CN106366196B - 一种EpCAM抗体免疫磁珠及其制备方法 - Google Patents

一种EpCAM抗体免疫磁珠及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种EpCAM抗体免疫磁珠及其制备方法，包括磁性微球部分和抗体部分，所述免疫磁珠的结构式为：A‑NH‑N＝CH‑B，其中A表示磁性微球，B表示EpCAM抗体，或者A表示EpCAM抗体，B表示磁性微球。将本发明的免疫磁珠用于捕获CTC，不仅特异性、敏感性好，而且磁响应迅速、富集时间短，捕获效率高。而且免疫磁珠的性质稳定，同时粒径小，磁响应性好，分散性好。并且制备方法简单，具有很强的实用性。

Description

一种EpCAM抗体免疫磁珠及其制备方法
技术领域
本发明涉及免疫磁珠的制备领域，具体地说是一种EpCAM抗体免疫磁珠及其制备方法。
背景技术
EpCAM(表皮细胞粘附分子)是一个跨膜糖蛋白介导的钙离子非依赖性同型细胞-细胞粘连。EpCAM也参与细胞信号，迁移，增殖和分化。另外，EpCAM能上调c-myc，e-fabp和周期素。由于EpCAM在上皮和上皮来源的肿瘤完全表达，EpCAM可以用作各种诊断标记癌症，尤其在循环肿瘤细胞的鉴定上。EpCAM在肿瘤发生和癌转移中发挥了重要的作用，因此它也可以作为一个潜在的预后标记，作为用于免疫治疗策略的潜在目标。
循环肿瘤细胞(CTC)是指自发或因诊疗操作由实体瘤原发灶或转移灶释放进入外周血循环的肿瘤细胞，一般以单个细胞或细胞团(又称循环肿瘤微栓子，CTM)的形式存在于循环系统中。转移是癌症相关死亡的主要原因，而CTC被视为转移的种子，在新的肿瘤生物标志物的发现、肿瘤预后判断及个体化治疗方面存在很大的应用潜力，是国内外肿瘤研究的热点之一。然而，CTC在外周血中的浓度非常低，通常在约109个血细胞中仅有数个CTC，大约每105～107个单核细胞中才有几个循环肿瘤细胞。因此，从复杂血液样本中准确、高效地将CTC分选出来，需要很高的捕获率和敏感度。
现有的捕获和富集CTC的方法主要有基于CTC的物理性状进行捕获，如密度、分子大小等物理性状，或基于CTC表面生物标识物如EpCAM(上皮细胞粘着分子)等进行富集。基于密度、分子大小等物理性质对CTC进行捕获，容易导致CTC漏筛，得到假阴性结果。基于CTC表面生物标识物的免疫磁珠富集则是目前应用最为广泛的CTC捕获方式之一，其操作容易，捕获效率高，应用前景好。但目前市面上大多用微米级(1200-4500nm)的免疫磁球捕获CTCs，此大小的免疫磁球进行磁分离时容易对细胞造成机械压力，影响细胞的生物学功能和活性，不利于后续分析和培养。而且由于捕获的CTCs还需要经过磁球释放后才能进一步分析，这使CTCs的检测和分析过程变得比较繁琐。Miltenyi Bioec公司开发的MACS系统以及Veridex公司开发的CellSearch系统采用了纳米级的免疫磁珠捕获CTCs。其中，MACS系统使用的是粒径为50nm的纳米免疫磁珠，但是磁响应较慢，必须使用较强的磁场搭配专用的一次性磁分离柱才能完成CTCs的捕获，成本昂贵。CellSearch系统使用的是粒径为120-200nm的纳米免疫磁珠，其在捕获CTCs过程中增加了多步额外的步骤来增强纳米球的磁性，并且采用了捕获增强试剂来增强纳米免疫磁珠与抗原的结合，操作比较繁琐，且CellSearch系统的免疫磁珠已自2016年初就已经开始停止销售。
国内武汉大学申请的201310614556.5专利，其专利名称为《一种循环肿瘤细胞的富集方法》，公开了一种CTCs的富集方法及其试剂盒，其中公开的免疫磁珠是以苯乙烯-丙烯酰胺共聚纳米球为模板，通过酰肼化、丁二酸酐化以及1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐/N-羟基琥珀酰亚胺(EDC/NHS)活化法得到PEI纳米球，再利用层层组装法在其表面层层组装油溶性的磁性纳米粒子nano-γ-Fe2O3，组装五层后，再在其表面包被SiO2，制备得到粒径为380nm的磁性纳米球，之后经过丁二酸酐化在纳米球表面引入羧基，再通过(EDC/NHS)活化磁球表面的羧基，然后把EpCAM抗体偶联到磁性纳米球上，制备得到免疫磁珠。该免疫磁珠捕获效率高、富集时间短以及特异性好，所捕获的细胞的活性率保持在(90.5±1.2)％。但是制备380nm磁性纳米球和免疫磁珠的步骤繁琐，制备过程复杂，成本高难以扩大规模。
