(鼠源，Thermo Fisher公司)和1％HK2一抗(兔源，Abcam公司)，4℃孵育过夜；
(4)利用PBS清洗芯片八遍，吸去芯片表面溶液，在芯片上加100微升3％BSA和10％山羊血清混合液，室温下封闭1小时，利用PBS清洗芯片表面两遍，吸去芯片表面溶液，在芯片上加100微升0.25％FITC标记的羊抗兔二抗(Thermo Fisher公司)，室温孵育1小时，用PBS清洗芯片五遍，吸去芯片表面溶液，在芯片上加100微升DAPI原液，室温孵育10分钟，孵育结束后用PBS清洗芯片五遍；
(5)高速荧光成像设备成像，并分析扫描结果，其中HK2阳性阈值为芯片上白细胞荧光值的平均值加五倍标准差。CD45阳性和DAPI阳性的判断标准是显色的即为阳性。
如图7为一骨肉瘤患者血液中检测到的CTC的荧光分通道图，其中CD45阴性/DAPI阳性/HK2阳性的细胞被定义为CTC。
(6)借助显微操作平台准确回收目标肿瘤单细胞，使用商业试剂盒MALBAC(亿康基因，中国)完成单细胞全基因组扩增。肿瘤单细胞全基因组扩增产物直接用于全基因组测序文库构建。肿瘤单细胞全基因组扩增产物使用
Figure BDA0002023053520000111
AMPure XPbeads(BeckmanCoulter，美国)纯化回收，全基因组测序文库构建使用
Figure BDA0002023053520000112
UltraTMDNALibraryPrepKit(New England Biolabs，英国)完成，测序文库浓度和质量分别使用Qubite 3.0(ThermoFisher Scientific，美国)和Agilent 2100Bioanalyzer(Agilent，美国)进行评估，全基因组测序使用Hiseq Xten(Illumina，美国)测序平台，采取PE150测序策略。
如图8为多名骨肉瘤患者所检测到CTC的单细胞拷贝数变异检测结果，证实基于HK2/CD45/DAPI标志物组合鉴定出的CTC确实为肿瘤细胞，这表明HK2/CD45/DAPI作为标志物组合可用于检测间质来源肉瘤的CTC。
结果
在70个骨肉瘤患者外周血样本中，共在48个样本中找到了一定数目的HK2阳性/CD45阴性/DAPI阳性的稀有肿瘤细胞。借助显微操作平台准确回收目标单细胞并对其进行单细胞扩增和测序研究，结果如图8所示，HK2阳性/CD45阴性/DAPI阳性细胞被证实为CTC，提示了该方法具有较高的灵敏度和准确性，适用于检测间质来源肿瘤的循环肿瘤细胞。
实施例3：肺癌患者脑脊液样本中稀有肿瘤细胞的检测
本实施例中，方法包括以下步骤：
(1)5毫升肺癌脑转移患者脑脊液样本，离心(300g，5分钟)，弃去绝大部分上清液，剩下100微升上清液重悬细胞，将这100微升细胞悬液滴加在微孔阵列芯片上，静置10分钟使细胞进入到微孔内；
(2)利用HBSS清洗芯片表面两遍，吸去芯片表面溶液，在芯片上加100微升2％PFA在室温下对细胞进行固定(10分钟)，利用PBS清洗芯片表面五遍，吸去芯片表面溶液，在芯片上加30微升0.5％Triton X-100处理15分钟，增加细胞膜对抗体的通透性，利用PBS清洗芯片表面五遍，吸去芯片表面溶液，在芯片上加100微升3％BSA和10％山羊血清混合液，室温下封闭1小时；
(3)利用PBS清洗芯片表面两遍，吸去芯片表面溶液，在芯片上加入100微升抗体混合液：其中包含有1％APC标记的CD45抗体(鼠源，Thermo Fisher公司)、1％PE标记的CK抗体(鼠源，BD公司)和1％HK2一抗(兔源，Abcam公司)，4℃孵育过夜；
(4)利用PBS清洗芯片八遍，吸去芯片表面溶液，在芯片上加100微升3％BSA和10％山羊血清混合液，室温下封闭1小时，利用PBS清洗芯片表面两遍，吸去芯片表面溶液，在芯片上加100微升0.25％FITC标记的羊抗兔二抗(Thermo Fisher公司)，室温孵育1小时，用PBS清洗芯片五遍，吸去芯片表面溶液，在芯片上加100微升DAPI原液，室温孵育10分钟，孵育结束后用PBS清洗芯片五遍；
(5)高速荧光成像设备成像，并分析扫描结果，其中HK2及CK阳性阈值为芯片上白细胞荧光值的平均值加五倍标准差。CD45阳性和DAPI阳性的判断标准是显色的即为阳性。
