CN202011883U - 用于捕获和分离目标细胞的装置 - Google Patents

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阿什利·A·鲍威尔
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斯蒂芬妮·S·杰弗里
罗纳德·W·戴维斯
迈克尔·明德里诺斯
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Abstract

本文描述自动的自动机械装置，其分离具有极高纯度的循环肿瘤细胞(CTC)或其它生物结构。该装置使用被可移动的塑料套管包覆的强力磁棒。这些棒扫遍血液样品，捕获例如标记有与磁响应性颗粒(例如超顺磁珠)连接的抗体的癌细胞。在完成捕获规程之后，磁棒进行几轮的清洗，以去除所有的污染血细胞。通过从套管拆除磁棒将捕获的目标细胞释放到最终捕获溶液中。另外，通过本装置捕获的细胞当在捕获后培养时存活力没有下降。捕获的细胞处于适合进行遗传分析的状态。本实用新型还公开了用于单细胞分析的方法。自动化使得本装置可以以高通量进行操作。

Description

用于捕获和分离目标细胞的装置
发明人： 
Ronald W.Davis；Stefanie S.Jeffrey；Michael N.Mindrinos；R.Fabian Pease；Ashley Ann Powell；AmirAli Hajhossein Talasaz 
对相关申请的交叉引用 
本申请要求提交于2007年12月12日的美国临时专利申请第61/013,238号的优先权，并在此将其全文并入作为参考。 
政府支持的声明 
本发明是在加利福尼亚乳腺癌研究项目(California Breast Cancer Research Program)拨款号：11IB-0175(SPO#33394)和国家健康研究中心的国家人类基因组研究中心(National Human Genome Research Institute of the National Institutes of Health)，拨款号P01HG000205的支持下完成的。美国政府对于本发明具有特定的权利。 
相关序列表、计算机程序或光盘 
无 
发明背景 
发明领域
本发明涉及细胞分离领域，包括从外周循环分离细胞、对感兴趣的细胞进行磁标记，以及使用自动化装置固定和分离活的标记的细胞用于进一步的检测和培养。
相关技术
背景
利用当前的技术，可以对来自乳腺癌患者的血液中存在的循环肿瘤细 胞进行计数并且预测疾病的演变[1，2]。然而，由于缺少关于循环的肿瘤细胞群的额外信息，当前的方法无法为指导治疗或开发新型疗法提供启示。当前的靶向治疗(targeted treatment)是基于乳腺癌亚型例如Her2/neu或雌激素受体(ER)状态，其仅关注于原发性肿瘤的亚型[3，4，5]。最近的研究显示，与原始的原发性肿瘤相比，部分乳腺癌肿瘤的转移具有不同的Her2和ER状态[6，7，8，9]。通过分析循环肿瘤细胞(circulating tumor cell)(CTC)的遗传特征，不但可以使治疗靶向原发性肿瘤，也可以靶向可能促成和充当转移的代替标志的细胞，从而提高具有转移性疾病的妇女的存活率。
CTC可以通过相对无创的采血(non-invasive blood draw)来收集。然而，分离、纯化和表征这些细胞被证明是具有挑战性的。几种当前的技术可以从患者的血液样品中分离并计数循环肿瘤细胞。另外，也可以评价两种或三种生物标志的表达。然而，尽管在这些步骤过程中富集了CTC，其通常会被血细胞严重地污染，可能不是活的，或者RNA被严重减少(compromise)，使得难以可靠地测量基因的表达或同时测量多种基因的表达。下述的自动装置可以获得完全纯化的活的CTC。与多重qRT-PCR(multiplex qRT-PCR)结合，分析来自从患有转移性乳腺癌的患者血液中分离的单一CTC的基因的表达水平。
因此，当前的技术从血液中部分纯化了CTC，但是仍然具有其它血细胞的残留污染。一些技术也固定或透化(permeabilize)CTC，使它们不适合于下游的微阵列分析或体外和体内的生物学研究。
对CTC生物学的定义仍然不足，因为大多数研究仅评价了CTC负担(CTC burden)。描述CTC的特征是一个新生的领域；与计数不同，特定用于多基因分子分析的CTC的分离出于多种生物学上和技术上的原因是具有挑战性的。可能是由于血流中对CTC的机械应力和细胞毒性化疗的化学影响，细胞是脆弱的。另外，CTC是极为稀少的。例如，81％的转移性乳腺癌患者在含有约1010个血细胞的7.5cc管中会含有少于10个的CTC。在现有可利用的平台中阻碍CTC基因表达分析的技术因素包括细胞固定和透化、固定化、以及最为重要的血细胞的污染。在荧光标记CTC之前进行的CTC固定和透化可以在结构上修饰RNA并且影响细胞生存力。将CTC固定在例如载玻片、滤纸或者微柱(micropost)等的基质上限制单细胞操作。最终，甚至在富集之后，CTC可能会被数以千计混淆表达分析的白细胞(white  blood cell，WBC)污染，需要生物信息学技术去除非CTC基因表达。因此，还有待进行在单个人类CTC中直接同时分析多种基因目标的方法。
某些商业化的技术使用免疫磁性富集。市售产品包括 
Figure DEST_PATH_GSB00000532855900031
Figure DEST_PATH_GSB00000532855900032
系统和CellSearchTM Circulating 
Figure DEST_PATH_GSB00000532855900033
Cell试剂盒(Immunicon Corporation，Huntingdon Valley，PA)，MACS separation 
Figure DEST_PATH_GSB00000532855900034
(Miltenyi Corporation，Bergisch Gladbach，Germany)以及 自动细胞分离器(StemCell Technologies，Vancouver，Canada)。在这些技术中，将血液中的上皮细胞用磁性颗粒标记，所述磁性颗粒附着在靶向上皮细胞表面标志(通常为EpCAM)的抗体上。对血液进行处理并且外部磁体将上皮细胞保持在管的侧面，同时将其它的血细胞稀释和吸走或者通过柱洗提。然后剩余的上皮细胞可以用于免疫细胞化学分析，还是在1000-10000个WBC中。由于严重的单核细胞污染(其核酸或者蛋白质会压制(overwhelm)任何后续的CTC分子分析)，大部分分析染色并计数细胞，或有限表征一种或两种免疫染色。
具体专利和出版物
1976年7月20日授权的Giaever的题目为“Magnetic separation of biological particles(生物颗粒的磁分离)”的美国专利3,970,518公开了如下方法和装置：其中使要从混合群体中分离的特定细胞群与小型磁性颗粒或球相接触，为所述小型磁性颗粒或球预先提供了针对这种所选择群体的抗体的单分子涂层。当磁性颗粒进入到由容器底部的线圈形成的场中，在液体不会受到影响并且离开容器时，该磁性颗粒被捕获并且固定。
2006年10月24日授权的Luxembourg等人的题目为“Purification of antigen-specific T cells(抗原特异性T细胞的纯化)”的美国专利7,125,964公开了使用涂覆有重组MHC I类分子的磁珠捕获、纯化和扩张抗原特异性T淋巴细胞的方法。发明者利用了生物素化(biotinylated)MHC Class I分子在Aaidin-涂覆磁珠上的附着。
1993年4月6日授权的Liberti等人的题目为“Apparatus and methods for magnetic separation(用于磁分离的设备和方法)”的美国专利5,200,084公开了磁性颗粒悬浮于其中的非磁性测试介质中分离胶体磁性颗粒的磁分离装置和方法。该分离器包含：盛装非磁性测试介质的容器，基本上在容器的测试介质中设置的一条或多条磁线，以及在测试介质中产生磁场梯度的外 磁体(如该专利的图1的31所示)。根据该发明的方法，将盛装测试介质的容器放置在分离器中，产生磁场梯度，该磁场梯度有效地引起磁性颗粒吸引到磁化线周围的区域中并且粘附到所述线上。
1998年11月17日授权的Bienhaus等人的题目为“Method of magnetically separating liquid components(磁分离液体组分的方法)”的美国专利5,837,144公开了如下将液体组分与其它组分分离的方法：将该成分固定于容器中悬浮的磁性颗粒上，将磁性装置浸没于容器中，同时通过由非磁性材料制成的保护套管(protective sleeve)将所述装置与液体分开。选择该保护套管使得其外表面总是与容器的内表面间隔大约相同的距离。
2002年10月22日授权的Korpela的题目为“Magnetic particle transfer device and method(磁颗粒转移装置和方法)”的美国专利6,468,81公开了用于传递的类似于移液管的装置，该装置适合用于捕获和释放结合有固定化物质的微粒，其包含磁体和可伸展膜(extendable membrane)，可成形膜(shapable membrane)或者磁体涂层，由此紧压磁体表面的膜或涂层使磁体与微粒分开，但是基本上不削弱指向微粒的磁场(参照该专利的图1D和1E)。
2007年11月1日公开的Korpela等人的题目为“Method and a Device for Treating Microparticles(用于处理微粒的方法和装置)”的美国专利申请20070251885公开了通过如下方式操作微粒的方法，即对于微粒在同一容器中进行至少两步处理步骤而不用将颗粒移到另一容器。这可以通过使磁体在铁磁性管中按照如下方式移动来进行：即其完全在试管中，因此磁体的效率是不重要的或不存在的，或者其也可以部分或者完全在管外，因此磁体的效率和收集区域与磁体的突出部分相关。
发明内容
下述简要的概述不意在包括本发明所有的特征和方面，也不暗示本发明必须包括在下述概述所讨论的所有特征和方面。
在某些方面，本发明包括捕获和分离细胞的方法，其包括：(a)使含有稀有目标细胞(rare target cell)和污染细胞(contaminant cell)的样品与对于所述稀有目标细胞具有亲和力的磁响应性颗粒(magnetically responsive particle)混合，从而制备具有与稀有目标细胞结合的磁响应性颗粒的溶液；(b)使具有非粘附性套管(non-adherent sleeve)的磁性部件(magnetic member)与所述溶 液接触；(c)在所述磁性部件和溶液之间制造连续相对运动，同时磁性部件产生穿过非粘附性套管的磁场，从而使得与稀有目标细胞结合的磁响应性颗粒被选择性地捕获在所述非粘附性套管上；(d)使含有捕获的稀有目标细胞的磁性部件与回收溶液接触；(e)基本上去除由磁性部件产生的穿过非粘附性套管的磁场，从而使得与稀有目标细胞结合的磁响应性颗粒释放到回收液中。
在某些方面，本发明包括从混合细胞群中捕获和分离目标细胞的装置，其中，用磁响应性材料标记所述目标细胞从而形成标记的目标细胞，所述装置包含(a)具有尖端(tip)和另一与致动器(actuator)相连接的末端的磁性部件；(b)防止细胞与磁性部件直接接触的、在磁性部件和混合细胞群之间的套管，所述套管是非磁性的并且对于混合细胞群中的细胞是非粘附性的；(c)所述套管可藉由致动器与磁性部件分离，致动器引起磁性部件和套管之间的运动，由此使该磁性部件或多或少地移动到套管中；以及(d)所述致动器被这样构建并布置从而在装置中引起(i)磁性部件和混合细胞群之间的相对搅拌运动，以使得磁性部件与混合细胞群中的大部分细胞接触，和(ii)引起磁性部件进入或移出容器的运动，以从混合细胞群中回收目标细胞。在此使用的术语“套管”是指可以适配并闭合以完全覆盖与细胞相接触的磁性部件区域的覆盖物。相对搅拌运动、进入和移出套管的运动以及进入和移出容器的运动优选通过将致动器设置在用于x-y-z移动的自动机械(robotic mechanism)上来实现，这样的自动致动器在本领域中已知用于其它用途。
在(a)中的磁性部件可以是棒，其具有至少为4mm的直径以产生高磁场强度，并且具有用于产生高磁梯度的锥形尖端(tapered tip)。尖端的磁梯度可以用于在尖端附近的较小区域中聚集磁场，所述尖端在使用的容器中并且与目标细胞相接触。已经发现磁性部件具有渐缩的尖端可能是有利的。其可以是圆形的或者具有复合的形状。另一个方面，该磁性部件在尖端处所具有的场强至少为0.2～1特，或约0.5特。通过其它方式测量，该磁性部件可能具有至少70磅的扯离强度(pull strength)。在某些方面，该装置包括使用稀土磁体。因此该磁性部件可以包含钕、铁和硼(NIB磁体)。套管材料是非粘附性的，并且基本上可以由选自乙烯基聚合物(vinyl polymer)、顺磁性金属、陶瓷材料和聚甲基丙烯酸羟乙酯(polyHEMA)中的材料构成。所述乙烯基聚合物可以是医用级别的PVC。为了实现有效的扫集(sweeping)，该致 动器可以引起轨道运动(orbital movement)以使磁性部件与大部分细胞接触。轨道运动可以是，例如，向外扩展的同心圆，其向外扩展直到接近容器壁。该装置可以包括(在使用过程中可以使用)一个或多个用于盛装样品的、用于盛装清洗溶液的和用于盛装从混合细胞群中分离之后的目标细胞的容器。在某些实施方式中，存在分别用于盛装样品、清洗溶液和目标细胞的容器。与套管类似，可以设计使容器含有对于目标细胞是非粘附性的材料。不同于紧密接近于磁性部件的容器，该容器可以为盛装样品限定一个开放池。该池会具有明显比磁性部件的横截面积大的表面积，并且没有在扫集过程中使样品移动的外部手段。这样促进了搅拌或扫集。致动器可以包括引起磁性部件以同心圆扫遍池中的组件。在某些实施方式中，可以仅有一个磁性部件，或在每个容器中具有一个磁性部件的阵列。该装置可以含有由单一致动器控制的多个磁性部件。
该装置还可以包含用于进一步处理残留在清洗溶液中的纯化的目标细胞的设备。该装置还可以包含用于从目标细胞的收集品中提取出单个目标细胞的探针，该目标细胞的收集品是在去除了污染细胞后分离的。进一步处理设备还可以包含安装有图像识别软件程序并控制探针的计算机。该探针可以靶向目标细胞的浓缩物，该浓缩物是在使用磁体浓缩回收或清洗容器中的细胞时得到的。
在某些方面，本发明包括方法。其包括用于在样品中捕获和分离完整的、稀有目标细胞的方法，所述样品具有目标细胞和污染细胞的混合细胞群，其中使用磁响应性材料标记目标细胞从而形成标记的目标细胞，该方法包括：(a)使用对目标细胞特异性的标记来标记样品，所述标记是磁响应性的，从而形成标记的样品；(b)使标记的样品与伸展到样品中的部件相接触，并且该部件包含由非磁性的、非粘附性的套管所覆盖的强磁体；(c)使所述部件扫集经过样品从而使得细胞附着在套管上；(d)清洗附着有细胞的套管从而去除未经标记的细胞；(e)使磁体与套管分离，从而将标记的细胞从套管上去除；以及(f)收集标记的细胞从而形成含有珠和标记的细胞的组合物。术语“清洗/洗涤”可以包括简单地将在棒上结合的细胞浸没在无细胞的溶液中，和/或将附着在套管上的细胞移至无细胞的溶液中的步骤，释放结合的细胞和再次捕获所述细胞。释放和再次捕获步骤已经用于目前举例的方法中。
本方法还可以包括对分离细胞(例如CTC)的进一步处理。其可以包括从多个珠(或单个珠)分离单个标记的细胞的步骤。该方法可以包括使用特定细胞表面标志，例如HLA标志(例如HLA-A2)，上皮细胞表面标志，例如EpCAM，或者干细胞标志例如CD44或CD96。
如下所述，所述方法不需要预处理或也可以进行预处理，在某些方法实施方式中，样品为人外周血，对其仅进行最低限度的处理，例如稀释和抗凝处理。如下所述，该目标细胞可以为稀有细胞，例如CTC。在某些方面，本发明的方法可以包括如在步骤(d)中所述的多重清洗步骤。在某些方面，本发明的方法可以包括从经分离的目标细胞中提取出完整的遗传物质的步骤。该方法还可以包括检测提取的遗传物质中特定基因的表达的步骤。分析遗传物质在对来自指定患者(given patient)的个体CTC的研究中可能是有用的。要分析表达水平的基因可以包括GAPDH、β-肌动蛋白、大核糖体蛋白(big ribosome protein)(RPLPO)(前述为持家基因)、CRYAB、EGFR、FOXA1、CD44、ESR1(ER)PGR(PR)，和Myc、Ras、BRCA1、BRCA2、APC和p53的突变形式。在某些方面本发明的方法可以包括，检测波形蛋白基因的表达水平，其中波形蛋白的表达增加指示推定的间充质CTC。本装置和方法能够制备相对大量的纯化的CTC。在某些方面，本发明可以包括分离的活CTC群，其具有至少10个细胞，且具有至少90％纯度的CTC。如上所述，本分离方法的CTC是活的，并且其没有变化的基因表达模式。在此列举的组合物是乳腺癌细胞的CTC。已经发现目前制备的组合物包含推定的MSC(间充质样癌症干细胞(mesenchymal-like cancer stem cell))。
