CN111954816A - 检测magea4的方法 - Google Patents

检测magea4的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN111954816A
CN111954816A CN201980018008.1A CN201980018008A CN111954816A CN 111954816 A CN111954816 A CN 111954816A CN 201980018008 A CN201980018008 A CN 201980018008A CN 111954816 A CN111954816 A CN 111954816A
Authority
CN
China
Prior art keywords
minutes
sample
antibody
magea
incubating
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201980018008.1A
Other languages
English (en)
Inventor
A·威廉姆斯
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Immunocore Ltd
Original Assignee
Immunocore Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Immunocore Ltd filed Critical Immunocore Ltd
Publication of CN111954816A publication Critical patent/CN111954816A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/5743—Specifically defined cancers of skin, e.g. melanoma
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及检测样品中的MAGEA4方法。该方法包括：以范围从2μg/ml至20μg/ml的浓度向样品添加抗MAGEA4抗体；孵育抗体和样品；以及检测与样品结合的抗体。本发明的方法可用于诊断对象是否患有癌症以及对象是否有资格用靶向MAGEA4的癌症疗法进行治疗。

Description

检测MAGEA4的方法
技术领域
本发明涉及用于检测黑素瘤相关抗原A4(MAGEA4)的方法。本发明的方法可用于诊断对象是否患有癌症以及对象是否有资格用靶向MAGEA4的癌症疗法进行治疗。
背景技术
MAGEA4(NCBI参考序列：NP_001011550.1)是属于种系编码的癌症抗原中的MAGE家族的肿瘤相关抗原(TAA)(De Plaen,et al.,(1994),Immunogenetics 40(5):360-369)，并且是治疗干预的理想目标。据报道，MAGEA4在多种类型的肿瘤中高水平表达，包括黑色素瘤、食道癌、头颈癌、肺癌、乳腺癌和膀胱癌(Bergeron,(2009),Int J Cancer 125(6):1365-1371；Cabezon,et al.,(2013),Mol Cell Proteomics 12(2):381-394；Cuffel,etal.,(2011),Int J Cancer 128(11):2625-2634；Forghanifard,et al.,(2011),CancerBiol Ther 12(3):191-197；Karimi,et al.,(2012),Clin Lung Cancer 13(3):214-219；Svobodova,et al.,(2011),Eur J Cancer 47(3):460-469)。MAGEA4在正常组织中的表达限于成人睾丸和包括胎盘在内的其他免疫豁免部位。因此，在其他组织中检测到MAGEA4是癌症的指示，并可用于建议癌症靶向疗法。
癌症靶向疗法旨在与参与癌症的生长、演进或扩散的分子特异性相互作用。近年来，已批准或在临床测试中的此类治疗的数量已显著增加。与该增加同时出现的是，对能够鉴别出最有可能从特定疗法中受益的那些患者的合适伴随诊断方法的要求也在增加。
对于旨在特异性识别肿瘤相关抗原(TAA)(诸如MAGEA4)的疗法，检测患者肿瘤样品中给定TAA的表达提供了一种方便的诊断方法，以将患者分类为可能的反应者并因此有资格使用相应的疗法进行治疗。虽然可应用于检测TAA的已知技术有许多，但获得准确并且可再现的伴随诊断测定并非易事，并且需要仔细优化。假阴性结果可能意味着不会向患者提供潜在的有益治疗，而假阳性结果可能导致对该患者产生不必要的、潜在的毒性副作用。因此，仍然持续需要在治疗前检测TAA、诊断癌症并鉴别符合条件的患者的诊断方法。
免疫组织化学(IHC)是一种众所周知的诊断方法。可使用自动染色系统执行IHC。这样的系统使标准化和提高可再现性成为可能。自动染色系统可从包括Ventana/Roche、Dako/Agilent、Leica ThemoFisher在内的许多供应商处通过商业获得。与其他方法(诸如PCR)不同，IHC可提供细胞定位以及表达水平的信息。这对于其中抗原表达可能是异质的肿瘤样品特别重要。FDA批准的Herceptest(Agilent-Dako)被认为是针对靶向疗法的基于IHC的伴随诊断测定的原型。在该情况下，测试阳性则将患者分类为对乳腺癌的Her2靶向抗体曲妥珠单抗(赫赛汀)的“反应者”。最近的示例是针对非小细胞肺癌中的PD-L1抗体pembrolizumab的IHC诊断测定(Roach et al.,(2016),Appl.Immunohistochem.Mol.Morphol.24(6):392-397)。尽管IHC作为一种诊断方法已被广泛接受，但仍存在可再现性、缺乏标准化以及试剂、检测系统和测定条件过多的问题(Taylor et al.,(2014),Appl.Immunohistochem.Mol.Morphol.22(8):555-561)，所有这些问题使得诊断测定的发展与常规化相去甚远。