如图9为一肺腺癌患者5毫升脑脊液样本中检测到的稀有肿瘤细胞的荧光分通道图，根据HK2与CK的表达情况可进一步为HK2阳性/CK阳性/CD45阴性/DAPI阳性、HK2阳性/CK阴性/CD45阴性/DAPI阳性和HK2阴性/CK阳性/CD45阴性/DAPI阳性等三个细胞子群。
(6)借助显微操作平台准确回收目标肿瘤单细胞，使用商业试剂盒MALBAC(亿康基因，中国)完成单细胞全基因组扩增。因为临床上有较成熟的靶向治疗方案，肿瘤单细胞全基因组扩增产物首先进行BRAF、EGFR和KRAS靶基因突变检测，PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳确认后，借助一代测序检测基因突变；剩下的肿瘤单细胞扩增产物用于全基因组测序文库构建。使用
Figure BDA0002023053520000121
AMPure XPbeads(Beckman Coulter，美国)纯化回收剩下的单细胞扩增产物，纯化后的核酸用于全基因组测序文库构建，全基因组测序文库构建使用
Figure BDA0002023053520000122
UltraTMDNA Library Prep Kit(New England Biolabs，英国)完成，测序文库浓度和质量分别使用Qubite 3.0(Thermo Fisher Scientific，美国)和Agilent2100Bioanalyzer(Agilent，美国)进行评估，全基因组测序使用Hiseq Xten(Illumina，美国)测序平台，采取PE150测序策略。
如图10为图9所涉及肺腺癌患者脑脊液中稀有肿瘤细胞的单细胞拷贝数变异检测结果，证实基于HK2/CD45/DAPI标志物组合鉴定出的稀有肿瘤细胞均为肿瘤细胞。
结果
肺癌患者脑脊液样本实验中，所有样本都检测到了稀有肿瘤细胞，根据HK2和CK的表型，这些稀有肿瘤细胞可分为三个子群：HK2阳性/CK阳性/CD45阴性/DAPI阳性细胞子群、HK2阳性/CK阴性/CD45阴性/DAPI阳性细胞子群和HK2阴性/CK阳性/CD45阴性/DAPI阳性细胞子群。
借助显微操作平台准确回收目标单细胞并对其进行单细胞扩增和测序研究，结果如图10所示，HK2阳性/CK阳性/CD45阴性/DAPI阳性细胞子群是上皮来源的肿瘤细胞；HK2阳性/CK阴性/CD45阴性/DAPI阳性细胞子群则可能是发生了上皮间质转化的肿瘤细胞；HK2阴性/CK阳性/CD45阴性/DAPI阳性细胞子群则可能是上皮来源的低糖酵解的肿瘤细胞，提示了该方法具有较高的灵敏度和可靠性，可以用于检测肺腺癌患者脑脊液样本中的高糖酵解活性的稀有肿瘤细胞，尤其是能够用于检测上皮来源肿瘤中发生上皮间质转化的稀有肿瘤细胞。
实施例4：肺癌患者胸腔积液样本中稀有肿瘤细胞的检测
本实施例中，方法包括以下步骤：
(1)10毫升肺癌患者胸水离心(300g，5分钟)分离出细胞，加5毫升红细胞裂解液(BD公司)避光裂解5分钟，再次离心(300g，5分钟)，弃去上清液后用HBSS重悬并洗涤细胞，离心(300g，5分钟)弃去上清液，加入1毫升HBSS重悬细胞；
(2)将得到的细胞悬液滴加在可寻址的微孔阵列芯片上，静置10分钟，使得细胞进入到微孔内；
(3)利用HBSS清洗芯片表面两遍，吸去芯片表面溶液，在芯片上加100微升2％PFA在室温下对细胞进行固定(10分钟)，利用PBS清洗芯片表面五遍，吸去芯片表面溶液，在芯片上加30微升0.5％Triton X-100处理15分钟，增加细胞膜对抗体的通透性，利用PBS清洗芯片表面五遍，吸去芯片表面溶液，在芯片上加100微升3％BSA和10％山羊血清混合液，室温下封闭1小时；
(4)利用PBS清洗芯片表面两遍，吸去芯片表面溶液，在芯片上加入100微升抗体混合液：其中包含有1％APC标记的CD45抗体(鼠源，Thermo Fisher公司)、1％PE标记的CK抗体(鼠源，BD公司)和1％HK2一抗(兔源，Abcam公司)，4℃孵育过夜；
(5)利用PBS清洗芯片八遍，吸去芯片表面溶液，在芯片上加100微升3％BSA和10％山羊血清混合液，室温下封闭1小时，利用PBS清洗芯片表面两遍，吸去芯片表面溶液，在芯片上加100微升0.25％FITC标记的羊抗兔二抗(Thermo Fisher公司)，室温孵育1小时，用PBS清洗芯片五遍，吸去芯片表面溶液，在芯片上加100微升DAPI原液，室温孵育10分钟，孵育结束后用PBS清洗芯片五遍；
