CN108333371A - 一种磁珠时间分辨荧光免疫定量检测ngal试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种磁珠时间分辨荧光免疫定量检测NGAL试剂盒，包括包被NGAL单克隆抗体的免疫磁珠、NGAL校准品溶液、铕标记的NGAL单克隆抗体溶液、清洗液和增强液。所述的包被NGAL免疫磁珠为带有官能团修饰的直径1~3μm的超顺磁珠与NGAL单克隆抗体共价偶联物。本发明的灵敏度高，NGAL的灵敏度为1ng/mL，血清(浆)、尿液样本不需要稀释；检测时间短，30min出报告；样品需求量少，一次上样只需50μL；配套全自动时间分辨免疫分析仪，操作简单，无人为误差并节省人力。

Description

一种磁珠时间分辨荧光免疫定量检测NGAL试剂盒

技术领域

本发明涉及体外试剂检测技术领域，具体地说，本发明涉及一种磁珠时间分辨荧光免疫定量检测NGAL试剂盒。

背景技术

急性肾损伤(Acute Kidney Injury，AKI)是由各种原因引起的肾功能在短时间(几小时至几天)内突然下降而出现的临床综合症。AKI临床多发且病死率较高，流行病学调查表明在总住院病人中的发病率为5％～7％，而在重症监护病房病人中发病率为25％，其中病死率约为50％～80％。因此尽早诊断AKI已成为肾病治疗的一个关键因素。但缺乏特异性的早期临床诊断指标，是治疗该病的主要障碍。

中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白(Neutrophil Gelatinase-associatedLipocalin，NGAL)是脂质运载蛋白lipocalin超家族的2号成员，相对分子质量为25kD，由人类中性粒细胞分泌。缺血性或肾毒性肾损伤时，NGAL由肾脏大量表达，并被释放到尿液和血浆。NGAL含量在损伤发生后2小时内升高，使之成为早期且敏感的肾损伤生物标志物。

目前检测NGAL的方法主要有荧光免疫层析法、胶乳增强免疫比浊法、化学发光法。荧光免疫层析法和胶乳增强免疫比浊法虽然操作简单、检测时间短，但其存在检测灵敏度低、准确度较差、重复性差等缺点；化学发光法虽然具有灵敏度和准确度高、线性范围宽等优点，但是存在仪器设备昂贵、检测时间长等缺点，不适合基层社区医院使用。因此，我们需要更快提供准确结果的检测方法。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术中存在的上述问题，提出了一种磁珠时间分辨荧光免疫定量检测NGAL试剂盒。本发明将时间分辨荧光免疫分析技术与磁微粒相结合，提供了一种成本低廉、操作简单、准确、灵敏度高、检测范围宽的，基于磁微粒的时间分辨荧光免疫分析试剂盒，能够定量检测样品中NGAL含量，检测结果更加准确可靠，具有更高的检测灵敏度和特异性，并达到了较佳的性能参数。本发明的试剂盒将大大提高AKI的诊断率，在AKI早期诊断、疗效观察和预后判断中发挥越来越重要的作用。

为实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

一种磁珠时间分辨荧光免疫定量检测NGAL试剂盒，包括包被NGAL单克隆抗体的免疫磁珠、NGAL校准品溶液、铕标记的NGAL单克隆抗体溶液、清洗液和增强液。

在上述磁珠时间分辨荧光免疫定量检测NGAL试剂盒中，所述的包被NGAL免疫磁珠为带有官能团修饰的直径1～3μm的超顺磁珠与NGAL单克隆抗体共价偶联物，其中所使用的磁珠为羧基磁珠、氨基磁珠、羟基磁珠、甲苯磺酰基磁珠、NHS磁珠、链酶亲和素磁珠、蛋白A磁珠、蛋白G磁珠、抗小鼠IgG磁珠、亲水磁珠、疏水磁珠中的一种或几种。