发明内容
本发明的主要目的是针对现有技术存在的不足提供一种EpCAM抗体免疫磁珠及其制备方法，本发明的EpCAM抗体免疫磁珠粒径小，磁响应性好，用于循环肿瘤细胞捕获，捕获效率高，富集时间短，捕获得到的肿瘤细胞可以进行进一步的分析，同时制备过程简单，成本低。
在本发明的一方面，本发明是通过如下技术方案实现的：一种EpCAM抗体免疫磁珠，包括磁性微球部分和抗体部分，所述免疫磁珠的结构式为：A-NH-N＝CH-B，其中A表示磁性微球，B表示EpCAM抗体，或者A表示EpCAM抗体，B表示磁性微球。
优选的，所述磁性微球为核壳结构的无机或有机高分子包裹的磁性微球。比如二氧化硅包裹的磁性四氧化三铁、或者葡聚糖包裹的磁性四氧化三铁等。最优选的，所述磁性微球部分为二氧化硅包裹的磁性四氧化三铁。
优选的，所述EpCAM抗体免疫磁珠的粒径为200～300nm。
在本发明的第二方面，提供了一种制备上述EpCAM抗体免疫磁珠的方法，其步骤包括：
s1.磁性纳米簇的制备；
s2.氨基修饰的磁性微球的制备；
s3.肼基修饰的A部分的制备；
s4.醛基修饰的B部分的制备；
s5.免疫磁珠的制备：将步骤s3所述肼基修饰的A部分与步骤s4所述醛基修饰的B部分混合，在4～25℃下进行偶联反应2～24小时，得到所述免疫磁珠。
在本发明的一种实施方式中，对氨基修饰的磁性微球进行醛基修饰，并且对EpCAM抗体进行肼基修饰。或者对氨基修饰的磁性微球进行肼基修饰，并且对EpCAM抗体进行醛基修饰，均可以实现上述结构的免疫磁珠。
进一步的，所述步骤s3中的肼基修饰的A部分是通过：将氨基修饰的磁性微球或EpCAM抗体用摩尔当量为10～50倍的SANH进行肼基修饰后得到的。最优选的，SANH的摩尔当量为氨基修饰的磁性微球或EpCAM抗体的25倍。所述SANH为对-丙腙基吡啶甲酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(CAS：362522-50-7)，在室温条件下可以温和的将氨基转换为肼基。所述SANH一般溶解在DMF溶液中进行反应，浓度可以根据磁性微球或EpCAM抗体的浓度进行调整，不影响反应结果。该反应过程可以在15～25℃室温条件下进行，反应时间根据本领域技术人员常规的检测技术判断，本发明一般采用对磁性微球的修饰反应时间16～24h，对EpCAM抗体的修饰反应时间2～4h。
进一步的，所述步骤s4中的醛基修饰的B部分是通过：将氨基修饰的磁性微球或EpCAM抗体用摩尔当量为5～20倍的SFB进行醛基修饰后得到的。最优选的，SFB的摩尔当量为氨基修饰的磁性微球或EpCAM抗体的10倍。所述SFB为4-甲酰苯甲酸N-琥珀酰亚胺酯(CAS：60444-78-2)，在室温条件下可以温和的将氨基转换为醛基。所述SFB一般溶解在DMF溶液中进行反应，浓度可以根据磁性微球或EpCAM抗体的浓度进行调整，不影响反应结果。该反应过程可以在15～25℃室温条件下进行，反应时间根据本领域技术人员常规的检测技术判断，本发明一般采用对磁性微球的修饰反应时间16～24h，对EpCAM抗体的修饰反应时间2～4h。
所述步骤s1中的磁性纳米簇是通过水热法、溶剂热法或共沉淀法制备得到，也可以采用市售商品。制备磁性纳米簇的方法为本领域技术人员所熟知的技术，得到的产品只需要满足具有良好的磁性，并且可以与无机或有机高分子形成核壳结构即可。
作为优选的，所述步骤s1中的磁性纳米簇是通过如下方法制备得到：