发明内容
在第一方面，本发明提供检测样品中的MAGEA4的方法，该方法包括：
以2μg/ml至20μg/ml范围内的浓度向样品添加抗MAGEA4抗体；
孵育抗体和样品；以及
检测与样品结合的抗体。
发明人发现，特定浓度的抗体允许准确且可再现的MAGEA4检测，从而使假阳性和假阴性结果最小化。
抗MAGEA4(或“一”抗)可以是单克隆抗体。它可以是人或小鼠抗体和/或可以是IgA、IgD、IgE、IgG或IgM亚型。如本领域技术人员已知的，MAGEA4与MAGE家族的其他蛋白质共享高水平的序列同源性。因此，为了使假阳性最小化，当在肿瘤样品中评估时，优选一抗能够特异性识别MAGEA4，并且证明与其他MAGE家族成员的交叉反应性有限或没有交叉反应性。
如本文所使用的，术语“抗体”是指与另一分子的特定空间和极性组织特异性结合并因此被定义为与另一分子的特定空间和极性组织互补的免疫球蛋白。该抗体可以是单克隆的或多克隆的，并且可通过本领域众所周知的技术制备，诸如宿主的免疫和血清的收集(多克隆)，或者通过制备连续的杂交细胞系并收集分泌性蛋白(单克隆)，或通过克隆和表达至少编码天然抗体的特异性结合所需氨基酸序列的核苷酸序列或其诱变形式。抗体可包括完整的免疫球蛋白或其片段，该免疫球蛋白包括各种类别和同种型，诸如IgA、IgD、IgE、IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3、IgM等。免疫球蛋白的片段可包括Fab、Fv和F(ab’)2、Fab’等。另外，可适当地使用免疫球蛋白或其片段的聚集体、聚合物和缀合物，只要保持对特定靶点的结合亲和力即可。术语“单克隆抗体”、“mAb”和“MAB”是指由淋巴细胞的单个克隆产生的免疫球蛋白的抗体，其仅识别抗原上的单个表位。例如，可用于本文公开的方法的单克隆抗体对MAGEA4的特定表位表现出单一的结合特异性和亲和力。如本文所使用的术语“多克隆抗体”是指能够与相同或不同抗原上的多种不同特异性抗原决定簇结合或反应的不同抗体分子的组合物。多克隆抗体的抗原特异性的可变性位于构成多克隆抗体的单个抗体的可变区中，特别是在互补决定区(CDR)中。
优选抗MAGEA4抗体是OTI1F9，其是可从Origene(Cat#TA505362)商购获得的小鼠IgG2a单克隆抗体。可使用其他一抗，包括CPTC-MAGEa4-1(Developmental StudiesHybridoma Bank-DSHB Cat#CPTC-MAGEA4-1，RRID:AB_2138142)。
抗体的浓度可以在4μg/ml至15μg/ml，4μg/ml至10μg/ml、5μg/ml至13μg/ml、6μg/ml至12μg/ml、7μg/ml至11μg/ml的范围内或可以为6μg/ml、7μg/ml、8μg/ml、9μg/ml、10μg/ml、11μg/ml或12μg/ml。优选的范围是4μg/ml至10μg/ml，优选的浓度是10μg/ml，。在使用OTI1F9抗体的本发明的那些实施例中，所使用的浓度可以是6μg/ml至12μg/ml、7μg/ml至11μg/ml或9μg/ml、10μg/ml或11μg/ml，优选为10μg/ml。
孵育的条件和持续时间将取决于所使用的特定抗体。样品和抗体可在36℃下孵育30分钟至60分钟、25分钟至50分钟、25分钟至39分钟、27分钟至35分钟、28分钟至34分钟、30分钟至33分钟、31分钟、32分钟或33分钟。可使样品和抗体在33℃至39℃、34℃至38℃、35℃至37℃、35℃、36℃或37℃下孵育上述任何时间。发明人发现，在36℃下进行32分钟提供了最佳结果，特别是对于OTI1F9。然而，时间和温度可变化。例如，如果使用较低的温度，则孵育时间可能较长，例如，4℃下孵育一夜。同样，如果使用较高的温度，则孵育时间可能较短。
可通过多种技术检测与样品结合的抗MAGEA4抗体。可直接或间接执行检测。在直接检测中，使用标记的试剂(诸如标记有荧光标签、酶或发色底物或荧光底物的一抗)直接确定抗体与MAGEA4的结合，无需进一步的抗体相互作用即可使抗体与MAGEA4的结合可视化。抗体可与可催化产生颜色的反应的酶(诸如，过氧化物酶)缀合。可替代地，也可将抗体标记到荧光团上，从而采用免疫荧光原理。在间接检测中，未缀合的一抗与MAGEA4结合，然后标记的二抗与一抗结合。可针对已经产生了一抗的动物物种的抗体同种型产生合适的二抗。例如，二抗可以是能够与小鼠抗体结合的抗小鼠抗体。由于来自结合一抗的多种二抗的信号放大，使用二抗的方法可能比直接检测方法更灵敏。可将二抗与酶标记物、发色底物或荧光底物缀合以提供抗原的可视化。合适的标记包括酶和比色剂，酶比如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶和荧光素酶，比色剂包括量子点、荧光团和发色团。可视化试剂可作为试剂盒的一部分提供，所述试剂盒为诸如可从Dako/Agilent和Ventana/Roche商购获得的试剂盒。本发明的方法优选为间接测定。
二抗可附接至任何合适的荧光团。在某些情况下，荧光团可以是香豆素、花菁、苯并呋喃、喹啉、喹唑啉酮、吲哚、苯并唑、硼聚氮杂吲哚(borapolyazaindacene)和或氧杂蒽，包括荧光素、罗丹明和对甲氨基酚(rhodol)。
