CN108387746A - 一种捕获外泌体的超顺磁纳米微粒及其制备方法和特异性外泌体发光免疫定量检测试剂盒 - Google Patents

一种捕获外泌体的超顺磁纳米微粒及其制备方法和特异性外泌体发光免疫定量检测试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN108387746A
CN108387746A CN201810175606.7A CN201810175606A CN108387746A CN 108387746 A CN108387746 A CN 108387746A CN 201810175606 A CN201810175606 A CN 201810175606A CN 108387746 A CN108387746 A CN 108387746A
Authority
CN
China
Prior art keywords
excretion body
superparamagnetic nanoparticle
antibody
superparamagnetic
capture
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201810175606.7A
Other languages
English (en)
Inventor
陶志华
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Zhejiang University ZJU
Original Assignee
Zhejiang University ZJU
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zhejiang University ZJU filed Critical Zhejiang University ZJU
Priority to CN201810175606.7A priority Critical patent/CN108387746A/zh
Publication of CN108387746A publication Critical patent/CN108387746A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G01N33/54326—Magnetic particles
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G01N33/54346—Nanoparticles

Abstract

本发明提供了一种捕获外泌体的超顺磁纳米微粒及其制备方法和特异性外泌体发光免疫定量检测试剂盒；属于外泌体检测技术领域。本发明所述的捕获外泌体的超顺磁纳米微粒包括超顺磁纳米微粒基体和与所述超顺磁纳米微粒基体偶联的外泌体共有标记物抗体。本发明提供的特异性外泌体发光免疫定量检测试剂盒包括捕获外泌体的超顺磁纳米微粒、发光标记的外泌体特异性标记物抗体，封闭液、洗涤液、NaOH水溶液、双氧水和校准品，能够实现简便、快速、定量检测特异性外泌体；可以直接用于血清、血浆、胸腹水、尿液、脑脊液标本中特异外泌体的标记物的检测，灵敏度高、稳定性好且检测时间短，操作简便，非常适用于临床检测。