在上述磁珠时间分辨荧光免疫定量检测NGAL试剂盒中，所述的单克隆抗体为针对NGAL不同表位的抗体。

在上述的磁珠时间分辨荧光免疫定量检测NGAL试剂盒中，所述免疫磁珠的制备方法为直径1～3μm的磁微粒与所述对应单克隆抗体经洗涤、活化、偶联、封闭制备得到。所述NGAL免疫磁珠的制备方法为：吸取羧基磁珠到离心管中，将离心管放置在磁力架中，利用磁力架进行磁珠和缓冲液的分离，用0.05M pH6.0的2-(N-吗啡啉)乙磺酸洗涤磁珠3～5次；向上述洗涤好的磁珠中加入0.05M pH6.0的2-(N-吗啡啉)乙磺酸，加入20mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸溶液和20mg/mL N-羟基琥珀酰亚胺，室温震荡反应；将活化好的磁珠置于磁力架上，弃上清，收集活化好的磁珠；加入单克隆抗体，室温持续旋转孵育3～5小时，反应时间取决于磁珠的配位基与浓度；上述磁珠置于磁力架上，弃上清，收集免疫磁珠；加入含有2％BSA 0.1M pH 8.0的Tris-HCl缓冲液，重悬磁珠，封闭未偶联单克隆抗体的活化羧基位点，反应30～60分钟；上述磁珠置于磁力架上，弃上清，加入免疫磁珠保存液。所述的保存液为含5％(w/v)BSA，1％(w/v)海藻糖，0.1％(v/v)Tween-20 0.05M pH8.0的Tris-HCl缓冲液。

所述的铕标记NGAL抗体的制备方法为：按照NGAL抗体与Eu³⁺的质量比为5:1，将DTTA-Eu作为标记物，在0.05M pH8.5的碳酸盐缓冲液下，加入DTTA-Eu与NGAL单克隆抗体，混合后溶于0.05M pH8.5的碳酸盐缓冲液，室温震荡过夜；用葡聚糖凝胶柱纯化后收集峰管；将上述制备好的铕标抗体稀释，使NGAL抗体的终浓度为0.0045～0.0080g/L。

所述清洗液的配方为：0.8～1.5％Tween-20，0.02％Proclin300，pH 7.2～7.50.01M Tris-HCl缓冲液。

所述增强液的配方为：0.03％乙酸钠、0.0002～0.0009％β-NTA、0.0024％TOPO、0.08％醋酸、0.1％无水乙醇、0.01％的Triton X-100的水溶液。

所述NGAL校准品的制备方法为：用含1.5％Tween-20，0.02％Proclin300，pH 7.50.02M Tris-Hcl缓冲液将NGAL抗原稀释至0、10、100、500、1000、1500ng/ml。

所述荧光物质的激发波长为300～350nm，发射波长为500～650nm。

本发明所述的磁珠时间分辨荧光免疫定量检测NGAL试剂盒的检测原理为夹心法，试剂条的反应孔中预装有NGAL免疫磁珠，测试时，先将待测样本(血清、血浆或尿液)或者校准品加到试剂的反应孔中，再加入铕标NGAL抗体，振荡孵育15min，形成免疫磁珠-抗原-铕标抗体复合物。洗涤后，再加入增强液，在激发光的作用下，荧光物质发射一定波长的光信号，被免疫荧光检测仪识别，样本中被测物越多，产生的荧光信号强度越强。将NGAL校准品浓度与荧光信号值拟合剂量-反应曲线，即可按此测值得到未知样本中NGAL浓度。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)采用磁分离技术，形成的免疫复合物在外加磁场中直接沉淀，不需离心即可以将免疫复合物与未结合物质分离。因磁珠具有更大的结合面积与能在液相中分散而充分反应，大大提高检测范围，缩短反应时间，提高灵敏度。由于磁珠与抗原或抗体为共价偶联，克服了物理吸附的不稳定性，因此免疫磁珠保存时间久且更稳定。

(2)采用时间分辨荧光免疫分析技术，采用镧系螯合物铕、铽、钐、镝作为标记物，其具有较宽的激发光谱、较窄发射光谱，有利于降低本底，提高灵敏度；紫外光激发具有较高量子产率、较大Stokes位移，避免激发光谱和荧光发射光谱以及生物基质发射的光谱重合，荧光衰变时间长等优点，比传统荧光物质检测范围更宽、特异性更好。

(3)配套全自动检测仪器，实现自动化操作，可同时检测一份或多份样本中NGAL含量，样本用量少，操作简便快速(30分钟即可出结果)、为早期诊断AKI提供重要依据，为病人节约了宝贵的时间。

