CN105331516B - 稀有细胞富集装置和方法 - Google Patents
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Abstract
一种稀有细胞富集装置，其包括：细胞筛选部分，其包含形成在两个相对表面之间的细胞筛选通道，两个相对表面中的至少一个表面为磁性吸附表面，其中细胞筛选通道的厚度设置为，当细胞悬液流经时形成为使得细胞基本上以单层分布的薄液层，从而结合了免疫磁球的多数细胞在所述细胞筛选通道内被吸附到所述磁性吸附表面时避免裹挟稀有细胞。还包括：细胞收集部分，其包含过滤单元，其可拆卸地设置于所述细胞筛选部分的下游，以截留未被磁性吸附的稀有细胞。本发明解决了通过负选富集稀有细胞时容易导致稀有细胞丢失的吸附裹挟和离心损失这两个关键问题，因此能获得较高的稀有细胞回收率。本发明还公开了一种利用上述富集装置回收稀有细胞的方法。
Description
技术领域
本发明涉及细胞分离、检测领域，尤其涉及一种从细胞悬液中高回收率筛选收集稀有细胞的装置和方法。
背景技术
为了医学诊疗等目的，会需要从人或动物的血液、组织液或淋巴液，尤其是血液中筛选、分离出游离其中的特定目标细胞，主要是病变的细胞或从病变组织、器官上脱落的细胞。经常地，目标细胞在在上述体液中的含量非常稀少。
例如，循环上皮细胞是存在于血液中的一种稀有细胞，从病变的上皮组织脱落，其中从良性病变组织脱落的为良性上皮细胞，从恶性病变组织(癌症)脱落的为肿瘤细胞，其数目极其稀少，每10ml血液可能仅含几个到几十个循环肿瘤细胞，却有多达约1亿个白细胞和500亿个红细胞(Zhe XN,Cher ML,Bonfil RD,Am.J.Cancer Res.2011,1,740-751)，对其检测犹如大海捞针。除了血液之外，一些组织液中也含有从病变组织脱落的具有诊疗价值的细胞，如腹水、胸腔积液、脑脊液等中的肿瘤细胞。此外，孕妇外周血中也可检测到来自胎儿的有核红细胞，收集这些胎儿的稀有细胞能够获得胎儿完整的基因组，从而为产前诊断遗传病提供有力的工具。
下面以血液中循环上皮细胞为例概述目前一些稀有细胞富集方法。从血液中富集循环上皮细胞的方法按照富集方式可分为正选或负选，按照富集原理可分为基于细胞表面标志物或基于细胞的物理性质。
(1)正选+细胞表面标志物：这一方法主要通过针对上皮细胞特异性标志物(如EpCAM,EGFR,HER2等)的抗体来富集血液中的上皮来源细胞，抗体可修饰于免疫磁球表面或微流控芯片通道表面，其中最具代表性的是已被美国FDA批准应用于检测转移性乳腺癌、前列腺癌及结直肠癌患者外周血中循环肿瘤细胞的CellSearchTM系统(Cristofanilli M,Budd T,Ellis MJ,et al.N.Engl.J.Med.2004,351,781-791；Riethdorf S,Fritsche H,Muller V,et al.Clin.Cancer Res.2007,13,920-928；Cohen SJ,Punt CJA,Iannotti N,et al.J.Clin.Oncol.2008,26,3213-3221)，该系统运用标记有EpCAM抗体的磁性微球进行血液中循环肿瘤细胞的富集，但这一方法难以捕获不表达或低表达EpCAM的上皮细胞，即使使用若干种针对不同抗原的抗体进行联合捕获也依然存在上述问题。