Description

一种捕获外泌体的超顺磁纳米微粒及其制备方法和特异性外 泌体发光免疫定量检测试剂盒
技术领域
本发明属于外泌体检测技术领域，具体涉及一种捕获外泌体的超顺磁纳 米微粒及其制备方法和特异性外泌体发光免疫定量检测试剂盒。
背景技术
外泌体是细胞释放到胞外的大小为30nm～200nm的双层膜性囊泡，携带 大量蛋白质、脂质和RNAs等物质，介导体内细胞间的信息传导，从而影响细 胞的生理功能。外泌体膜表面除了共有标记物(如CD9、CD63、CD81等)外， 亦表达多种特异性标记物(如GPC1、GPC3、PSMA、TMEM256、EpCAM等)，这 些特异性外泌体高度反映了宿主细胞类型和状态。研究显示，分离检测特异 性外泌体对疾病诊断、治疗监控与预后判断具有重要意义，尤其在恶性肿瘤诊断方面具有很高诊断特异性和诊断灵敏度。
目前对于体液中特异性外泌体的检测主要是先通过超速离心法进行外泌 体的分离纯化，然后对外泌体特殊标记物进行检测，这种方式耗时长，不方 便，不利于临床常规开展。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种捕获外泌体的超顺磁纳米微粒及 其制备方法和特异性外泌体发光免疫定量检测试剂盒。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：一种捕获外泌体的 超顺磁纳米微粒，包括超顺磁纳米微粒基体、外泌体共有标记物抗体；所述 超顺磁纳米微粒基体包括氧化铁纳米粒子和偶联单元；所述超顺磁纳米微粒 基体通过所述的偶联单元与外泌体共有标记物抗体偶联，所述偶联单元为羧 基磷脂聚乙二醇。
优选的，所述外泌体共有标记物抗体包括anti-CD9、anti-CD63、 anti-CD81和anti-Flotillin-1中的一种或几种。
优选的，所述超顺磁纳米微粒的粒径为3～50nm。
本发明还提供了所述捕获外泌体的超顺磁纳米微粒的制备方法，包括以 下步骤：1)将偶联单元羧基磷脂聚乙二醇、氧化铁纳米粒子和三氯甲烷在超 声条件下中进行氧化反应，获得的羧基修饰氧化铁纳米粒子为超顺磁纳米微 粒基体；2)将所述超顺磁纳米微粒基体与外泌体共有标记物抗体缩合偶联， 获得捕获外泌体的超顺磁纳米微粒。
优选的，步骤2)中所述的偶联采用N-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基 丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐化学偶联法进行。
本发明还提供了一种特异性外泌体发光免疫定量检测试剂盒，包括上述 的捕获外泌体的超顺磁纳米微粒、发光标记的外泌体特异性标记物抗体，封 闭液、洗涤液、NaOH水溶液、双氧水和校准品。
优选的，所述发光标记的外泌体特异性标记物抗体为吖啶酯标记的GPC1 抗体。
优选的，所述封闭液为牛血清白蛋白溶液。
优选的，所述洗涤液为含吐温20的PBS溶液。
优选的，所述校准品为癌细胞的外泌体。
本发明的有益效果：本发明提供的超顺磁纳米微粒通过将超顺磁纳米微粒基 体与外泌体共有标记物抗体偶联得到，所述超顺磁纳米微粒能够与外泌体的 共有标记物特异性结合，从而实现对外泌体的快速、特异和高效捕获。
本发明提供的特异性外泌体发光免疫定量检测试剂盒，将超顺磁纳米微 粒磁性和化学发光免疫的特异性、可检测性结合，能够实现简便、快速、定 量检测特异性外泌体；本发明提供的特异性外泌体发光免疫定量检测试剂盒 可以直接用于血清、血浆、胸腹水、尿液、脑脊液标本中特异外泌体的标记 物的检测，灵敏度高、稳定性好且检测时间短，操作简便，非常适用于临床 检测。
附图说明
图1实施例1中GPC1+外泌体蛋白Western Blot结果图；
图2实施例1流式细胞检测方法筛选外泌体捕获抗体结果图；
图3-1为超顺磁纳米微粒基体的电镜图，图3-2为超顺磁纳米微粒基体 的动态光散射图；
图4超顺磁纳米微粒捕获外泌体的分离装置示意图；
图5GPC1+外泌体化学发光免疫学检测技术原理示意图；
图6GPC1+外泌体的检测校准曲线图；
图7GPC1+外泌体在胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌患者中的表达水平差异对 比图；
图8GPC1+外泌体对胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌诊断ROC曲线图；
图9胰腺癌患者术前及术后5天血清GPC1+外泌体水平变化图。
具体实施方式
本发明提供了一种捕获外泌体的超顺磁纳米微粒，包括超顺磁纳米微粒 基体、外泌体共有标记物抗体；所述超顺磁纳米微粒基体包括氧化铁纳米粒 子和偶联单元；所述超顺磁纳米微粒基体通过所述的偶联单元与外泌体共有 标记物抗体偶联。
在本发明中所述超顺磁纳米微粒的粒径优选的为3～50nm，更优选的为 5～20nm。在本发明中所述的超顺磁纳米微粒大小均匀，分散性良好。在本发 明中所述超顺磁纳米微粒基体通过偶联单元偶联外泌体共有标记物抗体，能 够特异性结合外泌体。本发明中所述超顺磁纳米微粒基体为具有磁性的氧化 铁纳米粒子，本发明中所述超顺磁纳米微粒基体负载外泌体共有标记物抗体 的比例为0.1-3.0μg(Fe)/μg(IgG)。本发明中所述的外泌体共有标记物 抗体优选的包括anti-CD9、anti-CD63、anti-CD81和anti-Flotillin-1中的 一种或几种；所述偶联单元优选的为羧基磷脂聚乙二醇。
本发明还提供了所述捕获外泌体的超顺磁纳米微粒的制备方法，包括以 下步骤：1)将偶联单元、氧化铁纳米粒子和三氯甲烷在超声条件下中进行氧 化反应，获得的羧基修饰氧化铁纳米粒子为超顺磁纳米微粒基体；2)将所述 超顺磁纳米微粒基体与外泌体共有标记物抗体缩合偶联，获得捕获外泌体的 超顺磁纳米微粒。
在本发明中，用羧基磷脂聚乙二醇与氧化铁纳米粒子发生氧化反应，获 得羧基修饰的氧化铁纳米粒子即为超顺磁纳米微粒基体。在本发明中，所述 氧化铁纳米微粒的粒度优选为2～40nm；所述的氧化铁纳米粒子的制备方法优 选包括：将铁、油酸和十八烯在300～340℃下混合搅拌发生氧化反应；将得到 的反应产物经丙酮沉淀，得到氧化铁纳米微粒。
在本发明中，所述原料铁优选的为单质铁粉，本发明中所述反应优选的 在氩气保护下进行，本发明中所述氩气的流速优选的为0.9～1.2m·s-1；本发 明中所述氩气的作用为置换反应体系中空气，防止Fe被氧化。在本发明中， 所述搅拌的转速优选的为100r/min。在本发明中所述氧化反应的温度更优选 为310～330℃；所述氧化反应的时间优选为20～40min，更优选为30min。
在本发明中所述氧化反应结束后优选的将反应产物自然降温至20～30℃， 然后用丙酮沉淀反应产物；在本发明中所述丙酮的用量优选的为60ml。
本发明优选的将所述丙酮沉淀后的产物进行离心，收集固相组分获得氧 化铁纳米粒子。在本发明中，所述离心的转速优选的为8000～12000rpm，更优 选的为10000rpm；所述离心的时间优选的为8～12min，更优选的为10min。
在本发明中，所述氧化反应的过程优选具体包括以下步骤：将所述氧化 铁纳米粒子和羧基磷脂聚乙二醇在三氯甲烷混合进行第一次超声震荡处理， 得到第一混合物；浓缩所述第一混合物获得浓缩产物；对所述浓缩产物进行 第二超声震荡处理获得超顺磁纳米微粒基体。
本发明在获得氧化铁纳米粒子后，将所述氧化铁纳米粒子和羧基磷脂聚 乙二醇在三氯甲烷混合进行第一次超声震荡处理，得到第一混合物。本发明中 所述氧化铁纳米粒子的质量、羧基磷脂聚乙二醇质量、三氯甲烷的体积混合 比例优选的为(4～6):(8～12):(2～4)(m/m/v)；所述超声的功率优选为 40～60w，更优选为50W；所述超声的频率优选为35～45KHz，更优选的为40KHz； 本发明中所述超声震荡的时间优选为7～13min，更优选为10min。
本发明在所述第一次超声震荡处理后，优选的对第一次超声震荡处理后 的第一混合物进行旋转蒸发浓缩，得到浓缩产物。本发明中所述旋转蒸发浓 缩的温度优选的为200℃，时间优选的为10min。
本发明优选的在旋转蒸发浓缩后，将得到的浓缩产物与PBS缓冲液混合进 行第二次超声震荡处理，获得超顺磁纳米微粒基体。本发明中，所述浓缩产 物的质量以使用的氧化铁纳米粒子的质量计算，所述PBS缓冲液与氧化铁纳米 粒子的质量体积比(mg/ml)优选为1:(0.5～2)；本发明中第二次超声震荡 处理的时间优选的为5～15s，更优选的为10s；所述第二次超声震荡处理的其 它参数与第一次超声震荡处理一致，在此不再赘述。