感兴趣的特定荧光染料包括：氧杂蒽染料，例如荧光素和罗丹明染料，诸如异硫氰酸荧光素(FITC)、6-羧基荧光素(已知通常缩写为FAM和F)、6-羧基-2’,4’,7’,4,7-六氯荧光素(HEX)、6-羧基-4’,5’-二氯-2’,7’-二甲氧基荧光素(JOE或J)、N,N,N’,N’-四甲基-6-羧基罗丹明(TAMRA或T)、6-羧基-X-罗丹明(ROX或R)、5-羧基罗丹明-6G、6-羧基罗丹明-6G和罗丹明110；花菁染料，例如Cy3、Cy5和Cy7染料；香豆素，例如伞形酮；苯甲酰亚胺染料，例如赫斯特(Hoechst)33258；菲啶染料，例如德克萨斯红；乙锭染料；吖啶染料；咔唑染料；吩恶嗪染料；卟啉染料；聚次甲基染料，例如花菁染料，诸如Cy3、Cy5等；BODIPY染料和喹啉染料。通常在对象应用中使用的感兴趣的特定荧光团包括：芘、香豆素、二乙基氨基香豆素、FAM、荧光素氯三嗪基、荧光素、R110、曙红、JOE、R6G、四甲基罗丹明、TAMRA、丽丝胺、萘荧光素、德克萨斯红、Cy3和Cy5等。
可用于本发明的合适的可区分的荧光标记对包括Cy-3和Cy-5(Amersham Inc.，Piscataway，NJ)、Quasar 570和Quasar 670(Biosearch Technology,Novato Calif.)、Alexafluor555和Alexafluor647(Molecular Probes,Eugene,Oreg.)、BODIPY V-1002和BODIPY V1005(Molecular Probes,Eugene,Oreg.)、POPO-3和TOTO-3(Molecular Probes,Eugene,Oreg.)以及POPRO3和TOPRO3(Molecular Probes,Eugene,Oreg.)。进一步合适的可区分的可检测标记可在Kricka等人(Ann Clin Biochem.39:114-29,2002)、Ried等人(Proc.Natl.Acad.Sci.1992:89:1388-1392)和Tanke等人(Eur.J.Hum.Genet.1999 7:2-11)等中找到。
可使用荧光显微镜和适用于每个荧光团的滤光片，或通过使用双带通或三带通滤光片组观察多个荧光团，来观察抗体的结合-例如参见第5776688号美国专利。
多种可检测的酶底物可用于酶标记的抗体。这些酶底物包括发色底物，诸如pNNP、BCIP/NBT(5-溴-4-氯-3’-吲哚磷酸盐/硝基蓝色四唑)、TMB(四甲基联苯胺)、DAB(3,3’-二氨基联苯胺)、OPD(邻苯二胺盐酸盐)和ABTS(2,2’-叠氮基双[-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸])，以及化学发光底物，诸如ECL(增强化学发光物)标记或吖啶鎓酯(AE)。可用光学显微镜观察抗体结合。可使用抗小鼠二抗来检测OTI1F9，该抗小鼠二抗可与辣根过氧化物酶(HRP)或荧光团如Alexa
Figure BDA0002671931310000041
Plus 488缀合。这样的二抗是本领域已知的。
二抗可优选地与HRP缀合，并且包含HRP标记的抗体的混合物(山羊抗小鼠IgG、山羊抗小鼠IgM和山羊抗兔)。可优选用过氧化氢底物和3,3’-二氨基联苯胺四盐酸盐(DAB)使抗MAGEA4抗体/二抗复合物可视化。过氧化氢底物可以是0.4％，而3,3’-二氨基联苯胺四盐酸盐(DAB)发色剂可以是0.2％。乙酸缓冲液中的硫酸铜(5g/L)优选用于增强染色。染色可通过光学显微镜来评估。
使用由Ventana/Roche提供的检测试剂盒，时间安排根据说明进行。可使用其他检测试剂盒。优选地，使用由Ventana Medical Systems提供的ultraView检测试剂盒(产品代码760-500)来检测抗MAGEA4抗体(例如，OTI1F9)，将载玻片在HRP-多聚体中于36℃下孵育20分钟。在这种情况下，棕色沉淀物的出现表明存在MAGEA4，并且对象可能有资格利用靶向MAGAGE-4的疗法进行治疗。
可将染色与对照进行比较。对照可用于支持染色的有效性和鉴别实验假像。在某些情况下，对照可以是参考样品或参考数据集。参考可以是先前已经以适当的已知程度从对象获得的样品。参考可以是通过分析参考样品获得的数据集。对照可以是其中已知靶分子存在或靶分子以高水平表达的阳性对照，或者可以是其中已知靶分子不存在或以低水平表达的阴性对照。合适的阳性对照组织是睾丸，合适的阴性对照组织是卵巢。
对照可以是来自已知从治疗中受益的对象的组织样品。该组织可以是与被测试样品相同的类型。例如，可将来自对象的肿瘤组织的样品与来自已知适合于治疗的对象(例如先前对治疗有反应的对象)的肿瘤组织的对照样品进行比较。在某些情况下，对照可以是从与测试样品相同的对象但从已知健康的组织获得的样品。因此，可将来自对象的癌组织样品与非癌组织样品进行比较。在某些情况下，对照是细胞培养样品。在某些情况下，在与抗体孵育之前先对测试样品进行分析，以确定该样品固有的背景染色水平。在某些情况下，使用同种型对照。同种型对照使用与靶标特异性抗体的类别相同但与样品没有免疫反应性的抗体。这样的对照可用于区分靶标特异性抗体的非特异性相互作用。
为确保准确解释测试结果，病理学家可进行形态和免疫组织化学解释。该方法可包括确认表达模式与预期模式相关。该方法可包括确认靶标信号与噪声的比高于阈值水平，从而允许清楚地区分特定背景信号和非特定背景信号。
检测MAGEA4可以可选地或另外地包括确定MAGEA4在样品中的表达水平。MAGEA4的水平可定量或半定量确定。如果样品中MAGEA4的水平升高或过表达，则可确定对象适合治疗或选择该对象进行治疗。在某些情况下，相对于对照确定MAGEA4的水平。
最终，将由具有IHC程序经验的合格病理学家来进行对患者的治疗资格的确定。
在本发明的方法中使用的样品可以是细胞系，其可以是人类的。可替代地，并且优选地，它是来自对象的组织样品，该对象可以是人类。该样品可以是人肿瘤组织样品。