本发明的一个方面包括捕获和分离细胞的方法，其包括：(a)使含有稀有目标细胞和污染细胞的样品与对于所述稀有目标细胞具有亲和力的磁响应性颗粒混合，从而产生具有与稀有目标细胞结合的磁响应性颗粒的样品溶液；(b)使具有非粘附性套管的磁性部件与所述样品溶液接触；(c)在磁性部件和样品溶液之间制造连续相对运动，同时磁性部件产生穿过所述非粘附性套管的磁场，从而使得与稀有目标细胞结合的磁响应性颗粒被选择性地捕获到所述非粘附性套管上；(d)使具有捕获的稀有目标细胞的磁性部件与回收溶液接触；(e)基本上去除由所述部件产生的穿过非粘附性套管的磁场，从而使得与稀有目标细胞结合的磁响应性颗粒释放到回收液中。
在一些实施方式中，所述非粘附性套管包含磁性部件上的套管，并且 基本上去除穿过所述非粘附性套管的磁场的步骤(e)包括将磁性部件从所述套管的至少一部分中移出。
在一些实施方式中，所述磁性部件包含电磁体，并且基本上去除穿过所述非粘附性套管的磁场的步骤(e)包括电磁体的去磁化。
在一些可选的实施方式中，使所述磁性部件在流体流动通道中保持静止，并且磁性部件和样品溶液之间连续的相对运动是通过使样品溶液流过磁性部件而产生的。
在本发明的某些方面，磁性部件和样品溶液之间的连续相对运动产生非湍流状态的速度(a velocity in the non-turbulent flow regime)。在某些实施方式中，磁性部件和样品溶液之间的连续相对运动具有的雷诺值为0.1～100。在一些实施方式中，磁性部件和样品溶液之间的连续相对运动具有的速度为0.1mm/秒～1mm/秒。在一些实施方式中，磁性部件具有的表面场强为0.2特～1特。在一些实施方式中，磁性部件具有的表面场强为0.2特～1特，并且磁性部件和样品溶液之间的连续相对运动的速度为0.1mm/秒～1mm/秒。
在一些实施方式中，运用连续相对运动从而使得大部分样品溶液可以接近(access to)磁性部件。
在一些实施方式中，所述非粘附性套管包含选自乙烯基、含氯氟烃聚合物和硅氧烷的聚合物。在一些实施方式中，所述非粘附性套管包含聚氯乙烯(PVC)。
在一些实施方式中，所述方法还包括在步骤(c)之后使具有捕获的稀有目标细胞的磁性部件与清洗液接触的步骤。
本发明的一个方面包括用于捕获和分离细胞的方法，其包括：(a)使具有非粘附性套管的磁性部件与含有稀有目标细胞和污染细胞的样品溶液相接触，其中所述稀有细胞占样品中细胞的小于0.1％，并且其中部分或全部稀有目标细胞与磁响应性颗粒结合；(b)相对于样品溶液移动所述磁性部件来捕获与磁响应性颗粒结合的稀有目标细胞；以及(c)使稀有目标细胞从非粘附性套管上释放到回收溶液中，由此捕获率大于35％，且纯度高于99％。
在一些实施方式中，所述样品溶液为血液，且稀有细胞以少于5千万分之一存在于样品溶液中，而捕获率大于75％，且纯度高于90％。在一些实施方式中，样品溶液为血液，且稀有细胞以少于5亿分之一存在于样品溶液中，而捕获率大于35％，且纯度高于25％。在一些实施方式中，高于 80％的回收的稀有目标细胞为完整的。在一些实施方式中，高于80％的回收的稀有目标细胞为活的。
本发明的一个方面包括用于捕获和分离细胞的装置，其包含：(a)用于盛装包含稀有目标细胞和污染细胞的样品溶液的样品容器，其中一些或全部稀有目标细胞与磁响应性颗粒结合；(b)具有非粘附性套管的磁性部件；(c)用于盛装回收溶液的回收容器；(d)用于引起磁性部件进行如下连续相对运动的致动器：(i)在容器之间的相对运动，(ii)进入和离开容器的运动，以及(iii)在样品容器内在至少两个方向上的运动，以提供选择性捕获结合了稀有细胞的磁响应性颗粒；和(e)用于当磁性部件在样品溶液中时产生穿过非粘附性套管的磁场，而当非粘附性套管在回收溶液中时基本上去除穿过非粘附性套管的磁场的机制(mechanism)。如上所述，样品容器可以设置为使盛装的样品成为一个池。
在一些实施方式中，所述非粘附性套管包含磁性部件上的套管，并且用于基本上去除穿过所述非粘附性套管的磁场的机制包括将磁性部件从所述套管的至少一部分中移出。
在一些实施方式中，所述磁性部件包含电磁体，并且用于基本上去除穿过非粘附性套管的磁场的机制包括去磁化磁性部件。
本发明的一个方面包括用于从混合细胞群中捕获和分离目标细胞的装置，其中所述目标细胞用磁响应性材料标记形成标记的目标细胞，该装置包含：(a)具有尖端并且另一末端与致动器相连接的磁性部件；(b)防止细胞与磁性部件直接接触的、在磁性部件和混合细胞群之间的套管，所述套管是非磁性并且对于混合细胞群中的细胞是非粘附性的；(c)所述套管可藉由致动器与磁性部件分离，致动器引起磁性部件和套管之间的运动，由此使该磁性部件或多或少地移动到套管中，以及(d)所述致动器被这样构建并布置从而在装置中引起(i)磁性部件和混合细胞群之间的相对搅拌运动，以使得磁性部件与混合细胞群中的大部分细胞接触，和(ii)引起磁性部件进入或移出容器的运动，以从混合细胞群回收目标细胞。
在一些实施方式中，所述磁性部件为棒，其具有1mm～10mm的直径以产生高磁场强度，并且具有用于产生高磁梯度的渐缩的尖端。在一些实施方式中，所述磁性部件具有渐缩的尖端。在一些实施方式中，所述磁性部件在尖端处具有至少0.5特的场强。在一些实施方式中，所述磁性部件为稀 土磁体。在一些实施方式中，所述磁性部件具有至少70磅的牵引力。在一些实施方式中，所述磁性部件具有0.2～1特的表面场强。在一些实施方式中，所述磁性部件包含钕、铁和硼。
在一些实施方式中，所述套管基本上(essentially)由选自乙烯基聚合物、顺磁性金属、陶瓷材料和polyHEMA中的材料构成。
在一些实施方式中，所述磁性部件基本上由钕、铁和硼合金构成。
在一些实施方式中，所述致动器引起轨道运动使磁性部件与大部分细胞相接触。
在一些实施方式中，所述装置还包括一个或多个用于盛装样品、用于盛装清洗溶液和用于盛装从混合细胞群分离之后的目标细胞的容器。在一些实施方式中，存在分别用于盛装样品、清洗溶液和目标细胞的容器。在一些实施方式中，所述容器包含对于目标细胞为非粘附性的材料。
本发明的一个方面包含用于在具有目标细胞和污染细胞的混合细胞群的样品中捕获和分离目标细胞的装置，其中所述目标细胞使用磁响应性材料标记形成标记的目标细胞，该装置包括：(a)用于盛装样品的容器；(b)具有尖端的磁性部件；(c)防止细胞与磁性部件直接接触的、在磁性部件和混合细胞群之间的套管，所述套管是非磁性的并且对于混合细胞群中的细胞是非粘附性的；(d)所述套管可藉由致动器与磁性部件分离，所述致动器引起磁性部件和套管之间的运动，由此使该磁性部件或多或少地移入套管中；以及(e)所述致动器被这样构建并布置以引起(i)在容器中磁性部件和混合细胞群之间的相对搅拌运动，以使得磁性部件与混合细胞群中的大部分细胞接触，以及(ii)引起磁性部件进入和移出容器的运动，以从混合细胞群中回收目标细胞。
在一些实施方式中，所述装置还包含容器，该容器包含具有磁体的部分，该磁体与所述磁性部件的磁性相对，用于在分离的群体的形成中从磁性部件上吸引分离的标记的目标细胞。在一些实施方式中，所述容器限定出用于盛装样品的开放池。在一些实施方式中，所述致动器包括引起磁性部件以同心圆扫遍所述池的组件。在一些实施方式中，所述装置在一个容器中仅含有一个磁性部件。在一些实施方式中，所述装置包括由一个致动器控制的多个磁性部件。
在一些实施方式中，所述装置还包括从目标细胞的收集品提取单细胞 的探针，该目标细胞的收集品是在去除了污染细胞后分离的。在一些实施方式中，所述装置包括安装有图像识别软件程序并控制所述探针的计算机。在一些实施方式中，装置还包括用于将目标细胞从套管去除的磁体。
本发明的一个方面包括用于在样品中捕获和分离完整的、稀有目标细胞的方法，所述样品具有目标细胞和污染细胞的混合细胞群，其中使用磁响应性材料标记目标细胞从而形成标记的目标细胞，该方法包括：(a)使用目标对细胞特异性的标记来标记样品，所述标记是磁响应性的，从而形成标记的样品；(b)使标记的样品与伸展到样品中的部件相接触，并且该部件包含由非磁性的、非粘附性的套管所覆盖的强磁体；(c)使部件扫集经过样品从而使得细胞附着在套管上；(d)清洗附着有细胞的套管从而去除未标记的细胞；(e)使磁体与套管分离，从而将标记的细胞从套管上去除；以及(f)收集标记的细胞从而形成含有珠和标记的细胞的组合物。
在一些实施方式中，所述方法还包括从珠分离单个标记的细胞的步骤。在一些实施方式中，所述标记为针对细胞表面标志的抗体，所述细胞表面标志选自下组：HLA、EpCAM、CD44和CD46。在一些实施方式中，所述样品为人外周血。在一些实施方式中，所述目标细胞为CTC。
在一些实施方式中，强磁体为具有轴向偶极(axial dipole)的稀土磁体，由此将磁性颗粒聚集在磁体的一个细长的末端上。在一些实施方式中，非粘附性套管为聚合物。在一些实施方式中，所述聚合物是选自乙烯基聚合物、含氯氟烃聚合物或硅氧烷的聚合物。
在一些实施方式中，所述方法还包括如下步骤：在去除了磁体后施加与套管相反的磁场以辅助从套管上去除标记的细胞。
在一些实施方式中，所述方法还包括多个如在上述步骤(d)中所述的清洗步骤。
在一些实施方式中，所述方法还包括从分离的目标细胞提取完整的遗传物质的步骤。在一些实施方式中，方法还包括检测提取的遗传物质中某些基因的表达的步骤。
在一些实施方式中，基因选自GAPDH、β-肌动蛋白、大核糖体蛋白(RPLPO)、CRYAB、EGFR、FOXA1、CD44、ESR1(ER)、PGR(PR)，以及Myc、Ras、BRCA1、BRCA2、APC和p53的突变形式。
在一些实施方式中，所述方法包括检测波形蛋白的表达，其中波形蛋 白表达的增加指示(indicate)间充质CTC。
本发明的一个方面包括组合物，所述组合物包含活的CTC的分离群，其具有至少1个细胞，且具有至少25％纯度的CTC。在一些实施方式中，所述CTC为乳腺癌细胞。在一些实施方式中，组合物还包含MSC或推定的MSC。
附图说明
图1A-D为一系列4张表现本发明装置的一个实施方式的示意图，其中使用线型的磁性部件，其中1A显示扫集以获得细胞；1B显示将附着的细胞从介质中提起；1C显示将从1B移出的细胞沉积在不同的介质中；而1D显示使细胞与线分离。
图2A-F为一系列6张示例本发明装置一个实施方式的图。
图3A-E为一系列5张显示扩增点线图的图，其说明了用本发明装置分离的细胞的完整性，指明了15种不同的基因，在含有下列的样品中：(图3A)，0.1ng人参照RNA(reference RNA)；图3B单个MCF7培养细胞；图3C SM014细胞7号；图3D SUBL017细胞18；和图3E SUBL017细胞23。
图4A和B包括显示本装置使用磁棒和塑料套管的实施方式的设计的图片，其中有6个棒和6个套管，并且套管全部连接在套管架(sleeve holder)上，如图4A侧视图所示。如俯视图(图4B)所示，排列套管和棒使得可以对每一个进行操作并且放置到不同的样品容器中。
图5A-F为一系列显示多种磁体设计的概略图，从右到左为图5A：无磁体，图5B：在支持板下的单根棒，图5C：在板下的4节(section)，图5D：在板下的单根细棒，图5E：在壳体中的6节，以及图5F：没有壳体的6节。这些图中的所有磁体在支持板上均具有两个短节。
图6为显示在塑料套管中的磁棒的磁性概况(magnetic profile)。对附着有磁珠的细胞(黑色圆圈)，磁棒产生z方向的磁力，与磁场的不均匀性(non uniformity)(dB2/dz)成比例，因此在z方向上赋予与(dB2/dz)成比例并且与驻留时间(dwelltime)成比例的动量，其中驻留时间取决于以下二者：扫集速度以及从套管的表面伸展到流体中的跨边界层的速度分布。对不带珠的细胞(空心圆圈)，仅有在扫集方向(大箭头)上的横向的力作用在细胞上。为了捕获标记的细胞，横向动量必须足够克服流体对细胞的阻力，从而使其在驻 留时间内到达套管表面。针对这些参数控制磁场强度和扫集速度从而在磁性部件的尖端得到高捕获效率。
图7A-C为一系列3张显示在4个单独的CTC(7A)、白细胞(7B)和参照RNA(7C)中CD-45和β-肌动蛋白的扩增曲线的图。4个单独CTC是从两位患有转移性乳腺癌的女性分离的，并且在7C中使用了0.01ng的人参照RNA。
图8为针对GAPDH表达标准化的对单个CTC的簇分析，显示了不同的CTC群，包括推定的间充质样癌干细胞。刻度线表示ΔCt，较高的ΔCt值表示较低的基因表达。
图9为自动细胞提取系统的示意图，其中可以对细胞簇进行操作以生成单独的细胞。
图10为显示经设计而具有大磁场梯度的磁体排列的示意图。
图11为显示包括流体通道的本发明示例性实施方式的示意图。
图12A-D为显示包括流体通道和磁性部件的本发明的可选示例性实施方式的示意图，所述磁性部件可以插入中空柱(hollow pillar)或从中移出；(A)显示附着之前的细胞；(B)显示出细胞附着在磁性的、带套管(sleeved)的顶部；(C)显示附着细胞的清洗步骤；以及(D)显示释放。
图13A-C为示例在包含流体通道的实施方式中，利用高流速辅助释放和用外部磁体辅助释放的示意图；(A)显示清洗步骤；(B)显示辅助释放；以及(C)显示用外部磁体的辅助释放。
图14为显示磁性部件插入到流体通道的示意图。
具体实施方式
除非另有定义，在此使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域的技术人员所通常理解的含义相同。尽管与在此所描述的方法和材料类似或相当的任何方法和材料可以用于实行或检测本发明，但在此描述优选的方法和材料。通常来说，使用的与细胞和分子生物学以及化学相关的术语，和细胞和分子生物学以及化学技术，为本领域中为人熟知和通常使用的。没有具体限定的某些实验技术通常是按照本领域中已经为人所知的常规方法来进行的，并如在多种综合性的和在本说明书中引用和讨论的更为具体的参考文献中有所描述。
磁分离装置和方法的概述
下述装置可以用于分离和纯化稀有细胞，例如CTC，其通过用磁响应性颗粒标记CTC，然后使用一种或多种永久性磁化的或可磁化的部件用于数轮的细胞捕获和释放(capture-and-release)，所述部件例如具有非粘附性套管(例如可移动套管)的线或棒。因而能够分析和制备分离的CTC。在整个过程中，细胞存活力可以得到维持(没有固定或透化步骤)，并且去除了所有污染的血细胞。因此，这种技术可以从患有转移性疾病的患者中分离活的循环肿瘤细胞(CTC)用于进一步研究，以及分离其它稀有细胞群体。稀有细胞通常是那些在不同种类的细胞群体中占小于约0.1％的细胞。
所述装置可以用于在具有目标细胞和污染细胞的混合细胞群的样品中捕获和分离完整、稀有且存活的目标细胞(在某些实施方式中，所述目标细胞可以包括亚细胞成分或颗粒)。目标细胞可以是稀有的，构成细胞群体中非常小的一部分。例如，罕见肿瘤细胞或胎儿细胞(fetal cell)或干细胞可能存在于成人的外周血中。该方法和装置也可以用于动物或其它生物组织，或细胞培养物。用磁响应性材料标记目标细胞，所述材料可以为铁磁性或顺磁性的珠，或者铁或金的纳米颗粒(nanoparticle)等。顺磁性材料包括，例如铝、镁和铂，并且，如已知的，指不是铁磁性、但仅较弱地被强磁体吸引的材料。铁磁性材料例如镍、钴、纯铁、铁合金、某些稀土元素例如钆、镝等，是受磁体强力吸引的材料，并且是用于磁响应性颗粒的优选材料。
磁响应性颗粒(例如，珠)与目标细胞特异性的配体相连，所述配体通常为抗体，但该配体也可以包括另外的细胞特异性配体，例如蛋白质或脂质。配体的选择可以依赖于将要被分离的目标细胞。本发明的装置意在成为自动化的并自动地或重复地进行某些预先编程的步骤。在一些实施方式中，所述技术包括一个或多个容器或与一个或多个容器一起使用，因所述装置进行的某些步骤涉及完全样品接触，清洗掉污染细胞，以及收集富集的目标细胞群体。设计所述容器从而在某些方面允许扫集经过相对平静的一池样品，所述扫集覆盖大部分、或基本上全部的池表面。该装置包括经构建的磁性部件，例如经构建以获得高磁场强度。这可以为稀土磁体或可磁化的材料，条件是可以获得所需的场强。其可以是电磁体，所述电磁体可以被磁化从而进行捕获且可以被去磁化从而进行释放。磁性部件，在其外表 面上，在会与液体接触的部分具有非粘附性套管。在一些实施方式中，可以适应性地调节磁性部件使其严密地适配包围所述磁性部件的薄的、自承式的(self-supporting)套管，以防止样品细胞与磁性部件的直接接触，所述套管与磁性部件紧密适配，但仍然与磁性部件是可分的，所述套管进一步由对于混合细胞群中的细胞为非粘附性的材料构成。
“非粘附”通常是指细胞(至少90％，优选至少99％)会容易地从套管上洗掉或掉落。细胞粘附到例如塑料等材料上的水平可以通过本领域中已知的方法测定。通常来说，将材料暴露于含有细胞的样品，然后将材料暴露于新鲜的溶液，并测定粘附在材料上的细胞数。例如，可以将塑料片在全血中在室温下温育，例如温育30分钟。然后用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗该片。在清洗之后测定粘附的细胞数来测定细胞的粘附。非粘附性材料通常每平方毫米具有的细胞少于1000个。特别有用的材料甚至会具有更少的细胞，例如，少于100细胞/mm2或少于100细胞/mm2。我们已经发现聚氯乙烯，特别是生物级聚氯乙烯具有少于100细胞/mm2。