(2)正选+细胞物理性质：这一方法主要是利用肿瘤细胞与血细胞尺寸上的差异进行富集。红细胞明显小于上皮来源的细胞，而白细胞虽然平均尺寸小于上皮细胞，但是数量巨大的白细胞其尺寸分布很宽，且上皮细胞尤其是肿瘤细胞异质性较大，因此部分白细胞与循环上皮细胞的尺寸存在重叠。通过这一方法分离的循环上皮细胞中往往混入大量白细胞，获得样本的纯度很低，难以进行后续的分子分析。同时，由于肿瘤细胞的异质性，存在着一些尺寸较小的肿瘤细胞容易被漏选从而造成损失。
(3)负选：这一方法主要是为解决正选难以富集到血液中全体游离的循环上皮细胞而采用的，其富集策略是将血液中已知的血细胞分步去除，从而剩下的细胞悬液中包含了我们所需要的循环上皮细胞。基本的方法是首先通过密度梯度离心去除血液中的红细胞及部分白细胞，取单个核细胞层与修饰了CD45抗体的免疫磁球孵育(CD45是白细胞表面共同抗原)，然后通过施加磁场截留表面结合了CD45磁球的白细胞，同时收集剩余的细胞悬液，其中包含了所需要的循环上皮细胞，最后通过离心浓缩这一稀有细胞悬液并进行后续分析。但之前的研究证实这一方法的对上皮细胞的回收率很低，因此一直不是主流的稀有细胞富集方法。
由于稀有细胞难以高收率的筛选和富集，导致对其检测分析困难。因此需发展高效、快速的将稀有细胞从例如血液这类极为复杂的生物样本中富集出来的工具与方法，达到回收率收集稀有细胞的目的。
发明内容
本发明所要解决的正是稀有细胞负选回收率低的问题。
本发明的第一方面是一种稀有细胞富集装置，其包括：细胞筛选部分，其包含形成在两个相对表面之间的细胞筛选通道，两个相对表面中的至少一个表面为磁性吸附表面，其中所述细胞筛选通道的厚度设置为，当细胞悬液流经时形成为使得细胞基本上以单层分布的薄液层，从而结合了免疫磁球的多数细胞在所述细胞筛选通道内被吸附到所述磁性吸附表面时避免裹挟稀有细胞。所述装置还包括：细胞收集部分，其包含过滤单元，其可拆卸地设置于所述细胞筛选部分的下游，以截留未被磁性吸附的稀有细胞。
本发明的第二方面是一种富集稀有细胞的方法，包括：制备包含多数细胞和稀有细胞的细胞悬液，其中所述多数细胞结合有免疫磁球；使所述细胞悬液以细胞基本上呈单层分布的薄液层形式流过磁性吸附表面，其中结合了免疫磁球的多数细胞被吸附到所述磁性吸附表面；及用微滤膜截留细胞悬液中未被吸附的稀有细胞，以收集未被吸附的稀有细胞。
当含有目标稀有细胞以及结合有免疫磁球的多数细胞悬液从流经细胞筛选通道时，由于流过通道的适当稀释细胞悬液的液层很薄，细胞基本上以单层形式存在，表面结合磁球的细胞被吸引到磁性表面的时候不会裹挟稀有的循环上皮细胞。另外，用微滤膜截留未被吸附的稀有细胞可以提高稀有细胞回收率，克服离心浓缩稀有细胞悬液带来的回收率低的问题。本发明解决了通过负选富集稀有细胞时容易导致稀有细胞丢失这两个关键问题，因此能获得较高的稀有细胞回收率，这也正是本发明的创新之处。
附图说明
图1是根据本发明具体实施方式的稀有细胞富集装置的原理图；
图2是根据本发明具体实施方式的稀有细胞富集装置的三维图；
图3是用于本发明稀有细胞富集装置的用于收集稀有细胞的双层滤膜示意图；及
图4是图3所述滤膜截留了细胞的照片。
附图标记的说明：1.稀有细胞富集装置；2.磁性部；2A.内管；2B.磁体；3.外管；4.进样口；5.出样口；6.滤膜；7.集液瓶；8.抽气口；9.填充物；及C.细胞筛选通道。
具体实施方式
参见图1和图2，它们示出了本发明一具体实施方式的稀有细胞富集装置的原理图和三维图。本发明的稀有细胞富集装置1具有主体部分或细胞筛选部分，其包括磁性部2和套在磁性部2外的外管3。磁性部2可包括内管2A和容纳其中的磁体2B。磁性部2的外壁与外管3的内壁，也即内管2A的外表面与外管3的内表面，共同界定细胞筛选通道C。主体部分的上、下两端分别形成有与细胞筛选通道C液体联通的进样口4和出样口5。因此，本发明的这一实施方式中，富集装置的筛选部分大体形成为内含磁体的双层套管结构。
