CN113777326A - 一种高特异检测肝素结合蛋白的试剂盒及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种高特异检测肝素结合蛋白的试剂盒及其应用，涉及免疫检测技术领域，该试剂盒包括联接有异硫氰酸荧光素的HBP结合抗体、标记有发光标记物的HBP标记抗体以及表面包被了异硫氰酸荧光素抗体的固相载体，通过异硫氰酸荧光素与抗异硫氰酸荧光素系统对样本进行检测，很好地避免内源性生物素的干扰，并且特异性高、稳定性好，在检出限上更有优势。

Description

一种高特异检测肝素结合蛋白的试剂盒及其应用
技术领域
本发明涉及免疫检测技术领域，具体而言，涉及一种高特异检测肝素结合蛋白的试剂盒及其应用。
背景技术
感染性疾病是一类对健康威胁比较严重的疾病,脓毒症和一些严重的感染性疾病已然成为导致发病和死亡的主要原因。脓毒血症是指由感染引起的全身性炎症反应综合征(systemicinf1animatoryresponsesyndrome，SIRS)，临床上证实有感染或高度可疑感染，一旦发生后，病情发展迅速，全身凝血功能紊乱和免疫炎症反应失衡，诱发器官功能衰竭，导致死亡，如何在感染性疾病的预防和治疗中及早地采取合理的应对措施是成功的关键,目前看来不管是在临床还是实验室研究,都需要一种可以在病人感染早期就能进行鉴定的方法。
肝素结合蛋白(heparin-binding protein,HBP)是存在于中性粒细中的蛋白质，由Shafer教授在1984年发现并分离成功。由于当时测得相对分子质量为37000，因此将其命名为CAP37(cationic antimicrobial protein of 37000)。后来学者又从嗜苯胺蓝颗粒中分离出具有杀菌活性的嗜苯胺蓝蛋白，命名为Azurocidin，即天青杀素。再后来发现其具有极强的肝素结合能力，因此命名为肝素结合蛋白(Heparin-bindinprotein，HBP)肝素结合蛋白是细菌感染最早升高的标志物，当发生感染时，细菌侵入血管内，刺激中性粒细胞释放HBP，血浆中HBP含量升高。HBP通过其自身较强的正电荷，改变血管内皮细胞通透性，诱发血浆渗漏与组织水肿(炎症反应的特征性表现)。另外HBP激活单核细胞和巨噬细胞，释放肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、γ-干扰素(INF-γ)等炎性介质，进而增强机体对感染或损伤的免疫反应，与其他传统感染指标如PCT、CRP、IL-6、白细胞数量等相比，HBP的感染变化出现早，在灵敏度、特异性、阳性和阴性检出率等综合指征显著优于其他感染指标。动态监测血浆HBP浓度，可用于评估脓毒症的严重程度，预测严重感染患者休克风险、脓毒症患者心搏骤停风险等，对临床细菌感染性疾病尽早诊断和治疗具有重要指示意义。最常用的指标有：降钙素原,C-反应蛋白,白细胞计数,中性粒细胞比,血沉,体温等，但上述指标都不同程度的存在滞后，敏感度低及特异性不高的缺陷，在感染性疾病的预防和治疗中，如何及早地采取合理的应对措施是成功的关键。
近期有研究发现肝素结合蛋白(heparin-binding protein，HBP)可以作为新兴的诊断严重脓毒血症及脓毒血症性休克的早期生物标志物，可以对严重感染患者即将发生的休克进行预测。HBP是一种颗粒释放蛋白，以它作为临床新的炎性标志物，具有早期、特异、敏感的特性，优于传统的炎性标志物，具有对病情早期评估，预后评价及疗效观察的价值。