(7)高速荧光成像设备成像，并分析扫描结果，其中HK2及CK阳性阈值为芯片上白细胞荧光值的平均值加五倍标准差。CD45阳性和DAPI阳性的判断标准是显色的即为阳性。
如图11为一肺腺癌患者胸腔积液样本中稀有肿瘤细胞检测情况，其中CD45阴性/DAPI阳性/HK2或CK阳性的细胞被定义为稀有肿瘤细胞。
如图12为图11所涉及肺腺癌患者胸腔积液中HK2阳性/CK阳性的稀有肿瘤细胞与HK2阳性/CK阴性的稀有肿瘤细胞的尺寸比较，其中尺寸使用细胞在荧光扫描图片上的绝对面积衡量的。
(8)借助显微操作平台准确回收目标肿瘤单细胞，使用商业试剂盒MALBAC(亿康基因，中国)完成单细胞全基因组扩增。因为临床上有较成熟的靶向治疗方案，肿瘤单细胞全基因组扩增产物首先进行BRAF、EGFR和KRAS靶基因突变检测，PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳确认后，借助一代测序检测基因突变；剩下的肿瘤单细胞扩增产物用于全基因组测序文库构建。使用
Figure BDA0002023053520000141
AMPure XPbeads(Beckman Coulter，美国)纯化回收剩下的单细胞扩增产物，纯化后的核酸用于全基因组测序文库构建，全基因组测序文库构建使用
Figure BDA0002023053520000142
UltraTMDNA Library Prep Kit(New England Biolabs，英国)完成，测序文库浓度和质量分别使用Qubite 3.0(Thermo Fisher Scientific，美国)和Agilent2100Bioanalyzer(Agilent，美国)进行评估，全基因组测序使用Hiseq Xten(Illumina，美国)测序平台，采取PE150测序策略。
如图13为图11所涉及肺腺癌患者胸腔积液中稀有肿瘤细胞的单细胞拷贝数变异检测结果，图中所展示的细胞经单细胞测序均具有EGFR L858R驱动突变，因此均为肿瘤细胞，但其中CK阳性与CK阴性的肿瘤细胞的单细胞拷贝数变异特征不同。
如图14为图13中六个带星号细胞的Sanger测序图，显示该六个细胞带有EGFRL858R突变，可以明确是肿瘤细胞。
实施例5：膀胱癌患者尿液样本中稀有肿瘤细胞的检测
本实施例中，方法包括以下步骤：
(1)尿液样本离心(4℃，410g，5分钟，离心机刹车：加速8，减速8)，弃去上清液，加入适量海世嘉稀释液重悬细胞；
(2)取2毫升细胞悬液加入到载玻片制片仓的漏斗中，将载玻片放入制片机，离心(4℃，200g，3分钟)，倒掉制片仓中的液体，用自来水冲洗载玻片；
(3)旋转取下制片仓，取出载玻片，用自来水冲洗数秒，立刻浸入95％乙醇中固定15分钟，在流动自来水中浸泡1分钟，取出载玻片，保持细胞处于液体环境中，擦干周围多余水分，用免疫组化笔划定范围；
(4)吸去液体，加50微升0.5％Triton X-100处理15分钟，增加细胞膜对抗体的通透性，利用PBS清洗四遍，加100微升3％BSA和10％山羊血清混合液，室温下封闭1小时，利用PBS清洗两遍，加100微升抗体混合液：其中包含有1％APC标记的CD45抗体(鼠源，ThermoFisher公司)和1％HK2一抗(兔源，Abcam公司)，4℃孵育过夜；
(5)利用PBS清洗五遍，加100微升3％BSA和10％山羊血清混合液，室温下封闭1小时，利用PBS清洗两遍，吸去表面溶液，加100微升0.25％FITC标记的羊抗兔二抗(ThermoFisher公司)，室温孵育1小时，用PBS清洗五遍，吸去表面溶液，加100微升DAPI原液，室温孵育10分钟，孵育结束后用PBS清洗五遍；
(6)高速荧光成像设备成像，并分析扫描结果，其中HK2阳性阈值为芯片上白细胞荧光值的平均值加五倍标准差。CD45阳性和DAPI阳性的判断标准是显色的即为阳性。
(7)借助显微操作平台准确回收目标肿瘤单细胞(即HK2阳性、CD45阴性、DAPI阳性)，使用商业试剂盒MALBAC(亿康基因，中国)完成单细胞全基因组扩增。肿瘤单细胞全基因组扩增产物直接用于全基因组测序文库构建。肿瘤单细胞全基因组扩增产物使用
Figure BDA0002023053520000151
AMPure XP beads(Beckman Coulter，美国)纯化回收，全基因组测序文库构建使用
Figure BDA0002023053520000152