本发明在获得超顺磁纳米微粒基体后，优选的用透射电镜对所述超顺磁 纳米微粒基体进行观测微粒大小，并用动态光散射(Dynamic Light Scattering，DLS)测试微粒的分散性能。
本发明在获得超顺磁纳米微粒基体后，将所述超顺磁纳米微粒基体与外 泌体共有标记物抗体偶联获得捕获外泌体的超顺磁纳米微粒。本发明中，所 述偶联优选的采用N-羟基琥珀酰亚胺/1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺 盐酸盐(NHS/EDC)化学偶联的方法进行。
在本发明中，所述偶联反应优选包括以下步骤：将所述超顺磁纳米微粒 基体表面的偶联单元上的羧基激活，然后通过激活的羧基将所述超顺磁纳米 微粒基体与抗体偶联。
在本发明中将所述超顺磁纳米微粒基体表面偶联单元上的羧基激活，本 发明中所述羧基激活反应优选的NHS/EDC-MES混合溶液中进行；所述NHS/ EDC-MES混合溶液的浓度优选为0.05～0.15M，更优选为0.1M；所述NHS/ EDC-MES混合溶液的pH值优选的为4.8～5.2，更优选的为5.0；所述NHS/ EDC-MES混合溶液通过以下方法制备获得：将等质量的NHS与EDC溶解于10倍体 积的MES中获得NHS/EDC-MES混合溶液。在本发明中，所述的羧基激活具体 为将所述超顺磁纳米微粒基体分散于所述NHS/EDC-MES混合溶液中 20～40min，激活所述超顺磁纳米微粒基体上的羧基获得超顺磁纳米微粒基体 溶液。本发明中所述NHS/EDC-MES混合溶液与超顺磁纳米微粒基体溶液的体 积比优选的为1：(3～5)，更优选的为1:4，所述激活反应时间优选的为 25～35min，更优选的为30min。
本发明所述激活反应结束后，优选的采用MES缓冲液对反应产物进行超滤 离心，去除多余的激活剂，得到纯化的超顺磁纳米微粒基体。本发明中所述 超滤离心的转速优选为11000～12000g，更优选的为11500g；所述超滤离心的 时间优选的为5-15min，更优选的为10min。本发明中所述超滤离心优选的采 用Millipore Ultrafree 0.5的离心管进行；所述Millipore Ultrafree 0.5 的截留分子量优选的为30KDa。
本发明在所述过滤离心后，猝灭NHS和EDC，得到猝灭NHS和EDC的超顺磁 纳米微粒基体。在本发明中，所述猝灭NHS和EDC优选的采用低温猝灭的方法， 所述低温猝灭的温度优选为3～5℃；所述低温淬灭的时间优选为10～14h，更优 选的为12h。
本发明在猝灭NHS和EDC后，用BSA溶液封闭超顺磁纳米微粒基体上的非结 合位点，然后将所述外泌体共有标记物抗体与封闭后的超顺磁纳米微粒基体 偶联，获得捕获外泌体的超顺磁纳米微粒。
本发明中，所述所述偶联的外泌体共有标记物抗体与封闭后的超顺磁纳 米微粒基体的质量比优选的为0.8μg(Fe)/μg(IgG)；所述偶联的温度优 选为20～30℃，更优选为25℃，所述偶联的时间优选为40～80min，更优选的为 60min。
本发明在所述偶联结束后，优选的将所述捕获外泌体的超顺磁纳米微粒 在4℃放置过夜后PBS缓冲液洗涤多余未结合抗体。
本发明中获得的所述捕获外泌体的超顺磁纳米微粒优选的置于4℃保藏。
本发明还提供了一种特异性外泌体发光免疫定量检测试剂盒，包括上述 捕获外泌体的超顺磁纳米微粒、发光标记的外泌体特异性标记物抗体，封闭 液、洗涤液、NaOH水溶液、双氧水和校准品。
本发明所述试剂盒包括发光标记的外泌体特异性标记物抗体；所述发光 标记的外泌体特异性标记物抗体优选的为吖啶酯标记的GPC1抗体。在本发明 中所述吖啶酯标记的GPC1抗体通过以下方法制备获得：将GPC1抗体与吖啶 酯混合避光孵育，获得吖啶酯标记的GPC1抗体。本发明中所述GPC抗体的浓 度优选为0.4～0.6mg/ml；更优选为0.5mg/ml,本发明中所述GPC抗体的溶剂 优选的为0.1M磷酸盐缓冲液；所述吖啶酯的浓度优选为0.45～0.55mM，更优 选为0.5mM，所述吖啶酯的溶剂优选的为0.1M碳酸盐缓冲液。本发明中所述GPC1抗体与吖啶酯的体积比优选的为10:2.5～3.5，更优选的为10：3。本发 明中所述避光孵育的时间优选的为10～14h，更优选的为12h；所述避光孵育 的温度优选的为20～30℃，更优选的为25℃。
本发明在所述避光孵育结束后，优选的将所述孵育后的混合物在PBS缓 冲液中透析过夜，并通过15x80mm Sephadex G-50脱盐柱纯化获得吖啶酯标 记的GPC1抗体溶液。本发明在获得吖啶酯标记的GPC1抗体溶液后，将质量 分数为10％NaN3溶液与吖啶酯标记的GPC1抗体溶液溶液以1:95～105的体积 比混合；储存于4℃备用。
本发明所述试剂盒还包括封闭液；所述封闭液优选的为牛血清白蛋白溶 液，所述牛血清白蛋白溶液的质量浓度优选的为8～12％，更优选的为10％。所 述封闭液的作用为减少吖啶酯标记抗体的非特异性吸附。
本发明所述试剂盒还包括洗涤液，所述洗涤液优选的为添加0.01％(w/w) 吐温20的PBS溶液。所述洗涤液的作用为洗涤多余未结合物质。
本发明所述试剂盒还包括NaOH水溶液，所述NaOH水溶液的浓度优选的 为0.1mol/L；所述NaOH水溶液的作用为使反应体系变成碱性溶液，让吖啶 酯发光。
本发明所述试剂盒还包括双氧水，所述双氧水的浓度优选的为0.01 mol/L；所述双氧水的作用为吖啶酯发光反应提供活性氧。
本发明所述试剂盒还包括校准品，本发明中所述校准品为生长状态良好 癌细胞的外泌体，在本发明中所述校准品优选的为胰腺癌细胞系Panc-1的外 泌体。本发明中所述胰腺癌细胞系Panc-1的外泌体通过培养胰腺癌细胞系 Panc-1并从细胞培养上清通过超速离心的方式获得外泌体。取部分校准品外 泌体，加入高效组织细胞裂解液(Beyotime，P0013K)后在冰上裂解40分钟。 通过GPC1检测试剂盒(GPC1Human ELISA kit，ABIN840422)定量检测GPC1 蛋白总量。取相应量的定量样本加入正常体检者的血清或前 列腺按摩液中，模拟基质效应，检测定量样本中的GPC1的浓度，完成GPC1 蛋白总浓度的标准曲线。本发明中优选的对校准品进行赋值后，绘制以校准 品浓度为横坐标，以发光值为纵坐标的标准曲线。
本发明所述的试剂盒用于快速简便地检测人体体液中特异性外泌体含 量，本发明所述试剂盒的使用原理和流程图如图5所示：首先使用捕获外泌 体的超顺磁纳米微粒捕获体液中的外泌体，然后利用捕获外泌体的超顺磁纳 米微粒分离装置将捕获外泌体的超顺磁纳米微粒与体液中其他物质分离，同 时使用发光标记的外泌体特异性标记物抗体与捕获的外泌体上的特异性标记 物进行反应，通过检测其化学发光量根据绘制好的标准曲线对特异性外泌体 进行定量检测。
本发明所述捕获外泌体的超顺磁纳米微粒的分离装置(结构如图4-1～4-3 所示)，包括超顺磁纳米微粒分离柱(图4-1,左图为剖视图，右图为正视图) 和配套的磁分离装置(图4-2和图4-3)。本发明中所述超顺磁纳米微粒分离 柱优选的通过磁性分子筛分离所述捕获外泌体的超顺磁纳米微粒。在本发明 中所述超顺磁纳米微粒分离柱自上而下依次包括加样槽(1)、分离区(2) 和液流区(3)。
本发明中所述加样槽(1)优选的自上而下依次包括圆柱形加样区(4) 和漏斗状过渡区(5)，所述加样槽(1)优选的可容纳2～3ml液体，更优选 的为2.5ml；在本发明中所述加样槽(1)的总高度优选的为17.5～18.5mm； 更优选的为18mm。在本发明中，所述圆柱形加样区(4)的垂直高度优选的为 12～14mm，更优选的为13mm；所述圆柱形加样区(4)的外径优选的为 11.5～12.5mm，更优选的为12mm；所述圆柱形加样区(4)的内径优选的为11～12mm，更优选的为11.50mm。在本发明中所述漏斗状过渡区(5)的垂直 高度优选的为1.5～2.5mm，更优选的为2.00mm。本发明中所述漏斗状过渡区 (5)的大口直径优选的为12.0mm、所述漏斗状过渡区(5)的小口直径优选 的为7.5mm。