不管是在临床还是实验室研究，都需要一种可以在病人感染早期就能进行鉴定的方法。目前，临床上常用的产品有酶联免疫分析法、胶乳比浊法、磁微粒化学发光法以及免疫荧光层析法等。酶联免疫分析法能准确地检测样品中的肝素结合蛋白浓度，但实际操作中实验耗时较长，操作过程比较复杂。胶乳比浊法和免疫荧光层析法可以快速检测，但准确度偏低，无法为临床判断提供可靠的依据。现有的磁微粒化学发光法利用生物素-链霉亲和素放大系统，虽然在特异性，灵敏度等方面都有所提高，但无法避免内源性生物素的干扰，使得检测结果不能得到保障。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于检测肝素结合蛋白的试剂盒及其方法和应用。
本发明是这样实现的：
第一方面，本发明实施例提供了一种用于检测肝素结合蛋白的试剂盒，其包括以下组分：HBP结合抗体、HBP标记抗体、固相载体以及用于联接所述固相载体的异硫氰酸荧光素抗体；
其中，所述HBP结合抗体为联接异硫氰酸荧光素的HBP抗体；
所述HBP标记抗体为发光标记物标记的HBP抗体。
第二方面，本发明实施例提供了一种用于检测肝素结合蛋白的方法，其包括：采用如前述实施例所述的用于检测肝素结合蛋白的试剂盒对待测样本中的肝素结合蛋白进行检测；
所述方法不以疾病的诊断或治疗为直接目的。
第三方面，本发明实施例提供了如前述实施例所述的用于检测肝素结合蛋白的试剂盒在诊断感染性疾病的应用。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种试剂盒，通过异硫氰酸荧光素与异硫氰酸荧光素抗体系统，很好地避免内源性生物素的干扰，并且特异性高、稳定性好，在检出限上更有优势。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明实施例1试剂盒发校准拟合曲线。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
首先，本发明实施例提供了一种用于检测肝素结合蛋白的试剂盒，其包括以下组分：HBP结合抗体、HBP标记抗体、固相载体以及用于包被在所述固相载体表面的异硫氰酸荧光素抗体；
其中，所述HBP结合抗体为联接异硫氰酸荧光素的HBP抗体；
所述HBP标记抗体为发光标记物标记的HBP抗体。
经一系列创造性劳动，本发明实施例提供了一种用于检测肝素结合蛋白磁微粒的试剂盒，利用FITC(异硫氰酸荧光素)与抗-FITC系统，即将联接有FITC的HBP抗体通过特异性反应联接到包被有FITC抗体的固相载体上，检测时，包被到固相载体上的HBP抗体可以捕捉待测样本中的肝素结合蛋白，然后待测样本中的肝素结合蛋白可与标记有发光标记物的HBP抗体结合，形成抗体-抗原-抗体复合物，在底物存在的条件下实现高特异性检测。
相对于现有对肝素结合蛋白的检测而言，具有特异性高，稳定性好的优势，且在检出限上更有优势。
本文中的“发光标记物”是指能够用于标记抗体或抗原，用于化学发光免疫分析检测的试剂。化学发光是指化学发光物质经催化剂的催化或氧化剂的氧化，形成一个激发态的中间体，当这种激发态中间体回到稳定的基态时会释放等能级的光子，出现发光现象。化学发光免疫分析过程是首先将发光物质或酶(发光标记物)标记在抗原或抗体上，抗原抗体特异性结合后，加入发光底物，经与底物发生反应后，发生发光现象。由于化学检测体系中待测物浓度与体系的化学发光强度在一定条件下呈线性定量关系，利用仪器对体系化学发光强度的检测，而确定待测物含量。
优选地，所述发光标记物选自吖啶类化合物和碱性磷酸酶中的至少一种。
优选地，所述发光标记物为吖啶类化合物。
优选地，所述发光标记物包括吖啶酯和/或吖啶磺酰胺。
优选地，所述试剂盒还包括发光底物，所述发光标记物为吖啶类化合物时，所述发光底物为过氧化物，当所述发光标记物为碱性磷酸酶时，所述发光底物为AMPPD(3-(2-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3-磷氧酰)-苯基-1,2-二氧环乙烷二钠盐)。