1)在空气中，向二价铁盐的水溶液中加入氨水，然后搅拌使溶液变成黑色，得到黑色Fe3O4颗粒；
2)向步骤1)中加入油酸，混合均匀后转移至密闭的反应釜中，在60～130℃下加热反应3～5小时，即可得到所述磁性纳米簇。
进一步的，所述步骤s2中的氨基修饰的磁性微球为核壳结构的二氧化硅包裹的磁性微球，效果更加优于直接在磁性纳米簇粒子表面进行氨基修饰得到的磁性微球，可以采用市售商品或者按照本领域技术人员所知的常规方法制备，均不影响本发明的结果。可以使纳米簇聚集在二氧化硅内部，形成核壳结构，增大粒径，并且增加磁性和稳定性即可。优选的，本发明采用如下方法制备氨基修饰的二氧化硅包裹的磁性微球：向含有磁性纳米簇的溶液中加入氨水、硅烷化试剂和氨基硅烷偶联剂，反应1～3天后得到氨基修饰的磁性微球部分；所述磁性纳米簇、氨水、硅烷化试剂、氨基硅烷偶联剂加入的质量比为：1:(12.5～40):(2～8):(0.5～3)。其中氨水的质量百分浓度为25～28％。其中，硅烷化试剂可以为正硅酸四乙酯(CAS：562-90-3)，氨基硅烷偶联剂可以为(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷(CAS：919-30-2)。本领域技术人员在选择其他的硅烷化试剂与氨基硅烷偶联剂时，可以对反应原料的比例进行调整，均不超出本发明的保护范围。
优选的，所述步骤s5中，磁性微球和EpCAM抗体的质量比为1：(0.01～1)。EpCAM抗体与磁性微球的质量比越高越有利于磁性微球表面偶联EpCAM抗体，但是考虑到EpCAM抗体的成本因素，本发明采用磁性微球和EpCAM抗体的质量比为1：(0.01～0.2)。
在本发明的第三方面，提供了一种用于捕获循环肿瘤细胞的试剂盒，所述试剂盒中含有上述的EpCAM抗体免疫磁珠。
本发明的有益效果为：
(1)将本发明的免疫磁珠用于捕获CTC，不仅特异性、敏感性好，而且磁响应迅速、富集时间短，捕获效率高。避免了捕获的CTC损伤，CTC可以用于进一步的分析。也可以用于外泌体、体液或活检组织的肿瘤细胞捕获与分析。
(2)本发明的免疫磁珠，其磁性微球部分和EpCAM抗体部分通过腙键结构相连，得到的免疫磁珠在弱碱性条件下(血液中)性质稳定，同时粒径小，磁响应性好，分散性好。
(3)本发明的制备方法简单，反应条件温和，氨基、醛基和肼基修饰的过程均可以在室温下进行，不容易造成EpCAM抗体的变质、降解等，同时避免了使用还原剂，使EpCAM抗体可以在低温下与细胞孵育，保持EpCAM抗体和细胞的生物活性。
(4)本发明原料简单易得，成本低，工艺步骤简单，具有很强的实用性。
附图说明
图1为本发明EpCAM免疫磁珠分选的CTC细胞免疫荧光图。
具体实施方式
以下通过具体实施例来进一步说明本发明：下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
实施例1用于捕获循环肿瘤细胞的免疫磁珠的制备
(1)磁性纳米簇的制备：
a.在空气中，将7g FeCl2·4H2O加入到50mL去离子水中，得到浓度为0.14g/mL的FeCl2水溶液。向50mL FeCl2水溶液中加入氨水30mL，搅拌20min后，颜色逐渐变为浅绿色，再变深绿色，最后变为黑色；
b.向步骤a中加入1.1g油酸，混合均匀后将混合液置于密闭的反应釜中，在110℃下加热反应4小时，然后用去离子水和乙醇交替洗涤各一次，磁分离后分散在正己烷中，即可得到黑色的磁性纳米簇Fe3O4 1。
(2)氨基修饰的磁性微球的制备：向10mg磁性纳米簇Fe3O4 1的溶液中加入125mg氨水、30mg正硅酸四乙酯和30mg(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷，反应1天后进行磁分离，并且用乙醇和水交替洗涤各两次，并用0.1M的pH 7～8的磷酸缓冲液分散后得到浓度为5mmol/L的氨基修饰的磁性微球1。