例如，内管2A和外管3分别采用的材料为聚苯乙烯或亲水凝胶包被的聚苯乙烯或其他对细胞不吸附或超低吸附的材料。磁体2B可以是由一个或多个永磁体组合成的圆柱状的磁体。但本发明不限于此。
内管2与外管3的管壁间距(即沿管壁纵向延伸的通道C的宽度)设置为，当细胞悬液流过通道C时形成的液层很薄，使得悬浮细胞基本上以单层分布。为了使悬浮细胞在通道C中以单层分布，可根据悬浮液中细胞尺寸和悬浮细胞密度来确定通道C的宽度为0.1mm–5mm，优选为0.1mm-1mm。在本发明实施例2中，对于从作为多数细胞的白细胞中筛选出作为稀有细胞的循环上皮细胞时实际使用的富集装置中，通道C的宽度为0.5mm。
当含有目标稀有细胞(例如循环上皮细胞)以及结合有免疫磁球的多数细胞(例如白细胞)悬液从进样口4经细胞筛选通道C流向出样口5时，带磁性的多数细胞被吸附到磁性部2的外壁，而稀有细胞则通过通道C流向出样口5。由于流过通道C的细胞悬液的液层很薄，同时由于细胞被充分稀释，因此位于同一高度的细胞数目少，表面结合磁球的白细胞被吸引到磁性部2壁部的时候不会裹挟稀有的循环上皮细胞。
在本具体实施方式中，内管2A内部设置的磁体2B可以为从上至下磁性逐步增强的磁体，例如为梯度递增磁体。该梯度磁体上部磁场强度较低，下部磁场强度较高，即形成沿细胞筛选通道C或细胞悬液流动方向逐步升高的梯度磁场。例如，通过上下方向放置不同尺寸的磁块可以获得梯度磁体。例如，磁体2B为由一组磁性不同的永磁体组合成的圆柱状的能产生梯度磁场的磁体。或是一个纵截面为梯形的柱状永磁体，也能够产生梯度磁场。
当含有目标稀有细胞(例如循环上皮细胞)以及结合有免疫磁球的多数细胞(例如白细胞)悬液从进样口4经细胞筛选通道C流向出样口5时，在通道C的上游吸附表面结合有较多免疫磁球的白细胞，下游吸附表面结合较少免疫磁球的白细胞。这一梯度磁场的设置使所有的白细胞尽可能均匀的排布于磁性部2的整个长度上，避免出现白细胞堆积于上部管壁的情况。这可以进一步减少被吸附多数细胞裹挟稀有细胞的可能性。
另外，为了避免细胞悬液从位于磁性部2的上方进样后细胞被吸附于磁性部2的上表面，可以在磁体2B上端设置填充物9以减弱磁感应强度。如图2所示，填充物填充于磁体2B上端与内管2A的上端盖部之间的空隙中。或者可以整个磁性部2的上端设置填充物。填充物的材料可以采用空气、海绵、塑料等。
本发明的稀有细胞富集装置还可以包括收集或富集部分。在图1和图2所示具体实施方式中，稀有细胞富集装置的富集部分包括设置于出样口5中或附近的滤膜6。滤膜6下方设有集液瓶7。用于形成负压抽滤的抽气口8设于滤膜6和集液瓶7之间，或设于集液瓶7上。滤膜6和集液瓶7都是可拆卸地安装至本发明装置细胞筛选部分的下游，具体地，可拆卸地安装至出样口5的位置。
所述滤膜可以是包括具有细胞截留孔的微滤膜，该细胞截留孔的孔径为3-8微米，优选为4-6微米。本发明实施例中，所述微滤膜包含约10000个细胞截留孔。
优选地，可采用双层结构的滤膜，该滤膜的上层为具有微孔的微孔板，下层为具有细胞截留孔的微滤膜，所述微孔的尺寸设置为允许所述稀有细胞通过，而所述细胞截留孔的尺寸设置为不允许所述稀有细胞通过。且其中所述微滤膜的细胞截留孔位于所述微孔板的对应微孔的下方，用以截留进入微孔中的稀有细胞。进一步优选地，所述细胞截留孔的孔径为3-8微米，优选为4-6微米，且所述微孔的孔径为所述细胞截留孔的5-20倍，优选为8-15倍。
