JP2006053031A - 免疫組織化学的染色による抗原の検出方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】本発明の免疫組織化学的染色用複合体は、抗原と、前記抗原へ結合する一次抗体と、前記一次抗体へ結合する二次抗体と、前記二次抗体及び第一の西洋ワサビペルオキシダーゼからなる複合体と、標識タイマライド及び当該標識タイマライドへ結合する第二の西洋ワサビペルオキシダーゼからなる第二の複合体と、からなることを特徴とする。
【選択図】図1
Description
2)0.3〜6% 過酸化水素水メタノール溶液に5〜30分間浸し、一次の内因性ぺルオキシダーゼの活性の抑制を行い、
3)0.005〜0.02Mリン酸緩衝液0. 5〜1%塩化ナトリウム溶液(PBS)で洗浄し、固定組織標本切片の親水化を行い、
4)抗原に対応した抗原回復処理(一般的には、0.001〜0.02Mクエン酸緩衝液等に切片を浸し、オートクレーブで110〜140℃、1〜15分間の熱処理を行い、冷却後に、PBSに浸す。)を行い、
5)自動免疫染色装置に固定組織標本切片を配置し、
6)0.3〜6%過酸化水素水PBSに1〜15分間反応させ、二次の内因性ぺルオキシダーゼの活性の抑制を行い、25〜60℃に加熱した0.01〜0.2% ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート (tween 20)を含む0. 5〜1%塩化ナトリウムを加えた0.01〜0.1Mトリス緩衝液(TBS)洗浄液で1〜4回洗浄し、
7)0.1〜1%カゼイン溶液に2〜30分間反応させ、抗原特異(一次)抗体の非特異反応の抑制前処理を行い、
8)それぞれ一次抗体の至適希釈溶液と至適反応時間(13分間〜2時間)で反応させた後、25〜60℃に加熱したTBS洗浄液で2〜5回洗浄し、
9)0.1〜1%カゼイン溶液に2〜30分間反応させ、特異ポリマー試薬反応の非特異反応の抑制前処理を行い、
10)ポリマー試薬を10分間〜1時間反応させ、25〜60℃前後に加熱したTBS洗浄液で2〜5回洗浄し、
11)0.1〜1%ガゼイン溶液に2〜30分間反応させ、ビオチンないし蛍光物質で標識されたタイラマイド試薬反応の非特異反応の抑制処理を行い、
12)ビオチンないし蛍光物質で標識されたタイラマイド試薬と10〜30分間反応させ、25〜60℃前後に加熱したTBS洗浄液で2〜4回洗浄し、
13)ストレプトアビチンないし蛍光物質と特異的に反応する抗体と西洋ワサビぺルオキシダーゼ等の酵素ないし蛍光物質の複合体溶液と10分間〜1時間反応させ、25〜60℃前後に加熱したTBS洗浄液で2〜4回洗浄する。
15)ヘマトキシン等の溶液で、後対比染色を行い、水で1〜3回洗浄し、
16)自動免疫染色装置から固定組織標本切片を外し、
17)封入剤に対応した処理を行い、超高感度免疫染色を行った固定組織標本パラフィン切片を永久標本とし、光学顕微鏡下での抗原の検出となる。
<キシレン>
キシレンは、特級キシレンを用いる。
<エタノール>
エタノールは、特級エタノールを用いる。
特級過酸化水素水(30%溶液)を、特級メタノールで100倍希釈したものを用いる。
28.7gのリン酸水素第二ナトリウム・12水と3.3gのリン酸第二水素ナトリウム二水和物を1Lのイオン交換水に溶解した0.1Mリン酸緩衝液に、85gの塩化ナトリウムを加え、オートクレーブで完全に溶解し室温まで冷却し、10N 水酸化ナトリウム水でpHを7.6に調整したものを10倍溶液として、使用時に10倍にイオン交換水で希釈する。
2.1gのクエン酸・一水和物と2.94gクエン酸三ナトリウム・二水和物を100 mlのイオン交換水にオートクレーブで加熱し溶解し、10N 水酸化ナトリウム水でpHを6.0に調整し、イオン交換水で100mlに調節したものを10倍溶液とし、使用時に10倍にイオン交換水で希釈する。商業的には、10倍溶液がDakoCytomation Co.やダイヤトロンから供給されている。その他に、抗原回復には、
のp.114に記載されている1mM EDTA溶液 pH 8.0、などが用いられ、DakoCytomation Co.から供給されている。