(3)肼基修饰的EpCAM抗体的制备：将5μL SANH的DMF溶液(浓度为5mmol/L)加入到100μL EpCAM抗体溶液(浓度为10μmol/L)中，在室温反应2h后，用超滤柱纯化得到肼基修饰的EpCAM抗体(简写为EpCAM-SANH)1。
检测EpCAM-SANH的浓度：通过BCA法计算修饰后的EpCAM-SANH的浓度为0.80mg/mL。
检测肼基修饰率：用定量的2-甲酰苯磺酰钠盐溶液检测肼基修饰率。取纯化后的EpCAM-SANH加入到的2-甲酰苯磺酰钠盐溶液中，涡旋混匀后于37℃反应1h，Nanodrop检测348nm处的吸光值为0.19。通过348nm处的吸光值和EpCAM-SANH的浓度计算出EpCAM-SANH的肼基修饰率为3.3。
(4)醛基修饰的磁性微球的制备：将5μL的氨基修饰的磁性微球1加入到SFB的DMF溶液(浓度为5mmol/L)50μL中，在室温反应20h后，进行磁分离纯化，得到醛基修饰的磁性微球1。
(5)免疫磁珠的制备：将1mg步骤(4)中的醛基修饰的磁性微球与0.01mg步骤(3)中的肼基修饰的EpCAM抗体混合，在25℃下pH值为6.0的PBS缓冲液中混合2小时后，进行磁分离得到EpCAM抗体偶联磁性微球的EpCAM抗体免疫磁珠。计算得到每毫克EpCAM抗体免疫磁珠1上，包被抗体率为85％(消耗的抗体量与加入的抗体总量的比例)。
实施例2EpCAM抗体免疫磁珠的敏感性检测
采集健康志愿者血样，通过人淋巴细胞分离液进行PBMCs提取，然后将人乳腺癌细胞MCF7(来源中国科学院细胞库购买)悬液按比例加入到PBMCs中，使PBMCs与MCF7的比例分别为103:1、104:1、105:1、106:1。然后将EpCAM免疫磁珠依次加入到上述各混合细胞悬液中，在4℃下孵育30分钟。在1分钟内进行磁分选并用PBS洗涤2-3次，得到用免疫磁珠捕获并回收的MCF7细胞。并且磁分选在1分钟内完成，说明EpCAM免疫磁珠的磁响应性好。
重复各浓度下的实验，结果表明，所有浓度下都可以检测到MCF7细胞，说明EpCAM抗体免疫磁珠的敏感性好。
实施例3模拟血液中肿瘤细胞的捕获
采集健康志愿者血样，将MCF7细胞与健康人的外周血混合，配成混合细胞悬液，调节MCF7细胞的浓度为1、10、20、50、500、1000个/mL，然后将EpCAM免疫磁珠依次加入到上述各混合细胞悬液中，在4℃下孵育30分钟。在1分钟内进行磁分选并用PBS洗涤2-3次，得到用免疫磁珠捕获并回收的MCF7细胞。统计回收的MCF7细胞，在MCF7细胞的浓度为1个/mL时仍然可以捕获到MCF7细胞。
从实施例2-3的捕获结果来看，免疫磁珠在单纯环境中(实施例2)的捕获效率能够精确到1：106，免疫磁珠在复杂环境中(实施例3)也可以检测到1个/mL的MCF7细胞，敏感性可以满足目前液态活检的要求。
对上述孵育后的磁珠用无钙镁的PBS缓冲液重悬，将洗脱得到的磁珠-细胞用PicoPure RNA Isolation Kit试剂盒(Thermo Cat No：KIT0214)提取纯化总RNA，采用了PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser(TAKARA,Cat No：RR047A)，按说明书要求去除基因组DNA以及进行cDNA链合成。接下来涉及相应Taqman引物，进行qPCR检测，在相同条件下，与MCF7细胞的qPCR检测结果一致。说明用本发明的免疫磁珠捕获循环肿瘤细胞不会损伤细胞，可以用于后续细胞分析。并且说明，用本发明的免疫磁珠捕获到的细胞基本没有PBMCs细胞，PBMCs细胞则基本不与EpCAM抗体免疫磁珠结合。
实施例4癌症病人的CTC细胞捕获