附图说明

图1是磁珠时间分辨荧光免疫定量检测NGAL试剂盒利用试剂条进行检测，试剂条的结构俯视示意图。

图2是磁珠时间分辨荧光免疫定量检测NGAL试剂盒利用试剂条进行检测，试剂条的结构示意图。

1、测试孔1，2、测试孔2，3、荧光标记物1，4、荧光标记物2，6、清洗液，7、清洗液，8、样本稀释液1，9、样本稀释液2，12、增强液，5、10、11、13均为预备孔。

具体实施方式

本发明所述的NGAL包被磁珠为带有官能团修饰的直径1～3μm的超顺磁珠与蛋白的共价偶联物，其中所使用的磁珠有羧基磁珠、氨基磁珠、羟基磁珠、甲苯磺酰基磁珠、NHS磁珠、链酶亲和素磁珠、蛋白A磁珠、蛋白G磁珠、抗小鼠IgG磁珠、亲水磁珠、疏水磁珠等其中的一种或几种。

以下结合附图和具体实施例来详细说明本发明。

实施例1

在该实施例中，磁珠时间分辨荧光免疫定量检测NGAL试剂盒由试剂条和NGAL校准品组成。

其中，试剂条的形状为扇形，从左到右依次排列1～13个孔。第1、2孔为测试孔，第3、4孔为荧光标记孔，第6、7孔为稀释液孔，第8、9为样本稀释液孔，第12为增强液孔，第5、10、11、13为预备孔。第1与2孔之间可以存放磁铁进行磁分离实验，第1与2孔可以存放液体体积为300μl；第3、4孔可以从整个试剂条上拆卸成为独立的组分，便于对荧光标记物进行分装储存。第3、4、5孔可以存放液体体积为400μl；第6、7孔可以存放液体体积为3000μl；第8～12孔可以存放液体体积为400μl；第13孔可以存放液体体积为600μl。

本试剂条由测试孔1(NGAL单克隆抗体包被羧基磁珠)、第3孔(铕标NGAL单克隆抗体)、洗液孔6与7、增强液孔12组成，如图1和图2所示。

所述磁珠时间分辨荧光免疫定量检测NGAL试剂盒的制备过程如下，其中

(1)NGAL免疫磁珠的制备方法：

①洗涤磁珠

吸取1mg直径1μm羧基磁珠到1.5ml离心管中，将离心管放置在磁力架中，利用磁力架进行磁珠和缓冲液的分离，用1ml 0.0.5M pH6.0的2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)洗涤磁珠3～5次。

②磁珠活化

向上述洗涤好的磁珠中加入1ml 0.05M pH6.0的MES，加入20μL 20mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸溶液(EDC)和20μL 20mg/ml N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，室温震荡反应0.5～1小时。

③NGAL抗体与磁珠的偶联

上述活化好的磁珠置于磁力架上，弃上清，收集活化好的磁珠。加入1～2mg NGAL单克隆抗体，室温持续旋转孵育3～5小时，反应时间取决于磁珠的配位基与浓度。

④封闭

上述磁珠置于磁力架上，弃上清，收集免疫磁珠。加入含有2％BSA 0.1M pH8.0的Tris-HCl缓冲液，重悬磁珠，封闭未偶联NGAL单克隆抗体的活化羧基位点，反应30～60min。

⑤储存

上述磁珠置于磁力架上，弃上清，加入500μL免疫磁珠保存液。

所述的保存液为含5％(w/v)BSA，1％(w/v)海藻糖，0.1％(v/v)Tween-20的0.05MpH 8.0的Tris-HCl缓冲液。

将上述制备好的免疫磁珠稀释，使NGAL单克隆抗体的终浓度为0.0025～0.0100g/L，分装至试剂条第1孔(测试孔1)中。

(2)铕标记NGAL抗体制备方法：

①铕标NGAL单抗的制备

1)取出1mg NGAL单克隆抗体置于30KD超滤离心管，10000rpm离心10min，弃去滤液。

2)加入标记缓冲液(0.05M pH8.5碳酸盐缓冲液)200μL，10000rpm离心10min，弃去滤液。重复此操作4～5次。

3)将离心管滤膜反转，3000rpm离心6min，收集浓缩的抗体。加入200μL标记缓冲液，静置3～5min，再将离心管滤膜反转，3000rpm离心6min，收集浓缩的NGAL单克隆抗体。

