CN104535772B - Her2高表达的循环肿瘤细胞的多肽-磁性纳米颗粒及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种人类表皮生长因子受体2(HER2)高表达的循环肿瘤细胞的多肽,尤其是一种可用于富集、分离和检测循环肿瘤细胞(CTC)的多肽‑磁性纳米颗粒及其制备方法和应用,所述多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO:1‑18之一所示;所述的多肽‑磁性纳米颗粒,其含有磁性纳米颗粒和与其相偶联的上述所述的用于特异性识别肿瘤细胞的多肽;所述的多肽或多肽‑磁性纳米颗粒在制备用于富集、分离或检测循环肿瘤细胞的产品或用于治疗肿瘤转移相关疾病的药物中可广泛应用。本发明提出了一种利用多肽对细胞表面抗原进行特异性识别和快速、准确检测CTC的新方法,为临床肿瘤转移患者的诊断、治疗和预后提供了有效方法。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域,具体涉及一种多肽,尤其涉及一种可以用于富集、分离和检测人类表皮生长因子受体2(Human Epidermal Growth FactorReceptor 2,HER2)高表达的循环肿瘤细胞(Circulating Tumor Cell,CTC)的多肽-磁性纳米颗粒及其制备方法和应用。
背景技术
癌症是威胁人类的重大疾病之一,侵袭与转移是恶性肿瘤最显著的特征之一,肿瘤细胞自发或因诊疗操作从原发肿瘤脱落,发生上皮-间质转化(Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT),从而具有流动特性,进入外周血中,就形成了循环肿瘤细胞(CTC)。因此在外周血中检测到循环肿瘤细胞(CTC)预示着有可能发生肿瘤转移,另外,美国哈佛医学院的最新研究表明,原位肿瘤组织能够吸引CTC细胞再次浸润到原发肿瘤上从而促进肿瘤的生长(可参考K.Pantel等人,Nat.Rev.Clin.Oncol.2009,6,339-351;J.Kaiser等人,Science2010,327,1072-1074),因此CTC的高效检测对于研究肿瘤转移机制有指导意义,而且可以对指导肿瘤治疗、判断治疗效果、推断预后提供可靠参考,对监测肿瘤的转移或复发都有非常重要的意义。
自1869年澳大利亚医生Thomas Ashworth在显微镜下首次从一名男性肿瘤转移患者的血液里观察到CTC以来,CTC的研究引起了人们的广泛关注。CTCs在血液中的含量极少(约几个CTCs/105~107个单个核细胞),人们对CTC的富集检测方法进行了不断的探究。这些方法可以分为两类:机械法和免疫分离法(可参考P.Paterlini-Brechot&N.L.Benali,Cancer Lett.2007,253,180-204)。前者是根据CTC与血液中的白细胞和红细胞的细胞直径及细胞密度不同,通过过滤或密度梯度离心的方法实现的;后者则主要是利用CTC表面的一些特异性标记物如:常见的上皮标记物细胞角蛋白(Cytokeratins,CKs)、上皮细胞粘附分子(EpCAM)、肿瘤胚胎抗原(Carcino Embryonic Antigene,CEA)和人类表皮生长因子受体2(Human Epidermal Growth Factor Receptor 2,HER2)等,通过抗原抗体特异性结合反应实现CTC与血液中其他细胞的分离(可参考H.Xu等人,Biomaterials 2011,32,9758-9765;S.L.Stott等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA2010,107,18392-18397;S.Nagrath等人,Nature 2007,450,1235-1239;A.-E.Saliba等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2010,107,14524-14529;X.Wang等人,Cancer Res.2011,71,1526-1532)。