上述双层结构滤膜的优点在于，上层微孔板中微孔尺寸允许流经的细胞悬液中的细胞进入，而被下方的更小尺寸的细胞截留孔截留，这样可以阻止细胞悬液中的其他细胞再进入微孔中。从而，可以在一个微孔中仅捕获一个细胞，从而实现稀有细胞的单细胞的分离。
图3是本发明实施例1中使用的双层结构滤膜的示意图。图3的左边部分为滤膜俯视图，其中70微米微孔中心位置的黑点对应的下层微滤膜的5微米细胞截留孔。图3的右上部位孔部分的放大图，右下部为孔部分的纵向截面放大图，其中示出上层微孔板由硅片形成，下层微滤膜可由厚度仅1微米的氮化硅形成。如用细针冲击机械脆性的氮化硅膜，可收获单个的稀有细胞。和图4示出了双层滤膜截留了细胞的照片，其中间的5微米微孔上有一个细胞(注：滤膜上形成了两个气泡)。该照片来自实施例1的细胞富集过程。
下面以富集外周血中循环上皮细胞为例，描述根据本发明的稀有细胞富集方法。
首先通过密度梯度离心去除血液中的红细胞及部分白细胞，取单个核细胞层与修饰了CD45抗体的免疫磁球孵育(CD45是白细胞表面共同抗原)。在本发明稀有细胞富集装置1的细胞筛选通道C中加入Hank平衡盐溶液，然后从进样口4加入经过免疫磁球孵育的细胞悬液，并从抽气口8抽负压以抽吸装置1内的细胞悬液，细胞悬液中的白细胞在经过双层套筒中间的区域细胞筛选通道C时被梯度磁场吸附于磁性部2的管壁，而剩余细胞则流过该通道C，经出样口5最终被截留于滤膜7上。
上述实施方式的优点在于(1)针对稀有细胞的负选方法一般需要将绝大多数细胞从细胞悬液中分离出去，如何确保在分离这些细胞的过程中不将靶细胞裹挟在内从而造成损失是关键。本发明将所有细胞排成单层或单列，顺次通过磁场捕获区域，这样每个细胞在从体系中分离出去的时候并不会影响到其他细胞，也不会将靶细胞裹挟在内从而造成其损失，因此在本发明中设计了间距很小的双层套管结构将液层变得很薄，同时由于细胞悬液已充分稀释，这样在双层套管中间流动的细胞悬液中的细胞能够接近单层，从而在分离过程中使细胞之间互不干扰；(2)在绝大部分细胞从细胞悬液中分离后，剩余的极少数目细胞悬于较大体积液体中，传统的通过离心弃上清来浓缩靶细胞的方法极易导致在吸取上清液的时候丢失靶细胞，而使用小孔径滤膜则能够有效的截留细胞悬液中所有靶细胞，同时滤去尺寸较小的游离磁球。以上所述的两个优点解决了通过负选富集稀有细胞时容易导致稀有细胞丢失的两个关键问题，因此能获得较高的稀有细胞回收率，这也正是本发明的创新之处。
以下结合实施例对本发明的方法做进一步说明，以更好地理解本发明的装置和方法。
实施例1
富集人外周血中循环上皮细胞
(1)血液样本的预处理
将2毫升全血进行密度梯度离心以提取单个核细胞层，其中所使用的密度梯度离心液为Stemcell公司的LymphoprepTM(#07801)，密度梯度离心管为Stemcell公司的SepMateTM-15(#15415)，所提取的单个核细胞层用稀释液(Hank平衡盐溶液+0.1％牛血清白蛋白+5mM抗凝剂EDTA)进行稀释，并根据所获得的每一个白细胞加入100个免疫磁球的比例加入CD45抗体标记免疫磁球(尺寸约为1微米)，混合孵育1小时。
(2)去除样本中剩余白细胞
在循环上皮细胞富集装置中加入稀释液至梯度磁铁上方，然后将与免疫磁球孵育的细胞悬液用稀释液进一步稀释至15毫升后加入本发明的稀有细胞富集装置1中，启动泵通过负压以抽吸装置内的细胞悬液，细胞悬液中的白细胞在经过双层套筒中间的区域时被梯度磁场吸附于筒内壁上，而剩余细胞则流过该区域并最终被截留于磁铁下方的滤膜上，并用2毫升Hank平衡盐溶液进行清洗。
其中，所用稀有细胞富集装置1的结构如图1和2所示，其具体结构参数和操作参数如下：