特級過酸化水素水(30%溶液)を、28.7gのリン酸水素第二ナトリウム・12水と3.3gのリン酸第二水素ナトリウム二水和物を1Lのイオン交換水に溶解した0.1Mリン酸緩衝液に、85gの塩化ナトリウムを加え、オートクレーブで完全に溶解し室温まで冷却し、10N 水酸化ナトリウム水でpHを7.6に調整したものを10倍溶液として、使用時に10倍にイオン交換水で希釈する0.01Mリン酸緩衝液0.85%塩化ナトリウム溶液(PBS)で100倍に希釈する。
121.1gのトリスハイドロオキシメチルアミノメタン(シグマ社)を800mlのイオン交換水で希釈しオートクレーブで加熱溶解後に、1N塩酸でpHを7.5に調整し、イオン交換水で1Lにした1Mトリス溶液500mlと、292.2gの塩化ナトリウムを800mlのイオン交換水でオートクレーブ加熱溶解しイオン交換水で1Lにした5M塩化ナトリウム溶液360mlを、イオン交換水で20Lに希釈し、0.1%ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート (tween 20)とした溶液。自動免疫染色装置の洗浄液タンクに入れて、35℃前後に加熱したものである。
25mgのカゼイン(シグマ社)を28.7gのリン酸水素第二ナトリウム・12水と3.3gのリン酸第二水素ナトリウム二水和物を1Lのイオン交換水に溶解した0.1Mリン酸緩衝液に、85gの塩化ナトリウムを加え、オートクレーブで完全に溶解し室温まで冷却し、10N 水酸化ナトリウム水でpHを7.6に調整したものを10倍溶液として、使用時に10倍にイオン交換水で希釈する0.01M PBSの10 mlに希釈したもの。商業的には、DakoCytomation Co.から供給されている。
デキストランポリマーに直接二次抗体とHRPを結合させた試薬で、DakoCytomation Co.から商業的にダコ ChemMate ENVISION試薬として供給されている。
ビオチン化タイラマイドと過酸化水素水の試薬で、DakoCytomation Co.からはダコCSA Systemの増幅試薬として、パーキンエルマーライフサイエンスジャパン株式会社からはTSA免疫組織化学染色・in situ Hybridization増感システムのキットの増幅試薬として供給されている。
ビオチンないし蛍光物質で標識されたタイラマイド試薬に対応した沈着したタイラマイドを標識する試薬。HRP標識タイラマイドであればストレプトアビチンと西洋ワサビペルオキシダーゼ等複合体溶液は、DakoCytomation Co.からはダコCSA Systemの酵素標識試薬として供給されている。パーキンエルマーライフサイエンスジャパン株式会社からはTSA免疫組織化学染色・in situ Hybridization増感システムのキットの酵素や蛍光物質標識試薬として供給されている。
酵素の発色基質溶液。商業的に、種々のものが供給されている。
上記の発色色素と区別できる色素溶液を用いた核ないし細胞質の染色で、後対比染色を行う。一般的には、ヘマトキシリン溶液が用いられる。DakoCytomation Co.から自動免疫染色装置での染色用にダコ ChemMateヘマトキシリン試薬が供給されている。
発色基質に合わせて、ジアミノベンチジンであれば、エタノール系列に浸しての脱水後に、プラスチック封入剤で封入し、長期の保存に耐える永久標本を作成する。3-アミノ-9-エチルカルバゾールでの発色では、DakoCytomation Co.から供給されるUltramount試薬で、70℃での加熱固化で永久標本を作成する。ベクター社の種々の発色基質では、冷風による乾燥後に、VectaMount封入剤で封入し乾燥固化し、永久標本を作成する。
sABC法とHRPによるCARD反応とその検出からなる超高感度免疫組織化学の方法(DAKO CSA system, DakoCytomation Co)を自動免疫染色装置で実施し、各反応後の洗浄に、35℃加熱0.1%tween20界面活性剤添加トリス緩衝液(TBS)洗浄液を用い、洗浄回数と洗浄効果の関係の検討を行った。その結果、sABC法の各洗浄は35℃加熱0.1%tween20界面活性剤添加TBSによる三回の洗浄が、HRPによるCARD反応とその検出の反応後の洗浄は35℃加熱0.1%tween20界面活性剤添加TBSによる二回の洗浄が、至適な洗浄であることが示された。
洗浄は実施例1で示した至適洗浄法で、従来の超高感度の免疫組織化学の方法を種々の臓器の固定組織パラフィン標本切片で自動免疫染色装置を使い実施した。
実施例3