在本发明的可选实施方式中，没有去除非粘附性套管，但是对磁性部件进行去磁化从而去除了穿过非粘附性套管的磁场，以使得细胞能够释放。在一些实施方式中，使用第二磁体来促进从非粘附性套管去除细胞。第二磁体可以为，例如，设置在回收容器下面的磁体。此刻从磁性部件的场中释放出来的磁响应性颗粒会被第二磁体所吸引，促进所述颗粒的回收。一种优选的可以作为套管使用的非粘附性材料是生物级PVC，已经发现其为令人惊讶的非粘附性的。非粘附性套管通常为非磁性的，并且“磁力透射性的(magnetically transmissive)”，表示其具有使得磁体的磁力能够几乎不受阻碍地通过套管的材料(例如例举的有机聚合物)以及维度(dimension)。为此，形成的套管通常较薄。通常来说，预期套管会为1～1000μm数量级的，在一些实施方式中，为10-300μm厚，而在一些实施方式中，为约10-30μm厚。该套管可以为能够变形的，从而其可以改变形状来适应插入的磁性部件，例如图14所示。当磁体部件(或者多个部件，存在为多个、平行的具有单独非粘附性套管的部件的可能性)浸没在样品中并且扫遍(sweep through)样品以彻底地吸引稀有细胞，例如在样品中“搅拌”，在一些实施方式中，利用清洗步骤来洗掉被污染的细胞。通过用清洗溶液喷洒或冲洗磁性部件来进行清洗步骤。清洗步骤也可以通过将磁性部件浸没在具有清洗溶液的 容器中来进行。为此，提供用于盛装浸没用清洗溶液的清洗器皿或清洗容器，用于去除污染细胞的同时使目标细胞仍然结合在套管上。清洗容器通常盛装的液体样品的体积大小是为了大流体通量而定的。为此，该容器可以是磁体横截面积的许多倍。即，该磁体的直径可以为0.6cm，而容器(一个或多个)的直径可以是大20～50倍的级别。在一次或多次清洗后，在装置中提供用于盛装去除了污染细胞之后分离的目标细胞的回收器皿或回收容器。为了实现上述动作以及流体的移动，提供用于使磁性部件在容器之间移动、以及进入和移出容器的致动器，从而使磁性部件浸没在混合细胞群中；进入套管和移出套管；以及在样品中在至少两个方向上使带套管的部件扫遍样品。
在此描述的方法和装置可以用于分离循环肿瘤细胞(CTC)，并且可以用于稀有细胞或其它生物结构可以进行用于后续分开和分离的磁标记的任何情况中。现在构建的装置可以例如1小时处理9ml血液并且捕获超过50％的CTC(在掺加实验(spiking experiment)中检测的)。下述装置(包括称为MagSweeper的示例性实施方式)温和地从血液中将目标细胞例如CTC富集108倍。然后可以单独地选取经纯化的细胞用于生化分析。为此，提供用于探测从磁性部件上清洗得到的细胞簇的装置。在此所描述的技术可以获得在其它技术之上更好的捕获率和从混合细胞群中获得的稀有细胞的更好的纯度水平。捕获率通常是指相对于样品中的目标稀有细胞，捕获的目标稀有细胞所占的百分比。纯度通常是指在最终回收的溶液中稀有细胞占总细胞数的百分比，即，在回收的溶液中的(稀有细胞数)/(稀有细胞数+污染细胞数)。在一些实施方式中，从具有混合细胞群的样品，例如从5百万或更多中有约1个的血细胞群，该技术能够达到99.9％、99.99％或100％的纯度。在一些实施方式中，从具有混合细胞群的样品，例如5千万或更多中有约1个的血细胞群，该技术能够达到90％、99％或99.9％的纯度。在一些实施方式中，从具有混合细胞群的样品，例如5千万或更多中有约1个的血细胞群，该技术能够达到90％、99％或99.9％的纯度。在一些实施方式中，从具有混合细胞群的样品，例如从5亿或更多中有约1个的血细胞群，该技术能够达到25％、90％或98％的纯度。
在一些实施方式中，从具有混合细胞群的样品，例如5百万中有约1个、5千万中有约1个、或5亿中有约1个的血细胞群，该技术能够达到 35％的捕获率。在一实施方式中，从具有混合细胞群的样品，例如5百万中有约1个、5千万中有约1个、或5亿中有约1个的血细胞群，该技术能够达到75％的捕获率。在一些实施方式中，从具有混合细胞群的样品，例如5百万中有约1个、5千万中有约1个、或5亿中有约1个的血细胞群，该技术能够达到90％的捕获率。
在一些实施方式中，该技术能够达到的捕获率和纯度的组合优于用当前方法所达到的。在一些实施方式中，从具有混合细胞群的样品，例如5百万或更多中有约1个的血细胞群，该技术能够达到35％的捕获率和99.9％、99.99％或100％的纯度。在一些实施方式中，从具有混合细胞群的样品，例如5千万或更多中有约1个的血细胞群，该技术能够达到35％的捕获率和90％、99％或99.9％的纯度。在一些实施方式中，从具有混合细胞群的样品，例如5千万或更多中有约1个的血细胞群，该技术能够达到35％的捕获率和90％、99％或99.9％的纯度。在一些实施方式中，从具有混合细胞群的样品，例如5亿或更多中有约1个的血细胞群，该技术能够达到35％的捕获率和25％、90％或98％的纯度。
在一些实施方式中，该技术能够达到的捕获率和纯度的组合优于用当前方法所达到的。在一些实施方式中，从具有混合细胞群的样品中，例如5百万或更多中有约1个的血细胞群，该技术能够达到75％的捕获率和99.9％、99.99％或100％的纯度。在一些实施方式中，从具有混合细胞群的样品，例如5千万或更多中有约1个的血细胞群，该技术能够达到75％的捕获率和90％、99％或99.9％的纯度。在一些实施方式中，从具有混合细胞群的样品，例如5千万或更多中有约1个的血细胞群，该技术能够达到75％的捕获率和90％、99％或99.9％的纯度。在一些实施方式中，从具有混合细胞群的样品，例如5亿或更多中有约1个的血细胞群，该技术能够达到75％的捕获率和25％、90％或98％的纯度。
在一些实施方式中，该技术能够达到的捕获率和纯度的组合优于用当前方法所达到的。在一些实施方式中，从具有混合细胞群的样品中，例如5百万或更多中有约1个的血细胞群，该技术能够达到90％的捕获率和99.9％、99.99％或100％的纯度。在一些实施方式中，从具有混合细胞群的样品，例如5千万或更多中有约1个的血细胞群，该技术能够达到90％的捕获率和90％、99％或99.9％的纯度。在一些实施方式中，从具有混合细胞群的样品， 例如5千万或更多中有约1个的血细胞群，该技术能够达到90％的捕获率和90％、99％或99.9％的纯度。在一些实施方式中，从具有混合细胞群的样品，例如5亿或更多中有约1个的血细胞群，该技术能够达到90％的捕获率和25％、90％或98％的纯度。
如在本文它处所述，一种MagSweeper实施方式包括由薄(25μm)非粘附性塑料套(sheath)覆盖的圆底钕磁棒。该塑料材料减少了污染细胞的非特异性结合并且不削弱磁结合。列举的部件被构建成直径约6mm的棒，在棒的末端具有约0.7特的磁通密度。该具有非粘附性套管的磁体以连续运动的方式扫集整个孔(well)，从而使对磁性-标记的细胞的捕获效率最大化。即，使含有混合细胞群的相对较大的体积可以容纳在孔中，与相对较大的直径或宽度相比，该孔具有相对较浅的深度。在一个实施方式中，以预编程序的模式自动化驱动带套管的棒以重叠的同心圆环的模式扫遍含有样品的孔，所述重叠的同心圆环基本上覆盖了孔的整个区域但不刮到孔壁。已经发现在连续相对运动的过程中选择磁性部件相对于溶液的速度(扫集速度)对于最大化以下各项是重要的：(i)细胞捕获效率；(ii)足够的剪切力的应用以使吸附的非磁性标记的细胞脱离；以及(iii)防止破坏稀有目标细胞。最适扫集速度也可以依赖于磁场强度。已经发现约2mm/秒的扫集速度获得了高效的捕获。
磁性部件和样品溶液之间的相对运动或移动通常为连续相对运动。通过将磁性部件放置到溶液中再从溶液中取出所提供的运动是不充分的。该运动通常必须为连续移动，该连续移动产生跨磁性部件的剪切力(shear)，其持续的时间足以使磁性部件与大部分的样品溶液接触。该连续移动通常是在非湍流范围内的温和移动。在连续移动提供了对样品溶液中稀有目标细胞相较于污染细胞的选择性捕获的场合，该连续移动是充分的。
我们已经发现磁性部件和溶液之间具有约0.5mm/秒～约5mm/秒的速度的连续相对运动可提供高捕获效率。在一些实施方式中，使用的速度范围为1mm/秒～4mm/秒。在一些实施方式中，当表面磁场在0.1特～1特的范围内时，磁性部件和溶液之间的速度范围为约0.5mm/秒～约5mm/秒。在一些实施方式中，当表面磁场在0.1特～1特的范围内时，磁性部件和溶液之间的速度范围为约0.5mm/秒～约5mm/秒。在一些实施方式中，这些水平的速度和磁场用于直径为2mm～10mm的磁棒，例如钕磁体。
我们已经发现连续相对移动应当在磁性部件和溶液之间产生速度，所述速度通常应当是使体系处于非湍流状态的速度。非湍流状态是这样的状态，其中目的区域中的溶液流流过而不产生湍流。在一些情况下，可以为层流状态。能够进行控制从而维持非湍流状态的因素在化学工程领域是为人所熟知的。所述因素包括溶液粘度、流动速率、以及几何学因素。尽管不受理论的限制，认为通过保持流速，即磁性部件和样品液体之间的相对移动(其提供一种非湍流状态)，提供充足的剪切力从而清洗掉污染细胞，但是流动不能太剧烈以至于破坏稀有目标细胞，如此在捕获和释放之后产生完整和/或活的细胞。
磁性部件和溶液之间的合适的速度也可以通过雷诺数来表示。雷诺数是化学工程领域中公知的参数。我们已经发现0.1～100的雷诺数能够提供对完整的或活的细胞的高捕获效率。在一些实施方式中，使用0.5～50的雷诺数。在一些实施方式中，使用1～20的雷诺数。在一些实施方式中，雷诺数为0.5～50并且磁场的范围为0.1特～1特。在一些实施方式中，雷诺数为1～20并且磁场的范围为0.1特～1特。在一些实施方式中，这些水平的雷诺数和磁场用于直径为2mm～10mm的磁棒，例如钕磁体。
磁性部件和样品溶液之间的连续相对移动也可用来确保大部分样品可以接近磁性部件，或者大部分的样品可以经历(experience)足以捕获溶液中磁性颗粒的来自磁性部件的磁场。在一些情况下，理想的是大部分样品、多数样品、或者基本上是全部的样品能与磁性部件接触。
例如，在1ml血液中通常有约五十亿个总细胞和一千万个白细胞。如下所述，这种血液样品可含有不同数量的目标细胞，并且这些细胞是使用本发明的装置和方法分离的，所述细胞具有如下的纯度水平：
·循环稀有细胞(例如，胎儿细胞或循环肿瘤细胞)。通常每毫升血液中有5～1000个细胞。利用装置分离时典型纯度范围为50％-99.9％，取决于起始数量。
·干细胞(例如，癌症干细胞)。通常每毫升血液中有～100000个细胞。利用装置分离后的典型纯度范围为98％～100％。
·嗜中性粒细胞(例如，新生儿免疫应答)。通常每毫升血液中有一百万～五百万个细胞。利用装置分离后的典型纯度范围为99％～100％。
捕获-清洗-释放-再捕获的连续循环可以用于减少或者去除未被磁性颗 粒特异性标记的背景污染细胞。在一些情况下，第二或第三轮会改善纯度，但是如此会以一些捕获效率为代价。后续的循环可以用于如下情况，其中稀有目标细胞与污染细胞之比较高，例如高于1比5百万。
模拟了在磁力和流体阻力的影响下的本发明装置和方法的细胞轨迹。不受理论的限制，这些模型表明细胞捕获会在以下情况出现：当通过磁力加速的标记的细胞克服扫集速度和流体在磁体周围流动的相应的粘性阻力(viscous drag force)时。为了寻找磁体周围的捕获区域，开发了作为扫集参数的函数来模拟磁场、流体流动、和标记细胞轨迹的数学模型。通过利用磁棒的有限元模型(finite element model)来计算磁场，发现仅在磁体的圆形尖端附近的磁通量是可观的(＞0.1特)，并且远离磁体后磁通量会迅速下降。该结果强调了使用薄的非粘附性套管从而使来自磁性部件的磁场的减弱最小化并因此改善总体捕获率的重要性。另外，发现与具有未经修饰(钝尖端)的磁体相比，具有圆形尖端的磁体具有增加的(50％)表面磁通密度。为了评价施加在珠上的磁力，基于厂商的大量磁化数据，使用了对于珠的可变磁化率。通过将磁力驱动速度(通过斯托克斯阻力定律(Stoke′s drag law)测定)与流体速度相加来计算标记细胞的运行速度，假设用单个4.5μm直径的磁性珠标记直径10μm的细胞。得到的3-D流体运动对于颗粒捕获有很大影响。如图6所示，在磁体下存在由箭头908之间的点画线表明的捕获平面。在环形的捕获区域中存在间隙，尽管该磁体完成了一个完整的轨道(completed one full orbit)。这是磁性部件(棒)“搅拌”流体的结果，其将颗粒推到磁体的前面。在较高的z-平面，磁场较弱，捕获区域急剧减小。在这里，颗粒大部分围绕磁体运行并且穿过尾流(wake)而不被捕获。因此最好将该装置设计成覆盖至少一个贯穿整个孔的回路(circuit)，并且有利的是可以多次扫遍孔。
就规模来说，磁性速度场的最大设计速度矢量(plotted velocity vector)为7.8mm/秒(在r＝2mm，z＝-2.5mm处)。实际最大值出现在尖端处的磁体表面附近(～12mm/秒)。(c)理想化的流体-多孔磁体(idealized fluid-porous magnet)的侧面捕获边界(Lateral trapping boundaries)是磁体扫集速度的函数。(d)对于理想化的流动(idealized flow)xy-捕获边界在磁体尖端以下1.5mm处(z＝-4.68mm)。(e)对2mm/秒的磁体速度和6mm的轨道半径计算的孔内流体速度。矢量表示在xy-平面上在接近磁体弯曲部分的顶端(z＝-0.2mm)处的瞬 时流体速度，颜色表示流动的大小(magnitude)。流体速度场用于计算颗粒的轨道和捕获时间。(f)在位于磁体下方的xy-平面上(z＝-4.8mm)的细胞捕获概貌。(g)在流体表面(z＝3.5mm)的细胞捕获概貌。(h)对于一个完整轨道期(18.85秒)的叠加捕获边界(superimposed capture boundaries)。
在本发明的一些实施方式中，在MagSweeper使用之前不需要对血液进行样品处理，这减少了操作者的传递时间(hands-on time)和扰动CTC的风险。MagSweeper可以每小时处理9ml血液，其中有总共3-5分钟的传递时间，并且如在掺加实验中所测得的捕获多于50％的CTC，且捕获细胞的基因表达没有明显改变。MagSweeper的另一个优点是在初始样品体积和处理规模可变性(process scalability)上的灵活性。结果，可以如下增加装置的处理量(throughput)：通过使用单一运动-控制系统使带外套的磁棒阵列扫遍平行的多个样品。该装置成功地纯化了每毫升全血中的100～150万个嗜中性粒细胞(数据未示出)，其表明MagSweeper能够纯化动态范围较宽的细胞计数。
在高磁场梯度区域(例如，靠近磁体的圆形尖端)中，标记的细胞被高效地捕获，产生较大的扫集区域。如上所述，在此区域中流体运动的主要影响是存在在单一轨道后遗留的未捕获颗粒的小间隙。简单的第一任选方式是将扫集延伸以覆盖部分圆周(-10％)，从而捕获剩余的颗粒。在低磁场梯度区域中流体的运动影响较强，导致在捕获横截面上的显著降低。这通过较小的轨道半径的每级差距(1mm)来解决。
已经证明了该装置具有从样品高效地捕获活上皮细胞，同时去除所有污染细胞的能力，所述样品例如血液样品(例如，外周血)。这种例举的装置包括被非磁性、非粘附性的(例如塑料的)套管所覆盖的磁化部件，并且该部件可以经自动控制以主动或被动地扫遍(to sweep orbe swept through)血液样品，所述血液样品已经用标记进行了预处理，例如与磁性颗粒连接的上皮细胞粘附分子(EpCAM)抗体。EpCAM抗体可以从Abeam购买。其识别40kD的跨膜上皮糖蛋白(EGP40)，也被认定是人上皮特异性抗原(ESA)或上皮细胞粘附分子(EpCAM)。温和地捕获在活的状态下的细胞或其它标记的结构，而且以比任何现有可利用的商业技术高得多的捕获和纯化率。
在一些实施方式中，本发明的装置利用“扫集”作用提供连续的相对运动，该运动使样品温和的流经带套管的磁体。扫集效果可以通过多种方 式实现。在一些实施方式中，浸没在样品中的磁性部件以预定的模式移动通过样品，同时使盛装所述样品的容器保持静止。任选的，可以将该装置构建成使得容器相对于磁体移动。在另外的实施方式中，具有非粘附性套管的磁性部件可以保持静止，同时使不同的溶液流经磁性部件。本发明方法和装置能够利用连续运动通过盛装有样品的容器的大部分，这种运动引起至少大部分的样品体积(在某些情况下，基本上是全部的样品体积)与带套管的磁性部件接触。换言之，设计运动模式，使其沿着来回经过容器的全部区域或几乎是全部区域的模式运行。运动可以通过表示长和宽的x-y水平轴(或者表示径向的r)与表示垂直的z维度来表征。在沿z轴优化提供的不同深度上，运动首先在x-y或者r方向上进行。该容器可以是简单的孔型容器用于盛装不受阻的一池样品(an unobstructed pool of sample)。本发明的方法和装置不需要使用包含流体通道或者特定流体流动通道的容器；只是将样品存放在开放池中，当带套管的磁棒插入到池中时能够对样品发生作用。要尽量减少目标细胞附着到容器的侧面。本方法也不需要(但也可以采用)基于细胞大小的预选步骤；不需要对样品进行预处理但是可以为了方便(例如，防止凝固)将样品简单地在缓冲液中稀释并直接提取。本方法也不像其它方法需要将CTC固定或透化的化学处理步骤，因此本发明方法可以产生活的、完整的细胞。本发明装置还采用可控的自动运动的装置，其用于使磁性部件相对于样品进行可再现的、预定的、连续模式的运动。
