CN108508108A - 基于抗体识别的磁性材料及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于抗体识别的磁性材料及其制备方法与应用。所述基于抗体识别的磁性材料的制备方法包括如下步骤：(1)将磁性颗粒在EDC/NHS体系中进行孵育，得到官能化的磁性颗粒；(2)将所述官能化的磁性颗粒在溶有抗体的溶液中进行孵育，得到偶联抗体的磁性颗粒，即基于抗体识别的磁性材料。本发明提供的基于抗体识别的磁性材料能够特异性识别吗啡、甲基苯丙胺及氯胺酮等分子，并实现分子抓取功能，基于材料磁性，通过磁铁可方便地与溶液实现分离，置换到解吸体系中，且操作方式简单、环保，适宜应用和推广。

Description

基于抗体识别的磁性材料及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及一种基于抗体识别的磁性材料及其制备方法与应用，属于法庭科学领域。

背景技术

当前，我国禁毒形势严峻，随着毒品种类增多，对毒品检验技术的要求不断提高，特别是对毒品检验方法的快速、灵敏、特异性有了更高的要求。依据毒品形态和检测目的，针对不同类型的毒品样品需要进行不同的样品前处理，以保证检测的灵敏度和可靠性。目前，法庭科学实验室对于毒品样品的前处理仍多采用有机溶剂直接溶解或有机溶剂萃取。对于涉毒案件缴获检材中种类居多的固体物质，如晶体、片剂、粉末等，多采用有机溶剂直接溶解。这种方法操作简单，但由于存在同一溶剂中溶解性差异的问题，有时不能保证全组分溶解，且使用的有机溶剂量较大，易造成环境污染并对操作人员健康造成伤害。对于含水液体检材、植物检材，需使用有机溶剂从水相萃取待检组分，有时还需要先对水液浓缩再进行有机溶剂萃取以减少有机溶剂的用量，存在回收率低、乳化、重现性差、操作过程复杂、提取过程费时等问题。

面对上述问题，很多分析化学家在传统液液萃取基础上优化或开发了新的基于溶剂萃取的毒品样品前处理方法，但这些成果只能在某个特定体系中应用或有些方法还只停留在研究阶段，不便于自动化，不能广泛用于实际案件。因此需要进一步改进现有的涉毒检材的前处理方式，寻找更加环保、简便的操作方式以简化并规范涉毒检材的前处理。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于抗体识别的磁性材料及其制备方法与应用，以用于特异性识别毒品以及检测。

本发明所提供的基于抗体识别的磁性材料的制备方法，包括如下步骤：

(1)将磁性颗粒在EDC/NHS体系中进行孵育，得到官能化的磁性颗粒；

(2)将所述官能化的磁性颗粒在溶有抗体的溶液中进行孵育，得到偶联抗体的磁性颗粒，即基于抗体识别的磁性材料。

上述的制备方法中，所述磁性颗粒具体为四氧化三铁磁性颗粒。

上述的制备方法中，所述四氧化三铁磁性颗粒可由包括下述步骤的方法制备：

FeCl₃·6H₂O和醋酸钠在乙二醇中经水热反应即得；

如在密封的高压釜中于200℃中反应16小时；

所得产物用乙醇清洗多遍，60℃烘干。

上述的制备方法中，步骤(1)中，所述EDC/NHS体系指的是EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)与NHS(N-羟基丁二酰亚胺)的水溶液，

步骤(1)中，所述磁性颗粒、DEC和NHS的质量比可为1：1：1。

上述的制备方法中，步骤(1)中，所述孵育的温度可为室温(20～25℃)，时间可为0.5h。

上述的制备方法中，步骤(2)中，所述抗体可为甲基苯丙胺抗体、氯胺酮抗体或吗啡抗体。

上述的制备方法中，步骤(2)中，所述溶有抗体的溶液可采用醋酸钠缓冲溶液，如采用50mM、pH6.0的醋酸钠缓冲溶液。

上述的制备方法中，步骤(2)中，所述磁性颗粒与所述抗体的质量比可为10：1。

上述的制备方法中，步骤(2)中，所述孵育的温度可为4℃，时间可为12h；

可采用Tris缓冲液(50mM，pH7.2)室温孵育半小时以终止反应。

经本发明方法制备的基于抗体识别的磁性材料，磁性颗粒与抗体的偶联率约为40％～50％。

本发明提供的基于抗体识别的磁性材料能够特异性识别吗啡、甲基苯丙胺及氯胺酮等分子，并实现分子抓取功能，基于材料磁性，通过磁铁可方便地与溶液实现分离，置换到解吸体系中。

本发明具有如下优点：

1、能够针对吗啡、甲基苯丙胺、氯胺酮等毒品分子进行特异性识别并实现分子抓取功能。将相应的抗体偶联至磁性颗粒后，通过抗原抗体反应可实现偶联抗体的磁性颗粒与目标毒品分子的结合，其分子识别能力有效减少了样品基质对目标成分的影响。