UltraTMDNALibrary Prep Kit(New England Biolabs，英国)完成，测序文库浓度和质量分别使用Qubite 3.0(Thermo Fisher Scientific，美国)和Agilent2100Bioanalyzer(Agilent，美国)进行评估，全基因组测序使用Hiseq Xten(Illumina，美国)测序平台，采取PE150测序策略。
图15为所涉及膀胱癌患者尿液中稀有肿瘤细胞的单细胞拷贝数变异检测结果，可证实基于HK2标志物高表达鉴定出的稀有肿瘤细胞为肿瘤细胞。
结果
膀胱癌患者尿液样本实验中，所有样本都检测到了稀有肿瘤细胞，借助显微操作平台准确回收目标单细胞并对其进行单细胞扩增和测序研究，结果如图15所示，HK2阳性/CD45阴性/DAPI阳性细胞被证实是肿瘤细胞。
综上，提示了该方法具有较高的灵敏度和可靠性，可用于检测膀胱癌患者尿液样本中的高糖酵解活性的稀有肿瘤细胞。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种检测人体液样本中稀有肿瘤细胞的方法，包括：用荧光标记的己糖激酶2(HK2)抗体物质对来自人体液样本的细胞进行染色处理，对染色处理后的细胞进行荧光检测，根据荧光信号确定HK2阳性细胞，HK2高表达细胞为稀有肿瘤细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其中将荧光检测时所有白细胞的HK2荧光值的平均值加五倍标准差作为判断HK2高表达的阈值。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括用荧光标记的白细胞标志物抗体对来自体液样本的细胞进行染色处理、和用细胞核染色剂对来自人体液样本的细胞进行染色处理，符合HK2高表达/白细胞标志物阴性/细胞核染色阳性的细胞为稀有肿瘤细胞。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其中荧光标记的HK2抗体物质是荧光标记的HK2抗体，或者是HK2抗体与荧光标记的HK2二抗的组合。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，其中所述白细胞标志物抗体为针对细胞膜表面蛋白CD45的抗体，所述细胞核染色剂是细胞核荧光染料；将荧光检测时CD45阳性细胞的HK2荧光值的平均值加五倍标准差作为判断HK2高表达的阈值。
6.如权利要求1-5任一项所述的方法，其中所述体液样本为血液、胸腔积液、脑脊液或尿液样本，所述体液样本选择性地进行富集处理后，制成细胞悬液，并以单细胞形式铺展于可寻址的微孔阵列芯片或玻璃片以进行染色处理，所述富集处理包括减少体液样本中红细胞和/或白细胞的数量。
7.一种用于稀有肿瘤细胞检测的试剂盒，其包含：荧光标记的HK2抗体物质、荧光标记的白细胞标志物抗体、和细胞核染色剂。
8.HK2抗体物质的用途，其特征在于，用于：
a)非诊断目的检测稀有肿瘤细胞；或
b)制备稀有肿瘤细胞检测试剂盒；或
c)作为肿瘤细胞标志物检测稀有肿瘤细胞。
9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，将人体液样本中HK2高表达/白细胞标志物阴性/细胞核染色阳性的细胞鉴定为稀有肿瘤细胞；将人体液样本中上皮细胞标志物阴性的所述稀有肿瘤细胞鉴定为上皮间质转化的肿瘤细胞或间质来源肿瘤细胞；HK2高表达的细胞是指HK2荧光染色处理后荧光信号值达到预定阈值的细胞。
10.HK2抗体物质和上皮细胞标志物抗体物质的组合用途，其特征在于，用于制备鉴定CTC特征的检测试剂盒，所述HK2抗体物质为荧光标记的HK2抗体、或者是HK2抗体与荧光标记的HK2二抗的组合，所述上皮细胞标志物抗体物质为荧光标记的CK抗体，所述CTC特征是指区分CTC细胞是否为上皮来源肿瘤细胞、上皮间质转化的肿瘤细胞、或间质来源肿瘤细胞；所述试剂盒还包括用荧光标记的白细胞标志物抗体、细胞核染色剂、以及说明书，所述说明书记载以下内容：CTC细胞中上皮细胞标志物阳性细胞确定为上皮来源肿瘤细胞，上皮细胞标志物阴性细胞确定为上皮间质转化的肿瘤细胞、或间质来源肿瘤细胞。
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