优选地，所述HBP抗体中的抗体选自：单克隆抗体、多克隆抗体或抗体功能性片段中的至少一种。
本文中的“抗体功能性片段”同“抗原结合片段”，是能实现特异性结合抗原的片段。在一些实施例中，抗体功能性片段可包括Fab，scFv，Fab’，dAb，F(ab’)2和Fv中的任意一种。
优选地，所述HBP抗体为HBP单克隆抗体。
优选地，所述固相载体与所述异硫氰酸荧光素抗体为偶联状态。
优选地，所述固相载体为磁微粒、硝酸纤维素滤膜、尼龙膜、乳胶颗粒和微孔板中的至少一种。
优选地，所述固相载体为磁微粒。
本文中的“磁微粒”同“磁性微粒”或“磁珠”，是指可均匀分散于一定基液中的复合材料，具有较高的比表面积，表面可修饰功能基团。
优选地，所述磁微粒的表面修饰有羧基、氨基和甲苯磺酰基中的至少一种基团。
优选地，所述磁微粒的直径为0.5～5μm。
优选地，所述HBP结合抗体由以下步骤制备获得：将HBP抗体与异硫氰酸荧光素按照1mg：(100～200g)的比例进行混合标记；
在混合后的产物中加入1～10M NH4Cl溶液至NH4Cl终浓度为50mmol/L，以终止反应；
将终止反应后的产物在缓冲液中进行透析，透析后采用稀释液稀释至所需浓度，获得HBP结合抗体。
优选地，所述试剂盒还包括：缓冲液、稀释液、校准品、质控品以及清洗液中的至少一种。
优选地，所述稀释液中含1.0wt％的BSA，0.1wt％Proclin-300以及0.1mol/L(磷酸盐的浓度)，pH7.4的磷酸盐缓冲液。
优选地，所述校准品和/或所述质控品为：肝素结合蛋白与基质液混合配制而成。
优选地，所述校准品和/或所述质控品中的肝素结合蛋白为人重组肝素结合蛋白；
优选地，所述基质液中含有：1～5wt％的BSA,0.01～0.1mol/LNaCl，0.01～0.5wt％的Proclin-300以及0.01～0.1mol/L，pH 7.2～7.6的磷酸盐缓冲液。
此外，本发明实施例还提供了一种用于检测肝素结合蛋白的方法，其包括：采用如前述任意实施例所述的用于检测肝素结合蛋白的试剂盒对待测样本中的肝素结合蛋白进行检测；
所述方法不以疾病的诊断或治疗为直接目的。比如，在一些实施例中，当待测样本为环境样本时，基于对采集的环境样本进行分析所进行的检测。
此外，本发明实施例还提供了如前述任意实施例所述的用于检测肝素结合蛋白的试剂盒在诊断感染性疾病的应用。
优选地，所述感染性疾病为与HBP相关的感染性疾病，包括但不限于：脓毒症和细菌感染等。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
一种用于检测肝素结合蛋白的试剂盒，其包括以下试剂。
(1)磁微粒试剂
配制方法：取磁微粒10mg，磁分离5-10分钟，弃上清，加0.5M的MES溶液清洗，重复三次，将清洗完的磁微粒与异硫氰酸荧光素的抗体按照质量比为100：1的比例在0.5M的MES溶液中混合均匀，加入EDC溶液100μL，反应18-20小时，然后用磁微粒保护液重悬后稀释至1.5mg/ml，2-8℃平衡22-24小时，然后保存于2～8℃，备用。
上述磁微粒保护液含1wt％的牛血清，0.2wt％的酪蛋白，0.2wt％的Proclin-300,0.1mol/L，pH7.6的磷酸盐缓冲液。
(2)HBP结合抗体
配制方法：取2mgHBP单克隆抗体，与异硫氰酸荧光素按照1mg：150g比例缓慢溶于抗体稀释液中，混合均匀，避光，2～8℃反应6小时，然后加入5M的NH4Cl溶液至终浓度50mmol/L，终止反应1.5小时，将反应物在PBS缓冲液中透析3次，然后用抗体稀释液稀释至所需浓度，于2～8℃避光保存备用。
所述抗体稀释液含有1wt％的BSA，0.2wt％的Proclin-300,0.1mol/L，pH7.6的磷酸盐缓冲液。