与机械分离方法相比,免疫分离方法灵敏度高,分离的特异性好。在这些免疫分析中,EpCAM和CKs是CTC检测的常用表面标志物。然而,由于抗体生产成本及生产技术的限制,导致这种基于抗体检测CTC的技术成本较高,如CellSearch检测一个血样需要约600美元,因此寻找能与CTC特异性靶向结合的新型化合物有重要的意义。近年来,研究者们在利用多肽进行肿瘤细胞的识别,靶向肿瘤细胞表面方面展开了广泛的研究,人们已经从天然及合成的多肽中筛选出大量能分别靶向不同肿瘤细胞不同作用位点的多肽化合物(可参考M.Shadidi & M.Sioud,FASEB J.2003,17,256-258;M.Shadidi&M.Sioud,DrugResist.Updates 2003,6,363-371)。在本课题组的前期工作中,已针对EpCAM设计了一系列多肽,从低于30条的多肽库中,筛选出了靶向EpCAM的特异性识别多肽。以此特异性识别多肽为探针,将其修饰到磁性纳米颗粒表面,利用磁性富集技术成功实现血液体系中人乳腺癌细胞(MCF-7和SK-BR-3细胞)的富集,且富集率与抗体一致(Bai,L.;Du,Y.;Peng,J.;Yang,Y.et al.J.Mater.Chem.B,2014,2,4080–4088)。
然而,也有研究表明,因为CTC经历了一系列的EMT转化过程,CTC表面的上皮特性的分子标志物(例如EpCAM和CK等)可能会发生丢失。所以这种基于常见特异性标志物的CTC检测方法会漏掉一些CTC亚型,造成CTC检测的假阴性。除了这两种常见的表面标记物以外,HER2蛋白由于其在肿瘤分型上的特殊作用也成为了一种重要的标记物。研究发现乳腺癌(20~35%)和卵巢癌(8~11%)这两大恶性肿瘤细胞高表达HER2蛋白,且预后较差,严重影响患者的健康和生命。HER2蛋白是一种跨膜受体蛋白,表现酪氨酸激酶活性,分子量为185kD,由原癌基因HER2编码,是表皮生长因子受体(EGFRs)家族的成员之一。
因此,寻找一种HER2高表达的循环肿瘤细胞的多肽及其复合物用于富集、分离和快速检测循环肿瘤细胞是目前亟待解决的问题。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种能够特异性识别循环肿瘤细胞(CTC)的多肽片段替代现有的抗-循环肿瘤细胞抗体,从而降低检测成本;本发明的另一个目的是结合现有的纳米技术,将该特异性识别多肽与磁性纳米颗粒偶联,即提供一种多肽-磁性纳米颗粒,提高对血液中稀少循环肿瘤细胞(CTC)的检测效率。本发明的又一个目的是提供该特异性识别多肽-磁性纳米颗粒在制备用于检测肿瘤的转移或复发肿瘤治疗效果评价药物或产品方面的应用。
为达到此发明目的,本发明采用如下技术方案:
第一方面,本发明提供了一种用于特异性识别循环肿瘤细胞的多肽,所述多肽的氨基酸序列选自SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:18之一所示的氨基酸序列。
优选地,所述多肽的氨基酸序列选自如下SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。
GRQLFDNPDQALLDTANDG
本发明所述的多肽可通过特异性结合细胞人表皮生长因子受体2(HumanEpidermal Growth Factor Receptor 2,HER2)识别循环肿瘤细胞。
第二方面,本发明还提供了一种用于特异性识别循环肿瘤细胞的多肽-磁性纳米颗粒,所述的多肽-磁性纳米颗粒含有磁性纳米颗粒和与其相偶联的如本发明第一方面所述的多肽。
优选地,所述多肽和磁性纳米颗粒的质量比为0.01:5~4:5,例如可以是0.01:5,0.05:5,1:5,1.2:5,1.5:5,1.8:5,2:5,2.2:5,2.5:5,2.8:5,3:5,3.2:5,3.5:5,3.8:5,4:5,优选为1:5~3:5。
优选地,所述的磁性纳米颗粒为链亲和素修饰的磁性纳米颗粒。
优选地,所述磁性纳米颗粒的粒径为150-250nm,例如可以是150nm、180nm、200nm、220nm、250nm,优选为200nm。
第三方面,本发明还提供了一种如本发明第二方面所述的多肽-磁性纳米颗粒的制备方法,所述方法包括如下步骤:
(1)制备如本发明第一方面所述的用于特异性识别循环肿瘤细胞的多肽;