取健康人和不同癌症病人的外周血血液，对血液中的CTC进行捕获。要求受试者血常规白细胞值位于2×106～1.2×107个/mL之间，全血样本未出现溶血或血块凝结。并且受试者相关信息完整，样本采集、保存方法规范，实验操作规范，具体步骤如下：取不同癌症病人血液3ml，加入EpCAM免疫磁珠依次加入到上述各混合细胞悬液中，在4℃下孵育30分钟，然后在1分钟内进行磁分选并用PBS洗涤2-3次，将孵育回收的CTC进行抗体染色、并在载玻片上固定、然后进行细胞核DAPI染色、封片后，用荧光显微镜鉴定，结果如图1所示，细胞膜表面显示有荧光，在荧光显微镜下为绿光荧光，说明捕获到的细胞表面呈EpCAM阳性，说明为肿瘤细胞。而正常人的血液中没有捕获到肿瘤细胞。
如果先对血液进行红细胞裂解，并且用CD45抗体免疫磁珠去除血液中的白细胞后再用EpCAM抗体免疫磁珠进行CTC的捕获，捕获效率更高。
以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明实施例原理以及权利要求的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明实施例的保护范围。

Claims (3)

1.一种EpCAM抗体免疫磁珠，包括磁性微球部分和抗体部分，其特征在于：所述免疫磁珠的结构式为：A-NH-N＝CH-B，其中A表示磁性微球，B表示EpCAM抗体，或者A表示EpCAM抗体，B表示磁性微球,
所述磁性微球为二氧化硅包裹的磁性四氧化三铁、或者葡聚糖包裹的磁性四氧化三铁，
所述EpCAM抗体免疫磁珠的粒径为200～300nm,
制备所述EpCAM抗体免疫磁珠的方法，其步骤包括：
s1.磁性纳米簇的制备；
s2.氨基修饰的磁性微球的制备；
s3.肼基修饰的A部分的制备；
s4.醛基修饰的B部分的制备；
s5.免疫磁珠的制备：将步骤s3所述肼基修饰的A部分与步骤s4所述醛基修饰的B部分混合，在4～25℃下进行偶联反应2～24小时，得到所述免疫磁珠,
所述步骤s3中的肼基修饰的A部分是通过：将氨基修饰的磁性微球或EpCAM抗体用摩尔当量为10～50倍的 SANH进行肼基修饰后得到的,
所述步骤s4中的醛基修饰的B部分是通过：将氨基修饰的磁性微球或EpCAM抗体用摩尔当量为5～20倍的SFB 进行醛基修饰后得到的，
所述步骤s2中的氨基修饰的磁性微球部分为核壳结构的二氧化硅包裹的磁性微球，通过如下方法制备得到：向含有磁性纳米簇的溶液中加入氨水、硅烷化试剂和氨基硅烷偶联剂，反应1～3天后得到氨基修饰的磁性微球部分；所述磁性纳米簇、氨水、硅烷化试剂、氨基硅烷偶联剂加入的质量比为：1:(12.5～40):(2～8):(0.5～3)，
所述磁性纳米簇按照如下方法制备：
a.在空气中，将7g FeCl2·4H2O加入到50mL去离子水中，得到浓度为0.14g/mL的 FeCl2水溶液，向50mL FeCl2水溶液中加入氨水30mL，搅拌20min后，颜色逐渐变为浅绿色，再变深绿色，最后变为黑色；b.向步骤a中加入1.1g油酸，混合均匀后将混合液置于密闭的反应釜中，在110℃下加热反应4小时，然后用去离子水和乙醇交替洗涤各一次，磁分离后分散在正己烷中，即可得到黑色的磁性纳米簇Fe3O4。
2.一种制备权利要求1所述EpCAM抗体免疫磁珠的方法，其步骤包括：
s1.磁性纳米簇的制备；
s2.氨基修饰的磁性微球的制备；
s3.肼基修饰的A部分的制备；
s4.醛基修饰的B部分的制备；
s5.免疫磁珠的制备：将步骤s3所述肼基修饰的A部分与步骤s4所述醛基修饰的B部分混合，在4～25℃下进行偶联反应2～24小时，得到所述免疫磁珠,
所述步骤s3中的肼基修饰的A部分是通过：将氨基修饰的磁性微球或EpCAM抗体用摩尔当量为10～50倍的 SANH进行肼基修饰后得到的,
所述步骤s4中的醛基修饰的B部分是通过：将氨基修饰的磁性微球或EpCAM抗体用摩尔当量为5～20倍的SFB 进行醛基修饰后得到的，
所述步骤s2中的氨基修饰的磁性微球部分为核壳结构的二氧化硅包裹的磁性微球，通过如下方法制备得到：向含有磁性纳米簇的溶液中加入氨水、硅烷化试剂和氨基硅烷偶联剂，反应1～3天后得到氨基修饰的磁性微球部分；所述磁性纳米簇、氨水、硅烷化试剂、氨基硅烷偶联剂加入的质量比为：1:(12.5～40):(2～8):(0.5～3)，