在发明中所述加样槽漏斗状过渡区(5)的末端与分离区(2)直接相连； 本发明中所述分离区(2)选的可容纳0.45～0.85mL液体，更优选的为0.7ml。 本发明中所述分离区(2)的垂直总高度优选的为11.50～14.50mm，更优选的 为13.00mm。本发明中所述分离区(2)包括初始分离柱(6)和窄缩分离柱 (7)；所述初始分离柱(6)的垂直高度优选的为3.80～7.20mm，更优选的为 5.00mm；所述初始分离柱(6)的外径优选的为7.00～8.00mm，更优选的为7.50 mm，所述圆柱形初始过渡区的内径优选的为6.50～7.50mm，更优选的为6.00 mm。本发明中所述窄缩分离柱(7)的垂直高度优选的为4.80～9.20mm，更优 选的为8.00mm。本发明中所述窄缩分离柱(7)的外径优选的2.80～6.20mm， 更优选的为5.5mm，所述窄缩分离柱内径优选的为2.10-5.80mm，更优选的 为4.6mm。
本发明中所述初始分离柱(6)的顶端设置有分子滤网，底端设置有球形 铁珠；在所述分子滤网和球形铁珠之间填充球形镍微粒。在本发明中，所述 分子滤网的孔径优选的为5～10μm，更优选的为8μm；所述球形镍微粒的粒 径优选的为10～1000μm。在本发明中所述磁性分子筛分离柱通过在分子滤网 和球形铁珠之间填充的球形镍微粒形成的磁性分子筛分离所述捕获外泌体的 超顺磁纳米微粒。
在本发明中，所述窄缩分离区(7)的末端与液流区(3)直接相连；本 发明中所述液流区(3)包括顺次连接的收集空心柱(8)和窄缩收集空心柱 (9)；在本发明中，所述收集空心柱(8)的外径优选的为2.50～5.00mm，更 优选的为3.80mm；所述收集空心柱(8)的内径优选的为1.50～4.00mm，更优 选的为2.50mm；所述收集空心柱(8)的柱高优选的为6～12mm，更优选的为 8.50mm。所述窄缩收集空心柱(9)的外径优选的为1.50～4.50mm，更优选的 为1.80mm；所述窄缩收集空心柱(9)的内径优选的为1.00～3.00mm，更优选 的为1.00mm；所述窄缩收集空心柱(9)的柱高优选的为1.00～3.50mm，更优 选的为2.00mm。
在本发明中所述分离装置还包括配套的磁分离装置；所述配套的磁分离 装置优选为中空磁分离箱结构如图4-2所示，所述中空磁分离箱顶面设置若 干磁分离柱卡槽(10)，所述磁分离卡槽(10)优选的等间距设置在所述中 空磁分离箱的顶面；所述磁分离柱卡槽(10)优选的为10～15个，更优选的 为12个。本发明中，所述磁分离箱(12)对应磁分离柱卡槽两侧面分别平行 设置磁铁(11)穿过箱体，所述磁铁(11)优选的为圆柱体N52钕铁硼强磁 磁铁，本发明中所述磁铁提供强磁力，从而在分离过程中吸留超顺磁纳米微 粒。
本发明中，所述磁分离箱(12)底部连接负压引流管路。在本发明具体 实施过程中，将所述超顺磁纳米微粒分离柱插入磁分离柱卡槽上，在所述中 空磁分离箱的箱体下方添加负压引流设备，超顺磁纳米微粒在磁铁的作用下 停留在超顺磁纳米微粒分离柱中，洗涤液体通过磁分离箱(12)底部连接负 压引流管路快速引流于废液瓶。
在所述分离完毕后，转移超顺磁纳米分离柱，静置1～5min，待超顺磁性 微粒磁力完全消失后，通过正压推流装置完全收集分离柱内磁微粒及其表面 捕获的囊泡蛋白。本发明中所述正压推流装置的推气速率优选的≥22L/min； 正压调节范围优选的为0.02～0.09MPa(150～680mmHg)；噪声优选的 ≤20dB(A)；电源参数优选的为220V、50Hz。
在本发明中，所述配套的磁分离装置还可以为磁分离套管支具，结构如 图4-3所示；所述磁分离套管支具为圆柱状，所述磁分离套管支具的直径优 选的为18～19mm，更优选的为18.50mm；所述磁分离套管支具的柱高优选的为 19.00～21.00mm，更优选的为20.00mm；本发明中所述磁分离套管支具的外侧 壁对称设置离心支撑把，所述离心支撑把用于将套管支具悬挂于离心管管口。
在本发明中，所述磁分离套管支具顶面中心设置磁分离柱插孔，所述磁 分离柱插孔的直径优选的为3.50mm～4.50mm，更优选的为4.00mm；所述磁分 离柱插孔的垂直高度优选为19.00～21.00mm，更优选的为20.00mm。本发明 中，所述磁分离柱插孔两侧分别设置磁铁插孔，用于固定磁铁；本发明中所 述磁铁插孔与磁分离柱插孔的垂直间距优选的为2.00～4.00mm；所述磁铁插孔 优选的为长方形，所述磁铁插孔的长优选的为10-20cm，宽优选的为4-8cm， 垂直高度优选的为6-9cm。本发明中所述磁铁插孔中优选的放置N52钕铁硼 强磁磁铁。
在本发明具体实施过程中，将放入磁铁后的整个磁分离套管支具放于离 心管上方，然后将所述超顺磁纳米微粒分离柱插入套管支具的磁分离柱插孔 中，加入洗涤液离心，从而快速分离洗涤液体于离心管中；洗涤完毕后，转 移超顺磁纳米分离柱，静置1～5min，待超顺磁性微粒磁力完全消失后，通过 正压推流装置完全收集分离柱内磁微粒及其表面捕获的囊泡蛋白。本发明中 所述正压推流装置的推气速率优选的≥22L/min；正压调节范围优选的为 0.02～0.09MPa(150～680mmHg)；所述正压推流装置的噪声优选的≤20dB(A)； 电源参数优选的为220V、50Hz。
本发明所述的试剂盒的使用方法具体如下：将含外泌体样本加入反应管， 然后加入封闭液、超顺磁纳米微粒，外泌体特异性标记物抗体，室温混匀反 应获得混合液体。反应后，将分离柱置于所述分离装置上(两种装置任选一 种)，向分离柱中加入上述混合液体，待所述混合液体流尽后，用洗涤液洗 涤多余未结合物质，洗涤过程重复4～6次；待洗涤液流尽后，将超顺磁纳米 分离柱从外加磁场中取出，静置，待柱内超顺纳米磁微粒的磁性消失后，通 过正压推流装置收集超顺磁纳米微粒，将所述收集到的超顺磁纳米微粒与双 氧水和NaOH水溶液混合置于单管发光检测仪(型号：CLA-01))上检测化学 发光信号，根据标准曲线计算获得样品中特异性外泌体的含量。本发明中所 述双氧水和NaOH水溶液的用量独立的为/次，更优选的为/ 次。
下面结合实施例对本发明提供的一种捕获外泌体的超顺磁纳米微粒及其 制备方法和特异性外泌体发光免疫定量检测试剂盒进行详细的说明，但是不 能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
外泌体的共有标记物和特异性标记物确认
用含10％胎牛血清(FBS)的RPMI 1640培养胰腺癌细胞系Panc-1和胰 腺正常细胞系HPDE，待其生长密度至80％，更换无FBS的RPMI 1640培养基 继续培养36h；收集培养上清用于提取外泌体。将上清分装至50mL离心管， 1000g离心10min去除细胞碎片；将上清继续10000g离心20min去除微囊 泡及细胞碎片；取上清110000g离心70min，去掉上清后用PBS缓冲液重悬 沉淀物质后，再次110000g离心70min，得到沉淀物(外泌体)。用100μL PBS缓冲液重悬沉淀用于后续实验：透射电镜观察鉴定提取外泌体形态；纳米 微粒跟踪分析技术NTA(Nanoparticle Tracking Analysis)测定沉淀粒径和 粒子数；BCA蛋白定量试剂盒检测提取外泌体的表面总蛋白量。Western Blot 鉴定外泌体含有的共有膜蛋白以及特异性标记物，并从中分析选择表达较高 的膜蛋白抗体进行后续研究。结果如图1显示：Panc-1胰腺癌细胞来源外泌 体表达GPC1、CD9、CD63、CD81、EpCAM、Flotillin-1分子，而胰腺良性细 胞仅表达共有外泌体标记物CD9、CD63、CD81分子。
实施例2
外泌体标记物特异性结合抗体的筛选
用流式细胞检测技术鉴定可与特异外泌体表面蛋白标记物结合的自制抗 体包括GPC1、GPC3、PSMA、TMEM256和EpCAM。取外泌体重悬于 PBS中，加入醛基/硫酸盐微球(aldehyde/sulfate beads)，室 温混匀15min。加入PBS，4℃过夜。加入1M甘氨酸，室温 混匀30min。12000rpm离心1.5min。去掉上清，用10％BSA重悬 沉淀。室温混匀封闭1小时。12,000rpm离心1.5min。去掉上清后分别加入GPC3、PSMA、TMEM256或EpCAM等，相应抗体用2％BSA稀释为 室温混匀1小时。加入2％BSA，12,000rpm离心1.5min 后去掉上清，加入2％BSA，12,000rpm离心1.5min后去掉上清。 加入荧光二抗于2％BSA，室温混匀1小时。加入2％BSA， 12,000rpm离心1.5min后去掉上清。加入2％BSA，12,000rpm离 心1.5min后去掉上清。2％BSA重悬后过流式仪器检测。图2以CD63 抗体、GPC1抗体为例，结果显示能够与外泌体表面相应抗原蛋白结合，其相 对表达丰度分别为54.03％、23.07％。
实施例3
捕获外泌体的超顺磁纳米微粒的制备