(2)将步骤(1)中的多肽制成生物素修饰的多肽溶液;
(3)将磁性纳米颗粒溶于缓冲液中制成溶液;
(4)将步骤(2)中生物素修饰的多肽溶液与步骤(3)的磁性纳米颗粒溶液混合后,混匀,将所述的多肽偶联到所述的磁性纳米颗粒表面,即得。
本发明中,步骤(3)还包括将磁性纳米颗粒溶液通过超声或涡旋的方法进行分散的步骤。
本发明中,所述的磁性纳米颗粒为链亲和素修饰的磁性纳米颗粒。
本发明中,步骤(4)所述生物素修饰的多肽溶液与磁性纳米颗粒溶液以0.01:5-4:5的质量比混合,例如可以是0.01:5,0.05:5,1:5,1.2:5,1.5:5,1.8:5,2:5,2.2:5,2.5:5,2.8:5,3:5,3.2:5,3.5:5,3.8:5,4:5,优选为1:5~3:5。
本发明中,步骤(4)所述生物素修饰的多肽溶液与磁性纳米颗粒溶液在4-37℃混合0.5-2h;优选为于20-30℃混合10min-2h;进一步优选为于25-28℃混合30-40min。
本发明中,步骤(4)所述生物素修饰的多肽溶液与磁性纳米颗粒溶液于恒温摇床上混合;优选地,所述的混合于4℃的恒温摇床上混合;优选地,所述恒温摇床的转速为100-200rpm,优选为150rpm。
第四方面,本发明还提供了一种如本发明第一方面所述的多肽或如第二方面所述的多肽-磁性纳米颗粒在制备用于富集、分离或检测循环肿瘤细胞的产品中的应用。
优选地,所述产品为试剂盒或试剂。
第五方面,本发明还提供了一种如本发明第一方面所述的多肽或如第二方面所述的多肽-磁性纳米颗粒在制备用于治疗肿瘤转移相关疾病的药物中的应用。
优选地,所述肿瘤转移相关疾病为人类表皮生长因子受体2(HER2)高表达相关的肿瘤。
更优选地,所述人类表皮生长因子受体2高表达相关的肿瘤包括乳腺癌、卵巢癌、肺腺癌、肾细胞癌和前列腺癌。
本发明设计了一系列多肽片段,通过筛选得到了本发明的具有特异性识别HER2特异性的多肽片段;本发明利用生物素-链亲和素的强相互作用,将生物素修饰的特异性识别多肽与链亲和素修饰的磁性纳米颗粒偶联,用荧光显微镜观察了修饰FITC-多肽-Biotin后发荧光的磁性纳米颗粒;并通过试验证明本发明所述的多肽-磁性纳米颗粒能够用于循环肿瘤细胞的分离、富集和检测。
与现有技术相比,本发明至少具有以下有益效果:
(1)本发明的两种多肽修饰后的纳米颗粒在对模拟的CTCs样品中CTCs的分离率达到80%以上,重现性很好;
(2)本发明提供了一种富集、分离和检测循环肿瘤细胞(CTC)的快速、准确和低成本的检测方法,为临床肿瘤转移患者的诊断、治疗及预后提供了一种有效途径。
附图说明
图1为流式细胞实验检测结果图;
图2为不同浓度下QN37与SK-BR-3的结合率比较图;
图3为HER2抗体及设计肽与HER2阳性及阴性细胞结合率的流式结果图;
其中,其中图3a代表HER2抗体和18条设计肽与HER2阳性细胞SK-BR-3细胞结合率的比较,图3b代表HER2抗体和优选四条设计肽分别与HER2阳性细胞SK-BR-3及HER2阴性细胞K562结合率;图3c代表HER2抗体和优选四条设计肽各自与SK-BR-3细胞和K562细胞结合率的比值;
图4为HER2抗体-磁性纳米颗粒及GG19-磁性纳米颗粒和SK-BR-3细胞富集和分离的荧光显微镜照片;其中A/B/C表示HER2抗体-磁性纳米颗粒对PBS中富集得到的SK-BR-3细胞的明场(A)、荧光(B)显微镜照片及复合图片(C);D/E/F表示GG19-磁性纳米颗粒对PBS中富集得到的SK-BR-3细胞的明场(D)、荧光(E)显微镜照片及复合图片(F);
图5为HER2抗体-磁性纳米颗粒和GG19-磁性纳米颗粒对SK-BR-3细胞的富集和分离效率的统计结果。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。
本领域技术人员应该明了,所述实施例仅仅是帮助理解本发明,不应视为对本发明的具体限制。
除非特别指明,以下实施例中所用的人乳腺癌细胞(SK-BR-3和MCF-7)、人慢性髓系白血病细胞(K562)以及人非小细胞肺癌细胞(A549)均购自医学科学院基础科学研究所的细胞库。
除非特别指明,以下实施例中所用的试剂均为分析纯试剂,且可从正规渠道商购获得。