在一个实施方式中，可选地，通过将磁体等与磁场接触，可以将该磁性部件磁化或去磁化。在图1中，该磁性部件106a被磁化，例如，通过与组件106中所含磁体接触。这通过用可磁化材料来制作部件106a实现。磁化不只出现在具有永久磁矩的材料中，也出现在任何处于磁场中的可磁化材料中，所述磁场能够在所述材料的组成原子中引起磁矩。在钕磁体的特殊情况下，M＝χH A m-1，其中M为磁化强度，H为磁场强度，单位为安培每米(A m-1)。
因此，可以使特定材料磁化或去磁化。本磁性部件具有高场强度以捕获大部分磁标记细胞。
在此使用的术语“高场强度”表示能够吸引和捕获磁响应性颗粒的场强度。在一些情况下，场强度包括至少0.3特的磁通密度，优选为至少0.5特，通常高达约1～1.2特。在一些实施方式中，在磁性部件处于非粘附性套 管外部的点测量磁通密度，即具有最强的磁通密度的点。在为棒的情况下，在棒的尖端测量磁通密度。磁场强度可以按照磁体的供应商所提供的来测量，也可以通过磁强计来测量。需要的场强度，高场强度也通过实际指标来衡量，例如扯离强度。扯离力可以通过将磁体放置在两个合金钢的1″厚平面板之间来进行检测。一个板与记录磁体上拉力(tensile force)的数字力量计(digital force gauge)相连。将板拉开直到磁体与其中一个板分开。峰值记录为“扯离力”。当前的高场强度磁体会具有至少约30磅的扯离强度，优选至少约70磅。有效的高场强度可以从例如钕磁体获得。
细胞表面标志
多种不同的细胞表面标志可以用特异性配体靶定，并且可以通过多种试剂将所述配体制成磁响应性的。进一步的信息，可以参见，例如Stem Cells，Vol.25No.3March 2007，646-654页，其中公开了人妊娠的前三个月的胎儿血液、肝和骨髓MSC(但不是成人的MSC)表达多能性干细胞(pluripotency stem cell)标志CD44、CD96、Nanog、Rex-1、SSEA-3、SSEA-4、Tra-1-60和Tra-1-81。这样通过利用这些细胞表面标志的配体(例如抗体)，能够将稀有的胎儿血细胞从母体血细胞中分离。同样，也可以通过本方法分离患者特异性干细胞。使用抗-CD71，可以将胎儿的有核红细胞从母体血细胞中分离，尽管前者很稀少。关于分离胎儿有核红细胞的进一步内容，参见Pittenger等(1999)Science，284：143-147[3462]。
下文描述的是来自使用人EpCAM(上皮细胞粘附分子)的抗体识别的分离的单个CTC的发现。存在EpCAM的多种克隆抗体(正式名称为TACSTD1，也称为ESA)。多种EpCAM的单克隆抗体之一为HEA 125。其它抗体的列表参见www.abcam.com/index.html？t＝6920&pt＝1&c＝612。
在此列举的上皮细胞分离技术也可以用于其它肉瘤、腺肉瘤(adenosarcomas)或癌(上皮恶性肿瘤)，包括前列腺癌、乳腺癌、结肠癌、结肠直肠癌以及肺癌。(对于有关适用恶性肿瘤的其它内容，参见Clinical Cancer Research，Vol.5，4158-4163，December 1999，对于癌的更为详细的列表参加Allard等人的“ Tumor Cells Circulate in the Peripheral Blood of All Maj or Carcinomas but not in Healthy Subjects o
作为另一个实例，利用CD34的抗体可以在混合血液样品中将胎儿细胞与母体细胞分离(参考US20080254460)。还已知多种可以对其制造或已经制造了抗体或其它标记试剂的细胞表面标志。这些标志包括上述的CD34，以及CCR7、CD38、CD43、CD48、CD90、CD105、CD117/c-kit、CD123、CD135/Flk2、CD144(VE-钙粘着蛋白)、CD150、CD2338/ABCG2、c-Met、Nanog、Notch-1、SSEA-1、SSEA3、SSEA-4、Tral-60(足萼蛋白)和Tral-81(足萼蛋白)。
另一干细胞标志在Bhatie的“AC 133expression in human stem cells，”Nature，15：1685-1688(2001)中有所描述，将其引入作为进一步的信息，其报道了AC 133+细胞存在于移动和非移动的成人(mobilized and non-mobilized adults)的外周循环和骨髓腔(bone marrow compartment)中。根据在此描述的方法可以分离并培养这些细胞。根据本方法，可以制备具有一个标志的磁性珠，然后使用这一标志分离的细胞可以通过另一个标志进一步分离，因此获得的群体仅含有表达两种标志的细胞。
细菌和病毒即使在细胞群中少量存在，也可以分离。例如，通过使用特异性单克隆抗体例如在US6,818,392中所述的单克隆抗体，可以检测和分离在血液样品中以低拷贝数存在的HIV用于进一步的培养和遗传研究。
细胞的去除
通过去除穿过非粘附性套管的磁场，使捕获的细胞从包覆的磁化部件释放到回收溶液(例如捕获缓冲液)中。为了确保去除所有的污染细胞，该装置可以经过多轮的捕获和释放。另外，在捕获和释放步骤之间通常进行清洗步骤。已经证明从套管释放的细胞是活的并且未发生变化。通过例如在珠和结合的抗体之间使用可切断的接头可以将珠从分离的细胞上去除。可以并入接头的可用化学方法切断的部分包括：二烷氧基硅烷、β-氰基醚(β-cyano ether)、氨基甲酸氨基酯(amino carbamate)、二硫缩醛(dithoacetal)、 二硫化物等。还可以使用核酸接头，在其序列中构建了限制酶或其它内切核酸酶的识别位点。对于可切断接头的进一步描述，参考Ju等人2003年12月16日授权的题目为“Massive parallel method for decoding DNA and RNA.(用于解码DNA和RNA的大规模并行方法)”的美国专利6,664,079。
磁体排列
该装置的优选实施方式包括与上述线相比具有更大的直径的轴向磁化棒的集合。它们的直径可以为1～10mm、2.5～7mm或者4～6mm，并且在磁场强度方面显著高于针构型。该棒可以连接在5功能/3轴自动装置(5function/3axis robot)上，该自动装置用来在样品孔中按照预定的运动方式移动棒，该孔的横截面大小远大于所述磁棒。在开动自动装置时，将磁棒插入一个薄的、紧密适配的塑料套管中并下降进入到液体样品(即，人的血液)中，该样品已经预先与磁珠混合，所述磁珠与对于目标生物标志特异性的抗体附接(例如，标记有免疫磁珠的癌细胞)。随后，机械臂使磁棒扫遍液体从而捕获磁性标记的目标(例如，癌细胞)。机械臂提起磁棒和已捕获的生物物质(biologics)，然后沿直线方向移动到下一位置，其在该位置下降进入到清洗溶液中。棒在清洗溶液中搅动/扫集，在这段时间内污染物从磁棒上掉落。可以多次排干并且再装入清洗溶液从而确保污染物的全部去除。然后自动装置将磁棒移动到最终释放位置。在此提升磁棒使其离开塑料套管，去除穿过非粘附性套管的磁场，将塑料套管保留在释放溶液中。该自动装置可以摇动释放液，塑料套管上的细胞或生物物质掉落到释放液中用于进一步的分析。为了完全的捕获和纯度，可以重复任一捕获、清洗或释放步骤。在一些实施方式中，在释放步骤中使用第二磁体以辅助从非粘附性套管上释放珠。
非粘附性套管
可以调整磁体设计的表面积和几何形状以及非粘附性套管(例如塑料套管)的类型来降低污染细胞和捕获的细胞与塑料的非特异性粘附。自动装置允许对清洗的次数和严格度的控制从而确保完全清理污染物。
可以使用对于红细胞或白细胞为非粘附性的多种材料。
美国专利No.3,723,754、法国专利公布2,089,788和日本申请Ser.No. 45/75116公开了用于储存血液以及用于使血液在其中动态流动的装置。如这些专利中所述，聚偏氟乙烯具有期望的性质，可以用于本装置。优选的材料PVC(聚氯乙烯)可以是柔性的，即可以与增塑剂混合。可以使用占使用的柔性塑料干重多达40％的增塑剂，例如邻苯二甲酸二-2-乙基己酯(DEHP)。通常来说，需要非常少的增塑剂或不需要增塑剂，这是因为非粘附性套管较薄，且在某些情况下是自承式的。
也可以使用聚脲-聚氨酯套管，并且如同US5,169,720的涂料那样制备，由基本上或只由环氧乙烷单元构成的高分子量异氰酸酯封端预聚物来制备。至少75％，优选至少90％的预聚物单元为具有约7000-30,000的分子量的基于氧化乙烯的二醇(oxyethylene-based diol)或多元醇，在形成水合聚合物(hydrated polymer)涂料之前其基本上所有的羟基都被聚异氰酸酯封端。
另外，也有与血液相容的陶瓷材料报道。参见描述陶瓷材料的US6,158,984。polyHEMA(亲水水凝胶聚(甲基丙烯酸2-羟基乙酯))也已知可降低细胞粘附并且可以单独使用或与其它材料一起使用。
非粘附性材料在US6,663,584中也有描述。因此，根据本发明的教导，对于此处的用途可以适用非粘附性的、生理上惰性的、液体-排斥性的聚合物，例如碳氟化合物，包括含氯氟烃聚合物或硅氧烷聚合物。
在一个方面，重要的是所述装置使用薄套管，其仍然可以紧密适配磁性部件并且可以从磁性部件上移开。对薄的预期通常是该套管会在1～1000μm数量级，优选为10～300μm厚，优选约10～30μm厚。可以调节薄厚(thinness or thickness)来控制磁场透过套管的程度和套管材料的强度。套管通常会是自承式的，因为在操作过程中所述磁性部件会反复地完全施用(例如，插入)，再至少部分移出(例如，退出)或完全移出，这要求套管具有一定程度的结构完整性。当磁性部件移出时，不严格要求套管是刚性的或者固定的。为了辅助珠的释放，套管通常应不含有或保留磁场，尽管其可能是顺磁性的。
当套管用作非粘附性套管时，通常将套管设计成使其在磁性部件外部形成表面，该套管使得来自磁性部件的磁场能够通过套管或在当且仅当磁性部件紧邻套管时暂时地将套管本身磁化。优选棒和套管为圆柱型从而利于使用和去除套管，但是根据本发明的教导也可以设计成其它构型，例如曲线型。
磁响应性颗粒
除了列举的CELLECTED 
Figure DEST_PATH_GSB00000532855900271
(可以购自Dynal)之外，可以使用多种类型的磁珠用于附着于要分离的细胞。Dynebead为 
Figure DEST_PATH_GSB00000532855900272
是超顺磁性的，单一尺寸(monosized)的聚合物颗粒。试剂盒含有5ml用人上皮抗原EpCAM的单克隆抗体包覆的“CELLection”TM Dynabeads″(4.5m)和DNase Releasing Buffer(DNA酶释放缓冲液)。
链霉抗生物素蛋白-包覆的顺磁珠(直径2.8μm，M-280)可以从DynalCorp.(位于Lake Success，N.Y.)获得。链霉抗生物素蛋白-包覆的胶体铁磁流体磁性颗粒或者“MACS”珠可以从Miltenyi Biotec Corp.(位于Auburn，Calif)获得。通过使用链霉抗生物素蛋白-包覆的珠，可以使这些珠特异性地附着于生物素-标记的抗体或其它细胞类型特异性蛋白质。作为这种实施方式的实例，可以参考目前市售的BD IMagTM细胞分离系统。该系统使用磁珠技术来富集或排除(depletion)制备好的样品中的特定细胞群。BD Biosciences Pharmingen提供抗体-标记的磁性颗粒用于富集或排除白细胞亚群。可以为干细胞标志制备类似的颗粒。BD IMag颗粒的大小范围为0.1～0.45μm，并且包覆有BD Pharmingen单克隆抗体。
这里使用的磁响应性颗粒可以为磁性的、超顺磁性或顺磁性的。在Gilbert等人于1997年5月13日授权的题目为“Method and apparatus for separation of magnetically responsive spheres(用于分离此响应性球的设备和方法)”的美国专利5,628,407中对磁响应性颗粒进行了进一步的描述。
在一个方面，本发明包括大磁珠的使用。术语“大磁珠”是指磁珠(大于1微米～约10微米)的大小。其不同于小磁性颗粒(0.7～1.5微米)或胶体(小于200nm)磁性颗粒(也称为纳米颗粒)。
细胞分离和研究
在此描述的方法也包括允许分离完整、活的细胞(特别是CTC)的本装置的使用。作为比较，使用了FDA-批准的装置，其得到认可的清洗步骤具有提高的严格度来提高纯度，但是在该过程中捕获的细胞被“痛打(beat up)”，而不适合用于后续多重分子分析。捕获的细胞的细胞膜被剥去，且意欲用于分析步骤的细胞核物质溢出。以指定的扫集条件和清洗条件使用本装置，所述条件大大地提高活CTC的回收率。
本方法不依赖于检测恶性细胞中的特异性核酸序列来将细胞鉴定为CTC。本方法可以分离完整的细胞用于多重基因表达。如下所述，本方法可以包括其它步骤，一旦分离了CTC(在基本上纯的组合物中)，所述其它步骤为研究这些分离的细胞中一个或多个的乳腺癌生物标志的表达，所述生物标志例如ER(雌激素受体，在PNAS，August 29，2006vol.103no.3513162-13167中有进一步限定)，PR(孕酮受体，在MolecularEndocrinology，12(9)：1334-1342中有进一步限定)和HER2(人表皮生长因子受体2，也称为HER2/neu或c-erb2，在Proc.Natl.Acad.ScL USA，1999September 14；96(19)：10869-10874中有进一步限定)。在下述研究中，测定出ER阳性原发性肿瘤(positive primary tumor)可以含有ER阴性CTC。另外，HER2阳性原发性肿瘤可以导致HER2阴性CTC。进一步地关注，在下文显示CTC是异质的(heterogeneous)--一个来自患者B的CTC表达HER2，而另外其它三个不表达。使用本细胞分离方法还测定了转移性乳腺癌CTC经常表达波形蛋白和CD44。因此，本方法可以进行CTC研究，用于进一步的诊断目的，例如在转移性乳腺癌中。如果治疗对象存在或缺失，例如EGFR、HER2、ER或PR，会决定这样的定向治疗是否合适。另外，在该疾病中，可以利用CTC分析将CTC分为代表间充质样癌症干细胞(MSC)或部分分化的上皮细胞(PDE)，其中存在较低分化的CTC代表进行性转移性疾病的标志。
Patrawela等人的“Side Population Is Enriched in Tumorigenic，Stem-Like Cancer Cells，whereas ABCG2+ and ABCG2- Cancer Cells Are SimilarlyTumorigenic”，Cancer Research，65：6207-6219(July 15，2005)中描述了通过侧群技术(side population technique)获得的癌症衍生的干细胞样癌细胞(stem-like cancer cell)。这些细胞中的一些被表征为间充质的。因此，利用本发明的教导，可以分离CTC并且进一步研究这些分离的细胞，这些分离的细胞会导致对推定的间充质样癌症干细胞(MSC)的分离，MSC可以按较低分化的间充质细胞来鉴定，或者根据文献中所鉴定的涉及上皮到间充质的转变的性状来鉴定，或者利用下述基因表达研究来鉴定。Mani等人的“The Epithelial-Mesenchymal Transition Generates Cells with Properties of Stem Cells，”Cell，133：704-715(May 16，2008)中提供了对鉴定MSC的进一步指导。在下述标题“分离来自转移乳腺癌患者的CTC”中对鉴定MSC提供了进一步的指导，其中说明了当前方法包括检测在CTC中波形蛋白表达的增 强，在此波形蛋白是间充质细胞的标志。
本装置和方法的另一个方面涉及在细胞分离后自单一细胞的多重基因分析，分析在单一细胞中的多种基因(示例15-48个基因)的表达水平。该分析可以涉及如下步骤：其中用逆转录酶PCR方法预扩增细胞的RNA，之后在多室微流体装置中通过同时扩增检测该RNA。涵盖那些可替代在此具体示例那些基因的可选目标基因。例如，在由本方法得到的CTC中对pAkt/mTOR和p4E-BP 1进行了分析，参见Akcakanat等人，“Comparison of Akt/mTOR signaling in primary breast tumors and matched distant metastases，”Cancer，112：2352-2358(2008)。
以下列出了适合用于CTC表征的一组示例性基因，其中其全名，分类和序列可以通过给出的Gene ID从NCBI获取。该Entrez Gene Gene ID在所有分类群中是唯一的。因此通过使用可从下述网址获得的文件中提供的定义，可以将任意Gene ID转换为其现用名，所述网址为：ftp:ftp.ncbi.nlm.nih.gov/gene/DATA/gene_info.gz。
表1
Figure DEST_PATH_GSB00000532855900291
Figure DEST_PATH_GSB00000532855900301