2、利用磁性聚合物材料和磁铁的相互作用可方便地实现抓取分子与溶液的分离和转移，将富集的毒品分子释放到分析方法所需的溶液中，减少了原始检材中其它组分对毒品分子提取回收率和检测灵敏度的影响，能够实现高效快速的水溶液毒品检材的前处理。

3、操作方式简单、环保，适宜应用和推广。

附图说明

图1为本发明实施例1制备的偶联甲基苯丙胺抗体的磁性颗粒的扫描电子显微镜(SEM)图像。

图2为本发明实施例1制备的偶联吗啡抗体的磁性颗粒的扫描电子显微镜(SEM)图像。

图3为本发明实施例1制备的偶联氯胺酮抗体的磁性颗粒的扫描电子显微镜(SEM)图像。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、基于抗体识别的磁性材料的制备

FeCl₃·6H₂O、乙二醇、醋酸钠均购自北京化学试剂厂。

水热法合成磁性颗粒：将0.6g FeCl₃·6H₂O溶于20mL乙二醇，再加入1.5g醋酸钠，混合物搅拌30分钟，密封在高压釜中，置于200℃中加热16小时。产物用乙醇清洗多遍，60℃烘干。为便于保存和使用，按0.5mL分装在Tip管中，其中含0.5mg磁性颗粒(即磁性颗粒浓度约为1mg·mL^-1)，放置在4℃保存。

将抗体与上述磁颗粒偶联：将5mg EDC(Sigma-Aldrich)和5mg NHS(Sigma-Aldrich)溶于1mL去离子水中，再加入5mg磁性颗粒到混合液中，室温孵育半小时。用磁铁收集官能化的磁性颗粒，并用超纯水洗两遍。将溶有100μg·mL^-1的抗体(吗啡抗体/甲基苯丙胺抗体/氯胺酮抗体等)的5mL醋酸钠缓冲液(50mM，pH6.0)加入磁性颗粒中。涡旋混合物并4℃孵育12h。用Tris缓冲液(50mM，pH7.2)室温孵育半小时以终止反应。用PBS(pH 7.0)洗多遍以获得偶联抗体的磁颗粒，再重悬于1mL 5％BSA-PBS中。

经测定，本实施例制备的偶联抗体的磁性颗粒的偶联率约为40％～50％。

磁珠保存液的配制：分别准确称量Tris 3.0285g、NaCl 4.383g、NP-40 5mL(表面活性剂，壬基苯酚聚乙二醇，nonylphenoxypolyethoxylethanol，以防止团聚)配制成500μL水溶液，用HCl调节pH至8.0，获得50mmol·mL^-1Tris-HCl、150mmol NaCl、1％NP40(v/v)水溶液，作为磁珠保存液，保存偶联抗体后的磁性颗粒。

本实施例制备的偶联甲基苯丙胺抗体、吗啡抗体、氯胺酮抗体的磁性颗粒的形态及结构图像在扫描电子显微镜(SEM)下拍摄得到的图像如图1～图3所示。

实施例2、磁性材料的应用

1、分析条件

LC-MS/MS QQQ 1290-6460液相色谱-三重四级杆质谱联用仪(Agilent，美国)，百万分之一电子天平(Sartorius，德国)，纯水仪(Millipore，美国)，0.22μm滤膜(PALL，美国)。

色谱柱：安捷伦Poroshell 120EC-C18(3.0mm×50mm，2.7μm)；流动相：0.2％甲酸(A)和甲醇(B)；梯度洗脱程序：甲基苯丙胺、氯胺酮20％B(0min)～26％B(3min)～75％B(5min)；吗啡：25％B(0min)～33％B(3.5min)～75％B(5min)；柱温：30℃；流速：0.3mL·min^-1；进样量1μL；雾化气温度：350℃；雾化气压力：30psi；干燥气流量：10L·min^-1；毛细管电压：4000V。甲基苯丙胺、氯胺酮、吗啡的定量离子对分别为m/z 151.1m/z 91.1、m/z238.1m/z 125.0、m/z 286.1m/z 201.0。

甲基苯丙胺抗体、吗啡抗体、氯胺酮抗体均购自北京博奥森生物技术有限公司，浓度为1mg·mL^-1。其中，甲基苯丙胺抗体、吗啡抗体保存于0.01mol·L^-1TBS(pH7.4)、1％BSA、0.03％Proclin300和50％甘氨酸(Gly)，氯胺酮抗体保存于0.01mol·L^-1TBS(pH7.4)。

甲基苯丙胺、吗啡、氯胺酮标准物质按照下述方法制备：分别配置0.1mg·mL^-1甲基苯丙胺、吗啡、氯胺酮标准品的甲醇溶液；甘氨酸(分析纯)、磷酸盐缓冲液(PBS)、HCl(分析纯)购自国药集团化学试剂有限公司。

称取0.5g BSA溶于10mL PBS配制成PBS+5％BSA的吸附液。称取0.7507g Gly溶于100mL容量瓶中，用盐酸调节pH至2.32配制成0.1mol·L^-1的Gly-HCl解吸液。