如本文所使用的，术语“样品”包含从对象获得的多种样品类型，并且可用于诊断或监测测定中。样品可以是健康组织、患病组织或被怀疑是患病组织的组织。样品可以是例如在外科手术期间进行的活检样品。可通过细针吸取、刮擦或洗涤腔体以从中收集细胞或组织来收集样品。样品可以是肿瘤，诸如实体瘤和造血肿瘤以及邻近的健康组织。样品可以是单个细胞的涂片或组织切片。该术语包含生物学来源的血液和其他液体样品、固体组织样品，诸如活检标本或组织培养物或由其衍生的细胞及其后代。该术语包含在采购后以任何方式处理过的样品，诸如针对某些组分用试剂、增溶或富集进行处理的样品。该术语包含临床样品，并且还包括细胞培养物中的细胞、细胞上清液、细胞裂解物、细胞提取物、细胞匀浆和亚细胞组分，亚细胞组分包含合成的蛋白质、血清、血浆、体液和其他生物流体以及组织样品。生物样品可包含天然不与细胞或组织自然混合的化合物，诸如防腐剂、抗凝剂、缓冲液、固定剂、营养物、抗生素等。在一个实施例中，将样品保存为冷冻样品或甲醛固定或低聚甲醛固定的石蜡包埋(FFPE)组织制剂。例如，样品可包埋在基质中，例如，FFPE块或冷冻样品。可直接制备样品以执行本发明的方法，可替代地，可使用存档的样品(archivedsample)。
在向样品添加抗MAGEA4抗体之前，本发明的方法可另外地包括一个或更多个预处理步骤。
预处理可包括在向样品添加抗MAGEA4抗体之前表位修复或暴露的步骤。用福尔马林固定组织导致醛与存在于组织中的氨基之间形成共价键。这些键的形成使蛋白质变性，并可能导致抗原性丧失。此外，甲醛可形成使组织蛋白质交联的亚甲基桥，从而减少了组织对诸如抗体的大分子的渗透。使用pH和温度的组合来消除这些键，能使蛋白质分子复性并增加抗体的可及性。通常，这些变化导致抗体结合的显着增加，并改善信噪比。通常，适合于表位修复的任何缓冲液-尤其是Ventana/Roche提供的缓冲液，适合于此步骤。用于该表位修复或暴露的步骤的缓冲液可基于EDTA(pH8至pH9)或基于柠檬酸(pH6)。发明人发现，与柠檬酸缓冲液相比，基于EDTA的缓冲液具有更好的细胞外观。合适的缓冲液可包含10mM Tris碱、1mM EDTA、0.05％Tween 20、pH 8.0；这样的缓冲液可商购获得，例如由VentanaMedical Systems提供的细胞调节液1(产品代码950-124)。只要在形态学外观与组织破坏之间达到适当的平衡，执行此步骤的时间和温度就可以改变。较高的温度通常需要较短的孵育时间，而较低的温度通常需要较长的孵育时间。表位修复步骤的温度可以是80℃至110℃、90℃至100℃、92℃至108℃、94℃、95℃或96℃。表位修复步骤的持续时间可以是10分钟至30分钟、12分钟至28分钟、13分钟至27分钟、14分钟至26分钟、15分钟至25分钟、16分钟至24分钟、17分钟至23分钟、18分钟至22分钟、18分钟、19分钟、20分钟、21分钟或22分钟。优选的表位修复步骤在95℃下执行20分钟，优选的缓冲液是由Ventana Medical Systems提供的细胞调节液1(产品代码950-124)。
可选地，还可在表位修复步骤中添加诸如蛋白酶的酶。所使用的蛋白酶可以是任何合适的蛋白酶，包括丝氨酸蛋白酶、金属蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶。所使用的蛋白酶可选自由胰蛋白酶(例如，来自牛科动物)、胰凝乳蛋白酶(例如，来自牛科动物)、蛋白内切酶Asp-N(例如，来自脆弱假单胞菌(Pseudomonas fragi))、蛋白内切酶Arg-C(例如，来自小鼠颌下腺和溶组织梭菌)、蛋白内切酶Glu-C(例如，来自金黄色酿脓葡萄球菌)，蛋白内切酶Lys-C(例如，来自产酶溶杆菌(Lysobacter enzymogenes))、胃蛋白酶(例如，来自猪)、嗜热菌蛋白酶(例如，来自热解芽孢杆菌(Bacillus thermoproteolyticus))、弹性蛋白酶、木瓜蛋白酶(例如，来自番木瓜)、蛋白酶K(例如，来自白色念球菌)、枯草杆菌蛋白酶(例如，来自枯草芽孢杆菌)、蛋白酶K、弗林蛋白酶(furin)和无花果蛋白酶(ficin)组成的组。
本发明的方法可选地包括以下预处理步骤中的一个或多个，并且优选地包括所有以下预处理步骤，特别是在样品是组织样品的情况下。
可用试剂处理样品以抑制内源性过氧化物酶活性。内源性过氧化物酶与过氧化氢反应以还原3,3’-二氨基联苯胺(DAB)底物或其他过氧化物酶底物，从而导致组织的非特异性染色。抑制内源性过氧化物酶活性的最常见方法是在过氧化氢的溶液中孵育样品。过氧化氢的合适浓度可以为3％v/v，可替代地，例如如果在较高浓度下组织损伤明显，则可使用0.3％溶液。可使用甲醇、PBS、蒸馏水或盐水稀释过氧化氢。在样品是肿瘤样品并且在发色检测包含HRP标记的抗体的情况下，该步骤是特别优选的。可在表位修复之前或之后或者在一抗孵育步骤之前和之后执行内源性过氧化物酶的抑制。在优选实施例中，在表位修复步骤(如果存在的话)之后抑制内源性过氧化物酶。在另一优选的实施例中，抑制剂包含3％的过氧化氢，并从商业供应商获得。抑制剂可以是由Ventana Medical Systems提供的UltraView Universal DAB抑制剂(产品代码253-4291)。样品可在室温下暴露于DAB抑制剂至少5分钟、6分钟、7分钟、8分钟、9分钟、10分钟或11分钟，以确保充分抑制。优选在室温下进行至少8分钟。该预处理步骤可能长达60分钟或长达15分钟，优选8-15分钟。本发明的方法还可包括在封闭试剂中孵育的步骤。该步骤可以减少背景信号，并且在样品是细胞系的情况下可以是可选的。原则上，不特异性结合靶抗原或本发明方法中使用的抗体的任何蛋白质以及测定中的其他检测试剂都可用于封闭。然而，实际上，某些蛋白质的性能要优于其他蛋白质，因为它们易于在中性pH下与非特异性位点(也称为反应位点)结合或使其他测定组分的功能稳定。封闭试剂的示例包括诸如山羊血清的正常血清和/或诸如白蛋白、明胶、酪蛋白或奶粉的蛋白质。有各种各样的商业阻塞缓冲液可用。在优选的实施例中，封闭缓冲液包含山羊球蛋白和酪蛋白。例如，含有高达20％的山羊球蛋白和酪蛋白的100mM磷酸盐缓冲液。优选的商购封闭试剂是由Ventana Medical Systems提供的带有酪蛋白的抗体稀释剂(产品代码760-219)。IHC的封闭步骤优选在完成所有其他样品预处理步骤之后，并在将样品与一抗孵育之前执行。与封闭试剂的孵育可在36℃下进行7分钟至20分钟、8分钟至16分钟、9分钟至15分钟、10分钟至14分钟、11分钟至13分钟、11分钟、12分钟或13分钟。与封闭试剂的孵育可在33℃至39℃、34℃至38℃、35℃至37℃、35℃、36℃或37℃下进行任何上述时间。发明人发现，在36℃下进行12分钟提供了最佳结果。然而，时间和温度可以变化。例如，如果使用较低的温度，则孵育时间可能较长。例如，与封闭试剂的孵育可在4℃下进行过夜。同样，如果使用较高的温度，则孵育时间可能较短。