除非另外指明,本文中的“多肽-磁性纳米颗粒”是指“表面修饰有多肽的磁性纳米颗粒”。
除非另外指明,本文中的“anti-HER2”表示“抗-人类表皮生长因子受体2抗体”。
除非另外指明,本文中的“BRa/b”表示“a与细胞b的结合率”。
除非另外指明,本文中的“BRa/BRb”表示“某分子对细胞a和对细胞b的结合率的比值”。
除非另外指明,本文中的“2E7”表示“阴性细胞数为2×107个”。
作为优选的实施方案,本发明还提供了所述的多肽-磁性纳米颗粒富集分离循环肿瘤细胞的方法,包括以下步骤:
步骤A:分别制备生物素修饰的多肽溶液和磁性纳米颗粒分散的溶液,以及生物素修饰多肽与磁性纳米颗粒的混合溶液,于摇床混合;
步骤B:将步骤A中混合后的溶液,用强磁性磁铁吸引收集后,吸出溶液,再用pH=7.2的PBS缓冲溶液将磁铁富集的颗粒重悬,然后用磁铁富集,如此反复3遍,用pH=7.2的PBS重悬待用;
步骤C:将4%多聚甲醛固定、Hoechst.33342染色的HER2阳性的人乳腺癌细胞(SK-BR-3)与HER2阴性的人慢性髓系白血病细胞(K562)以50:2E7的比例混合分别混合成1mL的PBS溶液;
步骤D:取少量步骤B中修饰后的磁性纳米颗粒加入步骤C中的细胞混合液或待测血样,于摇床上混合;
步骤E:取下步骤D中的混合液,用强磁性磁铁吸引收集磁性纳米颗粒,弃去细胞液,用PBS重悬富集的磁性纳米颗粒,再用磁铁富集,如此反复3次。
步骤F:于显微镜下统计分离出的细胞并拍照。
优选地,所述步骤A具体包括以下步骤:
步骤A.1:将生物素修饰的多肽溶解于缓冲液中,优选地,将生物素修饰的多肽溶解到pH=6.8-7.5的磷酸盐缓冲液中,更优选地,将多肽溶解到pH=7.2的PBS溶液中;
步骤A.2:将分散于水中的磁性纳米颗粒提取出来,溶分散在少量的pH=6.8-7.5磷酸盐缓冲液中,优选地,将磁性纳米颗粒多肽溶解到pH=7.2的PBS溶液中,并在涡旋仪上涡旋3-5min;
步骤A.3:将步骤A.1中制得的生物素修饰的多肽溶液加入到步骤A.2中的磁性纳米颗粒中制得共混液,优选地,多肽与磁性纳米颗粒的质量比为1:5-3:5,优选地,该混合液于25℃,150rpm的恒温摇床上混合30-40min;
优选地,步骤B及步骤E中,富集磁性纳米颗粒时,用强磁性磁铁,优选地,富集颗粒过程中,不断晃动被富集溶液,更优选地,磁铁富集过程持续至少10min/次;
优选地,所述步骤C具体包括以下步骤:
步骤C.1:取一定量的SK-BR-3,用4%的多聚甲醛室温下固定细胞20-40min,优选地,室温下固定30min;
步骤C.2:利用PBS缓冲液除去洗去细胞固定液,用60-120μg/mL的Hoechest.33342在室温作用下进行细胞染色30-50min,优选地,80μg/mL作用的Hoechest.33342在室温下进行细胞染色30min。
优选地,步骤D中,加入的磁性纳米颗粒的量为5~10μL,更优选地,加入5μL。
实施例1.多肽特异性识别HER2的验证
所使用的多肽片段(由上海科肽生物技术有限公司合成,纯度为98%),如下表1所示;磁性纳米颗粒:链亲和素-磁性纳米颗粒(Ademtech,03121,法国)。
表1
将SK-BR-3细胞作为HER2阳性细胞,以anti-HER2与SK-BR-3细胞的结合率为阳性对照,采用流式细胞技术检测anti-HER2与MCF-7、A549和K562这三种细胞的结合率。以此为依据,寻找与anti-HER2结合率最低的细胞系,作为HER2阴性细胞系。
流式细胞实验检测结果如图1所示,结果表明anti-HER2与SK-BR-3、A549、MCF-7和K562的结合率分别为BRAnti/SK-BR-3=83.87%,BRAnti/A549=16.44%,BRAnti/MCF-7=13.91%,BRAnti/K562=0.96%。这证明了SK-BR-3细胞表面HER2蛋白的表达量很高,A549和MCF-7细胞表面HER2蛋白的表达量较低,K562细胞表面HER2蛋白的表达量极低,仅为0.96%。因此选定SK-BR-3细胞为HER2阳性细胞系,K562细胞为HER2阴性细胞系。
实施例2流式细胞学方法检测多肽分别对人HER2阳性和阴性乳腺癌细
胞的结合作用