2、基于抗体的磁性材料的吸附-解吸特性检测

将含有偶联抗体的磁性颗粒(以下简称磁珠)的保存液振荡混匀后取样10μL并加入100μL吸附液并混匀，取100μL，分别与100μL的0.1mg·mL^-1吗啡、0.002mg·mL^-1甲基苯丙胺、0.005mg·mL^-1氯胺酮标准品的甲醇溶液混合震荡30min、60min和90min取样分析。取样时需使用磁铁贴住Tip管外壁，使得Tip管内的磁珠聚集在放置磁铁的位置，吸取上清液作为分析样品。

吸附实验结束后，用磁铁贴住Tip管外壁，移除上清液，再向Tip管内加入0.1mL解吸液，分别震荡10min、20min、30min及过夜后取样分析，具体取样分析操作参照吸附实验。

1)偶联吗啡抗体的磁珠

不同吸附时间取样后分别平行测定峰面积三次，分别记为A₁、A₂、A₃，其平均值对0.1mg·mL^-1(浓度以C_S表示)吗啡标准溶液也测定三次且峰面积平均值记为因为吸附实验的溶液总体积为0.20mL、解吸实验的溶液总体积为0.10mL，根据下述公式分别计算不同吸附时间溶液中残留的吗啡浓度C及质量M，实验数据如下：

M_吸附(mg)＝C×0.2

M_解吸(mg)＝C×0.1

磁珠吸附量(mg吗啡/mg磁珠)＝M_解吸/(1mg·mL^-1×0.00909mL)

表1吸附实验结果

表2解吸实验结果

根据解吸20min的数据，利用偶联抗体的磁珠提取溶液中的吗啡，提取率为0.0024×100％/(0.1×0.1)＝24％。

2)偶联甲基苯丙胺抗体的磁珠

不同吸附时间取样后分别平行测定峰面积三次，分别记为A₁、A₂、A₃，其平均值对0.002mg·mL^-1(浓度以C_S表示)甲基苯丙胺标准溶液也测定三次且峰面积平均值记为因为吸附实验的溶液总体积为0.20mL、解吸实验的溶液总体积为0.10mL，根据下述公式分别计算不同吸附时间溶液中残留的甲基苯丙胺浓度C及质量M，实验数据如下：

M_吸附(mg)＝C×0.2

M_解吸(mg)＝C×0.1

磁珠吸附量(mg甲基苯丙胺/mg磁珠)＝M/(1mg·mL^-1×0.00909mL)

表3吸附实验结果

表4解吸实验结果

根据解吸20min的数据，利用偶联抗体的磁珠提取溶液中的甲基苯丙胺，提取率为0.0001×100％/(0.002×0.1)＝50％。

3)偶联氯胺酮抗体的磁珠

不同吸附时间取样后分别平行测定峰面积三次，分别记为A₁、A₂、A₃，其平均值对0.005mg·mL^-1(浓度以C_S表示)氯胺酮标准溶液也测定三次且峰面积平均值记为因为吸附实验的溶液总体积为0.20mL、解吸实验的溶液总体积为0.10mL，根据下述公式分别计算不同吸附、解吸时间溶液中残留的氯胺酮浓度C及质量M，实验数据如下：

M_吸附(mg)＝C×0.2

M_解吸(mg)＝C×0.1

磁珠吸附量(mg氯胺酮/mg磁珠)＝M/(1mg·mL^-1×0.00909mL)

表5吸附实验结果

表6解吸实验结果

根据解吸20min的数据，利用偶联抗体的磁珠提取溶液中的氯胺酮，提取率为0.000069×100％/(0.005×0.1)＝13.8％。

Claims (10)

1.一种基于抗体识别的磁性材料的制备方法，包括如下步骤：

(1)将磁性颗粒在EDC/NHS体系中进行孵育，得到官能化的磁性颗粒；

(2)将所述官能化的磁性颗粒在含有抗体的溶液中进行孵育，即得到基于抗体识别的磁性材料。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述磁性颗粒为四氧化三铁磁性颗粒。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述四氧化三铁磁性颗粒由包括下述步骤的方法制备：

FeCl₃·6H₂O和醋酸钠在乙二醇中经水热反应即得。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，所述磁性颗粒、DEC和NHS的质量比为1：1：1。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，所述孵育的温度为20～25℃，时间为0.5h。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，所述抗体为甲基苯丙胺抗体、氯胺酮抗体或吗啡抗体。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，所述磁性颗粒与所述抗体的质量比为10：1；

步骤(2)中，所述孵育的温度为4℃，时间为12h。

8.权利要求1-7中任一项所述方法制备的基于抗体识别的磁性材料。

9.权利要求8所述基于抗体识别的磁性材料在毒品识别与检测中的应用。

10.一种水溶液毒品检材的检测方法，包括如下步骤：

将权利要求8所述基于抗体识别的磁性材料加入至水溶液毒品检材中，并振荡，采用磁铁吸附所述基于抗体识别的磁性材料；然后利用解吸液将所述基于抗体识别的磁性材料分散于其中进行检测。