如上所述，样品可保存为甲醛固定或低聚甲醛固定的石蜡包埋(FFPE)组织制剂。在这种情况下，本发明的方法将在脱石蜡的样品上进行或包括脱石蜡的初始步骤。用于脱石蜡的合适条件对本领域技术人员而言是已知的。
可通过溶剂交换除去石蜡，例如，将样品暴露于石蜡溶剂(诸如，二甲苯、甲苯或柠檬烯)中，然后用酒精除去溶剂，并通过依次降低酒精浓度的酒精/水混合物除去酒精，直到最终组织再次被水或水溶液浸润。样品被水浸润允许水溶性化学和免疫化学染料对细胞成分进行染色。
可用如下毒性小的非极性有机溶剂替代诸如二甲苯和甲苯的毒性石蜡溶剂，该毒性小的非极性有机溶剂诸如萜烯油(例如AmeriClearTM，Baxter Healthcare Diagnostics，McGaw Park，IL)、异链烷烃烃类(诸如，来自Micron Diagnostics of Fairfax的MicroClearTM、VA和Histolene)、作为96％d-柠檬烯的dewaxer(Fronine Pty Ltd,Riverstone,New South Wales,Australia)。可使用自动化方法。例如，Ventana MedicalSystems的第6544798号美国专利描述了一种仅使用具有表面活性剂的热水从组织切片中除去石蜡的自动化方法。该过程依靠通过利用液化石蜡和热水的不混溶性将液化石蜡与组织进行物理分离。该过程广泛用在
Figure BDA0002671931310000081
系列的自动组织染色机上。从第6649368号美国专利已知一种基于水和乳化表面活性剂的相关方法。US6632598(Zhang等人)描述了用于使石蜡包埋的组织脱石蜡的方法和组合物。该方法包括在进行组织化学分析之前使石蜡包埋的样本与脱蜡组合物接触以溶解浸渍样本的蜡。脱蜡组合物具体包括：选自由芳香烃、萜烯和异链烷烃烃类组成的组的石蜡溶解有机溶剂；极性有机溶剂；和用于溶解与样本相关的蜡的表面活性剂。组合物还可包含水。
优选的脱石蜡步骤包括将样品加热至60℃保持30分钟以熔化蜡，随后将样品在合适的除垢剂水溶液中在69℃下孵育3个循环，每个循环8分钟。合适的商购缓冲液是由Ventana Medical Systems提供的EZ-Prep(产品代码950-102)。用于初始加热的通常温度范围是50℃至70℃，用于与反应缓冲液孵育的通常温度范围是68℃至71℃。低于此温度范围处理样品可能会导致蜡残留在样品中，并且表位进入无效，而高于此范围的温度可能会导致组织破坏。此外，循环数可增加(至例如4、5或6)或减少(至例如1或2)。循环的增加可包括循环的长度的减少(至例如3分钟、4分钟、5分钟、6分钟或7分钟)。循环的减少可包括循环的长度的增加(至例如9分钟、10分钟、11分钟、12分钟或13分钟)。
本发明的优选方法包括以下步骤：
例如通过将样品加热至60℃保持30分钟并随后将样品在诸如EZ-Prep溶液的反应缓冲液中在69℃下孵育3个循环，每个循环8分钟，来对样品进行脱石蜡；
例如通过将样品在细胞调节液1中在95℃下孵育20分钟来修复表位；
例如通过将样品在DAB抑制剂中在室温下孵育8分钟来抑制内源性过氧化物酶活性；
将样品在封闭试剂中在36℃下孵育，可选地孵育12分钟；
以10μg/ml的浓度向样品添加抗体OFI1F9；
将抗体和样品在36℃下孵育32分钟；以及
检测与样品结合的抗体。
可按照制造商的说明使用ultraView检测试剂盒进行抗体检测。
可使用自动染色系统执行根据本发明的IHC。优选地，自动染色系统是VentanaBenchMark ULTRA。可替代的载玻片染色系统包括Ventana BenchMark GX、VentanaBenchMark GT、Dako Autostainer Link 48、Dako Omnis、Leica BOND-III和Leica BOND-MAX。
本发明的方法可单独使用或可以与其他测定组合使用，包括但不限于其他形态学染色，原位杂交、qRT-PCT、ELISA、免疫印迹、蛋白质组学、FACS。
本发明的方法可作为用于确定肿瘤样品中MAGEA4蛋白的存在的诊断试剂盒的一部分而提供。优选地，该试剂盒用于确定患者进行靶向MAGEA4疗法的资格。该试剂盒可包括抗MAGEA4抗体以及可选地与实施本发明的方法所必需的试剂。
该试剂盒可适用于即时护理体外诊断测试。它可能是用于基于实验室的测试的试剂盒。该试剂盒可包括使用说明书，诸如例如说明书或传单。说明可包括用于执行本发明的方法的方案。说明可包括用于执行IHC测定的方案。其可描述用于使测试适应不同类型样品的方法和建议。说明可提供方法和建议，以优化从测试中获得的结果，诸如使信噪比最小化。
本发明的方法特别适合用作伴随诊断以鉴别有资格进行靶向MAGEA4疗法的患者。因此，另一方面，本发明提供了一种治疗有需要的人或哺乳动物对象的方法-有利地包括提供涉及MAGEA4靶向疗法的个体化或个性化治疗，该方法包括：
通过以2μg/ml至20μg/ml的浓度范围向样品添加抗MAGEA4抗体来检测来自对象的样品中的MAGEA4；孵育抗体和样品；以及检测与样品结合的抗体；
其中，如果在样品中检测到MAGEA4，则对对象施用靶向MAGEA4疗法。