利用流式细胞需方法检测本发明的多肽对HER2阳性细胞系和K562细胞的结合作用,具体方法包括以下步骤:
(1)设计并合成了一系列异硫氰酸荧光素(FITC,fluorescein isothiocyanate)-多肽-生物素(Biotin),以HER2阳性的SK-BR-3和HER2阴性的K5620细胞为测试对象,利用流式细胞技术及HER2阳性的SK-BR-3和HER2阴性的K562细胞,本发明设计的GG40、QN37和GG19能够特异性结合HER2阳性细胞,但对于HER2阴性细胞,GG40、QN37表现出一定的阴性结合特性,选择性较低;而GG19与HER2阴性细胞K562的结合率很低,选择性高。
所述的检测过程包括如下步骤:
a1:将设计的多肽制成溶液;
b1:取一定量的步骤a1得到的溶液,与SK-BR-3和K562细胞共混,4℃孵育2h;
c1:利用PBS缓冲液洗去未结合的多肽后制成一定密度(≥106个/mL)的细胞悬液;
将悬液于流式细胞仪上检测多肽与细胞的结合情况。
(2)将步骤(1)中证明特异性识别HER2阳性细胞的多肽溶液加入到磁性纳米颗粒中,制备成多肽-磁性纳米颗粒;
所述特异性识别HER2的多肽-磁性纳米颗粒的制备方法包括如下步骤:
a2:将所述FITC-多肽-Biotin与磁性纳米颗粒充分混合,形成混合液;
b2:并将上述a2中的溶液于25℃摇床上以150rpm的转速混合30~40min;
c3:除去未结合的多肽溶液,将多肽-磁性纳米颗粒重悬于PBS中。
在制备多肽-磁性纳米颗粒中,采用恒温摇床来充分混合。去除未结合的多肽溶液,优选使用强力磁铁,优选吸附时间为10min,为了防止磁性纳米颗粒流失,对弃去溶液,用吸管从颗粒聚集的另一侧将其缓慢吸出。
此外,在制备多肽-磁性纳米颗粒前,还包括分散磁性纳米颗粒的步骤,可以采用超声/涡旋的方法分散磁性纳米颗粒。
(3)将细胞用4%的多聚甲醛固定,Hoechst.33342染色后的乳腺癌细胞(SK-BR-3)与人慢性髓系白血病细胞K562以50:2E7的比例混合,溶解在1mL的PBS溶液中,具体操作方法为:
a3:取一定量的SK-BR-3细胞,用4%的多聚甲醛室温下固定细胞30分钟;
b3:PBS除去细胞固定液,用80μg/mL Hoechest.33342室温作用细胞30分钟;
c3:细胞计数板计数两种细胞后,取适量混合后定容至995μL。
(4)取少量多肽-磁性纳米颗粒加入步骤(3)中的细胞混合液或待测血样,于摇床上混合,利用磁铁对SK-BR-3细胞进行富集和分离;具体地,富集和分离SK-BR-3细胞的步骤如下:
a4:取5μL多肽-磁性纳米颗粒,加入到995μL的待分离样品中;
b4:将多肽-磁性纳米颗粒于细胞样品的混合液置于150rpm的恒温摇床上,4℃下共同孵育30min;
C4:强磁性磁铁吸附磁性纳米颗粒10min,并不断晃动混合液,从富集位置的另一侧,将未结合的细胞悬液吸出,再用PBS重悬磁性纳米颗粒,再富集磁性纳米颗粒,如此反复3次。
(5)于显微镜下统计细胞数;具体的统计与成像包括如下步骤:
a5:将上面收集到的磁性纳米颗粒用PBS缓冲液重悬成10~20μL的悬液,为了增强分散性,可在涡旋仪上涡旋3~5min;
b5:吸取一定量的上述a6悬液于载玻片上,而后用盖玻片盖上,即可用荧光显微镜观察;
c5:在显微镜下,取不同视野(至少3个)对明场中的所有细胞及暗场中发蓝光的细胞进行统计,拍照。
通过观察结果可以得出,本发明设计的GG19多肽能够特异性结合HER2阳性细胞,HER2阴性细胞结合率低,并且结合常数比较合适;而对于阴性细胞,作为对照的其余多肽序列表现出一定的阴性结合特性,但是阴性结合率较高,选择性较低。
实施例3不同浓度下多肽与HER2阳性乳腺癌细胞的结合率比较
以多肽QN37为例,将不同浓度的多肽QN37与HER2阳性乳腺癌细胞结合,所述的方法具体包括以下步骤:
1)设计肽用量对设计肽与SK-BR-3细胞结合率的影响
抗体anti-HER2的浓度为Canti-HER2=52μg/mL,分子量为150kDa,流式实验中细胞个数为106个,抗体用量为0.01733μM。抗体的分子量较大,是所设计多肽的几十到一百倍。相比于抗体,多肽氨基酸个数少,分子量很小,体积较小,空间自由度大,因此当多肽与细胞表面相互作用时很可能引起非特异性吸附。这一类非特异性吸附不仅与多肽的序列有关,更与多肽的加入量密切相关。因此为避免非特异性吸附,需首先确定多肽的合适用量。因此以所设计多肽序列中分子量最大的多肽QN37为例,设计了一系列浓度梯度,采用流式细胞技术检测不同浓度下QN37与SK-BR-3细胞的结合率,以此来确定多肽的最佳加入量。