(1)超顺磁纳米微粒基体的制备及表征：取1.8g铁置于油相中，加入 0.57g油酸和10g十八烯加入到三口烧瓶中，氩气(0.9-1.2m·s-1)保护 下搅拌并升温至320度，保持该温度继续搅拌30min，后温度降至室温，用 60mL丙酮将其沉淀并离心(10000转，离心10min)分离获得氧化铁纳米粒 子。称取5mg氧化铁纳米粒子和10mg羧基磷脂聚乙二醇，量取3ml三氯 甲烷并超声(超声波功率为50W，超声波频率为40KHz)震荡10min溶解。之 后旋蒸10min后取出，并加入5mL PBS缓冲液，同上参数再次进行超声震 荡10秒。得到羧基修饰的氧化铁纳米粒子。用透射电镜对产物进行观测及动 态光散射(Dynamic Light Scattering，DLS)测试，粒径为5～20nm。结果 如图3所示，透射电镜和DLS显示所制备超顺磁纳米微粒大小均匀，分散性 良好。
(2)超顺磁纳米微粒基体与外泌体共有标记物抗体偶联：使用N-羟基琥 珀酰亚胺/1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(NHS/EDC)化学 偶联的方法，实现对包被聚乙二醇(PEG)的超顺磁纳米微粒的抗体修饰。反 应在0.1M 2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)缓冲液(pH＝5.0)体系中进行，将10mg 的NHS和10mg的EDC溶解在的MES缓冲液。取其中添加到 包被了PEG的超顺磁纳米微粒以激活微粒表面羧基。室温下反应30min 后用0.1M的MES缓冲液，通过Millipore Ultrafree 0.5(30kDa),11500g离心过滤去除多余激活剂，离心保留液体停止，重复4次洗 涤。4℃过夜孵育猝灭EDC、NHS。10％BSA封闭超顺磁纳米微粒1小时， PBS洗涤4次后，用PBS收集保存置于4℃。后加入外 泌体共有标记物抗体，室温反应1小时后4℃过夜。次日将超顺磁纳米微粒洗 涤5次去除多余未结合抗体后，超顺磁纳米微粒分离器分离收集后4℃保存。
实施例4
捕获外泌体的超顺磁纳米微粒的分离装置
包括超顺磁纳米微粒分离柱和中空磁分离箱，所述超顺磁纳米微粒分离 柱的结构如附图4-1所示，所述超顺磁纳米微粒分离柱自上而下包括依次连 通的加样槽(1)、分离区(2)和液流区(3)；
本发明中所述加样槽(1)优选的自上而下依次包括圆柱形加样区(4) 和漏斗状过渡区(5)，所述加样槽(1)优选的可容纳2.5ml液体；在本发 明中所述加样槽(1)的总高度为18mm。其中圆柱形加样区(4)的垂直高度 为13mm；所述圆柱形加样区(4)的外径为12mm；内径为11.50mm。在本发 明中所述漏斗状过渡区(5)的垂直高度为2.00mm。本发明中所述漏斗状过 渡区(5)的大口直径为12.0mm，小口直径为7.5mm。
所述加样槽漏斗状过渡区(5)的末端与分离区(2)直接相连；本发明 中所述分离区(2)可容纳0.7mL液体，所述分离区(2)的垂直总高度为13.00 mm。本发明中所述分离(2)包括初始分离柱(6)和窄缩分离柱(7)；所述 初始分离柱(6)的垂直高度为5.00mm；所述初始分离柱(6)的外径为7.50 mm，所述圆柱形初始过渡区的内径为6.00mm。本发明中所述窄缩分离柱(7) 的垂直高度为8.00mm。本发明中所述窄缩分离柱的外径为5.5mm，所述窄 缩分离柱内径为4.6mm。
所述初始分离柱(6)的顶端设置有分子滤网，底端设置有球形铁珠；在 所述分子滤网和球形铁珠之间填充球形镍微粒。在本发明中，所述分子滤网 的孔径为8μm；所述球形镍微粒的粒径为10～1000μm。在本发明中所述磁性 分子筛分离柱通过在分子滤网和球形铁珠之间填充的球形镍微粒形成的磁性 分子筛分离所述捕获外泌体的超顺磁纳米微粒。
在本发明中所述窄缩分离区(7)的末端与液流区(3)直接相连；本发 明中所述液流区(3)包括顺次连接的收集空心柱(8)和窄缩收集空心柱(9)； 在本发明中，所述收集空心柱(8)的外径为3.80mm；所述收集空心柱(8) 的内径为2.50mm；所述收集空心柱(8)的柱高为8.50mm。所述窄缩收集空 心柱(9)的外径为1.80mm；所述窄缩收集空心柱(9)的内径为1.00mm；所 述窄缩收集空心柱(9)的柱高为2.00mm。
所述中空磁分离箱的结构如附图4-2所示，所述中空磁分离箱顶面等间 距设置12个磁分离柱卡槽，所述磁分离箱对应磁分离柱卡槽两侧面分别平行 设置圆柱体N52钕铁硼强磁磁铁，所述磁分离箱底部连接负压引流管路。
在具体实施过程中，将所述超顺磁纳米微粒分离柱置于磁分离柱卡槽上， 在所述中空磁分离箱的箱体下方添加负压引流设备，超顺磁纳米微粒在磁铁 的作用下停留在超顺磁纳米微粒分离柱中，洗涤液体通过磁分离箱底部连接 负压引流管路快速引流于废液瓶。在所述分离完毕后，转移超顺磁纳米分离 柱，静置2min，待超顺磁性微粒磁力完全消失后，通过正压推流装置完全收 集分离柱内磁微粒及其表面捕获的囊泡蛋白。本发明中所述正压推流装置的 推气速率≥22L/min；正压调节范围为0.02～0.09MPa(150～680mmHg)；噪声 ≤20dB(A)；电源参数为220V、50Hz。
实施例5
捕获外泌体的超顺磁纳米微粒的分离装置
包括超顺磁纳米微粒分离柱和磁分离套管支具，所述超顺磁纳米微粒分 离柱的结构如附图4-1所示，所述超顺磁纳米微粒分离柱自上而下包括依次 连通的加样槽(1)、分离区(2)和液流区(3)；
本发明中所述加样槽(1)优选的自上而下依次包括圆柱形加样区(4) 和漏斗状过渡区(5)，所述加样槽(1)优选的可容纳2.5ml液体；在本发 明中所述加样槽(1)的总高度为18mm。其中圆柱形加样区(4)的垂直高度 为13mm；所述圆柱形加样区(4)的外径为12mm；内径为11.50mm。在本发 明中所述漏斗状过渡区(5)的垂直高度为2.00mm。本发明中所述漏斗状过 渡区(5)的大口直径为12.0mm，小口直径为7.5mm。
所述加样槽漏斗状过渡区(5)的末端与分离区(2)直接相连；本发明 中所述分离区(2)可容纳0.7mL液体，所述分离区(2)的垂直总高度为13.00 mm。本发明中所述分离(2)包括初始分离柱(6)和窄缩分离柱(7)；所述 初始分离柱(6)的垂直高度为5.00mm；所述初始分离柱(6)的外径为7.50 mm，所述圆柱形初始过渡区的内径为6.00mm。本发明中所述窄缩分离柱(7) 的垂直高度为8.00mm。本发明中所述窄缩分离柱的外径为5.5mm，所述窄 缩分离柱内径为4.6mm。
所述初始分离柱(6)的顶端设置有分子滤网，底端设置有球形铁珠；在 所述分子滤网和球形铁珠之间填充球形镍微粒。在本发明中，所述分子滤网 的孔径为8μm；所述球形镍微粒的粒径为10～1000μm。在本发明中所述磁性 分子筛分离柱通过在分子滤网和球形铁珠之间填充的球形镍微粒形成的磁性 分子筛分离所述捕获外泌体的超顺磁纳米微粒。
在本发明中所述窄缩分离区(7)的末端与液流区(3)直接相连；本发 明中所述液流区(3)包括顺次连接的收集空心柱(8)和窄缩收集空心柱(9)； 在本发明中，所述收集空心柱(8)的外径为3.80mm；所述收集空心柱(8) 的内径为2.50mm；所述收集空心柱(8)的柱高为8.50mm。所述窄缩收集空 心柱(9)的外径为1.80mm；所述窄缩收集空心柱(9)的内径为1.00mm；所 述窄缩收集空心柱(9)的柱高为2.00mm。
所述配套的磁分离装置为磁分离套管支具；所述磁分离套管支具的结构 如附图4-3所示；所述磁分离套管支具为圆柱状，所述磁分离套管支具的直 径为18.50mm；所述磁分离套管支具的柱高为20.00mm；所述磁分离套管支具 的外侧壁对称设置离心支撑把，所述离心支撑把用于将套管支具悬挂于离心 管管口。在本发明中，所述磁分离套管支具顶面中心设置磁分离柱插孔，所 述磁分离柱插孔的直径为4.00mm；所述磁分离柱插孔的垂直高度为20.00mm。 本发明中，所述磁分离柱插孔两侧分别设置磁铁插孔内N52钕铁硼强磁磁铁； 本发明中所述磁铁插孔与磁分离柱插孔的垂直间距为1-3mm；所述磁铁插孔 为长方形，所述磁铁插孔直径为0.50-1.50cm，垂直高度为1.00-2.50cm。
在具体实施过程中，然后将放入磁铁后的整个磁分离套管支具放于离心 管上方，然后将所述超顺磁纳米微粒分离柱插入套管支具的磁分离柱插孔中， 加入洗涤液离心，从而快速分离洗涤液体于离心管中；洗涤完毕后，转移超 顺磁纳米分离柱，静置2min，待超顺磁性微粒磁力完全消失后，通过正压推 流装置完全收集分离柱内磁微粒及其表面捕获的囊泡蛋白。本发明中所述正 压推流装置的推气速率优选的≥22L/min；正压调节范围优选的为0.02～ 0.09MPa(150～680mmHg)；所述正压推流装置的噪声优选的≤20dB(A)；电源参数优选的为220V、50Hz。