结构参数：通道C的高度为10厘米，内管2A的直径为5厘米，通道C的宽度(即内外管间距)为0.5毫米；
操作参数：细胞悬液的细胞密度约为40万/毫升，负压力产生的进料速度为1毫升/分钟。
(3)循环上皮细胞的染色
将滤膜取出，在滤膜上加入100微升4wt％多聚甲醛水溶液，孵育15分钟以固定滤膜上的细胞。固定完成后，在滤膜上加入PBS缓冲液清洗滤膜，同时在滤膜下方用海绵吸去多余缓冲液，然后在滤膜上加入100微升0.2wt％Triton X-100细胞透膜液，孵育15分钟以增加循环上皮细胞细胞膜对染色剂的通透性。透膜完成后，用PBS缓冲液清洗滤膜，然后在滤膜上加入100微升封闭液(PBS缓冲液，包含10wt％山羊血清与3wt％牛血清白蛋白)对经固定透膜的细胞进行封闭，减少染色剂的非特异性结合，降低荧光信号的背景噪声。常温封闭1小时后，用PBS缓冲液清洗，然后加入100微升染色液(FITC荧光素标记的anti-pan-CK抗体和APC荧光素标记的anti-CD45抗体按体积比1:1配置的混合液)，常温孵育2小时，再用PBS缓冲液清洗去除多余的染色液，最后加入100微升核染色试剂DAPI(20μg/mL)对细胞核进行染色，待PBS缓冲液清洗后完成循环上皮细胞的染色。
(4)循环上皮细胞的鉴定
将步骤(3)经染色处理的滤膜在荧光显微镜下观察，依次选择CY5、FITC和DAPI的滤玻片，观察通道表面荧光颜色，显蓝色则DAPI+，不显蓝色则DAPI-，显绿色则CK+，不显绿色则CK-，显红色则CD45+，不显红色则CD45-，根据荧光显色，当DAPI+/CK+/CD45-且满足一定形态学特征的为循环上皮细胞，DAPI+/CK-/CD45+的为白细胞，DAPI-的为无核红细胞或其他背景信号，由此可对所有的循环上皮细胞进行计数，从而获得外周血样本中循环上皮细胞的数目。
实施例2
灵敏度与稳定性实验
将5、10、50、100个结肠癌肿瘤细胞HCT116用染料Vybrant DiI(LifeTehnologies)染色后各掺入1毫升健康人血液中，然后用实施例1的方法捕获肿瘤细胞，每个实验重复3次。捕获结束后直接用荧光显微镜计数芯片中的HCT116细胞来计算捕获效率和实验偏差。结果表明：掺入5、10、50、100个肿瘤细胞所对应的捕获效率与实验偏差分别为73±12％、77±12％、79±6％、78±4％，能够达到临床样本检测所需的灵敏度与稳定性。
实施例3
单细胞回收与测序实验
将100个非小细胞肺癌细胞H1975用染料Vybrant DiI(Life Tehnologies)染色后掺入1毫升健康人血液中，然后用实施例1的方法捕获肿瘤细胞，其中回收细胞的微滤膜使用的是如图3所示的具有双层结构的微滤膜，其底部为厚度仅1微米的氮化硅薄膜。捕获结束后直接用荧光显微镜计数滤膜上的H1975细胞的位置，并通过细针冲击H1975细胞所在微孔底部的机械脆性的氮化硅膜，使整个氮化硅薄膜碎裂连同细胞掉入位于其正下方用于细胞回收的384孔板的孔中，其中孔中事先添加了4微升磷酸缓冲液。然后将细胞裂解，并采用REPLI-g Single Cell Kit(Qiagen，USA)对单细胞全基因组进行放大。具体步骤为，在含有H1975细胞的孔中加入3微升变性液65℃高温孵育10分钟后，加入3微升终止缓冲液终止变性。然后，依次加入29微升反应液、2微升phi29DNA聚合酶，并补水至体积50微升，30度反应8小时，最后65℃高温继续反应3分钟使酶失活，终止整个放大过程。酚氯仿乙醇沉淀进行提纯后用于后续的目的基因扩增。