图2为不同浓度下QN37与SK-BR-3的结合率比较。在QN37的浓度由0.14μM增加到1.4μM的过程中,BRQN37/SK-BR-3的值由3.37%增加到60.44%。当QN37的浓度由1.4μM向2.8μM增加的过程中BRQN37/SK-BR-3的值基本保持不变。当QN37的浓度达到7μM时BRQN37/SK-BR-3的值均达到86.63%,超过了图1检测的anti-HER2与SK-BR-3的结合率(BRQN37/SK-BR-3=83.87%)。当QN37的浓度达到14μM甚至更大时,BRQN37/SK-BR-3达到90%以上,远远超过anti-HER2与SK-BR-3的结合率(BRQN37/SK-BR-3=83.87%)。因此为避免非特异性吸附,相对准确地检测QN37与SK-BR-3细胞的结合率,可将QN37的实验浓度围控制在0.5~3μM范围内。
18条设计肽中氨基酸个数从12个到40个不等,分子量从1321到4325不等。其中有4条多肽的分子量大于3000,13条多肽的分子量在1700-2555之间,氨基酸序列最短的1条多肽分子量为1321。在18条设计肽中以QN37的分子量为参考,QN37的分子量为其中17条多肽的1-2.4倍,为分子量最小多肽的3.3倍。因此为避免非特异性吸附,同时考虑计算的方便性和不同多肽序列与SK-BR-3细胞结合率的可比性,后续流式细胞实验中选定每种设计肽用量为1.5μM。
2)HER2阳性的特异性多肽的验证。
选定每种设计肽用量为1.5μM,以anti-HER2为阳性对照,利用流式细胞技术检测18条设计肽与SK-BR-3细胞的结合率。先将设计并合成的一系列FITC-多肽用pH=7.2的PBS配成1.0mM的母液;收集一定量(≥106个)的SK-BR-3及K562细胞于1.5mL的离心管中,加入多肽母液,并用PBS稀释成1.5μM;用吸管将该混合液吹匀,4℃混合30min,而后在转速为1000rpm的离心机(LD5-2A,北京雷勃尔离心机有限公司)中离心3min,弃去上清,再用PBS重悬,如此反复3次的方法除去未结合的多肽,最后将细胞重悬成1ml的溶液,用流式细胞仪(FCM,FACSAria,BD,美国)检测,统计检测结果,如图3a所示。
如图3a所示,anti-HER2与SK-BR-3的结合率最高,达到72.37%,即BRAnti/SK-BR-3=72.37%。设计肽GG40、QN37、GG19、GG22与SK-BR-3细胞的结合率均在50%以上,结合率值与BRAnti/SK-BR-3接近,具体为BRGG40/SK-BR-3=67.5%,BRQN37/SK-BR-3=64.55%,BRGG19/SK-BR-3=59.65%,BRGG22/SK-BR-3=54.85%。然而设计肽GG23、QQ19和GA19分别与SK-BR-3细胞的结合率在30~40%范围内,设计肽QN15、GG16、GG21和NG20分别与SK-BR-3细胞的结合率在20~30%范围内,设计肽GG12、GY27、QN21、GQ18和GG24分别与SK-BR-3细胞的结合率在10~20%范围内,设计肽GG36、YY16与SK-BR-3细胞的结合率均小于10%。
选定设计肽GG40、QN37、GG19和GG22等4条设计肽为目标肽,为检测目标肽对SK-BR-3细胞的结合特异性,采用流式细胞技术进一步检测目标肽与HER2阴性的K562细胞的结合率,如图3b所示。由图3b可知,4条目标肽中GG19与K562的结合率最低(BRGG19/K562=2.6%),接近anti-HER2与K562的结合率(BRAnti/K562=1.87%)。根据图3b的检测结果,可以计算出anti-HER2和目标肽与阳性细胞系SK-BR-3和阴性细胞系K562的结合率比值,以考察目标肽对SK-BR-3的结合特异性,即选择性。