实施例6
一种特异性外泌体发光免疫定量检测试剂盒，包括实施例3中获得的捕 获外泌体的超顺磁纳米微粒、实施例4或5中的分离装置、吖啶酯标记GPC1 抗体，10％BSA、含有质量分数0.01％吐温20的PBS溶液、NaOH水溶液、双氧 水和校准品，校准品为胰腺癌细胞系Panc-1的外泌体。
吖啶酯标记抗体制备：取0.5mg自备GPC1抗体通过8000rpm离心6min， 浓缩为1mg/mL。加入0.5mM的吖啶酯与之混合。在室温下，避光 孵育12小时。标记抗体混合物在PBS缓冲液中透析过夜，并经Sephadex G-50 纯化。最后将10％NaN3溶液按1：100比例添加到纯化的抗体溶液中，纯化标 记抗体被储存在4℃。
利用上述试剂盒对GPC1+外泌体化学发光免疫学定量检测
实验原理如图5：捕获抗体CD63(此处以CD63抗体为例说明)被包被在 超顺磁纳米微粒基体表面，将含外泌体样本分别加入1.5mL离心管，加入等 量10％牛血清白蛋白(BSA)，取已偶联捕获抗体的超顺磁纳米微粒， 加入150ng上述标记了吖啶酯的GPC1抗体，室温混匀反应2小时。2小时 后，将分离柱置于实施例4或5所述的分离装置上，向分离柱中加入1.5mL 反应管内的物质，待液体流尽后，用含0.01％吐温20(tween20) 的PBST缓冲液洗涤多余未结合物质，洗涤过程重复5次。待液体流尽后，将 纳米磁分离柱从外加磁场中取出，静置2分钟，待柱内超顺纳米磁微粒的磁 性消失后，通过正压推流装置将超顺磁纳米微粒收集到相应试管内，向管内 添加H2O2及NaOH后，置于单管发光检测仪(型号：CLA-01) 上检测化学发光信号。
校准品制备与赋值
取生长状态良好的胰腺癌细胞系Panc-1，待其生长密度至80％后，更换 无FBS的RPMI 1640培养基继续培养36h；收集培养上清用于提取外泌体。 将上清分装至50mL离心管，1000g离心10min去除细胞碎片；将上清继 续10000g离心20分钟进一步去除微囊、以及细胞碎片；取上清110000g 离心70分钟，去掉上清，用PBS重悬沉淀物质，再次110000g离心70分 钟，沉淀即外泌体。用1ml PBS缓冲液重悬沉淀，分装并-80℃保存，作为 后续实验的校准品原液使用。取部分校准品外泌体，加入高效组织细胞裂解 液(Beyotime，P0013K)后在冰上裂解40分钟。通过GPC1检测试剂盒(GPC1 Human ELISA kit，ABIN840422)定量检测GPC1蛋白总量。取相应量的定量 样本加入正常体检者的血清，模拟基质效应，检测定量样本中GPC蛋 白含量，完成GPC1蛋白总浓度的标准曲线。校准品浓度作为横坐标，对应发光量 值作为纵坐标，绘制校准曲线，结果如图6。
特异性外泌体定量检测的方法学性能指标：
(1)精密度：本发明的化学发光免疫法定量检测GPC1+外泌体，具有较 高精密度，其批内变异系数(CV)<10％，日间变异系数(CV)<15％。
(2)分析线性测量范围：结果如图6，利用直接化学发光免疫测定技术 测定，其在之间呈现良好的线性关系(R2＝0.9697)。
(3)最低检测限：本专利方法可最低检测3.8 105/mL GPC1+的特异外泌 体。
初步临床应用结果
(1)临床标本的准备。
标本采集：采集初诊未受治疗的且有明确病理诊断的患者血液标本。其 中胰腺癌42例，良性胰腺疾病38例；前列腺癌56例，良性前列腺疾病48 例；健康体检者60例。
标本处理：将血液标本置于黄头促凝管，用2500g在4℃下离心30分钟 去除细胞，10000g离心20mi去除大囊泡，后将去掉沉淀，取上清于-80℃ 储存。
(2)血清GPC1+外泌体含量测定：采用具体实施方案6中操作对于血清 标本中GPC1+外泌体进行定量检测。
(3)统计分析：用SPSS 19.0(SPSS Inc.Chicago,USA)软件进行统 计分析。
(4)临床标本测定结果：
如图7所示：血清GPC1+外泌体在胰腺癌、前列腺癌中相对于良性有明显 的升高(P<0.01)；此外在良性疾病患者的血清中，GPC1+外泌体相对健康人 无明显的升高。
如图8所示：GPC1+外泌体在胰腺癌、前列腺癌具有良好的特异性和敏感 性。尤其在胰腺癌中，诊断特异性及敏感性均达到了100％。
在上述42例胰腺癌患者中选取16例，比较其术前及术后(术后5天) 血清中GPC1+外泌体的水平。如图9所示，术后的胰腺癌患者血清GPC1+外泌 体水平较术前有明显下降(P<0.05)，提示血清GPC1+外泌体与肿瘤负荷有关， 可作为肿瘤复发的监测指标。
由上述实施例可知，本发明提供的超顺磁纳米微粒能够与外泌体的共有 标记物特异性结合，从而实现对外泌体的快速、特异和高效捕获。本发明提 供超顺磁纳米微粒的分离装置，在磁性分子筛和高强度外加磁场的共同作用 下实现对结合有外泌体的超顺磁纳米微粒的快速有效分离。本发明提供的特 异性外泌体发光免疫定量检测试剂盒，能够实现简便、快速、定量检测特异 性外泌体；本发明提供的特异性外泌体发光免疫定量检测试剂盒可以直接用 于血清、血浆、胸腹水、尿液、脑脊液标本中特异外泌体的标记物的检测，灵敏度高、稳定性好且检测时间短，操作简便，非常适用于临床检测。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普 通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润 饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种捕获外泌体的超顺磁纳米微粒，其特征在于，包括超顺磁纳米微粒基体、外泌体共有标记物抗体；所述超顺磁纳米微粒基体包括氧化铁纳米粒子和偶联单元；所述超顺磁纳米微粒基体通过所述的偶联单元与外泌体共有标记物抗体偶联；所述偶联单元为羧基磷脂聚乙二醇。
2.根据权利要求1所述的超顺磁纳米微粒，其特征在于，所述外泌体共有标记物抗体包括anti-CD9、anti-CD63、anti-CD81和anti-Flotillin-1中的一种或几种。
3.根据权利要求1所述的超顺磁纳米微粒，其特征在于，所述超顺磁纳米微粒的粒径为3～50nm。
4.权利要求1所述捕获外泌体的超顺磁纳米微粒的制备方法，包括以下步骤：
1)将偶联单元羧基磷脂聚乙二醇、氧化铁纳米粒子和三氯甲烷在超声条件下中进行氧化反应，获得的羧基修饰氧化铁纳米粒子为超顺磁纳米微粒基体；
2)将所述超顺磁纳米微粒基体与外泌体共有标记物抗体缩合偶联，获得捕获外泌体的超顺磁纳米微粒。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤2)中所述缩合偶联采用N-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐化学偶联法进行。
6.一种特异性外泌体发光免疫定量检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1～3任意一项所述的超顺磁纳米微粒或权利要求4～5任意一项所述制备方法得到的超顺磁纳米微粒、发光标记的外泌体特异性标记物抗体，封闭液、洗涤液、NaOH水溶液、双氧水和校准品。
7.根据权利要求6所述的特异性外泌体发光免疫定量检测试剂盒，其特征在于，所述发光标记的外泌体特异性标记物抗体为吖啶酯标记的GPC1抗体。
8.根据权利要求6或7所述的特异性外泌体发光免疫定量检测试剂盒，其特征在于，所述封闭液为牛血清白蛋白溶液。
9.根据权利要求6或7所述的特异性外泌体发光免疫定量检测试剂盒，其特征在于，所述洗涤液为含吐温20的PBS溶液。
10.根据权利要求6或7所述的特异性外泌体发光免疫定量检测试剂盒，其特征在于，所述校准品为癌细胞的外泌体。
CN201810175606.7A 2018-03-02 2018-03-02 一种捕获外泌体的超顺磁纳米微粒及其制备方法和特异性外泌体发光免疫定量检测试剂盒 Pending CN108387746A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810175606.7A CN108387746A (zh) 2018-03-02 2018-03-02 一种捕获外泌体的超顺磁纳米微粒及其制备方法和特异性外泌体发光免疫定量检测试剂盒