4)按照质量比NGAL单克隆抗体：铕螯合物DTTA-Eu＝5:1的比例充分混匀，放入旋转培养器，室温反应16～24小时。

②铕标NGAL单抗的纯化

用SepHadex TM G-75凝胶柱纯化铕标NGAL单抗，然后加入铕标NGAL单抗保存剂(5％(w/v)BSA+5％(w/v)Proclin300)，使BSA和Proclin300终浓度为0.3％，经0.22μm滤膜过滤，4℃储存备用。

将上述制备好的铕标NGAL单抗稀释，使NGAL单抗的终浓度为0.0045～0.0080g/L，分装至试剂条第3孔中。

所述的荧光物质铕的激发波长为340nm，发射波长为615nm。

(3)洗液的制备方法：

配制含有0.8～1.5％Tween-20，0.02％Proclin300，pH 7.2～7.5 0.01M Tris-HCl缓冲液，将配制好的溶液以每孔2000μL分装至洗液孔6和7中。

(4)增强液的制备方法：

配制含有0.03％乙酸钠、0.0002～0.0009％β-NTA、0.0024％TOPO、0.08％醋酸、0.1％无水乙醇、0.01％的Triton X-100的水溶液。将配制好的溶液以每孔400μL分装至试剂条第12孔(增强液孔)。

(5)校准品制备方法：

所述NGAL校准品的制备方法为：1.5％Tween-20，0.02％Proclin300，pH 7.50.02M Tris-Hcl缓冲液将NGAL抗原稀释至0、10、100、500、1000、1500ng/ml。

实施例2试剂条的制作与检测

本实施例中的试剂条，半成品通过以下工序组装而成：在第1、3、6、7、12分别分装50μLNGAL免疫磁珠、100μL铕标NGAL抗体、2000μL清洗液、2000μL清洗液、400μL增强液，然后用封膜机封口，所述的封板膜上涂有可供全自动荧光检测分析仪扫描识别的产品信息标识包括企业标准曲线、批次、生产日期、有效期。成品试剂条、分装好的NGAL校准品与其他配件组装成试剂盒。

样本检测：

①加样：

将待测样本或者校准品放入全自动仪器的装载系统，将试剂条插入试剂条卡槽，仪器自动识别封板膜的产品信息。在试剂条测试孔1中加入50μL待测样本或者校准品，然后加入50μL铕标抗体。

②孵育：

加样完成后37℃震荡孵育15min。

③洗涤：

孵育完成后，仪器自动洗孔5次，每次洗液200μL/孔。

⑤加入增强液：

洗涤完成后，加入增强液100μL/孔，37℃孵育5min。

⑥检测：

试剂条被推入暗室，仪器自动检测并出结果。

用来测试试剂条的全自动磁珠时间分辨荧光免疫分析仪包含样本装载系统、条码读取系统、加样系统、温育系统、荧光光源检测系统及自动软件分析控制系统。

本发明所述的磁珠时间分辨荧光免疫定量检测NGAL试剂盒，检测样本时只需将试剂条插入全自动仪器中，仪器自动完成加样、孵育、磁分离、检测过程，全程只需要30min即可以读取检测报告。

实施例3与市售试剂盒的比较

采用市售的中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白测定试剂盒(化学发光微粒子免疫检测法)(雅培贸易有限公司)与实施例1中的方法检测样品(所述样品中NGAL浓度范围为10～1500ng/mL)重复三次，验证本发明的试剂盒的检测结果正确性，结果见下表1。

表1样本检测结果

与市售试剂比较，本试剂偏差均小于±5％，本试剂的检测结果准确可靠。

采用市售的中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白测定试剂盒(化学发光微粒子免疫检测法)(雅培贸易有限公司)与实施例1中的试剂检测200例临床尿液样本，检测结果见下表2。

表2临床样本检测结果

本试剂对200例临床尿液样本的检测结果与雅培试剂条进行比较，阳性符合率96.7％，阴性符合率95.8％，二者的总符合率为96.3％。说明本发明所述的磁珠时间分辨荧光免疫定量检测NGAL试剂盒，具有如下优势：1)灵敏度高，NGAL的灵敏度为1ng/mL，血清(浆)、尿液样本不需要稀释；2)检测时间短，30min出报告；3)样品需求量少，一次上样只需50μL；4)配套全自动时间分辨免疫分析仪，操作简单，无人为误差并节省人力。