(3)HBP标记抗体
配制方法：取2mg HBP单克隆抗体溶于1mL的CB缓冲液中。另取20μg吖啶酯溶解于1ml二甲基亚砜中混合均匀，取混合后的吖啶酯-二甲基亚砜溶液溶解于2mg/ml的抗体溶液中，25℃恒温避光反应1小时后，加入1M甘氨酸缓冲液继续反应1小时，用超滤管进行纯化，收集标记好的抗体，用抗体稀释液稀释至所需工作浓度，保存于2～8℃备用。
(4)校准品
配制方法：将已知浓度的肝素结合蛋白加入到基质液中配制成下列浓度的校准品：0ng/ml,2ng/ml，5ng/ml，40ng/ml,150ng/ml,300ng/ml。
基质液含有2wt％的BSA,0.1mol/LNaCl，0.2wt％的Proclin-300，pH7.4,0.1mol/L的磷酸盐缓冲液。
(5)质控品
配制方法：将已知浓度的肝素结合蛋白加入到基质液中配制成下列浓度的质控品：4ng/ml，30ng/ml。
基质液含有2wt％的BSA，0.1mol/L NaCl，0.2wt％的Proclin-300，pH7.4,0.1mol/L的磷酸盐缓冲液。
(6)发光底物
配制方法：底物由预激发液A和激发液B液组成，其中预激发液A含有0.1mol/L盐酸和1.0wt％的过氧化脲，激发液B含有1.6wt％的氢氧化钠和2.0wt％的八烷基三甲基氯化铵。
(7)样本稀释液
配制方法：含有1.0wt％的BSA,0.2wt％Proclin-300,pH7.4,0.1mol/L的磷酸盐缓冲液。
(8)清洗液的浓缩液
配制方法：含有2.0％的Tween-20，2.0％的Procline300，PH7.5的磷酸盐缓冲液。
上述试剂盒的使用方法或用于检测肝素结合蛋白的方法如下。
A、试剂准备
样本、磁微粒、HBP结合抗体以及HBP标记抗体：取出平衡至室温(20℃至25℃)；
发光底物：将预激发液A和激发液B取出并平衡至室温；
清洗液：将浓缩液用纯化水稀释10倍，备用。
B、样本检测
吸取50μL待测样本和校准品加入反应管中，依次加入50μL磁微粒混悬液和50μL的HBP结合抗体，在37℃的条件下温育15min；进行磁分离；用清洗液清洗3次。然后再加入50μL的HBP标记抗体，在37℃的条件下温育15min；然后进行磁分离；用清洗液清洗3次。在清洗后的反应管中加入100μL激发液A，混匀后加入100μL预激发液B，同时检测其发光值。
以校准品的浓度为横坐标，校准品测定的发光值为纵坐标，得到线性回归方程:Log(Y)＝3.6516+0.8923Log(X)，计算求得线性相关系数r＝0.9993,大于0.95，具体数据可参照表1和图1。
表1 检测数据
校准品浓度(ng/ml) 0 2 5 40 150 300
发光值(RLU) 1679 7822 19297 133431 397936 673256
实施例2
提供了一种用于检测肝素结合蛋白的试剂盒及其方法，大致与实施例1相同，区别在于，HBP标记抗体的发光标记物为碱性磷酸酶(ALP)，与其相适应的化学发光底物为(金刚烷)-1,2-二氧环乙烷(AMPPD)；该溶液含有：0.5wt％AMPPD，三羟甲基氨基甲烷(0.05mol/L，pH范围为7.00-9.50)，0.2mol/L硫酸钠，0.1mol/L的氯化钠，0.2wt％的Proclin-300以及2wt％的发光增强剂。
上述碱性磷酸酶标记的HBP标记抗体制备方法如下：
称取5mg的碱性磷酸酶加入1ml抗体溶液(2mg/ml)中溶解，装入透析袋，于4℃用0.01mol/LpH7.2的PBS透析18小时，期间换液3次，加入2.5％戊二醛20μL，室温搅拌2小时，于4℃用0.01mol/LpH7.2的PBS透析18小时，期间换液3次，换用0.05mol/L pH8.0 Tris-HCL缓冲液透析，4℃过夜，换液3次，取出标记抗体，用含有1％BSA的pH8.0 Tris-HCL缓冲液稀释至工作浓度，即为碱性磷酸酶标记的HBP抗体。