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810175606.7A CN108387746A (zh) 2018-03-02 2018-03-02 一种捕获外泌体的超顺磁纳米微粒及其制备方法和特异性外泌体发光免疫定量检测试剂盒

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN108387746A true CN108387746A (zh) 2018-08-10

Family

ID=63070224

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810175606.7A Pending CN108387746A (zh) 2018-03-02 2018-03-02 一种捕获外泌体的超顺磁纳米微粒及其制备方法和特异性外泌体发光免疫定量检测试剂盒

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108387746A (zh)

Cited By (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108508108A (zh) * 2018-03-29 2018-09-07 公安部物证鉴定中心 基于抗体识别的磁性材料及其制备方法与应用
CN109283168A (zh) * 2018-08-13 2019-01-29 浙江大学 一种基于两性纳米颗粒的高灵敏度sers分子检测方法
CN109294907A (zh) * 2018-11-08 2019-02-01 浙江大学 基于微流控技术的超顺磁纳米微粒分离装置或分离系统在外泌体分离中的应用
CN109459571A (zh) * 2018-11-08 2019-03-12 浙江大学 基于微流控和化学发光免疫分析的超顺磁纳米微粒外泌体分离检测系统及其应用
CN109507426A (zh) * 2018-11-29 2019-03-22 上海晟燃生物科技有限公司 前列腺癌诊断、分级或预后标志物、检测试剂或试剂盒、系统及其应用
CN109738625A (zh) * 2019-01-04 2019-05-10 湖南师范大学 一种捕获纳米磁珠、捕获外泌体的方法和应用
CN109991427A (zh) * 2019-04-08 2019-07-09 王延博 一种用于检测血清中外泌体表面蛋白标志物的试剂盒
CN110106233A (zh) * 2019-03-25 2019-08-09 杭州师范大学 一种胞外囊泡/外泌体的数字pcr检测方法
CN110567921A (zh) * 2019-08-09 2019-12-13 湖北医药学院 通过磁纳米颗粒结合hrp催化对羟基苯乙胺产生荧光信号的聚合物及制备方法
CN111358957A (zh) * 2020-03-06 2020-07-03 西安组织工程与再生医学研究所 磁性纳米颗粒
CN112129939A (zh) * 2020-08-05 2020-12-25 宁波大学 基于Fe3O4@SiO2@TiO2纳米粒子富集和PSMA传感器检测前列腺癌外泌体的方法
CN113174359A (zh) * 2021-03-31 2021-07-27 中山大学 一种外泌体捕获纸芯片及其制备方法与应用
CN113444682A (zh) * 2021-08-30 2021-09-28 天九再生医学(天津)科技有限公司 一种外泌体分离纯化方法
CN113552372A (zh) * 2021-09-18 2021-10-26 湖南永和阳光生物科技股份有限公司 一种用于saa检测的磁微粒化学发光免疫试剂盒及其制备方法
CN113652399A (zh) * 2021-08-20 2021-11-16 宁波市第一医院 一种分离脑脊液中外泌体的方法