建立的概略体系应当包括标准标志，例如对于乳腺癌、ER、PR、HER2和增殖的标志例如细胞周期蛋白B2。除此之外，标志可以选自生物学相关的过程例如涉及酪氨酸激酶受体活性的信号转导途径，缺氧的标志，癌症干细胞的标志，涉及氧化应激、抗药性、凋亡和上皮-间充质转变的基因。尽管认为持家/参考基因在不同的细胞样品中不会发生变化，但是很多仍会发生变化。例如，最近证明了在细胞于缺氧期间转换为戊糖磷酸途径时GAPDH出现了变化，以及G6PD水平在不同的组织中可以发生变化。作为最初产品，应当选择在上表的最下行列出的持家基因，因为这些基因中有5个在FDA-批准的Genomic Health的21-基因Oncotype DX RT-PCR组织测定法中用作参考基因。
下述列举的方法使用了MagSweeper技术来捕获和纯化CTC用于在单细胞水平的多重表达分析，以及测定在一些在多个转移位点反映出异质性的患者中单细胞的CTC异质性。为了进行单细胞分析，列举的方法在CTC捕获和纯化之后的后处理步骤中手工鉴定并且提取了每个CTC。
II.磁耦合和线的实施方式(“MagBrush”)
在这个实施方式中，所述棒或者磁性部件本身不是磁性的，但是通过与强磁体耦合成为磁性的，或者任选地用电磁体成为磁性的。
现参考图1A-D，容器102中盛装有样品液103(如血液)，所述样品液103含有具有磁响应性标记的小群细胞104(例如CTL)。磁性支架106包括磁性或电磁体部分，该部分为多个可磁化线106a赋予磁场，所述可磁化线 106a连接在所述支架上并且插入安装在套管支架107上含有数量匹配的套管108的套管阵列中。如此将线106a插入到样品液103中，其中每条线均由单独的套管108围绕在线的末端。这种移动是通过可自动化的控制器110控制的，其使支架106和107或者一起或者分开移动，这依赖于所涉及的工艺步骤。如图1A所示，控制器110将包覆有套管的线插入到样品液103中，然后进行预定的自动扫集从而与细胞104接触，并且使其可以温和地逐渐附着在套管108上。然后，如图1B所示，将与套管108结合的细胞104从样品液取出。接下来，如图1C所示，将与套管结合的细胞插入到清洗或回收液114中，并如图D所示，通过由自动控制器110控制的相对于套管108向上的运动将线106a从套管108中收回。
图1的装置(称为“Magbrush”)是通过将线附接于永久性强磁体而构成的。套管为0.5mm厚的聚丙烯塑料。将细胞用来自Stem Cell Technologies的磁性纳米颗粒和EpCAM抗体使用EasySep Human EpCam Positive Selection Kit按照说明书的指示进行标记。在本实验中使用的乳腺癌细胞系MCF7和早幼粒细胞性白血病细胞系购买自ATCC。将EpCAM/纳米颗粒标记的MCF7细胞和HL60细胞以不同的数量混合然后使用所述MagBrush来捕获上皮细胞。我们将数千个HL60细胞与1200、100或50个MCF7细胞混合。
为了检测，首先使用了带有标记的EpCAM珠的已知肿瘤细胞系MCF7细胞。向96孔板的孔中装入250μl缓冲盐水，并向孔中加入已知数量的用所述磁性纳米颗粒标记的MCF7乳腺癌细胞。然后将没有塑料套管的单线原型MagBrush插入到孔中并使其温育15分钟后将其移出。对于较高的起始细胞数量(1200)，93％的细胞被清除；对于中等的起始细胞数量(100)，96％的细胞被清除；而当以50个细胞起始时，所有来自孔的细胞均被清除。
由于线被永久磁化，因此不可能从这个实验释放细胞。为MagBrush装配了PVC套管并且重复了捕获和释放实验。细胞捕获以与上述实验中所述相同的效率进行，但是通过把线从套管中移出，细胞可以容易地从塑料套管上掉落。
最终，使用套管包覆的线并用MCF7和HL60细胞的混合物进行了细胞分离。HL60细胞不表达EpCAM表面抗原。也可以分离相似百分比的MCF7细胞，但是不经意地也捕获了一些HL60细胞。为了清除这种污染，使用了 多轮的捕获和释放过程从而可以实现MCF7细胞的纯分离物。在利用MagBrush捕获MCF7细胞之后，将细胞释放到含有生长培养基的组织培养皿中并使其生长数日。所述细胞能够附着并生长，表明生存力没有受到标记、捕获和释放规程的影响。
因此，看以看出MagBrush从上皮细胞和非上皮细胞的混合物中高效地分离了纯化的并且是活的上皮细胞。该装置具有从全血中纯化活的CTC的能力，并且会使后续的生物分析更为容易。另外，与当前的方法相比，这种高通量测定法会实现更为快速和低成本的CTC分离。
III.永磁棒实施方式(“MagSweeper”)
本实施方式使用了强力永磁棒，如图2和图4-9所示。与线不同，该棒具有实体上的(substantial)直径，并且在长度方向上磁化形成具有一个末端的偶极，其中显示出珠附着在棒的底部。所述磁体具有非常高的扯离力(例如，～.99lbs)并且直径可以为1/8英寸量级。优选的磁棒为稀土磁体。钕磁体为稀土磁体家族的成员并且是世界上最强的永磁体。也将它们称作NdFeB磁体或者NIB，因为它们主要是由钕(Nd)、铁(Fe)和硼(B)组成的。在举例的装置中使用的磁体是从K&J Magnet获得的，如模型D2X0，其具有如下规格：维度：1/8″直径×1″厚度；容限：±0.001″×±0.002″；材料：NdFeB，等级N42；镀层/涂层：Ni-Cu-Ni(镍)；磁化方向：轴向(磁极在平端)；重量：0.0532盎司(1.51g)；扯离力：0.99磅；表面场：4175高斯；Brmax：13,200高斯；Bhmax：42MGOe。
现参考图2A-F，其中显示按图1中装置的原理运行的装置。示出的装置由三个NdFeB磁棒构成。这些磁棒上覆有设计为紧密装配在所述棒上的可移动的塑料套管(图2A)。为了捕获细胞，将所述棒装入(engage into)塑料套管中，然后在血液样品中移动，所述血液样品是经 
Figure DEST_PATH_GSB00000532855900321
超顺磁性、单一大小的聚合物颗粒处理的(图2B)。然后将棒/套管组合件(assembly)在PBS中清洗数次，随后移入(图2C)到新的孔中，在该孔中浸没含有细胞的棒(图2D)。将带有细胞的棒移动到另一用于接收细胞的容器(图2E)，然后将磁体从套管取出，并且在套管的下方放置磁体从而促进从当前为非磁性的套管去除标记的细胞(图2F)。图2F的底部可以观察到标记的细胞的附着和移动(removal)。
三个容器304各接收一个单独的磁性部件。将所述三个磁体构建在在磁体阵列308上，其中可以将每个磁棒可移动地封装在套管306内，该套管306在所述磁性部件和样品之间并接触样品。如图2B所示，用带套管的磁体涡旋搅动整个样品(swirl through the sample)，磁响应性细胞粘附在磁体上(通过套管)，如312所示。尽管显示细胞聚集在棒的末梢附近，但是细胞附着依赖于磁体的设计会有所不同(参照图5)。一旦细胞附着到塑料套管上，就将所述组合件从含有待捕获细胞的容器中移出，如图2C所示。如图2D所示，接下来将该组合件移入具有缓冲液317的清洗容器中，用来去除可能非特异性地结合到套管上的任何污染细胞。这个步骤可以视需要重复。然后，如图2E所示，将该组合件移动到另一溶液318中，在该溶液中细胞可以被释放和捕获。如图2F所示，将磁体306从套管306中移出，并通过孔下方的磁体320辅助细胞的释放，导致具有磁响应性标记的细胞被吸引到邻近所述磁体320的区域322。
为了获得在所用的设计中具有极高捕获能力的磁体设计，进行了一系列的实验，如图5所示。图5A到图5F显示出不同的磁体构型，每个图中示出了在磁体支架下具有不同轴向节段和直径的单棒。为了测试不同的磁体构型，用2ml DMEM中的～10,000个MCF7细胞制备了混合物，将所述混合物使用80μl EpCAM处理15分钟，用80μl纳米颗粒处理该样品15分钟，并且在robosep磁体中处理15分钟。去除上清液并将标记的细胞重悬在1ml DMEM中。计数(7.5细胞/μl)。将10μl细胞加入到24孔板的12个孔中每一个的2.5ml DMEM中。使用自动机械扫集细胞，然后的步骤是在800rpm下旋转沉降(spin down)平板5分钟，然后对孔中的细胞进行计数。然后按照如下方式检测图5A-F中的设计：
a)两个孔用于无磁体-51，32
b)两个孔用于非磁化的5.1mm的圆柱体-13，7
c)两个孔用于3mm(1/8英寸)圆柱体-1，2
d)两个孔用于1.5mm(1/16英寸)圆柱体-9，22
e)两个孔用于包装在Parafilm中的3/16″环形磁体-0，0
f)两个孔用于3/16″环形磁体-1，0。
在此发现，使用具有在长度方向上的偶极的单一长磁体(图5D)可以得到优异的结果。
为了显示本装置从血液分离肿瘤细胞的能力，将已知数量的用pAcGFP1-N1(来自Clontech)稳定转染的MCF7细胞加入到9ml普通供体血液中(进行GFP标记是为了使上皮细胞的鉴定更简单)。加入10ml CELLection Epithelia Enrich Dynabeads并在室温下温育30分钟，并不断混合。然后使用该装置分离和纯化细胞。在符合所有有关Human Subject的规定的条件下，从患有转移性乳腺癌的女性患者采集血液样品。从每位患者采集9ml血液，将血液用Dynabeads标记，并如上用所述装置分离。手动选择用于多重实时qRT-PCR的单个CTC。对于qRT-PCR而言，使用Invitrogen的qRT-PCR试剂盒预扩增单个细胞们的15个目标。稀释每个预扩增产物并应用于下文列出的针对每个单独目标的qRT-PCR反应。我们使用了Applied Biosystems的TaqMan引物和探针。使用了人参照RNA和TE缓冲液作为对照。
现先考图4A和B，其为对应于如是构建的原型的示意图，其中显示了连接并固定三个磁棒106a的支撑板106，所述106a磁棒向下伸展到套管阵列底部，和使套管相对于套管移出以及插入保持在固定的位置上的套管固定器。轴向或者径向磁化的棒与5功能/3轴的自动装置连接。俯视图显示出6-棒原型实施方式中阵列的大致大小。在激活自动装置时，磁棒被插入塑料套管并下降进入液体样品(例如，人血液)中，该液体样品事先与附接于目标生物标志特异性抗体的磁性珠混合(例如，用免疫磁珠标记的癌细胞)。然后机械臂使磁棒扫遍所述液体以捕获磁性标记的目标(例如，癌细胞)。该机械臂提起磁棒和捕获的生物物质，然后沿直线方向移动到下一位置，其在该位置下降进入到清洗溶液中。棒在清洗溶液中搅动/扫集，在这段时间内污染物从磁棒掉落。可以多次排干并且再装入清洗溶液从而确保污染物的全部去除。然后自动装置将磁棒移动到最终释放位置。在此磁棒在塑料套管中，但可以提出到塑料套管外，而塑料套管仍然保留在释放液中。该自动装置摇动释放液，塑料套管上的细胞或生物物质掉落到释放液中用于进一步的分析。为了完全的捕获和纯度，可以重复任一捕获、清洗或释放步骤。
IV.流体流动实施方式-固定的非粘附性套管
一个可选的实施方式利用了液体流动，例如在流体通道中的。例如，包含磁性部件的非粘附性套管延伸到流体通道中。然后使各种样品、清洗 和释放溶液流过非粘附性套管。可以施加以及去除穿过非粘附性套管的磁场以从流体捕获颗粒，或者释放颗粒到流体中。
与本文中描述的其它实施方式一样，为了获得本文描述的纯度和捕获效率，在捕获过程中控制磁性部件和非粘附性套管之间的速度是重要的。与上文描述的速度和雷诺数相同的范围也适用于本实施方式。如上所述，希望流体在磁性部件周围的流体流速处于非湍流状态。
图11显示本实施方式的实例。在此，磁性部件1502延伸到流体通道1506中，在该通道中含有细胞的液体样品1508，该液体样品可以沿箭头1510所指的方向流动。磁性部件1502周围由非粘附性套管1504所围绕，该非粘附性套管可以形成在流体通道1506内，其中由于磁性部件伸入到通道中，若非套管1504，所述磁性部件就可以与溶液1508接触。为了捕获和释放，可以施加或去除磁性部件穿过所述非粘附性套管的磁场。在一些实施方式中，所述磁性部件在整个过程中是固定的，并对磁性部件进行磁化或去磁化，例如使用一个或多个电磁体。在其它的实施方式中，将磁性部件插入到非粘附性套管中从而施加磁场，然后至少部分拔出从而基本上去除穿过非粘附性套管的磁场。图11中的实施方式显示三个磁性部件，但是可以使用任何有效数量的磁性部件。在一些情况下可以使用一个磁性部件，而在其它情况下可以使用的数量可以高达10个、100个或更多。
在一些实施方式中，该装置包括含有中空柱或者中空柱阵列的流体通道，其中在每一个柱中可以插入或者撤出外部磁体(参见图12(A)到(D))。通过将磁体插入到中空柱内部，磁性标记的细胞1602会被吸引并附着到柱上，产生捕获(图12B)。通过从柱中撤出磁体，标记的细胞会从柱上脱落并且释放到通道中的大量溶液(bulk solution)中(图12D)。在一些情况下，在插入磁性部件的同时，也可以通过使清洗溶液流过而使用清洗步骤(图12C)。为了促进将目标细胞从柱上去除，可以在流体通道下方放置外部磁体和/或可以调整流体的流动(图13)。在一些实施方式中，每个通道可以包含一个中空柱或者中空柱的阵列(图12)。磁化柱可以自由地移入或移出这些柱以用于捕获和释放用功能化磁珠标记的靶向细胞。当磁化柱进入流体通道中的中空柱时，标记的细胞会附着于柱的表面(图12B)。在使用清洗缓冲液清洗流体通道后(图12C)，磁体会脱离中空柱从而释放捕获的细胞(图12D)。在一些情况下，释放的细胞经过多轮的捕获-清洗-释放以提高目标细胞的纯度。液体 按照箭头1604的方向流动，并且可以看出释放的细胞向下游流动。图12～14的实施方式还涵盖额外的流体室以传递和接收流体。流体可以进一步连续循环或者以往复的方式来回清洗(wash back in forth in a reciprocal manner)。这提供了多个样品接触与清洗步骤。样品液可以盛装于可压缩的室内，例如，所述可压缩的室在示例的管的任一末端用于接收和排出液体，其在例如机械活塞或辊的控制下，所述机械活塞或辊以连续方式运转或根据其它预先编排的顺序运转。
图13显示在流体通道1704中的磁性部件1702，类似于图11和12。为了帮助目标细胞的释放，可以增加流体的流动速度(图13B)或者可以将外部磁体1706放置在流体通道(图13C)之下，并在磁性部件之下。该外部磁体可以为永磁体，所述永磁体可以以机械方法放置在通道下或者从通道下移开，或者也可以为能够通过电开启或关闭的电磁体。
另一个可选的实施方式中(图14中所示)，流体通道1802包括薄且有弹性的壁。当将磁体1806推向并进入流体通道时，流体壁也会变形并形成围绕磁体的中空柱，与溶液1804接触。
V.流程
通用流程和自动机械控制
如下文所详细描述的，本方法涉及首先获得含有待分离的细胞或其它结构(目标细胞)的样品，例如肿瘤细胞的分离物(其较为稀有，即，在外周血中，在100～40000个血细胞中有1个)。将该血液样品暴露于仅标记目标细胞的试剂。使抗体与磁响应性颗粒附接，例如通过生物素化所述抗体并使其结合到链霉抗生物素蛋白包覆的珠上。优选的试剂是识别肿瘤细胞的抗体。肿瘤细胞会具有与血细胞不同的表型，例如上皮细胞是典型的乳腺癌细胞类型。其它肿瘤可以是内皮或结缔来源，并且可以以此为基础进行区别。其它标记可以基于肿瘤或细胞亚型，例如干细胞或特定肿瘤表型的标志，例如EGF+或Her2+等。标记与磁性颗粒附接并在血液样品中充分混合。然后将封装在惰性非磁性套管中的磁性部件与血液样品相接触，所述套管允许磁力通过并且还不吸引或粘附血细胞或目标细胞。将所述带套管的部件充分地暴露于血液样品使其不破坏细胞，但是与任何存在的稀有细胞得到紧密接触。
在一些情况下，当进行捕获步骤时，磁体距离盛装血液样品的容器中 的板底部约1～2mm。包覆磁性部件的套管由例如PVC制成，所述套管非常紧密地与磁体适配。塑料套管的厚度范围为0.001～0.01″(25微米～254微米)。在捕获阶段期间(参照图1A和2B)，与能够在三个方向上运动的致动器(xyz致动器)连接的机械臂以预定的、可再现的模式扫遍各个样品容器。机械臂以2mm/秒的运动，其完成12圈，且每圈具有的半径从前一圈平移1mm。随后，如图1B和图2C以及2D所示，将磁性部件移动到不同的溶液中进行清洗。这优选通过移动所述自动机械来实现，但是也可以移动样品支架。将臂浸没到完全不同的液体中以洗掉夹带在珠装饰的细胞中的非目标细胞或非特异性地结合到覆盖磁体的惰性套管上的非目标细胞。对于清洗，机械臂的移动优选以例如2mm/秒、沿着5mm的圈半径运动30秒。优选通过更换第二个容器中的溶液进行数次清洗。接下来，在清洗之后，附着有磁珠的目标细胞作为纯化后的群体释放到第三容器中。这在图1C和1D以及图2E和2F中显示。通常将细胞放置于第三容器的捕获缓冲液中，该容器在底部具有磁体以帮助吸引磁珠从惰性套管上脱落。在这个阶段，磁体从套管移出使得珠不再吸附在套管上而是会掉落下来。在释放时，没有臂的运动。套管覆盖的磁体进入液体，将磁体撤出，并且在板的下方存在强磁体(例举的磁体为钕棒磁体，例如，如由K&J Magnetics，Jamison，PA生产的)，其将细胞/珠拉下套管落到板底部。
从以上描述可以看出，一旦通过对于待去除的细胞(优选CTL)特异性的抗体标记了血液，就可以通过计算机控制使整个过程自动化。
用于从人血液获得稀有细胞的示例性流程