这样的疗法包括可溶性生物剂、细胞疗法和疫苗。合适的疗法是双特异性分子，该双特异性分子包含与来自MAGEA4的HLA限制性表位具有高亲和力的、融合至T细胞重定向抗CD3抗体片段的可溶性工程化T细胞受体。WO2017175006中描述了这样的双特异性分子的优选示例。其他MAGEA4靶向疗法的示例包括但不限于由Adaptimmune(WO2017174824，临床试验编号：NCT03132922)、Immmatics(WO2017158103)、Adicet Bio(WO2016199141)和TakaraBio(临床试验编号：NCT02096614)开发的疗法。
该方法可用于治疗具有已知表达MAGEA4的任何肿瘤类型的患者，优选肺癌(包括NSCLC)、食道癌、头颈癌或尿路上皮/膀胱癌以及黑素瘤。其他肿瘤类型包括胃癌、卵巢癌、结直肠癌和肾癌。
本发明的每个方面的优选特征可在本发明的每个其他方面上加以必要的修改。本文引用的现有技术文献在法律允许的最大范围内通过引用而并入。
附图说明
现在将在以下的非限制性实施例中进一步描述本发明。参考附图，其中：
图1示出了根据本发明从肺癌、食道癌、头颈癌和膀胱癌(分别为A至D)获得的样品的代表性染色。
图2示出了对照样品(分别为睾丸和卵巢)的染色。
图3示出了针对四种不同肿瘤(A至D)的最佳抗体浓度与非最佳抗体浓度(分别为10μg/ml和1.25μg/ml)之间的染色比较。
具体实施方式
实施例1-用于检测肿瘤样品中的MAGEA4的IHC诊断测定
1.1制备福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)组织样品
将组织样品切成约5mm的切片，并在等于组织体积的20倍的最小体积的10％NBF中固定24小时(范围为16h至36h)。组织标本的尺寸之一中，深度不超过5mm(例如，10mm×10mm×5mm)，以允许有效地灌注福尔马林。如果样品较大(例如10mm×10mm×10mm)，则将其切成两片(或更多)，以使针对每个样品而言，尺寸之一为5mm或更小(例如，切成2个样品，每个为10mm×10mm×5mm)。24小时后，从福尔马林中取出组织，在70％乙醇中洗涤一次，并将其置于标记的组织盒中。将样品盒加载到组织处理器中，并使用延迟启动功能通过3蜡罐程序(3wax tank program)进行处理(程序：室温2×1h，75％乙醇；室温2×1h，90％乙醇；2×1h，室温，100％乙醇；3×1h，室温，二甲苯；3×80min，60℃，蜡)。
在程序完成时，将样品盒从组织处理器中取出，然后以适当的方向(FFPE格式)嵌入石蜡中。当完全固化并冷却时，将蜡块储存在4℃下。
在使用存档的FFPE样品进行染色测定的情况下，优选对样品进行质量检查(QC)以确认样品已被适当固定并减少假阴性。可使用抗PTEN抗体进行QC检查。
1.2染色测定
根据以下方案，使用Ventana BenchMark ULTRA自动IHC/ISH载玻片染色系统(美国Ventana Medical Systems Inc.)进行测定。
测定试剂
-一抗，小鼠单克隆抗MAGEA4抗体(克隆OTI1F9，Origene Cat#TA505362)，在封闭试剂中稀释至10μg/ml(范围为4μg/ml至10μg/ml)的浓度
-EZ-Prep溶液(Ventana，Cat#950-102)[除垢剂水溶液]
-细胞调节液1(Ventana，Cat#950-124)(Tris-EDTA缓冲液，pH8至pH9)
-封闭试剂，具有酪蛋白的稀释剂(Ventana，Cat#760-219)(100mM磷酸盐缓冲液，其具有<20mM的蛋白质(酪蛋白和山羊球蛋白)，<50mM的盐，<15mM的EDTA，brij除垢剂和防腐剂(0.05％ProClin 300))
-UltraView通用DAB检测试剂盒(Ventana，Cat#760-500)，其包含HRP多聚体-HRP标记的抗体(山羊抗小鼠IgG和IgM加山羊抗兔)的混合物(<50μg/ml)；3,3’-二氨基联苯胺四盐酸盐(DAB)色原(0.2％)；过氧化氢(0.04％)的磷酸盐缓冲液；硫酸铜(5g/L)的乙酸缓冲液。
方案
将载玻片在60℃烘烤30分钟。通过将载玻片在反应缓冲液中在69℃下孵育3个循环，每个循环8分钟，来进行脱石蜡。然后，在细胞调节液1中于95℃执行表位修复20分钟。随后，将载玻片在DAB抑制剂(ultraView检测试剂盒的组分)中于室温下孵育8分钟，然后，在封闭试剂中于36℃下孵育12分钟。以每张载玻片约100μl的量自动分配一抗，并将载玻片在36℃下孵育32分钟。按照制造商的说明使用ultraView检测试剂盒进行抗体检测。将载玻片在HRP-多聚体中于36℃下孵育20分钟。
1.3载玻片可视化
染色程序完成后，将载玻片在洗涤缓冲液中短暂洗涤，并用蒸馏水冲洗以除去残留的油。随后，将载玻片脱水(1×3分钟，70％乙醇；3×3分钟，100％乙醇；2×5分钟，100％二甲苯)，并将其安装在CTM6自动盖玻片仪器上并盖上DPX盖玻片。将载玻片在通风橱中风干过夜。
在3DHistech Pannoramic250扫描仪上以40倍的放大倍率对载玻片进行数字成像，每周校准一次以获取白平衡。
阳性染色表明样品中存在MAGEA4。
1.4结果
如上所述制备人肿瘤组织切片并进行染色。使用标准方法通过qRT-PCT确定每个FFPE样品中的MAGEA4表达，并将其计算为每100ng RNA的转录本数量。
图1示出了从肺癌、食道癌、头颈癌和膀胱癌(分别为A到D)获得的样品的代表性染色。在每种情况下，使用10μg/ml的抗体浓度进行染色。对于每种肿瘤类型，染色强度显示与RNA水平(RNA高、中或低/无)相关。
作为测定的对照，从睾丸(MAGEA4阳性)和卵巢(MAGEA4阴性)获得健康的人体组织样品，并使用相同的程序进行染色。在每种情况下，从3名单独的供体获得样品。
图2示出了睾丸样品的强烈染色，而来自卵巢的样品未染色。
比较实施例1
除了一抗的浓度低于最佳范围之外，使用相同的程序对实施例1中使用的人肿瘤样品进行染色。
图3示出了针对四种不同肿瘤(A至D)的最佳和非最佳抗体浓度(分别为10μg/ml和1.25μg/ml)之间的染色比较。
该实施例证实降低一抗的浓度导致次佳染色。这可能会导致假阴性结果，尤其是在MAGEA4含量较低的样品中。