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2388589A1 (en) * 2010-05-21 2011-11-23 Imec Plasma membrane isolation
CN105651995A (zh) * 2016-02-19 2016-06-08 武汉大复生物科技有限公司 检测血液中内皮及内皮祖细胞释放的细胞外囊泡的方法
CN105974122A (zh) * 2016-05-04 2016-09-28 华东医药（杭州）基因科技有限公司 一种检测外泌体gpc1蛋白的方法
CN106053811A (zh) * 2016-06-05 2016-10-26 浙江大学 一种尿液外泌体elisa的检测方法及其应用
CN106289926A (zh) * 2016-07-26 2017-01-04 华东理工大学 一种使用免疫磁珠分离血清中外泌体的方法
CN106366196A (zh) * 2016-08-31 2017-02-01 上海美吉生物医药科技有限公司 一种EpCAM抗体免疫磁珠及其制备方法
CN106841613A (zh) * 2017-01-18 2017-06-13 上海良润生物医药科技有限公司 一种检测外泌体的方法及体系

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2388589A1 (en) * 2010-05-21 2011-11-23 Imec Plasma membrane isolation
CN105651995A (zh) * 2016-02-19 2016-06-08 武汉大复生物科技有限公司 检测血液中内皮及内皮祖细胞释放的细胞外囊泡的方法
CN105974122A (zh) * 2016-05-04 2016-09-28 华东医药（杭州）基因科技有限公司 一种检测外泌体gpc1蛋白的方法
CN106053811A (zh) * 2016-06-05 2016-10-26 浙江大学 一种尿液外泌体elisa的检测方法及其应用
CN106289926A (zh) * 2016-07-26 2017-01-04 华东理工大学 一种使用免疫磁珠分离血清中外泌体的方法
CN106366196A (zh) * 2016-08-31 2017-02-01 上海美吉生物医药科技有限公司 一种EpCAM抗体免疫磁珠及其制备方法
CN106841613A (zh) * 2017-01-18 2017-06-13 上海良润生物医药科技有限公司 一种检测外泌体的方法及体系

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
陶可等: "铁的氧化物纳米颗粒及其组装体的化学制备", 《化学进展》 *

Cited By (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108508108A (zh) * 2018-03-29 2018-09-07 公安部物证鉴定中心 基于抗体识别的磁性材料及其制备方法与应用
CN109283168B (zh) * 2018-08-13 2020-07-03 浙江大学 一种基于两性纳米颗粒的高灵敏度sers分子检测方法
CN109283168A (zh) * 2018-08-13 2019-01-29 浙江大学 一种基于两性纳米颗粒的高灵敏度sers分子检测方法
CN109294907A (zh) * 2018-11-08 2019-02-01 浙江大学 基于微流控技术的超顺磁纳米微粒分离装置或分离系统在外泌体分离中的应用
CN109459571A (zh) * 2018-11-08 2019-03-12 浙江大学 基于微流控和化学发光免疫分析的超顺磁纳米微粒外泌体分离检测系统及其应用
CN109507426A (zh) * 2018-11-29 2019-03-22 上海晟燃生物科技有限公司 前列腺癌诊断、分级或预后标志物、检测试剂或试剂盒、系统及其应用
CN109507426B (zh) * 2018-11-29 2022-03-15 上海晟燃生物科技有限公司 前列腺癌诊断、分级或预后标志物、检测试剂或试剂盒、系统及其应用
CN109738625A (zh) * 2019-01-04 2019-05-10 湖南师范大学 一种捕获纳米磁珠、捕获外泌体的方法和应用
CN110106233A (zh) * 2019-03-25 2019-08-09 杭州师范大学 一种胞外囊泡/外泌体的数字pcr检测方法
CN109991427A (zh) * 2019-04-08 2019-07-09 王延博 一种用于检测血清中外泌体表面蛋白标志物的试剂盒
CN110567921A (zh) * 2019-08-09 2019-12-13 湖北医药学院 通过磁纳米颗粒结合hrp催化对羟基苯乙胺产生荧光信号的聚合物及制备方法
CN111358957A (zh) * 2020-03-06 2020-07-03 西安组织工程与再生医学研究所 磁性纳米颗粒
CN111358957B (zh) * 2020-03-06 2024-03-26 西安组织工程与再生医学研究所 磁性纳米颗粒
CN112129939A (zh) * 2020-08-05 2020-12-25 宁波大学 基于Fe3O4@SiO2@TiO2纳米粒子富集和PSMA传感器检测前列腺癌外泌体的方法
CN113174359A (zh) * 2021-03-31 2021-07-27 中山大学 一种外泌体捕获纸芯片及其制备方法与应用
CN113652399A (zh) * 2021-08-20 2021-11-16 宁波市第一医院 一种分离脑脊液中外泌体的方法
CN113444682A (zh) * 2021-08-30 2021-09-28 天九再生医学(天津)科技有限公司 一种外泌体分离纯化方法
CN113552372A (zh) * 2021-09-18 2021-10-26 湖南永和阳光生物科技股份有限公司 一种用于saa检测的磁微粒化学发光免疫试剂盒及其制备方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108387746A (zh) 一种捕获外泌体的超顺磁纳米微粒及其制备方法和特异性外泌体发光免疫定量检测试剂盒
Kurian et al. Elucidating methods for isolation and quantification of exosomes: a review
He et al. Integrated immunoisolation and protein analysis of circulating exosomes using microfluidic technology
Xu et al. Antibody conjugated magnetic iron oxide nanoparticles for cancer cell separation in fresh whole blood
JP5265855B2 (ja) 循環ガン細胞の迅速かつ効率的な単離のための方法および試薬
Nie et al. Folic acid targeting for efficient isolation and detection of ovarian cancer CTCs from human whole blood based on two-step binding strategy
CN105723221B (zh) 分离方法、检测方法、信号测定方法、疾病的判定方法、疾病治疗药的药效评价方法、试剂盒以及液态组合物
CN108114290A (zh) 一种同时负载化学药物和纳米材料的外泌体的制备方法
US11366117B2 (en) Application of exosome TβRII protein as a marker in the preparation of breast cancer detection kit
JP6509926B2 (ja) 抗体および磁性ナノ粒子が結合された導電性高分子を含む血中のがん細胞の検出および回収用の磁性ナノ構造体
JP2004534210A (ja) 希少細胞検出アッセイにおける内部機能対照として用いる標識細胞
CN106366196B (zh) 一种EpCAM抗体免疫磁珠及其制备方法
Chang et al. Biomimetic immunomagnetic gold hybrid nanoparticles coupled with inductively coupled plasma mass spectrometry for the detection of circulating tumor cells
CN108351347A (zh) 稀有细胞的无离心机分离和检测
US7390628B2 (en) Microparticle-based diagnostic methods
CN106366195B (zh) 一种pd-l1抗体免疫磁珠及其制备方法
US20200003660A1 (en) Magnetic needle separation and optical monitoring
JP5455220B2 (ja) 組織、細胞又は検体を濃縮するための生検装置
CN107525920B (zh) 聚离子液体磁性纳米复合物及其对痕量循环肿瘤细胞特异性富集和检测的应用
CN111351937A (zh) 一种mmr蛋白表达缺失检测试剂盒及其检测方法
Wang et al. A light-activated magnetic bead strategy utilized in spatio-temporal controllable exosomes isolation
CN207786802U (zh) 一种超顺磁纳米微粒的分离装置
Ngo et al. Improving SERS biosensors for the analysis of ovarian cancer-derived small extracellular vesicles
CN108296013A (zh) 一种超顺磁纳米微粒的分离装置及其应用
Cao et al. High-efficiency EpCAM/EGFR-PLGA immunomagnetic beads with specific recognition on circulating tumor cells in colorectal cancer

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20180810