作为从人全血获取稀有细胞的示例性方案，将血液收集在10ml EDTA小瓶(BD#366643)中。每个小瓶实际获得了约9ml。然后将血液拿到实验室并将血液分入三个(3)新的小瓶中，并且用PBS(pH7.2)将每个补成总共6ml。随后，向每个样品中加入3.4μl的Dynabeads，Cellection Epithelial Enrich(包覆有单克隆小鼠IgG1抗体Ber-EP4[即EpCAM]的直径4.5μm的超顺磁聚苯乙烯珠)。然后在室温下混合样品30分钟，同时进行旋转(10转/分钟)。然后将样品放到6-孔板(Falcon 353502)的孔中，并用PBS冲洗管使得每个样品达到10ml。自动机械的运行如下：
两个捕获循环、两个清洗循环、一个释放循环。然后将含有释放的细 胞的板放置在捕获位置上并进行一轮捕获。这轮再捕获是我们用来减少/避免血细胞污染的方式。
随后清洗样品两次(即重复图2C和2D中所示的步骤多次)，并且之后将样品释放到含有360μl培养基(300μl DMEM，含有10％胎牛血清、30μl的Dnase1、30μl的25mM氯化镁)的500μl管中。这去除了一些珠，但通常其只是防止珠粘在一起，其使结块尽可能的少从而使细胞更容易被观察到。
然后在室温下温育样品10分钟，并随后将样品转移到6-孔板中，其中细胞是手动选择的(使用微量加液器挑选)。将每个细胞均收集在加入了0.2μlRNA酶抑制剂(Superase IN，购买自Ambion，product#2694)的2μl体积中。然后在干冰上冷冻样品直到进行qRT-PCR。
表2.用Dynabead标记并用本装置捕获的
掺入普通供体血液中的MCF7细胞的实例
  加入的细胞   分离的细胞
  41   8
  50   10
  40   8
  24   13
  16   7
  19   5
从患者血液分离乳腺癌肿瘤细胞以及通过rt-PCR分析这些细胞
对两个患者样品进行了描述。从第一位患者(ID#SM014)处获取了一小瓶血液。从这位患者分离了10个可能的细胞(potential cell)，但其中仅有一个具有质量好到足以从qRT-PCR获得数据的RNA。从第二位患者(ID#SUBL017)处获得了三小瓶血液，并且分离了单独26个可能的细胞，其中25个显示了RNA。
随后从另外4位患者处分离了细胞(82个可能的细胞)，并从长有源自人乳腺癌细胞系(MDA-MD-231)的肿瘤的小鼠的血液分离了细胞。对来自小鼠的16个细胞样品进行了qRT-PCR分析，并且又培养了(grow in culture)数百个细胞。
多个目标的预扩增
1.使用CellsDirectTM qRT-PCR试剂盒(Invitrogen，目录号11754-100)预扩增样品。对于多重qRT-PCR，每个测定均使用Applied Biosystems的TaqMan测定法。在TE缓冲液中稀释目标的20×测定物从而配制1×测定混合物并且用于预扩增步骤。
通过结合下述步骤和成分制备样品RT-Pre-Amp主混合物：
 成分   体积＊(μl)
 CellsDirect2×反应混合物   5.0
 1×测定混合物   0.5
 RT/Taq酶   1
 TE缓冲液中的细胞   3.5
 总计   10
标注：如果细胞在分选后要进行储存，或者如果怀疑存在RNase活性，那么加入0.1μL的Ambion′s SUPERase-In。
2.进行热循环
a.在50℃将RNA反转录为cDNA，进行15分钟。
b.通过将样品达到95℃持续2分钟使RT酶失活并起动Tag酶。
c.通过进行18个循环的变性(每个在95℃进行15秒)和在60℃退火4分钟来预扩增cDNA。
d.将所得cDNA产物用水或TE缓冲液以1∶2稀释。
将预扩增样品应用到Fluidigm BioMark TM  48.48Dynamic阵列芯片
基于厂商的说明书，将此用于多重qRT-PCR反应。这样的芯片是可以商购的并且在Fluidigm网站上有进一步的描述。在微流体芯片(microfluidic chip)上的通道和阀门(valve)的矩阵(matrix)中实施 
Figure DEST_PATH_GSB00000532855900391
PCR测定法。可以将48个样品和48个测定物(assay)装载到芯片的输入框(chip′s input frame)的入口处。这样可以对含有皮克量RNA的单个细胞进行分析，其量不足以进行可再现的微阵列分析。该芯片使用集成流路(integrated fluidic circuit)和压力-控制纳米阀门来实现高灵敏度的平行qRT-PCR测定，该测定基于标准的5’-核酸酶探针(TaqMan)化学和引物-探针设计规则。这些芯片的各行加载的是试剂(例如，引物对和 
Figure DEST_PATH_GSB00000532855900392
探针混合物)，而各列加载的是由细胞的 RNA生成的cDNA样品和其它脱离芯片制备的PCR成分。随后，在没有交叉污染的情况下，在设计的芯片反应室(每个10nl)中，将行和列的内容物自动彼此混合。因此可以以组合学的方式来测试引物和样品：系统地组合成2304个平行反应。采用手动方式或使用自动机械进行同一组反应需要更高数量级的试剂和移液步骤，其每一项都有可能引入错误或交叉污染的可能性。另外，与标准qRT-PCR相比，使用的高成本试剂的量低得多。
单细胞分析可以通过多种可选的方式来进行。例如，可以进行更小的一组PCR或者其它扩增反应；可以培养单细胞以获得较大的RNA量；以及可以用酶或免疫学试剂来检测单细胞。
得自根据本方法分离的肿瘤细胞的qRT-PCR结果
使用上述qRT-PCR且获得自患者样品的结果示于下表3和图3A-E。表3示出来自多重实时qRT-PCR实验的15个基因的相对表达(以百分比表示)，其中比较了0.1ng人参照RNA(设定为100％表达)与单MCF7培养细胞，和捕获自两名癌症患者血液的分离的循环肿瘤细胞(CTC)的典型样品(单独分析了第二名患者中的25个单CTC)。两名患者均患有具有转移灶的高度浸润性导管癌(infiltrating ductal carcinomas)。
患者SM014的原发性肿瘤为ER-/PR-/HER2+。用曲妥单抗(trastuzumab)时骨转移(bone metastasis)有所发展，并且活检的骨转移为ER-/PR-/HER2-，其与CTC SM014细胞7的表达概况匹配。患者SUBL017患有ER-/PR+/HER2-的原发性左侧乳腺癌，然后在几年后发展出两侧锁骨和纵隔腺病(bilateral supraclavicular and mediastinal adenopathy)。右侧的SCLN活检(a right SCLN biopsy)为ER+/PR-/HER2-。来自此时具有骨转移灶的这位患者的两个CTC为ER-/PR-/HER2-。所有细胞就CK19而言是阳性的，但对于其它测试的基因具有范围较宽的表达水平。
通过MagSweeper从11位患有转移性乳腺癌的女性提取的CTC的表达概况测量
表3
Figure DEST_PATH_GSB00000532855900401
Figure DEST_PATH_GSB00000532855900411
N/A＝未扩增
MagSweeper参数
在本实施例中使用的装置已经在上文中进行了描述。更为具体地，该装置使用具有圆底的强力钕磁棒。该棒的直径为6mm(50mm2捕获面积)并且在棒的底部的磁通密度为0.5特。该磁棒与致动器连接以扫遍血液样品和提取免疫磁性-标记的肿瘤细胞。在捕获过程中，该棒覆盖在由聚氯乙烯(PVC)构成的可分离的、超薄(～25微米)惰性塑料中。如先前所述，由于磁棒套在塑料套管内，标记的细胞被吸引至塑料套管；棒从其套管中的脱离可去除强磁场梯度并有助于简单地去除标记的细胞。选择PVC是因为在21种检测过的套管材料中，其没有非特异性的血细胞结合。
在MagSweeper中使用的磁体购自K&J Magnetics，Inc.(Jamison，PA)。自动机械驱动带套管的棒以覆盖整个孔面积的重叠同心圆环的模式(in a  pattern of overlapping concentric circular loops)扫遍含有血液样品的孔(每孔一棒)。带套管的磁棒以每秒2mm以重叠的同心圆扫遍样品，捕获标记的细胞和游离的磁珠，以及一些污染血细胞。考虑下列各项来选择扫集速度：i)细胞捕获效率；ii)足以分离吸附的非磁性标记的细胞的剪切力的施加(清洗步骤图2D)；以及iii)防止损害脆弱的CTC。通过实验发现，最适圆周速度为约2mm/秒。在细胞捕获之后，带有附着细胞的带套管的棒移动到含有磷酸盐-缓冲盐水(PBS)的新孔中。细胞以圆形扫遍所述清洗缓冲溶液以去除可能吸附在棒上的非标记的血细胞。最后，将棒和细胞移动到含有新鲜PBS的第三清洗孔中。通过将棒从套管中取出并且在孔的下方施加外部磁场使细胞释放到PBS中。磁性-标记细胞容易地离开塑料套管向孔的底部移动，释放可能困在标记的细胞和过量的磁珠之间的非标记的细胞。在再次将棒插入到它们的塑料套中之后，则再次捕获标记的细胞，其中俘获的污染血细胞少得多。连续的捕获-清洗-释放-再捕获循环显著提高了纯度并且去除了所有的血细胞污染。
将装载到6-孔板的样品放置到MagSweeper的捕获位置。编排放入其塑料套管中的磁棒以使按程序以2mm/秒的速度以13圈同心圆环扫遍免疫磁性-标记的血液样品，每圈偏移1mm。立即重复所述捕获。然后，将带套管的磁棒移动到清洗位置，在该位置磁棒插入并在10ml PBS中扫集30秒，然后再次在10ml新鲜的PBS中清洗。随后在释放位置，棒插入到新鲜的含有PBS的6-孔板中。之后将棒从它们的套管中取出。然后将该释放板移动到捕获位置并使用新的套管至少再重复一次所述捕获-清洗-释放步骤。
标记和单细胞分析的流程
为了捕获CTC，利用以抗-EpCAM抗体功能化的4.5μm顺磁珠(Dynabeads)标记CTC细胞膜。大磁珠容许在仅有一个附着的珠的条件下分离细胞，并且减少了对CTC高表达EpCAM抗原的需求。细胞可以仅具有一个附着的珠，或者可以具有多个附着的珠。
MagSweeper平台允许视觉确认释放到溶液中的CTC；通过移液管抽吸单独提取这些不含污染的血细胞的CTC，从而容许单细胞分析。尽管另一技术，即细胞分选，也可产生纯的单个细胞，但是大量细胞被吸附在管中，因此需要输入数以百计的CTC，这使得现有的分选技术对于大部分癌症患 者的单细胞CTC是不切实际的。
利用Axio Observer A 1倒置显微镜(inverted microscope)(Carl Zeiss Microimaging， 
Figure DEST_PATH_GSB00000532855900431
Germany)通过视觉观察鉴定CTC并拍照。在视觉观察的指导下使用Pipetman P2(Gilson，Inc，Middleton，WI)手动抽吸单细胞。以1μl体积收集细胞，然后加至0.2μl的SUPERase-InTM RNAse抑制剂(Applied Biosystems/Ambion，Austin，TX)，再在干冰上冷冻。将样品储存在-80℃直到进行处理。
这些显微镜观察表明本发明和装置产生了纯的CTC组合物，其中没有污染的血细胞，例如白细胞、红细胞、血小板等。在本方法中，使用在临床上是实际的约9ml人血液样品，可以获得至少含有10个CTC的组合物，表示从人外周血获得了与CTC的定义所含意思一样的基本上纯的(至少90％纯，优选95％纯，且通常为100％纯)人CTC的新组合物。通过显微镜检查看到这种组合物不含外来细胞。
MagSweeper的性能通过如下测量捕获效率和细胞纯度来测试，即通过将来自MCF7和SKBR3人乳腺癌细胞系的5-50个磁性-标记的细胞掺入普通全血中并用MagSweeper处理来测量。在重复实验中(对于每个检测的细胞系n＝9)，发现对于MCF7细胞的细胞捕获率为59％±27％，而对于SKBR3细胞为66％±17％。在所有情况下，在两轮捕获-清洗-释放之后，如通过视觉检查所确定的，分离的细胞具有100％纯度(没有污染的WBC)。
显示捕获的细胞的生存力和基因表达的初步研究
为了研究在生理的环境下MagSweeper捕获CTC的能力，使用了模式系统在小鼠中产生CTC。在20只无免疫应答(NOD-SCID)的雌性小鼠中，通过向它们的乳房脂肪垫(fat pad)注射MDA-MB-231人乳腺癌细胞来产生同位肿瘤异种移植物。在注射50天后，平均肿瘤体积为1.5cm3并且在所有小鼠中均可以观察到显微镜下的肺转移灶。注射盐水的对照小鼠没有形成原发性肿瘤或转移灶。将小鼠血液用免疫磁珠(针对人EpCAM抗原)标记，并用MagSweeper处理。从每只患有肿瘤的小鼠捕获了超过100个CTC，但是从对照小鼠的血液没有捕获到CTC。通过MagSweeper分离的CTC保持了其在培养中生长的能力，再次确认了CTC的存活力。所有捕获的CTC的单个细胞生物标志概略与来自用于生成肿瘤异种移植物的亲本细胞系的单 个细胞相匹配。与体外实验相似，这些小鼠实验表明能够在不改变基因表达的情况下体内捕获高质量的CTC。再次通过视觉观察确认了所有提取的CTC的纯度为100％。图7中所示的结果表明了来自分离的CTC的RNA的完整性。
单个细胞分析
为了确定本捕获方法对于CTC基因表达概况的影响，利用使用了集成流路和集成的微型机械阀门的高通量微流体芯片，对通常含有皮克量RNA的单个捕获细胞进行分析，以进行高灵敏度的平行qRT-PCR测定(Fluidigm48.48Dynamic Array，在J.Liu，C.Hansen，Quake S.R.Anal.Chem.75，4718-4723(2003)和S.L.Spurgeon，R.C.Jones，R.Ramakrishnan，PLoS ONE3，e1662(2008)中有进一步描述)。
使用CellsDirect qRT-PCR试剂盒(Invitrogen，Carlsbad，CA)预扩增样品。对于下述基因进行了15个TagMan表达测定(20×)(Applied Biosystems，Foster City，CA)，其中括弧中的编号表明进一步信息的来源，其形式或者是Applied Biosystems目录编号(genes 1-3)或者是基因符号，Gene hCG2043341Celera注释：
1.人GAPD(GAPDH)内源对照(4333764F)；
2.人ACTB(β-肌动蛋白)内源对照(4333762F)；
3.人RPLPO(大核糖体蛋白)内源对照(4333761F)；
4.ESR1(ER，Hs00174860_m1)；
5.PGR(PR，Hs00172183_m1)；
6.ERBB2(Her2，Hs00170433_m1)；
7.VIM(Hs00185584_m1)；
8.KRT19(CK19，Hs00761767_s1)；
9.TACSTD1(Ep-CAM，Hs00158980_m1)；
10.CD44(Hs00153304_m1)；
11.CD24(Hs00273561_s1)；
12.EGFR(Hs00193306_m1)；
13.CRYAB(Hs00157107_m1)；
14.FOXA1(Hs00270129_m1)；
15.FOXC1(Hs00559473_s1)。
将这些TagMan基因表达测定物(20×)汇集在一起，并用TE缓冲液稀释得到1×的测定混合物。在包括下述物质的10μl体积中进行预扩增：5.0μlCells Direct 2×反应混合物，0.5μl1×汇集的测定混合物，1μl细胞[或人参照RNA(Stratagene，La Jolla，CA)]，2.5μl TE(pH8.0)，以及1μl RT-Taq酶。RT步骤在50℃进行15分钟，随后进行18个循环的扩增(95℃进行15分钟，然后在60℃进行4分钟)。在TE缓冲液中将预扩增的cDNA稀释2倍然后储存在-20℃。
CellsDirectTM(来自Invitrogen Corp.)qRT-PCR试剂盒直接从细胞提供高度灵敏和特异性的实时qPCR结果，当每个反应测试的细胞少于10000个至低至1个细胞时，不需要RNA纯化步骤。CellsDirectTM技术是为了较少样品的最大灵敏度而设计的。因为去除了昂贵且耗时的RNA纯化步骤，其对于高通量应用特别具有价值并且对于基因表达实验也较为理想。使用TaqMan Universal Master Mix(TaqMan通用主混合物)(Applied Biosystems，Foster City，CA，[TaqMan通用主混合物试剂提供一种PCR混合物，其可以与任何适当设计的引物和探针一起使用以检测任何DNA或cDNA序列])以及48.48动态阵列芯片、NanoFlexTM 4-IFC控制器和BioMark实时PCR系统(Fluidigm Corporation，South San Francisco，CA)来进行多重qRT-PCR。根据以下标准Fluidigm规程(Spurgeon等人的“High Throughput Gene Expression Measurement with Real Time PCR in a Microfluidic Dynamic Array，”PLoS ONE 3(2)：e1662.doi：10.13712008)使用阵列。首先在NanoFlexTM 4-IFC控制器中将Krytox加载至芯片。然后，将含有2.5μl2×TaqMan Universal Master Mix，0.25μl DA样品上样试剂(Fluidigm Corporation，South San Francisco，CA)，以及2.25μl预扩增的cDNA的5μl样品混合物移液到样品入口。将含有2.5μl 20×基因表达测定混合物(Applied Biosystems，Foster City，CA)和2.5μl DA测定上样试剂(Fluidigm Corporation，South San Francisco，CA)的5μl测定混合物移液到测定物入口。然后装载芯片并在NanoFlexTM 4-IFC控制器中混合。利用BioMark实时PCR系统进行芯片的qRT-PCR反应。循环程序的组成如下：95℃10分钟，随后进行95℃15秒、60℃1分钟的循环40次。