对比例1
提供了一种用于检测肝素结合蛋白的试剂盒，大致与实施例1相同，区别在于磁微粒试剂和HBP结合抗体的不同，对比例1的磁微粒与HBP的单克隆抗体直接偶联，且对比例1不含有HBP结合抗体。
检测方法与本发明提供的测定方法有所不同,对比例1在测定时，将待测样品、偶联有HBP的单克隆抗体磁微粒以及HBP标记抗体依次加入反应管中混合温育。
对比例的检测步骤如下：
将50μL待测样品和校准品加入反应管中，依次加入偶联有HBP的单克隆抗体磁微粒和HBP标记抗体，在37℃的条件下温育30min；然后将反应管进行磁分离，用清洗液清洗3次。清洗后，在反应管中加入100μL预激发液，混匀后再加入100μL激发液，同时检测其发光值。
对比例2
提供了一种用于检测肝素结合蛋白的试剂盒，基本与实施例1相同，区别在于磁微粒试剂和HBP结合抗体的不同，对比例2的磁微粒为链霉亲和素包被的磁微粒，HBP结合抗体为联接生物素的HBP抗体。
检测方法与本发明提供的测定方法基本相同,对比例2在测定时，将待测样品、联接有HBP单克隆抗体磁微粒以及HBP标记抗体依次加入反应管中混合温育。
对比例2的检测步骤如下：
将50μL待测样品和校准品加入反应管中，依次加入链霉亲和素包被的磁微粒混悬液50μL，联接有生物素的HBP结合抗体溶液50μL、吖啶酯标记的HBP标记抗体溶液50μL，在37℃的条件下温育30min；然后将反应管进行磁分离，用清洗液清洗3次。清洗后，在反应管中加入100μL预激发液，混匀后再加入100μL激发液，同时检测其发光值。
验证例1
验证实施例1提供的试剂盒的精密性。
将高值300ng/ml的校准品用本发明实施例1的样品稀释液稀释3个梯度，各重复检测10次，计算变异，结果见表2。
表2 检测结果
Figure BDA0003258479550000111
由表2可知，本发明试剂盒的变异在8％以内，精密性较好。
验证例2
验证实施例1提供的试剂盒的重复性和灵敏度。
用校准品基质液作为空白样本，将样本分为2份，分别采用实施例1和对比例1提供的试剂盒及其检测方法对样本进行检测，检测结合参照表3。
表3 检测结果
Figure BDA0003258479550000121
Figure BDA0003258479550000131
由表3可知，本发明提供的测定试剂盒的重复性和分析灵敏度比对比例提供的测定试剂盒要更好。实施例1提供的试剂盒分析灵敏度(空白限)0.36ng/ml，对比例1提供的试剂盒分析灵敏度(空白限)1.24ng/ml，实施例1试剂的分析灵敏度远低于对比例1试剂的分析灵敏度，同时也印证了本发明所提供的试剂盒在检出限上的更有优势。
验证例3
验证实施例1提供的试剂盒的特异性。
分别采用实施例1和对比例2的试剂盒对含有干扰物的样本进行检测，检测结果如表4和表5所示。
表4 实施例1的特异性检测结果
Figure BDA0003258479550000132
Figure BDA0003258479550000141
表5 对比例2的特异性检测结果
Figure BDA0003258479550000142
Figure BDA0003258479550000151
由表4和表5特异性检测结果可知，实施例1提供的试剂盒比对比例2提供的试剂盒特异性更高，同时也印证了本发明所提供的试剂盒很好的避免了内源性因素的干扰。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种用于检测肝素结合蛋白的试剂盒，其特征在于，其包括以下组分：HBP结合抗体、HBP标记抗体、固相载体以及用于偶联在所述固相载体表面的异硫氰酸荧光素抗体；
其中，所述HBP结合抗体为联接有异硫氰酸荧光素的HBP抗体；