セルブロック標本は、大量に培養した細胞ないし採取された細胞を試験管に集め、500rpmで10秒程、フラッシュ遠沈し、細胞集塊を作り、それに、10%緩衝ホルマリン溶液を注ぎ30分間固定し、この固定された細胞集塊を組織と同様に処理し、パラフィン包埋標本を作成した。
ダコChemMate ENVISION(K5027)は、商業的に供給されているポリマー法の一つであり、自動免疫染色装置での染色を前提に供給されている。ダコEnVisionより抗原検出感度が高いとされている。
ダコENVISION+(抗マウス一次抗体用)(K4006は、商業的に供給されているポリマー法である。チレイ(ザイメット社)のヒストファイン・シンプル・ステイン・マルチニチレイ(ザイメット社)のヒストファイン・シンプル・ステイン・マルチ(ペルオキシダーゼ標識)(Histofine Simple Stain, MULTI (PO)、424154)は。商業的に供給されているポリマー法である。
本発明の超高感度免疫組織化学的染色を、ヒト扁桃固定組織パラフィン標本切片を用い、0.01Mクエン酸緩衝液pH6.0に浸しオートクレーブでの熱処理による抗原回復を行い、一次抗体は抗Ki67抗原抗体溶液でKi-67 Antigen, MIB-1 (マウス単クローン抗体)(DakoCytomation Co. M7240)をダコ抗体希釈溶液での50倍に希釈した溶液を用い、実施した。
次に、非特異反応を、さらに抑制する方法を見出すべく、種々の比較試験を行なった。
染色は、DAKO autostainerを用いて、洗浄緩衝液は35℃に加熱した界面活性剤添加トリス緩衝液である。
<ポリマー試薬>
ダコ・サイトメーション社のダコChemMate ENVISION K5027。
0.25%カゼイン溶液試薬:ダコ・サイトメーション社の非特異反応ブロッキング試薬 X0909。
ダコ・サイトメーション社のダコCSA System K1500のボトル8の増幅試薬。
ダコ・サイトメーション社のダコCSA System K1500のボトル9の酵素標識試薬。
ダコ・サイトメーション社のCSA II (K1497)の増幅試薬ないしダコ・サイトメーション社のダコGenPoint system (K0618)のFITC標識タイラマイド溶液。
ダコ・サイトメーション社のダコGenPoint system (K0618)の抗FITC抗体/HRP二次酵素試薬。
上記の実施例4で確立した簡略化CSA法(simplified CSA法)は、生検、針生検標本では、非特異反応が強すぎることが判明した。一次抗体等の抗体希釈液の汚染等の問題を検討したが、この非特異反応が抗体等の希釈溶液等の汚染によるのではなく、CARD反応の非特異反応であることが示唆されたことから、実施例5でCARD反応前に非特異反応抑制処理を行う新規簡略化CSA法(new simplified CSA system(以下、nsCSAsystemともいう)を実施し、これを確認した。しかし、このCARD反応の非特異反応抑制は、ビオチン標識タイラマイド(biotinyl-tyramide)を用いる場合には、非特異反応を減じたが、FITC標識タイラマイド(FITC-tyramide)では、CARD反応によるシグナル増幅が極端に低下する傾向があった。
この検索には、連結不可能匿名化が行われた壊死性リンパ節炎を示すリンパ節のホルマリン固定パラフィン包埋標本切片を用いた。
Wash buffer: 0.05M Tris 1.8M NaCl pH 7.5, 温度35 ℃での洗浄。
Wash water: 脱イオン水による洗浄。
Protein block:ダコプロテインブロック試薬でプロテインブロックを5分間行った。新規簡素化CSA法は、ポリマー法(簡素化CSA法、the Histochem J, Hasui et al, 2002)及びCARD反応前に2回追加のプロテインブロックを行った。
<結果1、new simplified CSA system (ビオチン標識タイラマイドを用いる場合)に於ける種々の非特異抑制剤の効果(実験1)>