Claims (9)

1.一种磁珠时间分辨荧光免疫定量检测NGAL试剂盒，其特征在于包括包被NGAL单克隆抗体的免疫磁珠、NGAL校准品溶液、铕标记的NGAL单克隆抗体溶液、清洗液和增强液。

2.如权利要求1所述的磁珠时间分辨荧光免疫定量检测NGAL试剂盒，其特征在于，所述的包被NGAL单克隆抗体的免疫磁珠为带有官能团修饰的直径1~3μm的超顺磁珠与NGAL单克隆抗体共价偶联物，其中所使用的磁珠为羧基磁珠、氨基磁珠、羟基磁珠、甲苯磺酰基磁珠、NHS磁珠、链酶亲和素磁珠、蛋白A磁珠、蛋白G磁珠、抗小鼠IgG磁珠、亲水磁珠、疏水磁珠中的一种或几种。

3.如权利要求1所述的磁珠时间分辨荧光免疫定量检测NGAL试剂盒，其特征在于，所述的免疫磁珠的制备方法为：吸取羧基磁珠到离心管中，将离心管放置在磁力架中，利用磁力架进行磁珠和缓冲液的分离，用0.05M pH6.0的2-（N-吗啡啉）乙磺酸洗涤磁珠3~5次；向上述洗涤好的磁珠中加入0.05M pH6.0的2-（N-吗啡啉）乙磺酸，加入20mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸溶液和20mg/mL N-羟基琥珀酰亚胺，室温震荡反应；将活化好的磁珠置于磁力架上，弃上清，收集活化好的磁珠；加入单克隆抗体，室温持续旋转孵育3~5小时；上述磁珠置于磁力架上，弃上清，收集免疫磁珠。

4.如权利要求3所述的磁珠时间分辨荧光免疫定量检测NGAL试剂盒，其特征在于，所述的免疫磁珠还加入含有2%BSA 0.1M pH 8.0的Tris-HCl缓冲液，重悬磁珠，封闭未偶联单克隆抗体的活化羧基位点，反应30~60分钟。

5.如权利要求4所述的磁珠时间分辨荧光免疫定量检测NGAL试剂盒，其特征在于，所述免疫磁珠置于磁力架上，弃上清，加入免疫磁珠保存液；所述的保存液为含5%（w/v） BSA，1%（w/v）海藻糖，0.1%（v/v）Tween-20 0.05M pH 8.0的Tris-HCl缓冲液。

6.如权利要求1所述的磁珠时间分辨荧光免疫定量检测NGAL试剂盒，其特征在于，所述的铕标记的NGAL单克隆抗体溶液的制备方法为：按照NGAL抗体与Eu³⁺的质量比为5:1，将DTTA-Eu作为标记物，在0.05M pH8.5的碳酸盐缓冲液下，加入DTTA-Eu与NGAL单克隆抗体，混合后溶于0.05M pH8.5的碳酸盐缓冲液，室温震荡过夜；用葡聚糖凝胶柱纯化后收集峰管；将上述制备好的铕标抗体稀释，使NGAL抗体的终浓度为0.0045~0.0080g/L。

7.如权利要求1所述的磁珠时间分辨荧光免疫定量检测NGAL试剂盒，其特征在于，所述清洗液的配方为：0 .8~1 .5% Tween-20，0.02%Proclin300，pH 7.2~7.5 0.01M Tris-HCl缓冲液。

8.如权利要求1所述的磁珠时间分辨荧光免疫定量检测NGAL试剂盒，其特征在于，所述增强液的配方为：0.03%乙酸钠、0.0002~0.0009%β-NTA、0.0024% TOPO 、0.08%醋酸、0.1%无水乙醇、0.01%的Triton X-100的水溶液。

9.如权利要求1所述的磁珠时间分辨荧光免疫定量检测NGAL试剂盒，其特征在于，所述NGAL校准品的制备方法为：用含1.5% Tween-20，0.02%Proclin300，pH 7.5 0.02M Tris-Hcl缓冲液将NGAL抗原稀释至0、10、100、500、1000、1500ng/ml。