所述磁性纳米簇按照如下方法制备：
a.在空气中，将7g FeCl2·4H2O加入到50mL去离子水中，得到浓度为0.14g/mL的 FeCl2水溶液，向50mL FeCl2水溶液中加入氨水30mL，搅拌20min后，颜色逐渐变为浅绿色，再变深绿色，最后变为黑色；b.向步骤a中加入1.1g油酸，混合均匀后将混合液置于密闭的反应釜中，在110℃下加热反应4小时，然后用去离子水和乙醇交替洗涤各一次，磁分离后分散在正己烷中，即可得到黑色的磁性纳米簇Fe3O4。
3.一种用于捕获循环肿瘤细胞的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中含有权利要求1所述的EpCAM抗体免疫磁珠。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107525920B (zh) * 2017-08-11 2019-04-16 徐州医科大学 聚离子液体磁性纳米复合物及其对痕量循环肿瘤细胞特异性富集和检测的应用
CN107490681A (zh) * 2017-09-29 2017-12-19 安徽安龙基因科技有限公司 一种EpCAM抗体免疫磁珠的制备方法
CN107858144B (zh) * 2017-11-10 2019-10-11 四川大学 一种用于高效检测循环肿瘤细胞的磁性材料及其制备方法
CN108387746A (zh) * 2018-03-02 2018-08-10 浙江大学 一种捕获外泌体的超顺磁纳米微粒及其制备方法和特异性外泌体发光免疫定量检测试剂盒
CN110527725A (zh) * 2018-05-25 2019-12-03 国家纳米科学中心 用于侵袭性和非侵袭性垂体瘤判断的外泌体检测装置和应用
CN110658165A (zh) * 2019-09-23 2020-01-07 潍坊市康华生物技术有限公司 一种功能化磁珠、制备方法及特异性捕获结直肠癌循环肿瘤细胞的方法
CN112755925B (zh) 2020-12-25 2021-11-12 南通大学 一种神经组织来源外泌体的提取方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103100358A (zh) * 2012-12-20 2013-05-15 华南理工大学 一种磁性纳米离子液体复合微粒及其制备方法和应用
CN105087493A (zh) * 2014-09-26 2015-11-25 卢英 联用三种单克隆抗体偶联免疫磁珠在肿瘤细胞分选中应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103100358A (zh) * 2012-12-20 2013-05-15 华南理工大学 一种磁性纳米离子液体复合微粒及其制备方法和应用
CN105087493A (zh) * 2014-09-26 2015-11-25 卢英 联用三种单克隆抗体偶联免疫磁珠在肿瘤细胞分选中应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Fe3O4纳米材料的制备、改性及应用;王娟;《中国优秀硕士学位论文全文数据库工程科技I辑》;CNKI;20101115(第11期);第21-46页 *
SureLINKTM Conjugation Chemistry: Phosphatase Conjugates and Their Use in Immunodetection;Danielle Russell等;《KPL APPLICATION NOTE》;KPL APPLICATION NOTE;20061231;第1-2页、第5页右栏第3段，图1-图3 *

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