目标肽对SK-BR-3细胞的选择性结果如图3c所示,其中anti-HER2对SK-BR-3的选择性最高(BRAnti/SK-BR-3/BRAnti/K562=38.70),综合抗体的检测结果,可知,SK-BR-3为HER2阳性细胞,K562为HER2阴性细胞,与已有报道一致。GG19对SK-BR-3的选择性仅居其次(BRGG19/SK-BR-3/BRGG19/K562=22.94)。由此,进一步证明GG19不仅与HER2阳性的SK-BR-3细胞有很高的结合率并且与HER2阴性的K562细胞系有极低的结合率。因此在选出的4条目标肽中,GG19对HER2阳性的SK-BR-3细胞的选择性最高,接近anti-HER2对SK-BR-3的选择性。
实施例4利用多肽-磁性纳米颗粒进行乳腺癌细胞的分离、富集和检测
(1)将特异性识别多肽GG19通过生物素-链亲和素相互作用与磁性纳米颗粒偶联:取5mg/mL的磁性纳米颗粒250μL,于vortex mixer涡旋仪(WH-866,太仓市华利达实验设备有限公司)上混合3-5min,用强磁性磁铁出去收集,并去除溶剂,而后取1mg/mL的HER2抗体-生物素(Biotin)和1mg/mL的GG19-生物素(Biotin)的PBS溶液各500μL,分别与磁性纳米颗粒混合(多肽与磁性纳米颗粒的质量比为2:5),而后放在摇床(THZ-D,泰州市万达气弹簧有限公司)上在25℃,150rpm下混合40min。而后用强磁性磁铁富集磁性纳米颗粒于离心管一侧,约10min后从离心管的另一侧吸取液体,再加入一定量的PBS缓冲液,重悬磁性纳米颗粒,再富集,吸去液体,如此反复3次,即可去除未结合的多肽,得到HER2抗体-生物素(Biotin)-磁性纳米颗粒和GG19-生物素(Biotin)-磁性纳米颗粒,最后分别再用250μL的PBS缓冲液溶解。
(2)收集一定量的SK-BR-3细胞,而后用4%的多聚甲醛室温固定30min,之后用PBS洗去固定液,再加入20μL的80μg/mL的Hoechst33342(购自Sigma公司)对细胞进行染色(参见Q.Yuan等人,Biochem.Biophys.Res.Commun.2007,356,880-885),室温30min;用细胞计数板对细胞计数。收集K562细胞,并计数,而后取适量的SK-BR-3细胞和K562细胞,以SK-BR-3细胞与K562细胞数比例为50:2E7混合制成体积为995μL的细胞液,而后加入上面5μL的多肽-磁性纳米颗粒溶液,在150rpm的摇床上4℃下混合30min。而后,用强磁性磁铁富集磁性纳米颗粒于离心管一侧,约10min后从离心管的另一侧吸取液体,再加入一定量的PBS,重悬磁性纳米颗粒,再富集,除去液体,如此反复3次,即得分离的SK-BR-3细胞。将其用20μL的PBS重悬,取10μl滴在载玻片上,盖玻片再盖上后,制成样本,于荧光显微镜下统计计数。PBS与全血富集结果如图4和图5所示。
图4为磁珠从PBS缓冲液和新鲜血液中捕集到的SK-BR-3细胞在倒置荧光显微镜下拍摄的照片。通过明场(Light)、荧光(Dark)和融合(Merged)照片的对比,结合SK-BR-3细胞的尺寸(10-20μm),可确认荧光照片中产生荧光的部位均为细胞。Anti-HER2-磁性纳米颗粒和GG19-磁性纳米颗粒分别代表用HER2抗体-磁性纳米颗粒和GG19-磁性纳米颗粒捕集到的细胞。
如图5所示,进一步的统计结果表明,GG19-磁性纳米颗粒可从PBS缓冲液和新鲜血液两种体系中成功富集到SK-BR-3细胞,且富集率均在70%以上(81.8%和70.4%),重现性很好。
综合上述实施例可以看出,本发明所述的多肽及多肽-磁性纳米颗粒可以高效富集乳腺癌肿瘤细胞,对临床乳腺癌肿瘤转移的诊断及肿瘤的预后有重要的意义;由于高表达HER2的肿瘤很多,包括乳腺癌、卵巢癌、肺腺癌、肾细胞癌和前列腺癌等,因此,本发明所述的多肽-磁性纳米颗粒同样可以适用于其他HER2高表达的肿瘤,为临床肿瘤转移患者的诊断、治疗及预后提供了一种有效途径。
申请人声明,本发明通过上述实施例来说明本发明的工艺方法,但本发明并不局限于上述工艺步骤,即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了,对本发明的任何改进,对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等,均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (25)