所述HBP标记抗体为发光标记物标记的HBP抗体。
2.根据权利要求1所述的用于检测肝素结合蛋白的试剂盒，其特征在于，所述发光标记物选自吖啶类化合物和碱性磷酸酶中的至少一种；
优选地，所述发光标记物为吖啶类化合物；
优选地，所述发光标记物包括吖啶酯和/或吖啶磺酰胺；
优选地，所述试剂盒还包括发光底物；当所述发光标记物为吖啶类化合物时，所述发光底物为过氧化物，当所述发光标记物为碱性磷酸酶时，所述发光底物为AMPPD。
3.根据权利要求1所述的用于检测肝素结合蛋白的试剂盒，其特征在于，所述HBP抗体中的抗体选自：单克隆抗体、多克隆抗体或抗体功能性片段中的至少一种；
优选地，所述HBP抗体为HBP单克隆抗体。
4.根据权利要求1所述的用于检测肝素结合蛋白的试剂盒，其特征在于，所述固相载体与所述异硫氰酸荧光素抗体为偶联状态。
5.根据权利要求1所述的用于检测肝素结合蛋白的试剂盒，其特征在于，所述固相载体为磁微粒；
优选地，所述磁微粒的表面修饰有羧基、氨基和甲苯磺酰基中的至少一种基团；
优选地，所述磁微粒的直径为0.5～5μm。
6.根据权利要求1所述的用于检测肝素结合蛋白的试剂盒，其特征在于，所述HBP结合抗体由以下步骤制备获得：将HBP抗体与异硫氰酸荧光素按照1mg：(100～200g)的比例进行混合；
在混合后的产物中加入1～10M NH4Cl溶液至NH4Cl终浓度为50mmol/L，以终止反应；
将终止反应后的产物在缓冲液中进行透析，透析后采用稀释液稀释至所需浓度，获得HBP结合抗体。
7.根据权利要求1～6任一项所述的用于检测肝素结合蛋白的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：缓冲液、稀释液、校准品、质控品以及清洗液中的至少一种；
优选地，所述稀释液中含0.1～3wt％的BSA，0.1～1wt％Proclin-300以及0.01～1mol/L，pH7.2～7.6的磷酸盐缓冲液。
8.根据权利要求7所述的用于检测肝素结合蛋白的试剂盒，其特征在于，所述校准品和/或所述质控品为：肝素结合蛋白与基质液混合配制而成；
优选地，所述校准品和/或所述质控品中的肝素结合蛋白为重组肝素结合蛋白；
优选地，所述基质液含有：1～5wt％的BSA,0.01～0.1mol/LNaCl，0.01～0.5wt％的Proclin-300以及0.01～0.1mol/L pH 7.2～7.6的磷酸盐缓冲液。
9.一种用于检测肝素结合蛋白的方法，其特征在于，其包括：采用如权利要求1～8任一项所述的用于检测肝素结合蛋白的试剂盒对待测样本中的肝素结合蛋白进行检测；
所述方法不以疾病的诊断或治疗为直接目的。
10.如权利要求1～8任一项所述的用于检测肝素结合蛋白的试剂盒在诊断感染性疾病中的应用；
优选地，所述感染性疾病为与HBP相关的感染性疾病。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115389760A (zh) * 2022-10-27 2022-11-25 艾康生物技术(杭州)有限公司 用于免疫分析试条的检测试剂

Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006053031A (ja) * 2004-08-11 2006-02-23 Kagoshima Univ 免疫組織化学的染色による抗原の検出方法
CN104880564A (zh) * 2015-04-30 2015-09-02 南京格耀生物科技有限公司 一种检测抵抗素的试剂盒及其制备方法和检测方法
CN109490555A (zh) * 2018-12-28 2019-03-19 南京新耀医疗技术有限公司 一种基于化学发光法检测Lp-PLA2和CRP含量的试剂盒、方法及应用