Claims (20)

1.检测样品中的MAGEA4的方法，所述方法包括：
以2μg/ml至20μg/ml范围的浓度向所述样品添加抗MAGEA4抗体；
孵育所述抗体和所述样品；以及
检测与所述样品结合的抗体，其中，所述抗体为OTI1F9。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述抗体的浓度为4μg/ml至15μg/ml，4μg/ml至10μg/ml、5μg/ml至13μg/ml、6μg/ml至12μg/ml或7μg/ml至11μg/ml。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述抗MAGEA4抗体的浓度为10μg/ml。
4.根据任一前述权利要求所述的方法，其特征在于，将所述样品和所述抗MAGEA4抗体在33℃至39℃、34℃至38℃、35℃至37℃、35℃、36℃或37℃下孵育30分钟至60分钟、25分钟至50分钟、25分钟至39分钟、27分钟至35分钟、28分钟至34分钟、30分钟至33分钟、31分钟、32分钟或33分钟。
5.根据任一前述权利要求所述的方法，其特征在于，将所述样品和所述抗MAGEA4抗体在36℃下孵育32分钟。
6.根据任一前述权利要求所述的方法，其特征在于，通过二抗间接地检测与所述样品结合的抗MAGEA4抗体，所述二抗与所述抗MAGEA4抗体结合。
7.根据任一前述权利要求所述的方法，其特征在于，使所述二抗与辣根过氧化物酶缀合。
8.根据任一前述权利要求所述的方法，其特征在于，还包括在向所述样品添加所述抗MAGEA4抗体之前进行表位修复步骤。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述表位修复步骤的温度为80℃至110℃、90℃至100℃或92℃至108℃，和/或所述表位修复步骤的持续时间为10分钟至30分钟、12分钟至28分钟、13分钟至27分钟、14分钟至26分钟、15分钟至25分钟、16分钟至24分钟、17分钟至23分钟、18分钟至22分钟。
10.根据权利要求8或权利要求9所述的方法，其特征在于，所述表位修复步骤在95℃下执行20分钟。
11.根据任一前述权利要求所述的方法，其特征在于，还包括可选地通过使所述样品与DAB(3,3’-二氨基联苯胺)接触来抑制所述样品中的内源性过氧化物酶活性。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，使所述样品与所述DAB抑制剂在室温下接触至少5分钟、6分钟、7分钟、8分钟、9分钟、10分钟或11分钟，优选地，接触至少8分钟。
13.根据任一前述权利要求所述的方法，其特征在于，还包括可选地在抑制内源性过氧化物酶活性之后，使所述样品接触封闭试剂的步骤。
14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，使所述样品与所述封闭试剂接触8分钟至16分钟、9分钟至15分钟、10分钟至14分钟或11分钟至13分钟和/或在33℃至39℃、34℃至38℃、35℃至37℃下接触。
15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，使所述样品与所述封闭试剂在36℃下接触12分钟。
16.根据任一前述权利要求所述的方法，其特征在于，所述样品嵌在石蜡中。
17.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，还包括脱石蜡的步骤。
18.根据权利要求17所述的方法，其特征在于，所述脱石蜡的步骤包括将所述样品在反应缓冲液中在69℃下孵育3个循环，每个循环为8分钟。
19.根据任一前述权利要求所述的方法，其特征在于，所述方法包括：
可选地通过将所述样品在诸如EZ-Prep溶液的反应缓冲液中对所述样品进行脱石蜡，可选地在69℃下孵育3个循环，每个循环为8分钟；
可选地通过将所述样品在细胞调节液1中在95℃下孵育20分钟来修复表位；
可选地通过将所述样品在DAB抑制剂中在室温下孵育8分钟来抑制内源性过氧化物酶活性；
将所述样品在封闭试剂中孵育，可选地在36℃下孵育12分钟；
以10μg/ml的浓度向所述样品添加抗体OFI1F9；
将所述抗体和所述样品在36℃下孵育32分钟；以及
检测与所述样品结合的抗体。
20.用于检测样品中的MAGEA4的试剂盒，所述试剂盒包括抗MAGEA4抗体以及实施权利要求1至19中任一项所述的方法所必需的试剂。
CN201980018008.1A 2018-03-08 2019-03-07 检测magea4的方法 Pending CN111954816A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB1803750.7 2018-03-08
GBGB1803750.7A GB201803750D0 (en) 2018-03-08 2018-03-08 Method
PCT/GB2019/050640 WO2019171064A1 (en) 2018-03-08 2019-03-07 A method of detecting magea4