1.一种用于特异性识别循环肿瘤细胞的多肽,其特征在于,所述多肽的氨基酸序列选自SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:18之一所示的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的多肽,其特征在于,所述多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
3.一种用于特异性识别循环肿瘤细胞的多肽-磁性纳米颗粒,其特征在于,所述的多肽-磁性纳米颗粒含有磁性纳米颗粒和与其相偶联的如权利要求1或2所述的多肽。
4.根据权利要求3所述的多肽-磁性纳米颗粒,其特征在于,所述多肽和磁性纳米颗粒的质量比为0.01:5~4:5。
5.根据权利要求4所述的多肽-磁性纳米颗粒,其特征在于,所述多肽和磁性纳米颗粒的质量比为1:5~3:5。
6.根据权利要求3所述的多肽-磁性纳米颗粒,其特征在于,所述的磁性纳米颗粒为链亲和素修饰的磁性纳米颗粒。
7.根据权利要求6所述的多肽-磁性纳米颗粒,其特征在于,所述磁性纳米颗粒的粒径为150-250nm。
8.根据权利要求7所述的多肽-磁性纳米颗粒,其特征在于,所述磁性纳米颗粒的粒径为200nm。
9.根据权利要求3所述的多肽-磁性纳米颗粒的制备方法,其特征在于,所述方法包括如下步骤:
(1)制备如权利要求1或2所述的用于特异性识别循环肿瘤细胞的多肽;
(2)将步骤(1)中的多肽制成生物素修饰的多肽溶液;
(3)将磁性纳米颗粒溶于缓冲液中制成溶液;
(4)将步骤(2)中生物素修饰的多肽溶液与步骤(3)的磁性纳米颗粒溶液混合后,混匀即可,将所述的多肽偶联到所述的磁性纳米颗粒表面。
10.根据权利要求9所述的制备方法,其特征在于,步骤(3)还包括将磁性纳米颗粒溶液通过超声或涡旋的方法进行分散的步骤。
11.根据权利要求9所述的制备方法,其特征在于,所述的磁性纳米颗粒为链亲和素修饰的磁性纳米颗粒。
12.根据权利要求9所述的制备方法,其特征在于,步骤(4)所述生物素修饰的多肽溶液与磁性纳米颗粒溶液以0.01:5-4:5的质量比混合。
13.根据权利要求12所述的制备方法,其特征在于,步骤(4)所述生物素修饰的多肽溶液与磁性纳米颗粒溶液的质量比为1:5-3:5。
14.根据权利要求9所述的制备方法,其特征在于,步骤(4)所述生物素修饰的多肽溶液与磁性纳米颗粒溶液在4-37℃混合0.5-2h。
15.根据权利要求14所述的制备方法,其特征在于,步骤(4)所述生物素修饰的多肽溶液与磁性纳米颗粒溶液于20-30℃混合10min-2h。
16.根据权利要求15所述的制备方法,其特征在于,步骤(4)所述生物素修饰的多肽溶液与磁性纳米颗粒溶液于25-28℃混合30-40min。
17.根据权利要求9所述的制备方法,其特征在于,步骤(4)所述生物素修饰的多肽溶液与磁性纳米颗粒溶液于恒温摇床上混合。
18.根据权利要求17所述的制备方法,其特征在于,所述的混合于4℃的恒温摇床上混合。
19.根据权利要求18所述的制备方法,其特征在于,所述恒温摇床的转速为100-200rpm。
20.根据权利要求19所述的制备方法,其特征在于,所述恒温摇床的转速为150rpm。
21.根据权利要求1或2所述的多肽或权利要求3至5任一项所述的多肽-磁性纳米颗粒在制备用于富集、分离或检测循环肿瘤细胞的产品中的应用。
22.根据权利要求1或2所述的多肽或权利要求3至5任一项所述的多肽-磁性纳米颗粒在制备用于治疗肿瘤转移相关疾病的药物中的应用。
23.根据权利要求22所述的应用,其特征在于,所述肿瘤转移相关疾病为HER2高表达相关的肿瘤。
24.根据权利要求23所述的应用,其特征在于,所述HER2高表达相关的肿瘤为乳腺癌、卵巢癌、肺腺癌、肾细胞癌或前列腺癌。
25.根据权利要求24所述的应用,其特征在于,所述HER2高表达相关的肿瘤为乳腺癌。
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