我们检测EGFR基因20外显子中的L858R突变以及21外显子中的T790M突变，使用的引物为EGFR 20F(CTTTATCCAATGTGCTCCTC)、EGFR 20R(TCTCCCTTCCCTGATTACCT)、EGFR 21F(TTCGCCAGCCATAAGTCCT)以及EGFR 21R(TCATTCACTGTCCCAGCAAG)，并选择退火温度59℃，30个循环。实验结果显示，所回收的H1975细胞成功扩增出EGFR基因的20、21外显子，并通过Sanger测序检测到H1975细胞所具有L858R和T790M突变，从而证明了该技术的可行性。
Claims (10)
1.一种稀有细胞富集装置，其包括：
细胞筛选部分，其包含形成在两个相对表面之间的细胞筛选通道，两个相对表面中的至少一个表面为磁性吸附表面，细胞筛选部分的上、下两端分别形成有与细胞筛选通道液体联通的进样口和出样口，
其中所述细胞筛选通道的厚度设置为，当细胞悬液流经时形成为使得细胞基本上以单层分布的薄液层，从而结合了免疫磁球的多数细胞在所述细胞筛选通道内被吸附到所述磁性吸附表面时避免裹挟稀有细胞，
所述装置还包括：
细胞收集部分，其包含过滤单元，其可拆卸地设置于所述细胞筛选部分的下游，以截留未被磁性吸附的稀有细胞。
2.如权利要求1所述的稀有细胞富集装置，其中所述细胞筛选部分包含具有磁性吸附表面的磁性部及具有非磁性吸附表面的非磁性部，
其中所述磁性吸附表面以及所述非磁性吸附表面分别构成所述两个相对表面中的一个，且
其中沿所述细胞筛选通道内细胞悬液的流动方向，所述磁性部的磁性逐步增强，以在所述磁性吸附表面均匀吸附结合不同数量免疫磁球的所述多数细胞。
3.如权利要求2所述的稀有细胞富集装置，其中所述磁性部包括内管和容纳其中的磁体，所述非磁性部为套着所述内管的外管，所述细胞筛选通道界定在所述内管的外表面与所述外管的内表面之间。
4.如权利要求1或2所述的稀有细胞富集装置，其中所述过滤单元包括具有细胞截留孔的微滤膜，该细胞截留孔的孔径为3-8微米。
5.如权利要求1或2所述的稀有细胞富集装置，其中所述过滤单元包括双层结构的滤膜，该滤膜的上层为具有微孔的微孔板，下层为具有细胞截留孔的微滤膜，所述微孔的尺寸设置为允许所述稀有细胞通过，而所述细胞截留孔的尺寸设置为不允许所述稀有细胞通过，且所述微孔的孔径为所述细胞截留孔的5-20倍；
且其中所述微滤膜的细胞截留孔位于所述微孔板的对应微孔的下方，用以截留进入微孔中的稀有细胞。
6.如权利要求5所述的稀有细胞富集装置，其中所述细胞截留孔的孔径为4-6微米，且所述微孔的孔径为所述细胞截留孔的8-15倍。
7.如权利要求1或2所述的稀有细胞富集装置，其中所述细胞筛选通道的厚度为0.1毫米至5毫米。
8.一种利用权利要求1-7任一项的稀有细胞富集装置来富集稀有细胞的方法，包括：
制备包含多数细胞和稀有细胞的细胞悬液，其中所述多数细胞结合有免疫磁球；
将所述细胞悬液加入所述稀有细胞富集装置的进样口，以使所述细胞悬液以细胞基本上呈单层分布的薄液层形式流过所述磁性吸附表面，其中结合了免疫磁球的多数细胞被吸附到所述磁性吸附表面；及
用微滤膜截留细胞悬液中未被吸附的稀有细胞，以收集未被吸附的稀有细胞。
9.如权利要求8所述的方法，其中沿所述细胞悬液的流动方向，所述磁性表面的磁性逐步增强，以在所述磁性吸附表面均匀吸附免疫磁球结合数量不同的所述多数细胞。
10.如权利要求8或9所述的方法，其中所述稀有细胞为外周血中的循环上皮细胞、循环内皮细胞或孕妇外周血中的胎儿有核红细胞；并且/或者所述多数细胞为结合了免疫磁球的白细胞。
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