每一个Biomark芯片可以针对48个基因靶物测定48个样品。表3表示 的结果是代表性Ct值，其是基于仅使用人类序列特异性引物对15个基因的一式三份测量的值，其中以水作为阴性对照。下表3表示的是之前作为热图(heat map)(未示出)表示的数据的数值样本。该表说明了三个持家基因(GAPDH、β-肌动蛋白和PRLPO)和12个与患者A～G中乳腺癌相关的基因的表达概况。尽管持家基因的水平没有随细胞的不同而变化，在测量的其它基因中发现了在基因表达上的显著差异，甚至是来自同一患者。表4显示所述数值在患者和患者之间也有所变化。
表4
  FOXA1   CD44   ER   PR   VIM   ERBB2   EpCAM
  A1   21.4   20.27   24.27   21.55   18.2   22.63
  A2   22.34
  B1   27.72   19.05   26.06
  B2
  B3   23.54
  C1   22.99   21.58
  D   23.16
  E1   25.94   24.22
  F1   20.75   25.13
  F2
  G1   23.19
  GAPDH  β-肌动蛋白   RPLPO   RPLPO   CRYAB   EGFR
  A1   14.75  15.95   18.46   18.39   17.12   23.7
  A2   19.58  21.03   24.67   24.1
  B1   19.1  21.91   23.15   23.51
  B2  22.62   25.59   26.74
  B3   20.92  18.47   23.41   22.38
  C1   19.88  18.89   23.4   23.66
  D   22.51  27.89   25.5   24.77
  E1   29.86  32.05   27.36   27.79
  F1   21.42   22.87   23.55   23.54
  F2   21.15   20.12   25.98   27.38
  G1   22.07   24.47   30.09
表4-续
  FOXC1   CD24   CK19
  A1   22.63   19.55   17.34
  A2
  B1
  B2   23.43
  B3   24.91   25.21
  C1   31.65
  D   23.05
  E1
  F1   24.41   19.5
  F2   24.14   26.39   22.29
  G1
表4A-仅患者A的结果
Figure DEST_PATH_GSB00000532855900471
Figure DEST_PATH_GSB00000532855900481
表4和4A显示了15个基因的基因表达数据，其中表达是对从7位患者分离的单个CTC(用7个字母A-G表示)进行的。对于每一个单个的CTC，15个基因中的每一个基因均以一式三份测量(显示1次测量的数据)。患者A、B和F具有相继的血液抽取(sequential blood draw)，表示为A1和A2；B1，B2和B3；F1和F2。表3A示出了来自相同患者的单独的细胞来示例CTC之间的可变性。
将掺入血液中并通过MagSweeper捕获的单个MCF7细胞的基因表达概况与亲本细胞系比较。在标记和捕获之后，所述细胞在基因表达方面没有显著的变化。另外，在单细胞水平，亲本细胞系的细胞异质性在通过MagSweeper捕获的单细胞中得到了重现。这对于人类CTC的研究是一个重要的方面：如果在给定的癌症患者中存在不同的CTC群体，那么只能在单细胞水平观察到CTC异质性。
从转移性乳腺癌患者分离CTC
上述体外和体内临床前实验显示了本装置提供了对CTC的温和分离和完全纯化，且没有影响细胞的存活力或基因表达。然后在临床应用中检测了MagSweeper的性能。在得到同意后，从11名患有转移性乳腺癌的女性和5名健康的志愿者(正常对照)处获得了血液样品。在样品采集前，已经根据Stanford′s Human Subjects Research Compliance Board和HIPAA规章，得到了患有已知的转移性乳腺癌的患者或者健康的正常对照的同意。将血液收集在10mL的BD Vacutainer塑料EDTA管(Becton Dickinson，Franklin Lakes，NJ)中。通过静脉穿刺和/或从植入进入静脉的通道口(access port)收集血液。丢弃每次抽血的前3cc样品以防止来自针穿刺位点的皮肤上皮细胞的 污染。随后，从每个人受试者采集了约9ml的血液并在室温下保存。在采集后3小时内处理所有的血液样品。将血液分瓶到三个管中并用PBS将每管稀释到6ml，并且在室温下用3.4μl 
Figure DEST_PATH_GSB00000532855900491
进行标记，在连续混合条件下进行15分钟。然后将样品放置在EasySep磁体(Stem Cell Technologies Vancouver，BC，Canada)中2分钟，然后再混合15分钟。将这些样品加入6-孔板的孔中，用PBS补足至10ml，随后通过MagSweeper进行处理。将4.5μm珠用单克隆BerEP4包覆，BerEP4对于上皮细胞表面表位(EpCAM)是特异性的，在J Clin Pathol，1990March；43(3)：213-219中有对BerEP4的进一步描述。在室温下，在持续混合的条件下，温育珠30分钟。在预混合步骤中使用EasySep磁体从而帮助珠与抗体连接。
从全部11位(100％)癌症患者都提取了CTC，而从健康的对照都没有(0％)提取到CTC。这与之前的研究是一致的，之前的研究在60-100％具有转移性乳腺癌的患者中鉴定了CTC，而在健康的对照者中鉴定了0-1个CTC。对于235个通过MagSweeper捕获的单独的CTC的每一个进行拍照，然后使用高通量微流体阵列进行分析以测定15个基因的表达概况。对于每一个单个CTC，描绘了下列基因表达的概况：3个持家基因(GAPDH、β-肌动蛋白和RPLPO)；2个乳腺癌内分泌(endocrine)生物标志(雌激素受体ER和孕酮受体PR)；2个受体酪氨酸激酶基因，对于这两个基因，有可用的定向疗法用于乳腺癌治疗(ERBB2/HER2和EGFR)；3个之前通过DNA微阵列研究鉴定的与乳腺癌腔内和基底亚型(luminal and basal subtypes of breast cancer)相关的基因(FOXA1、FOXC1和CRYAB)；2个上皮基因(CK 19和EpCAM)；2个用于癌症干细胞鉴定的基因(CD44和CD24)；以及间充质基因(波形蛋白VIM)，其涉及上皮-到-间充质转换(EMT)和间充质-到-上皮转换(MET)以及乳房祖细胞(breast progenitor cell)。
全部11位乳腺癌患者在获取他们的血液样品时均在接受化疗。在此使用的MagSweeper在10位(91％)转移性乳腺癌患者的血液中捕获了至少一种持家基因具有可测量的表达的CTC。我们保守地仅在全部3种持家基因均得以表达的情况下，将CTC定义为具有“强力的基因表达(robust gene expression)”；这样做是为了避免分析具有降解的RNA的CTC，如可能在正在经历凋亡或细胞毒性降解的CTC中所观察到的。在11位患者中，7位(64％)具有至少一个具有强力基因表达的CTC。48个CTC具有强力的基因 表达。其它187个CTC表达了0～2个持家基因。与我们的发现一致，形态学研究和分子研究显示了在正在进行针对转移性疾病的治疗的患者的血液中通常观察到成碎片的或正在凋亡的CTC。
对于所述七位具有强力CTC基因表达数据的患者，对原发性肿瘤、任何可用的(available)转移灶、和CTC的标准乳腺癌生物标志(ER、PR和HER2)的概貌在表5中进行了比较。在原发性肿瘤和CTC之间存在明显的不一致。特别地，在早些年切除过ER-阳性乳腺癌的患者和目前具有多处远端转移(distant metastases)的患者之间，他们的CTC几乎排他地显示出ER-阴性表型。这可以解释为什么在患有激素受体阳性的原发性乳腺癌的病人中内分泌疗法最终无法控制转移性疾病。所有患者均有一些具有三重阴性(ER阴性/PR阴性/HER2阴性)概况的CTC，即使没有患者最初具有三重阴性原发性肿瘤(triple negative primary tumor)。具体而言，一位患者(患者B，样品B1，B2，B3)患有显示出强HER2扩增的原发性乳腺癌，而她的转移性疾病在使用曲妥单抗(一种靶向HER2细胞表面受体的人源化单克隆抗体)的条件下继续发展。与她的原发性癌不同，她的CTC中仅有一个表达HER2，并且几乎她的所有其它CTC均为三重阴性(16/19，1/1和7/7，分别针对样品B1，B2和B3)。她大部分CTC的三重阴性表型与她的活检脊椎转移的三重阴性表型相吻合，这表明与原发性肿瘤概况相比，CTC生物标志概况可以更好地反映转移表型。也可以解释在进行性转移性疾病中的曲妥单抗抗性。与患者B相比，患者A(样品A1)在她的大部分CTC中表达了HER2。在用曲妥单抗治疗之后，她的CTC计数从每9cc血液几百个减少到5个细胞(样品A2)。在从样品A2中分离的5个CTC之中，仅有一个表达了全部3个持家基因并且这个细胞缺乏HER2的表达。
表5
Figure DEST_PATH_GSB00000532855900501
Figure DEST_PATH_GSB00000532855900511
上表5显示了患有转移性乳腺癌的、具有至少一个有强力基因表达的(表达全部3个持家基因)CTC的7位患者的生物标志概略。在四个月的阶段中，患者A，B和F进行了相继的血液抽取。显示了原发性肿瘤、转移灶(如果存在)和CTC的标准乳腺癌生物标志概略(ER、PR、HER2)。对于标准生物标志概况和每种CTC表型(MSCs，PDEs和DTEs)，分子为该表型的CTC的个数，而分母为从每个样品分离的CTC的总数。只显示出具有强力基因表达的CTC的数据。波形蛋白是最常观察到的由CTC所表达的基因。将分化的肿瘤上皮细胞(DTE)定义为表达了ER、PR、HER2、或EGFR以及至少一种其它乳房上皮基因(FOXA1、FOXC1、CRYAB、EpCAM或CK19)的CTC。将部分分化的上皮细胞(PDE)定义为没有表达ER、PR、HER2或EGFR，但仍然表达了至少一种上皮标志的细胞。如果CTC仅表达了波形蛋白或CD24，我们也将其表示为PDE，原因是其簇集的位置，尽管还需要进一步的表征。将共表达波形蛋白和CD44的CTC定义为间充质-样癌症干细胞(MSC)。
大部分CTC的概略在它们的波形蛋白和CD44表达上是令人惊讶的。间充质和乳房祖细胞表达的波形蛋白与细胞运动性、侵入、高肿瘤等级和转移相关。来自7位患者中的六位(86％)的CTC和全部具有强力基因表达的CTC的60％强力地表达了波形蛋白。另外，我们在超过70％的患者中和具有强力基因表达的全部CTC的超过半数中发现了表达CD44的CTC。CD44为细胞表面粘附分子，其由推定的乳腺癌干细胞表达。在具有降解概况(degraded profile)的细胞中(表达0-2个持家基因)，CK19是最常表达的基因(36％-62％)，而波形蛋白和CD44仅分别在12-27％和0-27％中表达。这表明，与更强力表达波形蛋白的细胞相比，更类似上皮细胞的细胞可能对正在经历化疗的患者血流中的降解更为敏感。
在体外实验中，单个捕获的细胞重现了亲本细胞的异质性。因此预测在临床样品中观查到的任何变化会类似地反映转移灶内不同的细胞群体。当分析从具有转移性乳腺癌的患者分离的CTC时，发现它们展现出一段基因表达的谱，范围从更加分化的肿瘤上皮细胞(DTE)到部分分化的上皮细胞(PDEs)再到间充质-样癌症干细胞(MSCs)。DTE表达ER、PR、HER2或EGFR以及至少一种其它乳房上皮标志例如FOXA1、FOXC1、CRYAB、EpCAM或CK19。PDE没有表达ER、PR、HER2或EGFR，但仍然表达了至少一 种上皮标志。如果细胞表达单独的波形蛋白或CD24，则我们也将其表示为PDE，尽管其还会需要在更大的系(a larger series)中的进一步表征。最后，w我们发现了重要的CTC类别，其共表达波形蛋白和CD44，但不表达其它标志；这些细胞似乎代表了一类间充质-样癌症干细胞(MSC)或乳房祖细胞。这些特殊的CTC可能对应于Neve等人(R.M.Neve et al.，Cancer Cell，10，515-527(2006))描述的乳腺癌细胞系中的基础B表型和由Korshing等人(E.Korsching et al.，J.Pathol，206，451-457(2005))在原发性人乳腺肿瘤中鉴定的乳房祖细胞。在进行系列血液分析的3位患者中的两位中，CTC群体随时间变化，在强力表达的CTC中显示出DTE比例的逐渐降低。第三位患者仅具有PDE。由此我们提出PDE和MSC比DTE的化学抗性更强，而这些较少分化的CTC的存在代表了进行性转移疾病的特点。在正在经历针对广泛转移的乳腺癌的治疗的患者中，单独CTC基因表达的固有变化提示为了遗传分析而汇集CTC会使特定的群体变得不明显，而需要单细胞分析来实现对转移生物学全部情形的描绘。在这些结果中，具有强力基因表达的人CTC中的25％具有间充质干细胞样表型(mesenchymal stem cell-like phenotype)，其可能需要进行特异性的治疗靶向(R.S.Finn et al.，Breast Cancer Res.Treat.105，319-326(2007))。对在转移癌中的单独CTC进行表型分析可以获得更为个性化的治疗。
其它细胞研究
将50个HLA-A2阳性细胞作为目标细胞掺入含有不同量的HLA-A2阴性细胞的溶液中。使用以抗-HLA-A2抗体功能化的4.5μm磁珠标记目标细胞(HLA-A2)。发现在2轮捕获-清洗-释放之后，通过MagSweeper分离的目标细胞的捕获率和纯度为约60％，与背景细胞数无关。分离的HLA-A2细胞的纯度为100％，直到背景细胞超过2×105，而在背景细胞数为2×106时纯度为89％±2％。另外，该数据表明当背景细胞高达2×107时，使目标细胞富集2.5×105倍。
在荧光显微镜下对捕获的细胞进行了视觉检察之后，我们发现大部分污染细胞附着于磁珠。这表明纯度受到抗体特异性和试剂质量的限制。
在另一个实验中，将50个来自人乳腺癌细胞系MCF7的染色癌细胞掺入1ml染色的自健康人志愿者抽取的外周血中。为了便于检测，根据厂商 的建议，用SNARF-1(Invitrogen，CA)和CFDA SE(Invitrogen，CA)荧光染料分别对目标MCF7细胞和背景血细胞进行染色。用4.5μm顺磁珠标记MCF7细胞，所述磁珠是用针对上皮细胞粘附分子(EpCAM)的抗体功能化的，所述上皮细胞粘附分子是在上皮细胞的细胞膜上表达的，但不在白细胞或红细胞上表达。4.5μm磁珠允许在仅有一个珠附着于细胞的条件下分离目标上皮细胞，其使得该方法适合于分离具有中到低EpCAM表达的CTC。
发现MagSweeper对MCF7细胞的捕获效率为66％±10％，纯度为23％±5％。然而，发现如果分离和标记过程在4℃进行，那么纯度可以增加到91％±6％。
为了评估在分离过程中MagSweeper方案是否干扰CTC的基因表达概况，利用微阵列分析研究了MCF7细胞基因组范围的转录组表达概况(genome wide transcriptome expression profile)。将20,000个在培养基中的培养的MCF7细胞的表达概况，与数量相似的在MagSweeper分离之前和之后与抗-EpCAM磁珠一起温育30分钟的MCF7细胞比较。培养的细胞和MagSweeper分离之后(的细胞)的基因表达变化系数相当，表明几乎没有因分离而使变化增加的证据。另外，分析了培养的细胞和MagSweeper(细胞)之间基因表达倍数变化。探针组(probe set)中的42％具有小于10％的变化，另外35％具有10-25％的变化，另外的17％为25-50％。对培养的细胞和MagSweeper之间基因表达的统计学分析显示，在5％的错误发现率(false discovery rate)(FDR)时，没有显著的变化，表明MagSweeper分离方案在分离过程中不会在细胞的基因表达概况中引起任何显著干扰。
对分离的稀有细胞的进一步操作
自动单细胞回收