CN111679086A (zh) * 2020-08-11 2020-09-18 苏州康和顺医疗技术有限公司 一种hbp的磁微粒化学发光法检测试剂盒及其制备方法
CN111781362A (zh) * 2020-07-08 2020-10-16 山东博科诊断科技有限公司 肌酸激酶同工酶磁微粒化学发光检测试剂盒及其应用
CN111781374A (zh) * 2020-07-08 2020-10-16 山东博科诊断科技有限公司 超敏肌钙蛋白i磁微粒化学发光检测试剂盒及其应用
CN112129933A (zh) * 2019-06-25 2020-12-25 迈克生物股份有限公司 一种免疫分析系统中抗生物素干扰的试剂、试剂盒及方法
CN112730839A (zh) * 2021-01-20 2021-04-30 宁波海壹生物科技有限公司 一种磁微粒化学发光法测定细胞角蛋白19片段含量的试剂盒
CN112858696A (zh) * 2021-02-24 2021-05-28 江西英大生物技术有限公司 肝素结合蛋白测定试剂盒

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006053031A (ja) * 2004-08-11 2006-02-23 Kagoshima Univ 免疫組織化学的染色による抗原の検出方法
CN104880564A (zh) * 2015-04-30 2015-09-02 南京格耀生物科技有限公司 一种检测抵抗素的试剂盒及其制备方法和检测方法
CN109490555A (zh) * 2018-12-28 2019-03-19 南京新耀医疗技术有限公司 一种基于化学发光法检测Lp-PLA2和CRP含量的试剂盒、方法及应用
CN112129933A (zh) * 2019-06-25 2020-12-25 迈克生物股份有限公司 一种免疫分析系统中抗生物素干扰的试剂、试剂盒及方法
CN111781362A (zh) * 2020-07-08 2020-10-16 山东博科诊断科技有限公司 肌酸激酶同工酶磁微粒化学发光检测试剂盒及其应用
CN111781374A (zh) * 2020-07-08 2020-10-16 山东博科诊断科技有限公司 超敏肌钙蛋白i磁微粒化学发光检测试剂盒及其应用
CN111679086A (zh) * 2020-08-11 2020-09-18 苏州康和顺医疗技术有限公司 一种hbp的磁微粒化学发光法检测试剂盒及其制备方法
CN112730839A (zh) * 2021-01-20 2021-04-30 宁波海壹生物科技有限公司 一种磁微粒化学发光法测定细胞角蛋白19片段含量的试剂盒
CN112858696A (zh) * 2021-02-24 2021-05-28 江西英大生物技术有限公司 肝素结合蛋白测定试剂盒

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
张赟 等: "《细胞和分子免疫学实用实验技术》", 第四军医大学出版社, pages: 53 - 55 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115389760A (zh) * 2022-10-27 2022-11-25 艾康生物技术(杭州)有限公司 用于免疫分析试条的检测试剂
CN115389760B (zh) * 2022-10-27 2023-04-18 艾康生物技术(杭州)有限公司 用于免疫分析试条的检测试剂

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