図9の上から5と6段の図、5段目が壊死を認めない部分、6段目が壊死を認める部分に示す様に、0.1% tween20を添加し、Protein blockの反応時間を15分間に延長すると、Dako Protein Blockでは特異反応も相当抑制され、 3% BSA PBSでは非特異反応が非常に少なく、特異反応が一部抑制されていた。ここでは、一次抗体反応、ポリマー試薬反応、CARD反応の前の非特異抑制に、0.1%tween20の添加と処理時間を15分延長した場合の効果を見ている。この実施例では、最終段階のDAB過酸化水素反応も自動免疫染色装置で行っている。従って、茶色の抗体の特異反応を反映する発色の消失は、特異反応抑制を意味する。CADR反応前の処理時間の延長では、CARD反応自体は同じ条件で実施されているので、標識タイラマイドの反応と理解することができる。0.25% Casein PBSとBlock Ace diluted 4 times with deionized waterでは非特異反応の抑制が出来なかった。0.25% Casein 1% BSA PBSとBlock Ace, Block Ace diluted 4 times with deionized waterでは、かなり非特異反応を抑制できたが完全ではなかった。
CSAIIはHRP-labeled antibody methodを、new simplified CSA systemはHRP- and antibody-labeled polymer methodを用いて、抗原と反応した一次抗体を標識している。
Claims (20)
- 抗原と、前記抗原へ結合する一次抗体と、前記一次抗体へ結合する二次抗体と、前記二次抗体及び第一の西洋ワサビペルオキシダーゼからなる第一の複合体と、標識タイマライド及び当該標識タイマライドへ結合する第二の西洋ワサビペルオキシダーゼからなる第二の複合体と、からなる免疫組織化学的染色用複合体。
- 前記標識タイマライドと前記第二の西洋ワサビペルオキシダーゼとの結合を、ビオチンとアビチン、又は蛍光物質とを用いて行う請求項1記載の複合体。
- 前記二次抗体が、非ビオチン化二次抗体である請求項1又は2項記載の複合体。
- 固定組織標本切片中の抗原を検出する免疫組織化学的染色方法による抗原の検出方法であって、前記抗原と一次抗体とを結合させて、二次抗体及び西洋ワサビぺルオキシダーゼを含むポリマー複合体と、前記結合した一次抗体とを結合させて、請求項1〜3記載の複合体を得た後、前記西洋ワサビぺルオキシダーゼによる標識タイラマイドの沈着反応の標識物を可視化することによって、抗原を検出する抗原の検出方法。
- 前記ポリマー複合体と前記結合した一次抗体との反応前に、非特異反応を抑制する処理を行う請求項4に記載の方法。
- 前記ポリマー複合体と前記結合した一次抗体との反応後に、非特異反応を抑制する処理を行う請求項4又は5に記載の方法。
- 前記標識タイラマイドの沈着反応前に、非特異反応を抑制する処理を行う請求項4〜6のいずれか1項に記載の方法。
- 前記非特異反応を抑制する処理が、二次抗体と同種の動物血清による処理、スキンミルクによる処理、ノンファットミルクによる処理、BSA (牛血清アルブミン)による処理及びガゼイン溶液による処理からなる群から選択される少なくとも1種であることを特徴とする請求項4〜7項のいずれか1項に記載の方法。
- 前記カゼイン処理を、0.025〜2.5%の範囲のカゼインを含む溶液により行なうことを特徴とする請求項4〜8項のいずれか1項に記載の方法。
- 前記BSAが、界面活性剤添加BSAである請求項4〜9項のいずれか1項に記載の方法。
- 前記界面活性剤が、tween20又はtriton X-100である請求項10記載の方法。
- 前記界面活性剤が、0.01〜1%である請求項10記載の方法。
- 前記BSAが、0.01〜5%である請求項10記載の方法。
- tween20添加BSAが、0.1%tween添加3%BSAである請求項10記載の方法。
- さらに、非特異反応生成物、及びその他の残存反応物を除去するために、加熱した洗浄液によって洗浄する工程を含む、ことを特徴とする請求項4〜14項のいずれか1項に記載の方法。
- 前記加熱した洗浄液の温度が、25〜60℃の範囲内であることを特徴とする請求項15記載の方法。
- 前記標識物が、可視化することができる物質である請求項4〜16項のいずれか1項に記載の方法。
- 前記可視化することができる物質が、ビオチン、蛍光物質の少なくとも一つを含むものである請求項17記載の方法。
- 蛍光物質が、フルオレスセンス・イソチアネ−ト(FITC)である請求項18記載の方法。
- 反応液、反応時間、及び洗浄回数をプログラムして自動免疫装置に組み込み、自動化して行なう請求項4〜19項のいずれか1項に記載の方法。
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