所述用于获得基本上纯的组合物的方法可以包括处理后的(post-processing)样品制备步骤，该步骤会使单细胞鉴定、提取和沉淀实现自动化。这可以通过自动化抽吸和磁性微量提取(microextraction)来实现，其中将单个分离细胞置于含有1-2微升为多重分子分析制备的流体的收集管中。现参考图9，该图示出了示例性全自动化细胞提取系统的示意图，其中可以从获得自MagSweeper的由珠包覆的细胞簇获得单个活细胞。在这个装置中，将含有目标的样品1102(即从本分离装置的收集孔获得的细胞簇或细 胞)放置在由计算机控制的机械驱动台1104上，其用于支承细胞。倒置显微镜1106获取细胞图像，并将视野传送给线阵CCD图像传感器1108(linear CCD image sensor)，其能够探测细胞和它们的外形以及其它可视特征。干涉仪1110也在光学上与细胞相连接以从照明源1112获得关于透光细胞的信息。控制计算机1114接收来自于图像传感器1108和干涉仪1110的数据。计算机1114也控制致动器1116，通过一个机械定位器(mechanical positioned)1118。致动器1118可以与自动移液器或微量提取器1120或者磁性装置连接，如下所述。计算机使用图像识别软件和接收自干涉仪和CCD图像传感器的信息。在操作过程中，通过照明带连续扫描含有目标的样品。线阵电荷耦合装置(CCD)随后逐行捕获图像。然后将图像集合到控制计算机的二维图像中。控制计算机按照程序来鉴定每一个目标，如下所述。利用来自干涉仪的平台位置信息(stage position information)，以及来自于CCD的行和高度信息，作为响应，计算机移动微量提取器头(tip)到位置处。然后可以提取目标(单独的细胞)。随后控制计算机会促动机械定位器，而微量提取器会被移动到收集管(未示出)，目标则被释放到收集管中。为样品中的每一目标重复这一过程。
自动移液
从细胞群获得单细胞的一种方法使用了细胞操作器系统，例如Eppendorf TransferMan NK2TM可以充当初始系统。然而，TransferMan使用手动操作的控制杆(joystick)。全自动系统可以是定制的。在一个实施方式中，在实时图像中控制器会点击(click)每个目标上的光标(cursor)；显微镜台和光标的联合坐标随后将传到计算机中，该计算机会引导移液管头到目标处。控制器会电起动目标进入移液管的抽吸过程。然后，移液管将会被移动到目标细胞将要被分配于其中的收集管。为了创建定制系统，可以建立一个有现货供应的微型操作器系统，例如Eppendorf TransferMan NK2。将这个系统与我们实验室中的Zeiss Axiovert倒置显微镜相连。使用控制器-辅助的可视反馈，用机动化的平台系统(motorized stage system)来放置样品。将不同的电子移液管系统与微操作器相连接，以便检测。合适的备选包括手持设备(handheld instrument)，例如Hamilton Gastight数字注射器手持设备，其可以设定用于重复的抽吸和分配，并改进为外部促动。程序控制注射器提取及释放预定的体积。在通过这些电子移液管中的任一抽吸CTC之后，可 以在控制杆的控制下移动该移液管以便释放到收集管中。对于手动抽吸，我们原来使用了小移液管头(150微米内径)。然而，锋利的边缘会促成细胞破裂，因为会引起大的局部压力，这种压力引起了对目标的剪切，因此我们更换为较大直径的头(0.5-10μl微量移液器头，400微米内径)。如果由于移液管的剪切导致的细胞破裂在自动移液系统中产生了问题，我们的移液管设计的一个变型会是横在口(orifice)上设置能够提供一个垫的带孔的平帽(perforated cap)。带孔的平圆盘硅末端帽(perforated flat disk silicon end cap)可以附接到玻璃移液管头的末端，该头具有0.25-0.5mm的末端开口，其中圆盘具有3-5个小孔。
作为移取单个细胞的替代方法，可以使用能够经显微操作以附于单个细胞的磁性探针。使用局部化磁场用于CTC提取的基本原理是不使用多余的珠或溶液提取目标，并且在潜在地比通过抽吸达到的细胞破裂更少的情况下进行提取。由软磁材料(例如，可以通过购买获得并且可以经后续退火的纯铁)制备的线促进CTC释放(软磁体可以轻易地去磁化)。为了避免沿着线的长度捡拾多余的珠，会通过非磁性材料来封装除尖端以外的线。采用这样的构型，目标上的磁力会迅速下降。简单的数值计算显示在每距尖端表面1个尖端半径的距离内，磁力会下降超过10倍。在目标上产生的力可以通过下述公式计算。
F = VKH ∂ H ∂ x
其中，V表示目标的体积，K为磁化率，而X为距离。
对于软铁，K可以超过1000并且表面的最大场可以超过1T(特)，但0.2T的数值可能是更为实用的最大值。目标的体积可以在10-15～10-14m3的范围。磁性微量提取器的操作涉及使尖端靠近附近(例如，小于100微米)并且随后通过连通电流给螺线管通电。与之前一样，随后在控制杆的控制下移动微量提取器到收集管处。为了目标的释放会将电流切断。如果目标没有释放，可以在降低振幅的情况下连续地反转磁场。也可以施加较大梯度的外部磁场来辅助目标释放，类似于已经在MagSweeper操作的最后一步中使用过的方法。
磁性部件构建的更多细节
图6说明了磁场对细胞的影响。在这个实施方式中，套管902沿棒904侧部的至少一部分紧密地装配在磁棒上，并且紧密地装配在尖端。(扩大间隔是为了说明的目的。)在边界层908内的没有充分磁性标记的细胞906仅在横向上受到影响。具有足以处于棒的磁力中的珠的细胞910被棒所吸引。因此，使用的具有套管的磁性部件含有陡峭(sharp)的磁场梯度以强力结合靠近棒附近的标记的珠是重要的。所述关系在B2对方向z所作的图中显示。陡峭的磁场梯度会在磁体表面(在此情况下即在尖端)附近产生高强度的场。图6中的插图说明磁通密度B2沿z轴(远离棒)衰减。由于陡峭的磁场梯度，在距离尖端6mm以外，通过建模发现存在的磁力极小。
本方法还可以包括不需要用户输入的用于CTC鉴定的目标识别技术。对细胞图像识别软件的进一步描述可以在Karacali等人的“Automated recognition of cell phenotypes in histology images based on membrane-and nuclei-targeting biomarkers，”BMC Medical Imaging 7：7(2007)中找到，该文章见于在线的www-biomedcentral.com/1471-2342/7/7。如该文献所述，通过互联网站服务器控制的开放访问系统(open access system)，例如EAMUSTM，最近被开发用来从免疫组织化学染色的组织切片和组织微阵列提取定量参数。也已经开发了数种商用软件包用于组织学切片和组织微阵列的细胞分析，例如Beecher Instruments(Beecher Instruments，Inc.，686Progress Way，Sun Prairie，WI 53590，USA)的Tissue Microarray Analysis Software(组织微阵列分析软件)(TMAx)，Tripath Imaging(Tripath Imaging，Inc.，780Plantation Drive，Burlington，NC 27215，USA)的Extended Slide Wizard，Becton-Dickinson(Becton-Dickinson Biosciences，Postbus 757，2400AT Alphen aan den Rijn，The Netherlands)的Discovery Image Analyser。这些系统可以用来辨别附着有珠和抗体的分离的CTC。
对磁性参数和可能的磁性部件构型的进一步说明如图10所示。如该图中所示，可以使用磁体1402，其可以不是棒，但在宽度上可以从横向向极的方向延伸。其可以横向(laterally)扫遍池。磁体1402在一极包含一个渐缩区域1404，其可以为半球形的，或可选地，如图所示，包含复合线性变窄，其具有第一变窄区1406和更急剧变窄的远端区域1408，其以锐利的尖端或在磁极(例如南极)处具有小曲率半径的尖端结束。如1410磁力线所示例的磁场，接近容器1416的非磁性底面。列举的构型改善了磁体的简单的钝末 端或半球形末端的磁场梯度。该构型可以用于棒的尖端，用于多种磁体，并且对具有相对磁极(opposing pole)的磁体可以进行编排使梯度更为陡峭。
分离细胞的培养
除对分离的单独细胞进行遗传学分析之外，本装置和方法可以用来捕获可以在培养基中生长的活细胞。按照下述方法开发用于检测捕获细胞生存力的模型，即通过自人类乳腺癌细胞系(MDA-MB-231)和从乳腺癌患者处切除的原发性肿瘤二者生成肿瘤异种移植物，并将其同位移植到无免疫应答的雌性小鼠(NOD-SCID)的乳房脂肪垫中。在四十只小鼠中，MDA-MB-231癌细胞形成了乳房脂肪垫肿瘤和肉眼可见的肺转移灶。取小鼠血液并使用人-特异性EpCAM-标记的磁珠捕获了数以百计CTC。将这些CTC放置到培养基中并进行温育。CTC附着在培养皿上并且迅速增殖。注射盐水的对照小鼠没有产生原发性肿瘤或转移灶，并且它们的血液不含CTC。另外，从原发性人乳腺癌生成了三份肿瘤异种移植物。从女性患者处切除了肿瘤组织并且将其移植到小鼠乳房脂肪垫中。从全部三份异种移植模型的小鼠血液分离了人CTC，并且将来自一个模型的CTC维持在培养中。据我们所知，这是首次证明从原发性人肿瘤异种移植物分离活的人CTC。这些方法为培养患者-特异性CTC铺平了道路，其可以用于测试药物、发现药物或其它研究。
上述内容显示本装置可以从全血分离活的纯的循环肿瘤细胞用于遗传分析。也可以将该装置和本方法应用于从母体血液中捕获胎儿细胞。掺加细胞(spiked cell)和肿瘤细胞的捕获显示无血细胞的污染，我们研究了提高捕获效率的方法，捕获效率通常平均为25％。在此，我们比较了从两位具有转移性乳腺癌(具有原发性肿瘤和转移灶表型的转移乳性腺癌)的患者处分离的单个CTC的多重qRT-PCR数据。在患者SM014中，尽管她的原发性肿瘤为ER-/PR-/HER2+，CTC为ER-/PR-/HER2-，这与她在用曲妥单抗时仍然继续发展的骨转移性疾病的表型匹配。在患者SUBL017中，原发性肿瘤为ER-/PR+/HER2-，并且介入锁骨(intervening supraclavicular)LN转移为ER+/PR-/HER-。我们捕获并分析了该患者的CTC，该患者目前具有未知受体状况(receptor status)的进行性的骨转移灶，CTC显示为ER-/PR-/HER2-表型。我们也发现了来自相同患者的CTC的基因表达是变化的。我们的数据 说明单个CTC基因表达是高度可变的并且可以反映来自单个或多个转移病灶的细胞的异质性。
自动机械的使用使得可以对所述设备进行编程以利用多个样品，例如在6孔板中。可以通过程序控制该自动机械来改变捕获和释放时的构型从而优化捕获效率和样品纯度。自动机械可以与所有可市购的免疫磁性颗粒一起使用。可以对自动机械进行改进，例如使得具有塑料套管的磁棒能够沿圆形(in a circular)(通过将孔方在传送带型器械上)移动到它们的下一个位置(捕获、清洗、释放位置)，而不是目前构建的线形棒-臂推进(rod-arm advancement)方式。我们也可以增加正交臂(orthogonal arm)，用来手动地或自动地将附加的磁板滑动到最终释放位置的下方以促进细胞从塑料套管中释放。
在某些方面，本装置的特征可以在于包括：首先，扫遍血液或其它溶液的磁棒。这些棒为实际的磁体(轴向的或径向的)，而不是由外部磁体磁化的金属。第二，其包括在磁体上的可移动的塑料套管以辅助多次释放循环来保证高捕获效率和高纯度(无污染的细胞-其它装置具有100-1000∶1的污染细胞与捕获细胞比例)。第三，其包括致动器，用于磁体的扫集，以及用于在释放循环结束时进行扫集或者摇动步骤从而确保捕获的细胞释放到适当的溶液中。第四，其使用塑料(用于磁体上的套管)，塑料对污染细胞具有最低的非特异性结合。最后，其具有在极低输入数量的条件下捕获稀有细胞的能力。例如，癌症血液样品在每7.5cc的管中可能具有0-10个细胞。
在本方法中，可以获得由多个珠覆盖的细胞的组合物，并且所述组合物含有大量(至少25％)的目标细胞。可以手动通过显微镜和微量加液器挑取所述目标细胞，并提取DNA、RNA或其它材料，或者对该细胞进行培养。
结论
上述具体的描述意在举例和说明本发明，而不应当视为对本发明范围的限制，本发明的范围是由所附权利要求的文字和与其相当的范围来限定的。在本说明书中提到的任何专利或者出版物是用来显示该专利和出版物的所属领域的技术人员当时的水平，并且意在传达没有明确说明的但本领域技术人员能够理解的本发明的细节。在此引用每一篇及全部的专利或出版物意在说明进一步的信息，在此引入作为参考的程度与具体地和单独地 引入其中每一篇作为参考时相同，至法律允许的最大范围。
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Claims (24)

1.用于捕获和分离目标细胞的装置，其特征在于：
(a)用于盛装包含要分离的稀有目标细胞的样品溶液的样品容器；
(b)具有非粘附性套管的磁性部件；
(c)用于盛装回收溶液的回收容器；
(d)用于引起磁性部件(i)在容器之间，(ii)进入和离开容器，和(iii)在样品容器内在至少两个方向上的连续相对运动的致动器，以提供磁性部件和样品之间的连续相对运动；和
(e)用于当磁性部件在样品溶液中时产生穿过非粘附性套管的磁场，而当非粘附性套管在回收溶液中时基本上去除穿过非粘附性套管的磁场的机制。
2.权利要求1所述的装置，其中所述非粘附性套管包括磁性部件上的套管，并且用于基本上去除穿过非粘附性套管的磁场的机制包括将磁性部件从所述套管的至少一部分中移出。
3.权利要求1所述的装置，其中所述磁性部件包含电磁体，并且用于基本上去除穿过非粘附性套管的磁场的机制包括去磁化磁性部件。
4.用于从混合细胞群捕获和分离目标细胞的装置，其中所述目标细胞用磁响应性材料标记形成标记的目标细胞，所述装置的特征在于：
(a)具有尖端且另一端与致动器连接的磁性部件；
(b)在磁性部件和混合细胞群之间的套管以防止细胞与磁性部件直接接触，所述套管是非磁性的并且对于所述混合细胞群中的细胞是非粘附性的；
(c)所述套管可藉由致动器与磁性部件分离，所述致动器引起磁性部件和套管之间的运动，由此使磁性部件或多或少地移动到套管中；和
(d)所述致动器被这样构建并布置以在装置中引起(i)磁性部件和混合细胞群之间的相对搅拌运动，以使得磁性部件与混合细胞群中的大部分细胞接触，和(ii)引起磁性部件进入或移出容器的运动以从混合细胞群回收目标细胞。
5.权利要求4所述的装置，其中所述磁性部件为产生高磁场强度的直径至少为4mm的棒，并且所述棒具有用于产生高磁力梯度的渐缩的尖端。
6.权利要求4所述的装置，其中所述磁性部件为产生高磁场强度的直 径为1mm～10mm的棒，并且所述棒具有用于产生高磁力梯度的渐缩的尖端。
7.权利要求4所述的装置，其中所述磁性部件具有渐缩的尖端。
8.权利要求4所述的装置，其中所述磁性部件在尖端具有至少0.5特的场强。
9.权利要求8所述的装置，其中所述磁性部件为稀土磁体。
10.权利要求8所述的装置，其中所述磁性部件具有至少70磅的扯离强度。
11.权利要求8所述的装置，其中所述磁性部件具有0.2～1特的表面场强。
12.权利要求4所述的装置，其中所述致动器引起轨道运动使磁性部件与大部分细胞接触。
13.权利要求4所述的装置，其还包括一个或多个用于盛装样品、用于盛装清洗溶液和用于盛装从混合细胞群中分离之后的目标细胞的容器。
14.权利要求13所述的装置，其中存在分别用于盛装样品、清洗溶液和目标细胞的容器。
15.权利要求13所述的装置，其中所述容器包含对于目标细胞为非粘附性的材料。
16.用于从目标细胞和污染细胞的混合细胞群中捕获和分离目标细胞的装置，其中所述目标细胞用磁响应性材料标记形成标记的目标细胞，所述装置的特征在于：
(a)用于盛装样品的容器；
(b)具有尖端的磁性部件；
(c)在磁性部件和混合细胞群之间的套管以防止细胞与磁性部件直接接触，所述套管是非磁性的并且对于所述混合细胞群中的细胞是非粘附性的；
(d)所述套管可藉由致动器与磁性部件分离，所述致动器引起磁性部件和套管之间的运动，由此使磁性部件或多或少地移动到套管中；和
(e)所述致动器被这样构建并布置以引起(i)磁性部件和混合细胞群之间在容器中的相对搅拌运动，以使得磁性部件与混合细胞群中的大部分细胞接触，和(ii)引起磁性部件进入或移出容器的运动以从混合细胞群回收目标细胞。
17.权利要求16所述的装置，其还包括容器，所述容器包含具有与所 述磁性部件相反的磁体的部分，用于在分离的群体的形成中从磁性部件吸引分离的标记的目标细胞。
18.权利要求16所述的装置，其中所述容器限定出用于盛装样品的开放池。
19.权利要求16所述的装置，其中所述致动器包含引起磁性部件沿同心圆扫遍所述池的组件。
20.权利要求16所述的装置，其在一个容器中仅含一个磁性部件。
21.权利要求16所述的装置，其包含由单一致动器控制的多个磁性部件。
22.权利要求16所述的装置，其还包含探针，所述探针用于从去除污染细胞之后分离的目标细胞的收集品中提取单个目标细胞。
23.权利要求22所述的装置，其包含用图像识别软件编制程序并控制所述探针的计算机。
24.权利要求16所述的装置，其还包含用于从套管上去除目标细胞的磁体。 
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