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN111954816A true CN111954816A (zh) 2020-11-17

Family

ID=61972925

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201980018008.1A Pending CN111954816A (zh) 2018-03-08 2019-03-07 检测magea4的方法

Country Status (11)

Country Link
US (1) US20200400674A1 (zh)
EP (1) EP3762726A1 (zh)
JP (1) JP2021517242A (zh)
KR (1) KR20200128689A (zh)
CN (1) CN111954816A (zh)
AU (1) AU2019232382A1 (zh)
CA (1) CA3093179A1 (zh)
GB (1) GB201803750D0 (zh)
IL (1) IL276898A (zh)
MX (1) MX2020009363A (zh)
WO (1) WO2019171064A1 (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2022233285A1 (en) 2021-03-09 2023-10-19 Cdr-Life Ag Mage-a4 peptide-mhc antigen binding proteins
US20240091262A1 (en) 2022-09-14 2024-03-21 Cdr-Life Ag Mage-a4 peptide dual t cell engagers
WO2024163440A1 (en) * 2023-01-31 2024-08-08 Agilent Technologies, Inc. Immunohistochemistry (ihc) mage-a4 scoring protocols and methods for aiding cancer treatments

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101492725A (zh) * 2008-01-22 2009-07-29 上海人类基因组研究中心 Magea4基因的应用
CN103890587A (zh) * 2011-08-31 2014-06-25 昂科赛特公司 用于治疗和诊断癌症的方法和组合物
CN105044348A (zh) * 2015-02-10 2015-11-11 桂林医学院附属医院 一种用于肺癌诊断的sall4免疫组织化学检测试剂盒

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5491224A (en) 1990-09-20 1996-02-13 Bittner; Michael L. Direct label transaminated DNA probe compositions for chromosome identification and methods for their manufacture
US6632598B1 (en) 1994-03-11 2003-10-14 Biogenex Laboratories Deparaffinization compositions and methods for their use
US6649368B1 (en) 1997-10-24 2003-11-18 Cell Marque Corporation Composition and method for treating tissue samples
US6544798B1 (en) 1999-02-26 2003-04-08 Ventana Medical Systems, Inc. Removal of embedding media from biological samples and cell conditioning on automated staining instruments
US20100003704A1 (en) * 2008-06-13 2010-01-07 Shuling Cheng IN SITU detection of early stages and late stages HPV infection
JP6168497B2 (ja) * 2012-03-30 2017-07-26 国立大学法人 岡山大学 抗体検出用試薬の製造方法、及びその用途
KR20140092422A (ko) * 2012-12-20 2014-07-24 충북대학교 산학협력단 Ｓ１００ａ９ 및 ｅｇｆｒ에 대한 저해제와 시스플라틴을 유효성분으로 포함하는 근육 침윤성 방광암의 치료용 약학적 조성물
NL2014935B1 (en) 2015-06-08 2017-02-03 Applied Immune Tech Ltd T cell receptor like antibodies having fine specificity.
GB201604492D0 (en) 2016-03-16 2016-04-27 Immatics Biotechnologies Gmbh Transfected t-cells and t-cell receptors for use in immunotherapy against cancers
RS62623B1 (sr) 2016-04-08 2021-12-31 Adaptimmune Ltd Receptori t-ćelija
RS63371B1 (sr) 2016-04-08 2022-08-31 Immunocore Ltd T ćelijski receptori
EP3443126B1 (en) * 2016-04-15 2023-11-15 Icahn School of Medicine at Mount Sinai Tissue profiling using multiplexed immunohistochemical consecutive staining

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101492725A (zh) * 2008-01-22 2009-07-29 上海人类基因组研究中心 Magea4基因的应用
CN103890587A (zh) * 2011-08-31 2014-06-25 昂科赛特公司 用于治疗和诊断癌症的方法和组合物
CN105044348A (zh) * 2015-02-10 2015-11-11 桂林医学院附属医院 一种用于肺癌诊断的sall4免疫组织化学检测试剂盒

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ORIGENE: "Truemab:"MAGEA4 mouse monoclonal，clone OTI1F9(formerly 1F9)（TA505362）", XP055594459, pages 1 - 3 *
张潇: "MAGE-A4在人脑胶质瘤中的表达及临床意义", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》, no. 9, 15 September 2014 (2014-09-15), pages 072 - 512 *
耿凛 等: "(MAGE-A1、A2、A3、A4在膀胱移行细胞癌组织及细胞株中基因表达的研究", 《生物磁学》, vol. 5, no. 3, 31 December 2005 (2005-12-31), pages 11 - 13 *
耿凛 等: "MAGE－A1‚A2‚A3‚A4在膀胱移行细胞癌组织及 细胞株中基因表达的研究 ●", 《生物磁学》, vol. 5, no. 3, pages 11 - 13 *

Also Published As

Publication number Publication date
CA3093179A1 (en) 2019-09-12
GB201803750D0 (en) 2018-04-25
WO2019171064A1 (en) 2019-09-12
IL276898A (en) 2020-10-29
MX2020009363A (es) 2020-10-14
JP2021517242A (ja) 2021-07-15
AU2019232382A1 (en) 2020-10-08
US20200400674A1 (en) 2020-12-24
KR20200128689A (ko) 2020-11-16
EP3762726A1 (en) 2021-01-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Ramos-Vara et al. When tissue antigens and antibodies get along: revisiting the technical aspects of immunohistochemistry—the red, brown, and blue technique
Sanderson et al. 19—Immunohistochemical and immunofluorescent techniques
CN110337588B (zh) 用于定量免疫组织化学的方法和系统
Jackson et al. Immunohistochemical techniques
RU2538022C2 (ru) Способ и аппарат для процесса восстановления антигена
CN103328979B (zh) 组合的组织学染色
US20020173053A1 (en) Multiple simultaneous antigen detection by immunohistochemistry
Hussaini et al. Immunohistochemistry and immunofluorescence
CN111954816A (zh) 检测magea4的方法
WO2010033597A2 (en) Methods for detecting overexpression of sparc and therapeutic and diagnostic methods relating to same
Jackson et al. Quality assurance in immunochemistry
WO2014100220A2 (en) Antibody cocktail systems and methods for classification of histologic subtypes in lung cancer
CN111819443A (zh) 从固定化细胞或ffpe组织切片脱离增强抗原性的细胞核的方法以及用于该方法的抗原活化剂及试剂盒
US9234892B2 (en) Multiple epitope detection in an FFPE tissue section
CN111363789B (zh) 一种同时检测蛋白质和rna的试剂盒和方法
WO2016174185A1 (en) Multiplex immunohistochemical panel for the identification of metastatic carcinoma in cytology fluid specimens
Hayat Factors affecting antigen retrieval
US20210048432A1 (en) Direct immunohistochemistry and immunocytochemistry methods
US10280445B2 (en) Chromogen layering for color generation
Cardoso et al. Immunofluorescence techniques in cell cycle studies
WO2013116537A1 (en) A method to distinguish benign from malignant oncocytic cell tissue
EP1387173A1 (en) Method for improved diagnosis of cervical lesions based on detection of INK4a gene products
Yigzaw et al. Review of Immunohistochemistry Techniques: Applications, Current Status, and Future Perspectives
US20070134742A1 (en) Diagnostic reagent for uterine adenocarcinoma and method of detecting adenocarcinoma cells
Leonardo et al. Pitfalls in Immunocytochemistry

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination