CN111819443A - 从固定化细胞或ffpe组织切片脱离增强抗原性的细胞核的方法以及用于该方法的抗原活化剂及试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明提供用于使用Ki‑67抗体检测含Ki‑67蛋白质阳性细胞核的细胞的数的预处理方法、该检测方法、该检测方法中使用的试剂盒、及使用该方法的治疗方案选定。探讨由不旨在Ki‑67抗原的活化的酶的活化，用不识别MIB‑1的表位的酶(稀有切点酶)预处理试样，则含细胞角蛋白的其他抗原的抗原性也增强的同时，增强Ki‑67抗原的抗原活化。结果，从FFPE切片增强抗原性的状态下使细胞核脱离，以存在于该核的Ki‑67蛋白质作为目标，通过使荧光标记的抗体反应，完成客观性、再现性、普遍性更高的Ki‑67阳性细胞的定量方法。

Description

从固定化细胞或FFPE组织切片脱离增强抗原性的细胞核的方 法以及用于该方法的抗原活化剂及试剂盒
【技术领域】
本发明涉及用于使用Ki-67抗体检测含Ki-67蛋白质阳性细胞核的细胞的预处理方法、该细胞的检测方法、在该预处理方法或检测方法中使用的试剂盒、及使用该检测方法的治疗方案选定。
【背景技术】
外科除去的组织的福尔马林固定是用于保存癌组织样品的世界上最一般的方法，是标准的病理技法。保存组织的最一般的方法是将组织整体长时间(8小时～48小时)浸到福尔马林水溶液中，接下来，为了将固定的组织整体于室温的长期保存而在石蜡中包埋。这样，用于对福尔马林固定癌组织进行分析的分子分析法是例如，为了癌患者组织的分析而最多利用的方法。
作为使用福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)组织的诊断技术之一的免疫组织染色法是通过将组织薄切而贴附在载玻片之后，使存在于病理切片组织或细胞的表面的生物体物质和识别所述生物体物质的物质的抗原抗体反应可视化，判断在病理切片组织或细胞的表面的目的生物体物质的存在的方法。
例如，在乳腺癌组织中有表达的人上皮生长因子受体(HER2)或雌激素受体(ER)、黄体酮受体(PgR)由于在治疗法的效果之间有关联性，称为效果预测因子，在临床中应用(非专利文献1)。
一方面，将该因子的有无和预后相关的因子称为预后因子。Ki-67现在也被认为是预后因子。在效果预测因子的检测中，多用主要肿瘤组织样品的免疫组织化学方法(IHC法)。使用考虑肿瘤细胞的染色强度和被染色的细胞的比率的两方的方法(All red Score等)或不评价染色强度而用仅被染色的肿瘤细胞的比率判断的方法(J-Score等)之任一者。
在HER2的情况中，一般用IHC法检查，在结果是0或1+的情况中是阴性，在结果是3+的情况中是阳性、在结果是2+的情况中由FISH法(Fluorescence in situ hybridization)研究扩增的有无，有扩增就判断为阳性、没有就判断为阴性。
在ER的情况中，在All red Score中3～8是阳性，另一方面，在用染色细胞的比率判断时，将10％设为截止值的情况多，但在存在1％时，也有要判断为ER阳性这样的意见。
在Ki-67的情况中，还有用组织整体算出阳性比例的方法、选择称为阳性细胞集合的热点的区域而算出的方法等。
不管怎样，当设定一定的截止值时，在这些效果预测因子被判断为阳性时，成为有效的治疗方案的指针。
由上述效果预测因子及预后因子的表达，乳腺癌分类为各种各样的亚型。
(1)LuminalA(样)类型：ER·PgR阳性、HER2阴性、Ki-67低值(＜14～20％)
(2)LuminalB(样)类型(HER2阴性)：ER·PgR阳性、HER2阴性、Ki-67高值(≥14～20％)
(3)LuminalB(样)类型(HER2阳性)：ER·PgR阳性、HER2阳性
(4)非Luminal类型：ER·PgR阴性、HER2阳性
(5)三重阴性型：ER阴性、PgR阴性、HER2阴性
这些分类还影响治疗方案的选定，在例如判断为Ki-67低值的LuminalA(样)类型时，主要选择单独的内分泌疗法，一方面，在判断为作为Ki-67高值的LuminalB(样)类型(HER2阴性)时，主要选择内分泌疗法和化学疗法的联用(非专利文献6、10～12)。
但是，免疫组织染色法将上述判断用由显微镜的目测判断进行，由于计数也是手动实施，即使是有经验的病理医，也需要时间和劳力。
Ki-67(MKI67)是核内蛋白质，是一般使用的细胞增殖标志物。在增殖性细胞的核小体及核分裂期的染色体上表达的分子，在细胞周期的全部的时期表达，G1期后期起在表达量上呈现变化，在S期发生表达量的增加，在M期变得最大。因此，见到Ki-67表达的细胞不过表示进入到细胞周期。但是，已知用于以Ki-67作为生物标志物之一使用的癌的诊断的试剂及方法(专利文献1～5)、已知为了节约该测定所耗的时间和劳力而用于自动解析细胞的细胞图像自动解析装置及用于自动化组织分析的方法(专利文献6～8)。另外也知，使用开源的软件测量对位于以Ki-67作为开始的核的蛋白质进行免疫染色的细胞的显微镜照片图像的方法，在网站公布(非专利文献2)。这样，尽管也探讨图像诊断技术的导入，但Ki-67的评价方法尚未标准化，每研究各种各样而不恒定(非专利文献3)。
尝试了从作为能长期保存从生物体单离的组织的方法的FFPE组织切片使用酶回收核，免疫荧光染色而用FCM检测，但，由于可从组织脱离核的酶切断蛋白质的多个部位，抗原识别部位被切断的危险性高。根据非专利文献4，报告了例如，在以相同的Ki-67蛋白质作为目标的抗体中，尽管在克隆名：S5中能检测到，在具有不同的抗原识别部位的克隆名：MIB-1中检测是不可能的。
再者，福尔马林固定组织或凝血酶：在(血浆)纤连蛋白固定组织的情况中，MIB-1抗体有发生假阳性或假阴性的结果的可能性(非专利文献9)
但是，由于使用MIB-1的IHC法经长年在临床现场使用，无法使用基于经验选择的抗体的克隆是大的损失。
也考察了从FFPE组织切片提取蛋白质的方法，但不是用于检测处理后的抗原阳性核的存在的方法。另外，提取核酸的试剂盒被实用化，但停留在研究用试剂，无达到实用化阶段的。
【现有技术文献】
【专利文献】
专利文献1：特表平11-509930号公报
专利文献2：特表2003-506716号公报
专利文献3：特开2005-315862号公报
专利文献4：特表2007-524103号公报
专利文献5：特表2009-527740号公报
专利文献6：特开2009-63508号公报
专利文献7：特开2009-122115号公报
专利文献8：特表2009-537822号公报
【非专利文献】
非专利文献1：基于科学根据的乳腺癌治疗指南1.治疗编(日本乳腺癌学会)
非专利文献2：Breast Cancer Research,2010,12:R56http://breast-cancer-resea ch.com/content/12/4/R56
非专利文献3：乳腺癌学会指南(日本乳腺癌学会)http://jbcs.gr.jp/guidline/guideline/g6/g61900/
非专利文献4：Cytometry.1997 Mar 1；27(3):283-9.Multi-parameter flowcytometric analysis with detection of the Ki67-Ag in paraffin embeddedmammary carcinomas。
非专利文献5：Dowsett M,et al.Assessment of Ki67 in breast cancer：recommendations from the International Ki67 in Breast Cancer working group.JNatl Cancer Inst.2011Nov 16；103(22):1656-64。
非专利文献6：Angela Toss,et al.Molecular characterization and targetedtherapeutic approaches in breast cancer.Breast Cancer Res.2015Apr 23；17:60。
非专利文献7：Leers MP,et al.Multi-parameter flow cytometric analysiswith detection of the Ki67-Ag in paraffin embedded mammarycarcinomas.Cytometry.1997 Mar 1；27(3):283-9。
非专利文献8：Polley MY,et al.An international Ki67 reproducibilitystudy.J Natl Cancer Inst.2013 Dec 18；105(24):1897-906。
非专利文献9：Blythe K.Gorman,et al.Comparison of Breast CarcinomaPrognostic/Predictive Biomarkers on Cell Blocks Obtained by Various Methods：Cellient,Formalin and Thrombin.Acta Cytologica 2012；56:289-296。
非专利文献10：基于科学根据的乳腺癌治疗指南2.疫学－诊断编(日本乳腺癌学会)
非专利文献11：A.Goldhirsch1,et al.Personalizing the treatment of womenwith early breast cancer：highlights of the St Gallen International ExpertConsensus on the Primary Therapy of Early Breast Cancer 2013.Annals ofOncology 24：2206-2223,2013。
非专利文献12：A.Goldhirsch,et al.Strategies for subtypes-dealing withthe diversity of breast cancer：highlights of the St Gallen InternationalExpert Consensus on the Primary Therapy of Early Breast Cancer 2011.Annals ofOncology 22：1736-1747,2011。
【发明的概要】
【发明要解决的课题】
如上所述，免疫组织染色法在利用显微镜的目测判断中进行，由于计数也是手动实施，即使使用相同的病理组织切片，也多由病理医判断不同(参照比较例2)。由于Ki-67阳性细胞的存在比(％)(截止值)影响治疗方案的选定，要求更客观性、再现性、普遍性高的Ki-67阳性细胞存在比的定量方法。
如上所述，含病理组织切片的组织试样在癌切除时或活体检查时，优选作为标准的病理技法制作保存，可使用此保存的试样的定量方法。
通常，从FFPE组织以单一的细胞水平进行解析时，有切断担负细胞间的接附的细胞外底物而活化抗原的必要。但是，使用这些酶的消化有切断作为目标的抗原的识别部位的可能性，限制能使用的抗体。因此，除了上述的既有方法以外，细胞分散，或脱离细胞核的方法变得必要。
【用于解决课题的手段】
本申请发明人锐意研究的结果，探讨由不旨在细胞分散或细胞核的脱离的酶的预处理法，当用不识别MIB-1的表位的酶(稀有切点酶)预处理组织或细胞试样时，含细胞角蛋白的其他抗原的抗原性也增强的同时，成功进行Ki-67抗原的活化。结果，从FFPE切片增强抗原性的状态下使细胞核脱离，以存在于该核的Ki-67蛋白质作为目标，通过使其与特异性的抗体反应，完成更客观性、再现性、普遍性高的Ki-67阳性细胞的检测方法。
从而，本发明如以下的[1]～[45]。
[1]使用抗Ki-67抗体检测含固定化的细胞群中的Ki-67阳性细胞核的细胞的方法，其包括：
(1)将固定化的细胞群用不识别切断SEQ ID NO:2的肽的水解酶预处理而使抗原活化的工序、其后
(2)使用抗Ki-67抗体进行染色的工序、及
(3)检测被染色的Ki-67阳性细胞或Ki-67阳性细胞核的工序；
[2][1]所述的方法，其中上述抗体是选自MIB-1、DAKO-PC、Ki-S5及A-0047的至少一种；
[3][1]或[2]所述的方法，其中上述酶是选自凝血酶、Arg-C(梭菌蛋白酶)肽酶、脯氨酸端肽酶及透明质酸酶的至少一种；
[4][1]所述的方法，其中上述酶是凝血酶及/或透明质酸酶，上述抗体是MIB-1；
[5][1]～[4]之任一项所述的方法，其中上述固定化的细胞群用选自福尔马林、戊二醛、醇、丙酮及它们的组合的固定化剂固定；
[6][1]～[5]之任一项所述的方法，其中在工序(1)之前包括由热处理活化；
[7][1]～[6]之任一项所述的方法，其还包括对细胞核特异性地进行染色，检测被染色的细胞核(例如，计数)；
[8][1]～[7]之任一项所述的方法，其还包括使用抗细胞角蛋白抗体而对细胞角蛋白进行染色(例如，荧光染色)，检测被染色的阳性细胞；
[9][1]～[8]之任一项所述的方法，其还包括使用抗雌激素受体(ER)抗体及/或抗黄体酮受体(PgR)抗体而对ER及/或PgR进行染色(例如，荧光染色)，检测被染色的阳性细胞或阳性细胞核(例如，计数)；
[10][1]～[9]之任一项所述的方法，其还包括使用与HER2基因杂交的探针而检测HER2基因被扩增的细胞或细胞核。
[11][1]～[10]之任一项所述的方法，其中上述固定化的细胞群含在组织切片中；
[12][11]所述的方法，其中上述组织切片用包理剂包理，在用上述水解酶活化抗原的工序之前包括除去该包理剂，使该组织切片亲水化的工序；
[13][11]或[12]所述的方法，其中在工序(1)和工序(2)之间包括破碎上述细胞而提取细胞核的工序；
[14][13]所述的方法，其中由用水流、超声波等发生的剪切应力破碎上述细胞而提取细胞核；
[15][13]或[14]所述的方法，其中在含表面活性剂的缓冲液中提取上述细胞核；
[16][15]所述的方法，其中上述表面活性剂是选自CHAPS、NP-40、及Triton-X100的至少一种；
[17][1]～[16]之任一项所述的方法，其中对上述被染色的Ki-67阳性细胞或Ki-67阳性细胞核的数进行计数；
[18][17]所述的方法，其中对上述Ki-67阳性细胞或上述Ki-67阳性细胞核进行荧光染色，使用流式细胞术而进行计数；
[19][1]～[18]之任一项所述的方法，其中上述固定化的细胞或上述组织切片是患者来源；
[20][1]～[18]之任一项所述的方法，其中上述固定化的细胞或上述组织切片是患者的肿瘤组织来源；
[21][20]所述的方法，其中上述固定化的细胞或上述肿瘤组织是乳腺癌细胞或乳腺癌组织；
[22][20]或[21]所述的方法，其用于辅助癌的诊断；
[23][20]或[21]所述的方法，其用于辅助诊断癌治疗的预后；
[24]用于确定癌的治疗方案的方法，其由[20]或[21]所述的方法计算细胞群内的Ki-67阳性细胞的比例，在比例是截止值以上的情况中选择内分泌疗法和化学疗法的联用，在比例是低于截止值的情况中选择单独的内分泌疗法；
[25]治疗癌的方法，其中由[20]或[21]所述的方法计算细胞群内的Ki-67阳性细胞的比例，在比例是截止值以上的情况中选择内分泌疗法和化学疗法的联用，在比例低于截止值的情况中选择单独的内分泌疗法而对患者实施，。
[26]使Ki-67活化的方法，其中将固定化的肿瘤细胞群或肿瘤组织用不识别切断SEQ ID NO:2的肽的水解酶预处理；
[27]在将Ki-67用免疫染色检测的细胞或组织试样中使用的抗原活化剂，其中含不识别切断SEQ ID NO:2的肽的水解酶；
[28][27]所述的抗原活化剂，其中上述酶是选自凝血酶、Arg-C(梭菌蛋白酶)肽酶、脯氨酸端肽酶及透明质酸酶的至少一种；
[29][28]所述的抗原活化剂，其中上述酶是凝血酶及/或透明质酸酶。
[30]在将Ki-67及细胞角蛋白用免疫染色同时检测的细胞或组织试样中使用的抗原活化剂，其中含不识别切断SEQ ID NO:2的肽的水解酶；
[31][27]～[30]之任一项所述的抗原活化剂，其还在对ER及/或PgR进行免疫染色而进行检测的细胞或组织试样中使用；
[32][27]～[31]之任一项所述的抗原活化剂，其还在检测扩增HER2基因的细胞的试样中使用；
[33]用于检测固定化的细胞中的Ki-67阳性细胞的试剂盒，其含：
不识别切断SEQ ID NO:2的肽的水解酶，和
抗Ki-67抗体；
[34][32]所述的试剂盒，其中上述水解酶是选自凝血酶、Arg-C(梭菌蛋白酶)肽酶、脯氨酸端肽酶及透明质酸酶的至少一种；
[35][34]所述的试剂盒，其中上述水解酶是凝血酶及/或透明质酸酶；
[36][33]～[35]之任一项所述的试剂盒，其中上述抗Ki-67抗体是选自MIB-1、DAKO-PC、Ki-S5及A-0047的至少一种；
[37][33]～[36]之任一项所述的试剂盒，其与Ki-67组合而还含用于检测为了辅助癌的诊断或为了辅助诊断癌的治疗的预后而使用的其他标志物的配体；
[38][37]所述的试剂盒，其中上述配体是选自抗细胞角蛋白抗体、抗ER抗体、抗PgR抗体、及与HER2基因杂交的探针的至少一种；
[39][33]～[38]之任一项所述的试剂盒，其中还含核染色用的化合物；
[40][33]～[39]之任一项所述的试剂盒，其中还含用于使细胞分散的缓冲液，该缓冲液含有表面活性剂；
[41][33]～[40]之任一项所述的试剂盒，其中还含热处理用抗原活化剂；
[42][33]～[41]之任一项所述的试剂盒，其用于辅助癌的诊断；
[43][33]～[41]之任一项所述的试剂盒，其用于辅助诊断癌治疗的预后；
[44][33]～[41]之任一项所述的试剂盒，其用于确定癌的治疗方案；
[45]试剂盒，其中上述治疗方案的决定通过计算细胞群内的Ki-67阳性细胞的比例进行，在比例是截止值以上的情况中选择内分泌疗法和化学疗法的联用，在比例低于截止值的情况中选择单独的内分泌疗法；
[46]用于由用水流、超声波等发生的剪切应力破碎固定化的细胞而提取细胞核的试剂盒，其包含含有表面活性剂的细胞分散用缓冲液；
[47]由用水流、超声波等发生的剪切应力破碎固定化的细胞而提取细胞核的方法，其中将该固定化的细胞分散于含有表面活性剂的缓冲液而进行该细胞的破碎；及
[48]使用该抗原的抗体检测固定化的细胞群中的目的抗原存在于细胞核的细胞的方法，其包括：
(1)将该固定化的细胞群用不切断该抗体的抗原识别部位的水解酶预处理而使抗原活化的工序、其后
(2)使用该抗体而对该细胞进行染色的工序、及
(3)检测被染色的抗原阳性细胞或抗原阳性细胞核的工序。
【发明的效果】
由本申请发明确立客观性、再现性、普遍性高的Ki-67阳性细胞的检测(定量)方法。
通过使用由本发明提供的流程(预处理试剂和过程)，达成从FFPE组织切片增强目标抗原的抗原性的细胞核的脱离。回收的分散细胞核能作为单一的细胞核解析。例如，核膜上或核内的蛋白质、核酸等成为检测对象，可由染料(荧光物质、化学发行物质、酶等)的染色，或使用由这些染料修饰的抗体而进行检测。特别是，能由流式细胞术解析迅速地算出脱离核中的对象蛋白质的阳性核的比例(Ki-67阳性率等)。
Ki-67的截止值由于以由病理医的目测判断和计数的工序作为必要，从而有偏差，根据每以往设施而不同。但是，通过使用由本发明提供的流程(预处理试剂和过程)，能提供偏差少的病理诊断的截止值的世界基准。
进而，能使用涉及的截止值而向患者提供QOL高的诊断方案。
【附图的简单的说明】
【图1】对乳腺癌组织的FFPE组织切片实施脱石蜡/亲水化、由热处理的抗原活化，使用水流剪切装置而破碎细胞之后，对回收产物进行免疫荧光染色，进行显微镜观察的镜检图像。左侧显示被DAPI染色的核，右侧显示被DAPI染色的核和被荧光标记的细胞角蛋白(在存在时)，从两者理解，细胞核维持其形状而被回收。
【图2】对福尔马林固定的各肿瘤细胞株(MB231、T47D、SKBR)实施由热处理的抗原活化，进行免疫荧光染色之后，用流式细胞仪进行分析，解析得到的数据而以前方散射作为横轴、以侧方散射作为纵轴显示的散点图。
【图3】以图2的被框包围的区域作为细胞核的区域选通，对于选通级分的数据，以DAPI的荧光强度作为横轴、以细胞(核)数作为纵轴显示的直方图。
【图4】对福尔马林固定的乳腺癌细胞实施由热处理的抗原活化，用抗细胞角蛋白抗体及抗Ki-67抗体或它们的同种型对照抗体进行免疫荧光染色之后，用流式细胞仪进行分析，对于作为细胞核区域选择的选通级分的数据，以荧光强度作为横轴、以细胞(核)数作为纵轴显示的直方图。
【图5】对福尔马林固定的各肿瘤细胞株(MB231、T47D、SKBR)实施由热处理的抗原活化，其后，进行或不进行由凝血酶的抗原活化而用抗Ki-67抗体或其同种型对照抗体进行免疫荧光染色之后，用流式细胞仪进行分析，对于作为细胞核区域选择的选通级分的数据，以荧光强度作为横轴、以细胞(核)数作为纵轴显示的直方图。
【图6】显示由凝血酶处理的有无的各肿瘤细胞株中的Ki-67阳性率的变化的坐标图。
【图7】对福尔马林固定的T47D细胞株实施由热处理的抗原活化，其后用透明质酸酶试剂处理，或者进行或不进行所述处理而用抗Ki-67抗体或其同种型对照抗体进行免疫荧光染色之后，用流式细胞仪进行分析，对于作为细胞核区域选择的选通级分的数据，以荧光强度作为横轴、以细胞(核)数作为纵轴显示的直方图。
【图8】对乳腺癌组织的FFPE组织切片实施脱石蜡/亲水化、由热处理的抗原活化，由水流的细胞的破碎之后，用抗细胞角蛋白抗体及抗Ki-67抗体或它们的同种型对照抗体进行免疫荧光染色，接下来用流式细胞仪进行分析，对于作为细胞核区域选择的选通级分的数据，以荧光强度作为横轴、以细胞(核)数作为纵轴显示的直方图。
【图9A】对乳腺癌组织的FFPE组织切片实施脱石蜡/亲水化、由热处理的抗原活化，进行或不进行由凝血酶的抗原活化而由水流破碎细胞之后，用抗细胞角蛋白抗体及抗Ki-67抗体或它们的同种型对照抗体进行免疫荧光染色，接下来用流式细胞仪进行分析，对于作为细胞核区域选择的选通级分的数据，以荧光强度作为横轴、以细胞(核)数作为纵轴显示的直方图。由此，确认到由凝血酶处理的FFPE组织切片受试体中的细胞角蛋白及Ki-67信号的增强。
【图9B】显示由凝血酶处理的有无的FFPE组织切片中的细胞角蛋白及Ki-67的阳性率的变化的坐标图。
【图10】显示由薄切切片的厚度的细胞角蛋白及Ki-67阳性率的变化的坐标图。
【图11】由本申请发明涉及的方法的Ki-67阳性率和由IHC法的阳性率(平均值)的相关图。
【图12A】对福尔马林固定的各肿瘤细胞株(MB231、T47D、SKBR)实施由热处理的抗原活化之后，用5种消化酶(凝血酶、胰蛋白酶、蛋白酶K、分散酶、脯氨酸端肽酶)的任何进行抗原活化，用抗Ki-67抗体或其同种型对照抗体进行免疫荧光染色，接下来用流式细胞仪进行分析，对于作为细胞核区域选择的选通级分的数据，以荧光强度作为横轴、以细胞(核)数作为纵轴显示的直方图。
【图12B】对福尔马林固定的各肿瘤细胞株(MB231、T47D、SKBR)实施由热处理的抗原活化之后，用5种消化酶(凝血酶、胰蛋白酶、蛋白酶K、分散酶、脯氨酸端肽酶)的任何进行抗原活化，用抗细胞角蛋白抗体或其同种型对照抗体进行免疫荧光染色，接下来用流式细胞仪进行分析，对于作为细胞核区域选择的选通级分的数据，以荧光强度作为横轴、以细胞(核)数作为纵轴显示的直方图。
【图13A】对乳腺癌组织的FFPE组织切片实施脱石蜡/亲水化、由热处理的抗原活化，用5种消化酶(凝血酶、胰蛋白酶、蛋白酶K、分散酶、脯氨酸端肽酶)的任何进行抗原活化，再者用水流破碎细胞之后，用抗Ki-67抗体或其同种型对照抗体进行免疫荧光染色，接下来用流式细胞仪进行分析，对于作为细胞核区域选择的选通级分的数据，以荧光强度作为横轴、以细胞(核)数作为纵轴显示的直方图。
【图13B】对乳腺癌组织的FFPE组织切片实施脱石蜡/亲水化、由热处理的抗原活化，用5种消化酶(凝血酶、胰蛋白酶、蛋白酶K、分散酶、脯氨酸端肽酶)的任何进行抗原活化，再者用水流破碎细胞之后，用抗细胞角蛋白抗体或其同种型对照抗体进行免疫荧光染色，接下来用流式细胞仪进行分析，对于作为细胞核区域选择的选通级分的数据，以荧光强度作为横轴、以细胞(核)数作为纵轴显示的直方图。
【图14】对乳腺癌组织的FFPE组织切片实施脱石蜡/亲水化、由热处理的抗原活化，用凝血酶进行抗原活化，再者由水流破碎细胞之后，用识别部位不同的2种抗Ki-67抗体(MIB-1克隆及S5克隆)之任何及抗细胞角蛋白抗体或它们的同种型对照抗体进行免疫荧光染色，接下来用流式细胞仪进行分析，对于作为细胞核区域选择的选通级分的数据，以荧光强度作为横轴、以细胞(核)数作为纵轴显示的直方图。
【图15】根据公知的方法而对乳腺癌组织的FFPE组织切片实施脱石蜡/亲水化的后，用胰蛋白酶进行抗原活化，用识别部位不同的2种抗Ki-67抗体(MIB-1克隆及S5克隆)之任何及抗细胞角蛋白抗体或它们的同种型对照抗体进行免疫荧光染色，接下来用流式细胞仪进行分析，对于作为细胞核区域选择的选通级分的数据，以荧光强度作为横轴、以细胞(核)数作为纵轴显示的直方图。
【图16】使ER及PgR阳性或阴性变得已知的FFPE组织切片脱石蜡/亲水化、实施由热处理的抗原活化，其后用凝血酶进行抗原活化，再者由水流破碎细胞之后，用抗ER抗体及抗PgR抗体或它们的同种型对照抗体进行免疫荧光染色，接下来用流式细胞仪进行分析，对于作为细胞核区域选择的选通级分的数据，以荧光强度作为横轴、以细胞(核)数作为纵轴显示的直方图。
【图17】对用福尔马林固定化的乳腺癌细胞株MDA-MB-231，使用不同的热处理用抗原活化剂而实施抗原活化，其后用凝血酶进行抗原活化，用抗Ki-67抗体及抗细胞角蛋白抗体或它们的同种型对照抗体进行免疫荧光染色，对于作为细胞核区域选择的选通级分的数据，以荧光强度作为横轴、以细胞(核)数作为纵轴显示的直方图。
【图18】对乳腺癌组织的FFPE组织切片实施脱石蜡/亲水化、由热处理的抗原活化，用凝血酶进行抗原活化，适用4种不同的破碎方法(捣碎器、研钵、超声波破坏、水流破坏和超声波破坏的组合)之任何之后，用抗细胞角蛋白抗体及抗Ki-67抗体或它们的同种型对照抗体进行免疫荧光染色，接下来用流式细胞仪进行分析，对于作为细胞核区域选择的选通级分的数据，以荧光强度作为横轴、以细胞(核)数作为纵轴显示的直方图。
【图19】对福尔马林固定化的2种乳腺癌细胞株SKBr3及MDA-MB-231、以及成淋巴细胞性细胞株Jurkat实施由热处理的抗原活化处理，用凝血酶抗原活化，由超声波破碎细胞之后，对细胞核进行染色，接下来用流式细胞仪进行分析，解析得到的数据而以前方散射作为横轴、以侧方散射作为纵轴显示的散点图。
【图20】对乳腺癌组织的FFPE组织切片实施指定的预处理，凝血酶处理，再者由水流破碎细胞，在含各种表面活性剂的缓冲液中使细胞分散而由超声波破碎细胞之后，对细胞核进行染色，接下来用流式细胞仪进行分析，解析得到的数据而以前方散射作为横轴、以侧方散射作为纵轴显示的散点图。
【图21】由不同的病理医算出的IHC法的乳腺癌组织的FFPE组织切片中的Ki-67阳性率的相关图。
【图22A】对福尔马林固定的各肿瘤细胞株(MB231、T47D、SKBR)实施由热处理的抗原活化，用3种消化酶(凝血酶、蛋白酶K、分散酶)的任何进行抗原活化之后，用抗Ki-67抗体S5克隆(Ki-S5)或其同种型对照抗体进行免疫荧光染色，用流式细胞仪进行分析，对于作为细胞核区域选择的选通级分的数据，以荧光强度作为横轴、以细胞(核)数作为纵轴显示的直方图。
【图22B】对福尔马林固定的各肿瘤细胞株(MB231、T47D、SKBR)实施由热处理的抗原活化，用3种消化酶(凝血酶、蛋白酶K、分散酶)的任何进行抗原活化之后，用抗细胞角蛋白抗体或其同种型对照抗体进行免疫荧光染色，用流式细胞仪进行分析，对于作为细胞核区域选择的选通级分的数据，以荧光强度作为横轴、以细胞(核)数作为纵轴显示的直方图。
【图23】对乳腺癌组织的FFPE组织切片实施脱石蜡/亲水化、由热处理的抗原活化，用凝血酶进行抗原活化，由水流进行细胞的破碎，进一步进行由超声波的细胞的破碎之后，用抗细胞角蛋白抗体及抗Ki-67抗体或它们的同种型对照抗体进行免疫荧光染色，接下来用流式细胞仪进行分析，对于作为细胞核区域选择的选通级分的数据，以荧光强度作为横轴、以细胞(核)数作为纵轴显示的直方图。在此图显示使阳性核判断的阈值变动时的阳性率。
【图24】对已知HER2阳性及阴性的FFPE组织切片实施脱石蜡/亲水化、由热处理的抗原活化之后，用凝血酶进行抗原活化，进行由水流的细胞的破碎，进一步进行由超声波的细胞的破碎之后，使用被荧光标记的DNA探针而将HER2基因由FISH法荧光染色，用荧光显微镜进行观察时的图像。
【定义】
“细胞的固定化”是指将试样浸渍于固定液而使由分子交联或蛋白质不溶化的细胞的形态或组织的结构稳定化。在固定化中使用公知的方法即可，例如，有使用福尔马林液、多聚甲醛液、戊二醛液、四氧化锇液、醋酸醇、甲醇、乙醇、丙酮等的方法。或者，也可由冷冻法固定化。
“Ki-67抗原(MKI67：Marker Of Proliferation Ki-67)”是核内蛋白质的一种，在人的情况中，以SEQ ID NO:1的氨基酸序列(3256氨基酸)表示(UniProtKB-P46013(KI67_HUMAN))。Ki-67是作为原本白血病患者的血液中的自身抗体发现的抗体的名称，在本申请中，在无特别指定的情况中，“Ki-67”是指“Ki-67抗原”蛋白质。从而，“抗Ki-67抗体”是指识别Ki-67抗原的“抗体”。
“抗体”可为完全长(IgG、IgA、IgM、IgD、IgE)免疫球蛋白，也可为含其抗原结合识别区域的片段(所谓的片段抗体(Fab、Fab’、F(ab’)2等))。另外，“抗体”除了人、小鼠、大鼠、山羊、马、骆驼等哺乳动物的之外，还可为来源于鱼类(含鲨)或鸟类(鸡)。
“MIB-1”或“MIB-1抗体”是使Ki-67抗体单克隆化的克隆之一。不特别限定，是从Dako公司或Immunotech公司可商购的。Ki-67中，识别结合由PKEKAQALEDLAGFKELFQT(SEQID NO:2)构成的表位。
“抗Ki-67抗体”是指识别Ki-67，与其结合的抗体，MIB-1之外、MIB-2、MIB-5、MIB-7、MIB-21及MIB-24等的属于MIB(注册商标)家族的抗体、DAKO-PC、Ki-S5、A0047等也可作为“抗Ki-67抗体”使用，此外的市售或临床检查上使用的相同的特性的抗体也可作为“抗Ki-67抗体”使用。抗Ki-67抗体可以Ki-67抗原或其一部分作为抗原使用，由公知的方法调制。在本发明中使用的“抗Ki-67抗体”优选含识别上述表位的抗体。
“凝血酶(Thrombin、第IIa因子)”是血液的凝固涉及的酶(丝氨酸蛋白酶)(EC编号：EC3.4.21.5)。
“不识别切断SEQ ID NO:2的肽的水解酶”是指不识别切断MIB-1抗体的表位的水解酶。
不限于此，可由公知的数据库得知(http://web.expasy.org/peptide_cutter/)、有这样的特性的蛋白分解酶(表1)。另外，某酶是否有这样的特性可使用识别MIB-1、或者相同的表位的其他抗体而分析确认所述酶是否切断所述表位。
为了在细胞内浸润抗体或/及为了细胞核的提取，涉及的酶是细胞外基质的优选可识别切断胶原。不限于此，可举出凝血酶、Arg-C(梭菌蛋白酶)肽酶(EC 3.4.22.8)、脯氨酸端肽酶(EC 3.4.21.26)等。
【表1】
Figure BDA0002653167390000171
胶原α-1(I)：UniProtKB-P02452(COLA1_HUMAN)
Ki-67：SEQ ID NO:1
在本发明的目的中，水解透明质酸酶等的蛋白以外的细胞外底物中的成分的酶也是优选的。透明质酸酶(EC 3.2.1.35)是分解透明质酸的β-1-4键的水解酶，不切断SEQ IDNO:2的肽。由透明质酸酶的此特性促进抗体向细胞内的浸润。作为这样的酶，可举透明质酸酶、糖苷酶(EC 3.2.1)、N-葡聚糖酶(EC 3.5.1.52)等，优选透明质酸酶。
另外，不识别切断上述的SEQ ID NO:2的肽的蛋白酶在不切断SEQ ID NO:2的肽的点与透明质酸酶共同，另一方面，由于两者是完全不同的作用的酶，期待通过组合两者而抗原灭活活性进一步升高。特别是，优选凝血酶和透明质酸酶的组合。
“由酶的抗原活化”是由酶处理切断抗原或细胞外底物，对抗体的反应性进行扩增的过程，可通过向pH调整的缓冲液溶解酶的试剂浸渍样品来进行。以适宜于酶反应的温度加温，经过指定时间后使反应停止。在反应停止中，使用试剂的除去、温度变化、螯合剂添加等。
“使用抗体进行染色”可通过使各抗体直接结合、荧光化合物、酶、化学发光物质等的标记(直接法)、使该标记抗体与抗原结合而进行，也可通过以与抗原结合的抗体作为非标记的第一抗体，使对此第一抗体各自具有特异性并且结合上述标记的第二抗体结合而间接标记(间接法)而进行。
“荧光化合物”不特别限定，可举出Cy3等的花青苷系染料、异硫氰酸荧光素(FITC)、别藻蓝蛋白、若丹明等的荧光物质。优选用发光的荧光波长不同的荧光染料标记各抗体(或者其第二抗体)(例如Alexa Fluor(注册商标)系列的荧光物质)。
“标记酶”不特别限定，可举出碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶。
“化学发光物质”不特别限定，可举出LUMINOR、AMPPD(注册商标)、CSPD(注册商标)、CDP-Star(注册商标)。
在一实施方式中，在组织切片中的细胞群中，除了Ki-67以外，还有多个检测/定量的抗原时，
(1)对于相同(FFPE)组织切片，也可用与不同的荧光波长的荧光染料等的其他配体的识别变得可能的标记标记各配体(例如，抗细胞角蛋白抗体、抗ER抗体、抗PgR抗体、与HER2基因杂交的核酸、或者与它们结合的第二抗体或核酸)检测/定量，或者
(2)也可从相同组织块制作假定为均质的多个(FFPE)组织切片，对于各目标物质而进行检测/定量染色(例如，免疫荧光染色、FISH)。
“对细胞核特异性地进行染色”是指用对固定化的细胞内的细胞核特异性地进行染色的化合物标记，不限于此，优选细胞非透过性的核酸染色用的化合物，例如，可举出DAPI或碘化丙啶(PI)等的荧光染料。
被荧光染色的细胞或细胞核可由细胞计量术(Cytometry)，计数。细胞计量术是指短时间(数秒钟至数分钟)内各1个定量测定大量(数千个至数百万个)的细胞的细胞测定法。在细胞计量术中，有将悬浮的细胞使用停止流向各1个感应区导入细胞，高速测定散射光和荧光等的流式细胞术(Flow Cytometry)和将多孔板或载玻片上的附着的细胞集团等激光扫描而取得荧光像、散射光、透射光像等，用细胞图像处理，提取每1个细胞的信息的成像细胞计量术(Imaging Cytometry)。
“提取细胞核的工序”是指从固定的细胞(组织)细胞核维持其结构的状态下提取。可使用使细胞发生剪切应力而破碎细胞的手段而进行，不限定于这些，可使用例如，水流破碎、捣碎器、研钵、超声波破碎、网、弗压碎器、均浆器处理、玻璃珠处理等、公知的方法而进行。
优选地，本发明是不使抗原性从FFPE组织消失，并且不限制使用抗体或检测方法而使细胞核脱离，进一步使染色信号增强的方法，含以下的步骤：
(1)薄切FFPE切片的脱石蜡/亲水化
(2)由热处理的抗原活化
(3)由酶的抗原的活化
(4)破碎组织及细胞而提取细胞核
在本发明中，使用的FFPE组织切片的薄切，为了使预处理工序效率化而作为薄切时的组织的厚度，只要是60μm以下，就能进行期望的标志物的检测，推荐20μm，但不限于此。对应于受试体的大小、对于其后的探讨必要的脱离的细胞核数，薄切枚数能增量为多个。
“包埋”是指将组织片(块)设为一定且均等的硬度，封组织内的中腔部，具有在薄切时不剥离的强度，为了增保存性，使“包埋剂”渗透于组织片(块)。作为“包埋剂”，不特别限定，可举出石蜡、石蜡衍生物、火棉胶、碳蜡、琼脂糖、非肝素处理血清、胶原、纤维素衍生物、壳多糖衍生物、壳聚糖衍生物、这些的混合物等。
在本发明中的“脱包埋/亲水化”是指在包埋中使用的包埋剂(例如石蜡)的除去、及在除去中使用的有机溶剂取代为水系溶剂。通过在以二甲苯为代表的有机溶剂中浸切片，进行包埋剂的除去，其后，为了取代有机溶剂而将带浓度梯度的多个浓度的乙醇溶液从高浓度至低浓度依次浸润到切片。乙醇浓度梯度可举出100％、95％、90％、70％、50％等，但不限于此。
在本发明中的“由热处理的抗原活化”是指在由固定时的交联形成覆盖抗原识别部位时将其由热处理除去的工序。在热处理时，使用含柠檬酸缓冲液、表面活性剂、鳌合剂、还原剂等的热处理用抗原活化剂而进行。不特别限定，作为热处理用抗原活化剂，能使用市售的Histo VT One(NACALAI TESQUE)、抗原活化液pH9(Nichirei Biosciences)、ImmunoSaver(日新EM)等。
“由水流的破碎”是指可用由水流的剪切力破碎细胞及组织，使用例如Sysmex公司的水流剪切装置(RP-10)等，冰冷下、由例如通过将刀片以每1分钟10,000rpm旋转而发生的水流破碎细胞及组织。
“由超声波的破碎”是指可用由超声波的剪切力破碎细胞及组织，使用例如SONICS&MATERIALS公司的超声波破碎装置(VCX130PB)，使细胞及组织以输出强度20％暴露于超声波30秒钟而破碎这些。
由超声波的破碎工序相比其他血液细胞，优先破碎淋巴细胞，不仅是淋巴细胞的细胞壁，在破碎淋巴细胞的核时有益。从而，在淋巴细胞的存在成为其他细胞的分析的妨碍时等，在想要优先破碎淋巴细胞的情况中，优选包括由超声波的破碎工序。
在使本发明的细胞核脱离的方法中，可将上述的方法2种以上组合，也优选由水流剪切和超声波的破碎的组合。
在提取细胞核的工序中，组织或细胞浸渍或分散于通常使用的缓冲液即可，使用例如三(羟基甲基)氨基甲烷缓冲液、磷酸缓冲液、碳酸缓冲液、甘氨酸缓冲液、醋酸缓冲液、酒石酸缓冲液、柠檬酸缓冲液、三乙醇胺缓冲液、硼酸缓冲液、Good缓冲液等即可。当然，由于表面活性剂有促进细胞核的脱离的作用，优选使用添加表面活性剂的缓冲液而进行细胞核的提取。作为表面活性剂，只要不影响细胞核，就不特别限定，可举出阴离子性表面活性剂(羧酸型、磺酸型、硫酸酯型、磷酸酯型等)、阳离子性表面活性剂(季铵盐型、烷基胺盐型、有吡啶环的型等)、两性表面活性剂(甜菜碱型、磺基甜菜碱型、胺氧化物型、烷基咪唑型、氨基酸型等)、非离子性表面活性剂(酯型、醚型、酯醚型、烷醇酰胺型、烷基糖苷等)的表面活性剂。优选可举出非离子性表面活性剂的TritonX-100、TritonX-405、NP-40、Briji-35、Briji-58、Tween-20、Tween-80、BPSH-25、Octyl Glucoside、及Octylthio Glucoside。
恶性肿瘤是在变得由基因变异进行不自律性地控制的增殖的细胞集团(含肿瘤、良性肿瘤和恶性肿瘤)之中浸润到周围的组织，或引起转移的肿瘤，恶性肿瘤(Malignanttumor)的用语在病理学中分类为下列(1)～(3)：
(1)癌肿(Carcinoma)：上皮组织来源的恶性肿瘤，
(2)肉瘤(Sarcoma)：非上皮组织来源的恶性肿瘤，
(3)此外：白血病等，
在本申请中，“癌”是指癌肿。不特别限定，头颈癌(上颚癌、(上、中，下)咽头癌、喉头癌、舌癌、甲状腺癌)、胸部癌(乳腺癌、肺癌(非小细胞肺癌、小细胞肺癌))、消化器癌(食道癌、胃癌、十二指肠癌、大肠癌(结肠癌、直肠癌)、肝癌(肝细胞癌、胆管细胞癌)、胆囊癌、胆管癌、胰腺癌、肛门癌、泌尿器的癌(肾癌、尿管癌、膀胱癌、前列腺癌、阴茎癌、精巢(睾丸)癌)、生殖器癌(子宫癌(子宫颈癌、子宫体癌)、卵巢癌、外阴癌、阴道癌)、皮肤癌(基底细胞癌、鳞状细胞癌)等的癌细胞与其符合。
Ki-67可单独或者与其他标志物组合，用于辅助癌的诊断，或用于辅助诊断癌的治疗的预后。
作为为了区别癌肿和肉瘤而使用的上皮性细胞的标志物，可举出细胞角蛋白。细胞角蛋白是上皮细胞的主要的骨架蛋白质，报告了约20～30种亚型(分子量40～68KDa)。作为上皮性细胞标志物，为了检测细胞角蛋白，使用识别公知的广泛的亚型的抗体(多克隆或单克隆抗体)，但也可使用含多种与各亚型特异性地结合的公知的抗体的混合物。
雌激素受体(Estrogen Receptor、ER)是属于类固醇受体超家族的分子之一，也称为卵泡激素受体。在ER中存在2个同种型，各自称为ERα及ERβ。这些从独立的基因(ESR1、ESR2)产生。ESR1存在于6q25.1，ESR2存在于14q21-22。
黄体酮受体(Progesterone receptor(PR或PgR)是属于核内受体超家族的亚家族3组C的核内蛋白。已知由存在于11q22的单一的PgR基因编码，分子量不同的2个同种型。
原发乳腺癌的约3分之2是激素受体阳性乳腺癌，得知日本人女性的ER阳性乳腺癌处于增加倾向。由于PgR由雌激素-ER复合体诱导表达，PgR的有无成为雌激素和ER的功能正常活动与否的基准。现在，这些激素受体的表达由使用病理组织标本的免疫组织化学方法检测。
HER2存在于细胞表面的约185kDa的糖蛋白，是受体型酪氨酸激酶。具有与上皮生长因子受体(EGFR、别名ERBB1)类似的结构，也称为EGFR2、ERBB2、CD340、或者NEU。编码HER2蛋白的基因是HER2/neu、erbB-2，存在于17号染色体长臂。另外，HER2是属于人类表皮生长因子受体(human epidermal growth factor receptor，HER/EGFR/ERBB)家族(EGFR家族)的蛋白质。
HER2蛋白在正常细胞中与细胞的增殖、分化等的调节相关，变得无法由某些理由而发生HER2基因的扩增或基因变异和细胞的增殖－分化的控制，细胞恶性化。HER2基因也可为癌基因，在多个种类的癌中见到基因扩增。
在上述的由酶的抗原活化工序、进一步提取细胞核的工序中得到的试样可还在与Ki-67组合进行诊断的辅助的这些标志物的分析中使用。特别是，将凝血酶和透明质酸酶组合的酶处理在还进行这些标志物的分析时优选。当然，HER2基因的检测也可使用在核脱离之后用公知的方法提取的核酸而进行。
“患者”可为哺乳动物，可为“人”或“非人哺乳动物”。
“组织切片”是指人或非人动物的单离的组织的切片。可为活体检查中采集的“组织切片”。“组织切片”也可在单离后，冷冻保存等。
“活体检查”是指在诊断时，为了用显微镜等观察而将病理组织的一部分用手术刀或针等采集。在乳腺癌的情况中，从患者的乳房通过“切除活体检查”(组织的肿块全摘出)；“切开活体检查”(摘出一部分)；“核心活体检查”(用粗的针摘出组织的一部分)；或者“细针穿刺抽吸(FNA)活体检查”(用细针摘出组织或体液)采集。
“由分解酶的抗原活化剂”及“由热处理的抗原活化剂”均可在成分溶解的溶液的状态下存在，也可为干燥的固体的状态。在这些中的任何一方或两方是固体的状态的情况中，在“试剂盒”中也可含用于使这些固体成分溶解的“溶剂”。
“在将Ki-67用免疫染色检测的试样中使用的抗原活化剂”是指使用抗Ki-67抗体检测细胞或细胞核的试样、典型而言，由固定化的细胞群或组织中使用的酶的活化剂。
“癌治疗的预后”是指对患者进行化学疗法(抗癌剂治疗)、内分泌疗法、外科手术(肿瘤的摘出)、放射线治疗等，确认预测其治疗的效果。
“用于检测固定化的细胞群中的Ki-67阳性细胞的试剂盒”含不识别切断SEQ IDNO:2的肽的水解酶和抗Ki-67抗体。水解酶优选为选自凝血酶、Arg-C(梭菌蛋白酶)肽酶、脯氨酸端肽酶及透明质酸酶的至少一种，更优选为凝血酶及/或透明质酸酶。抗Ki-67抗体优选为选自MIB-1、DAKO-PC、Ki-S5及A-0047的至少一种。抗Ki-67抗体可为直接用荧光染料、酶、化学发光物质、放射性元素等标记，或者，也可为试剂盒含与抗Ki-67抗体结合的第2抗体，此第2抗体用荧光染料、酶、化学发光物质、放射性元素等标记。试剂盒可与Ki-67组合而含用于检测为了辅助癌的诊断或为了辅助诊断癌的治疗的预后而使用的其他标志物的配体(例如抗体或探针等)。例如，可举出抗细胞角蛋白抗体、抗ER抗体、抗PgR抗体、与HER2基因(典型地，在严格的条件下)杂交的探针(这些或这些的第二配体(抗体或核酸等)也可被标记)、及核酸染色用的化合物(例如，DAPI或碘化丙啶(PI))。
试剂盒可还含用于使在“提取细胞核的工序”中使用的组织或细胞浸渍或分散的缓冲液，优选地，此缓冲液含表面活性剂。作为表面活性剂，优选可举出CHAPS、NP-40、Triton-X100，更优选NP-40、Triton-X100。从而，根据本申请发明，提供用于由用水流或超声波等发生的剪切应力从细胞(通常，固定化的细胞)提取细胞核的试剂盒，其包含含有表面活性剂的细胞分散用缓冲液。
“截止值”(分割点或病态识别值)是指鉴别检查结果的阳性和阴性的数值。在Ki-67的情况中，为了对LuminalA(样)类型和LuminalB(样)类型进行分类而现在推荐14～20％的值。
“抗癌剂”是指用于治疗或预防癌的医药。不限于此，分类为分子目标药、烷基化剂、代谢拮抗剂、植物生物碱、抗癌性抗生物质、铂制剂、激素剂、生物学应答调节剂等。
“内分泌疗法”是指使促进激素依赖性的乳腺癌的增殖的女性激素(雌激素)不活动的治疗法，不限于此，含施用抗雌激素剂、Lh-RH激动剂制剂、芳香酶抑制剂、黄体酮制剂等的激素剂。
“化学疗法”是指使用发挥抗癌作用的化学物质治疗癌。不限于此，含将作为DNA合成及复制抑制剂的蒽环类药物系抗癌剂(柔红霉素(道诺霉素)、多柔比星(阿霉素)、表柔比星、伊达比星等)、作为细胞增殖的抑制剂的紫杉烷系抗癌剂(紫杉醇(泰素)、多西他赛(泰素帝)等)、妨碍DNA的复制的铂(铂)制剂(顺铂、奥沙利铂等)等单施用或联合施用，优选含将蒽环类药物系抗癌剂和紫杉烷系抗癌剂联合施用。在本申请说明书中，在施用“激素剂”时，包括在“内分泌疗法”。
【实施例】
由以下的实施例、比较例及参考例进一步详细地说明本发明，但本发明不限定于这些实施例。
＜参考例1：由水流剪切的细胞核脱离观测＞
【1.材料及方法】
对乳腺癌组织的FFPE组织切片实施脱石蜡/亲水化、由热处理的抗原活化，使用水流剪切装置而分散处理后，对回收产物进行免疫荧光染色，进行显微镜观察。
【1-1.FFPE组织块】
使用从Proteogenex公司购入的乳腺癌组织的FFPE组织块。
【1-2.FFPE切片的制成】
使用Thermofisher公司制滑动式显微镜用薄片切片机而薄切FFPE组织块而制成厚度20μm的切片。
【1-3.脱石蜡/亲水化】
向薄切的FFPE切片添加充分量的二甲苯，静置10分钟后，除去二甲苯。再次进行此工序，完全地除去石蜡。接下来，在100％乙醇、95％乙醇、70％乙醇、50％乙醇、去离子水中顺序地浸渍各3分钟而亲水化。
【1-4.由热处理的抗原活化】
添加用纯水稀释10倍的NACALAI TESQUE公司制Histo VT One，用热块在98℃下加热20分钟。加热后，于室温静置20分钟后，除去抗原活化液。
【1-6.水流破碎】
使用Sysmex公司的水流剪切装置(RP-10)，冰冷下、将活化济组织在TBS1mL中以10,000rpm破碎1分钟。
【1-7.免疫荧光染色】
将添加10％正常山羊血清(和光)的4％BSA/TBS添加到放入由水流破碎的破碎物的微管中，室温下静置30分钟，封闭处理。对于免疫荧光染色，作为第1抗体，使用pan-细胞角蛋白抗体(Abcam、兔多克隆抗体：Anti-wide spectrum Cytokeratin antibody(AB9377-500))，第2抗体使用Abcam公司山羊抗兔第二抗体Alexa 488。第1抗体反应时间是50分钟、第2抗体反应时间是30分钟，在经过第2抗体反应时间时添加对细胞核进行染色的染料DAPISolution(和光)。反应全部在室温下进行，在添加第2抗体往后在遮光下进行。在抗体稀释液中使用0.5％BSA/TBS，在各工序之间进行由各1次0.5％BSA/TBS的清洗操作。在载玻片上负载5μLDAPI包埋剂(和光)，在其上载乘第2抗体反应后的样品。其后，覆盖盖玻片，静置5分钟后，自上垂直按下，将盖玻片的周围用修指甲剂密封。至观察时遮光，于4℃下保存。
【1-8.荧光显微镜】
在显微镜观察中，使用EVOS一体式显微镜、荧光显微镜(Thermoscientific)。在观察时使用DAPI Light Cube(Ex 357nm、Em 447nm)、GFP Light Cube(Ex 470nm/Em 510nm)。目镜使用10倍、物镜使用40倍。
【2.结果】
在图1显示用荧光显微镜观测的细胞核。如左图所示，核酸以圆形状存在，如右图所示，细胞角蛋白存在于核酸的周围。从而确认到，细胞核、骨架未破损而保持圆形，不凝集而作为单细胞核回收。
＜参考例2：福尔马林固定化乳腺癌细胞中的细胞角蛋白及Ki-67来源信号的确认＞
【1.材料及方法】
对用福尔马林固定化的乳腺癌细胞实施由热处理的抗原活化，进行免疫荧光染色，将细胞角蛋白和Ki-67的信号用流式细胞仪确认。
【1-1.细胞】
从ATCC(American Type Culture Collection)入手并使用3种乳腺癌细胞株、T47D、MDA-MB-231(在图中表述为MB231或231)、及SKBr3(在图中表述为SKBR)。
【1-2.细胞培养和福尔马林固定】
T47D细胞株用RPMI-1640培养基、MDA-MB-231细胞株用Leibovitz’s L-15培养基及SKBr3细胞用McCoy’s 5A培养基培养，补充10％的牛胎儿血清(FBS)。在细胞充分地增殖之后抽吸培养液，在用PBS清洗之后，添加TrypLE Express(Thermofisher)。在回收细胞之后进行离心分离，用PBS清洗。再者，用PBS充分地悬浮细胞后分注为1×106个，进行离心分离、PBS除去，添加10％中性缓冲福尔马林液(和光纯药)后，于4℃固定24小时。在使用细胞之前，除去福尔马林液，用PBS清洗。
【1-4.由热处理的抗原活化】
进行与参考例1同样的处理。
【1-7.免疫荧光染色】
将添加10％正常山羊血清(和光)的4％BSA/TBS添加到放入由热处理的抗原活化后的细胞的微管中，室温下静置30分钟，封闭处理。免疫荧光染色使用小鼠抗体和兔抗体的混合液而进行2重染色。第1抗体使用Ki-67抗体(Dako、克隆：MIB-1、小鼠单克隆抗体)、及pan-细胞角蛋白抗体(Abcam、兔多克隆抗体(AB9377-500))，第2抗体使用Thermofisher公司山羊抗小鼠第二抗体Alexa 647、及Abcam公司山羊抗兔第二抗体Alexa 488。第1抗体反应时间是50分钟、第2抗体反应时间是40分钟，在添加第2抗体后20分钟后，添加对细胞核进行染色的染料DAPI Solution(和光)。反应全部在室温下进行，第2抗体添加往后在遮光下进行。在抗体稀释液中使用0.5％BSA/TBS，在各工序之间进行由各1次0.5％BSA/TBS的清洗操作。另外，作为阴性对照(同种型对照)，代替第1抗体而使用与各自对应的第1抗体同种、同浓度的抗体。Ki-67使用Dako公司的小鼠IgG抗体，细胞角蛋白使用Cellsignalingtechnology公司的兔IgG抗体。
【1-8.流式细胞仪测定】
使Falcon(注册商标)细胞滤器5mL管用35μm(380目)(流式细胞仪用)的滤器通过之后，转移到指定容器，用流式细胞仪(Sysmex：Space)测定。测定根据机器手册而进行。
【1-9.细胞角蛋白及Ki-67阳性率的算出】
在得到的测定数据的解析中使用FLOWJO LLC公司制的软件FlowJo v10。数据解析根据软件附带的说明书，由以下的顺序进行。在以前方散射作为横轴、以侧方散射作为纵轴的散点图上，选择图2中所示的主要的区域。接下来，以DAPI的荧光强度作为横轴、以细胞(核)个数作为纵轴，以主要的区域作为细胞核选通(图3)。细胞角蛋白及Ki-67的阳性率作为全细胞核中的细胞角蛋白阳性核数、及Ki-67阳性核数的比例算出。阳性核的阈值作为同种型对照的95百分率值。
【2.结果】
在图4显示使得用抗细胞角蛋白抗体及抗Ki-67抗体检测的荧光强度的直方图(黑色实线)、及用它们的同种型对照抗体检测的荧光强度的直方图(灰色虚线)重合的图。在任何细胞株中，黑色的峰均示比灰色高的荧光强度。由这些确认，福尔马林固定化乳腺癌细胞中的细胞角蛋白及Ki-67的存在。
＜实施例1：由用凝血酶的抗原活化的福尔马林固定化细胞中的Ki-67信号的增强＞
【1.材料及方法】
使用用福尔马林固定化的乳腺癌细胞，对凝血酶处理的有无的信号强度进行比较。
【1-1.细胞】
使用在参考例2中使用的3种乳腺癌细胞株。
【1-2.细胞培养和福尔马林固定】
与参考例2同样地进行。
【1-4.由热处理的抗原活化】
进行与参考例1同样的处理。
【1-5.由酶的抗原活化】
向由热处理的抗原活化后的细胞添加凝血酶试剂(25mM Tris-HCl pH7.4、150mMNaCl、1000KU/L凝血酶、10mM CaCl2)，用热块在37℃下加热20分钟。
【1-7.免疫荧光染色】
与参考例2同样地进行。其中，作为第1抗体，使用Ki-67抗体(Dako、克隆：MIB-1、小鼠单克隆抗体)，作为第2抗体，使用Thermofisher公司山羊抗小鼠第二抗体Alexa 647。
【1-8.流式细胞仪测定】
与参考例2同样地进行。
【1-9.Ki-67阳性率的算出】
与参考例2同样地进行。
【2.结果】
在图5显示使得用抗Ki-67抗体(黑色实线)及同种型对照抗体(灰色虚线)检测的荧光强度重合的图，在图6及表2显示Ki-67阳性率的变化。在任何细胞株中，进行由凝血酶的抗原活化和荧光强度均升高，伴随其而见到Ki-67阳性率的增加。
【表2】
Figure BDA0002653167390000291
＜实施例2：由用透明质酸酶的抗原活化的福尔马林固定化细胞中的Ki-67信号的增强＞
【1.材料及方法】
使用用福尔马林固定化的乳腺癌细胞，对透明质酸酶处理的有无的信号强度进行比较。
【1-1.细胞】
使用在参考例2中使用的T47D细胞株。
【1-2.细胞培养和福尔马林固定】
与参考例2同样地进行。
【1-4.由热处理的抗原活化】
进行与参考例1同样的处理。
【1-5.由酶的抗原活化】
向由热处理的抗原活化后的细胞添加透明质酸酶试剂(25mM Tris-HCl pH7.4、150mM NaCl、4000-10000KU/L透明质酸酶I-S、7500-30000KU/L透明质酸酶IV-S、27mMKCl)，用热块在37℃下加热20分钟。
【1-7.免疫荧光染色】
与参考例2同样地进行。其中，作为第1抗体，使用Ki-67抗体(Dako、克隆：MIB-1、小鼠单克隆抗体)，作为第2抗体，使用Thermofisher公司山羊抗小鼠第二抗体Alexa647。
【1-8.流式细胞仪测定】
与参考例2同样地进行。
【1-9.Ki-67阳性率的算出】
与参考例2同样地进行。
【2.结果】
在图7显示使得用抗Ki-67抗体(黑色实线)及同种型对照抗体(灰色虚线)检测的荧光强度重合的图。由透明质酸酶处理而荧光强度升高，伴随其而见到Ki-67阳性率的增加。
＜参考例3：FFPE组织切片中的细胞角蛋白及Ki-67来源信号的确认＞
【1.材料及方法】
用流式细胞仪确认乳腺癌组织的FFPE组织切片中的细胞角蛋白及Ki-67的信号。
【1-1.FFPE组织块】
使用在参考例1中使用的FFPE组织块。
【1-2.FFPE切片的制成】
使用Thermofisher公司制滑动式显微镜用薄片切片机而薄切FFPE组织块而制成厚度20μm的切片2个，在探讨中使用。
【1-3.脱石蜡/亲水化】
与参考例1同样地进行。
【1-4.由热处理的抗原活化】
与参考例1同样地进行。
【1-6.水流破碎】
与参考例1同样地进行。
【1-7.免疫荧光染色】
与参考例2同样地进行。
【1-8.流式细胞仪测定】
与参考例2同样地进行。
【1-9.细胞角蛋白及Ki-67阳性率的算出】
在得到的测定数据的解析中使用FLOWJO LLC公司制的软件FlowJo v10。数据解析由以下的顺序进行。首先，以DAPI的荧光强度作为横轴、以细胞(核)个数作为纵轴，以横轴的荧光量是5～150的区域作为细胞核选通。细胞角蛋白及Ki-67的阳性率作为全细胞核中的细胞角蛋白阳性核数、及Ki-67阳性核数的比例算出。阳性核的阈值作为同种型对照的95百分率值。
【2.结果】
在图8显示使得用抗细胞角蛋白抗体及抗Ki-67抗体检测的荧光强度的直方图(黑色实线)及用它们的同种型对照抗体检测的荧光强度的直方图(灰色虚线)重合的图。黑色的峰示比灰色高的荧光强度。由这些确认，FFPE组织切片中的细胞角蛋白及Ki-67的检测。
＜实施例3：由用凝血酶的抗原活化的FFPE组织切片中的细胞角蛋白及Ki-67信号的增强＞
【1.材料及方法】
使用乳腺癌组织的FFPE组织切片，对凝血酶处理的有无的信号强度进行比较。
【1-1.FFPE组织块】
由从IProteogenex公司购入的HC法使用从Ki-67阳性率不同的2人的乳腺癌患者得到的2种FFPE组织块。
【1-2.FFPE切片的制成】
使用Thermofisher公司制滑动式显微镜用薄片切片机而薄切FFPE组织块而制成厚度20μm的切片2个，在探讨中使用。
【1-3.脱石蜡/亲水化】
与参考例1同样地进行。
【1-4.由热处理的抗原活化】
与参考例1同样地进行。
【1-5.由酶的抗原活化】
与实施例1同样地进行。
【1-6.水流破碎】
与参考例1同样地进行。
【1-7.免疫荧光染色】
与参考例2同样地进行。
【1-8.流式细胞仪测定】
与参考例2同样地进行。
【1-9.细胞角蛋白及Ki-67阳性率的算出】
与参考例3同样地进行。
【2.结果】
在图9A显示使得用抗细胞角蛋白抗体及抗Ki-67抗体检测的荧光强度的直方图(黑色实线)和用它们的同种型对照抗体检测的荧光强度的直方图(灰色虚线)重合的图。在任何FFPE切片上，进行由凝血酶的处理和细胞角蛋白、Ki-67的荧光强度均升高，伴随其而见到阳性率的增加(图9B)。
＜实施例4：由薄切切片的厚度对细胞角蛋白及Ki-67信号强度的影响＞
【1.材料及方法】
确认由FFPE切片的厚度是否影响细胞角蛋白及Ki-67的信号强度。
【1-1.FFPE组织块】
使用在参考例1中使用的FFPE组织块。
【1-2.FFPE切片的制成】
使用Thermofisher公司制滑动式显微镜用薄片切片机而由相同FFPE组织块制成20μm 3个、30μm 2个、60μm 1个的薄切样品。
【1-3.脱石蜡/亲水化】
与参考例1同样地处理。
【1-4.由热处理的抗原活化】
与参考例1同样地处理。
【1-5.由酶的抗原】活化
与实施例1同样地处理。
【1-6.水流破碎】
与参考例1同样地进行。
【1-7.免疫荧光染色】
与参考例2同样地进行。
【1-8.流式细胞仪测定】
与参考例2同样地进行。
【1-9.细胞角蛋白及Ki-67阳性率的算出】
与参考例3同样地进行。
【2.结果】
薄切切片的厚度和细胞角蛋白及Ki-67的阳性率的变化示于图10。
尽管在20μm的3个中检测效率最良好，但在20～60μm中任何厚度均能进行细胞角蛋白(CK)及Ki-67(Ki67)的检测。
＜实施例5：利用流式细胞仪的Ki-67阳性率和由IHC法的阳性率的比较探讨＞
【1.材料及方法】
使用FFPE组织块而比较利用流式细胞仪的Ki-67阳性率和由IHC法的阳性率。
【1-1.FFPE组织块】
由从Proteogenex公司购入的IHC法使用从Ki-67阳性率不同的19人的患者得到的19种FFPE组织块。
【1-2.FFPE切片的制成】
与参考例3同样地进行。
【1-3.脱石蜡/亲水化】
与参考例1同样地处理。
【1-4.由热处理的抗原活化】
与参考例1同样地处理。
【1-5.由酶的抗原活化】
与实施例1同样地处理。
【1-6.水流破碎】
与参考例1同样地进行。
【1-7.免疫荧光染色】
与参考例2同样地进行。其中，第1抗体使用Ki-67抗体(Dako、克隆：MIB-1、小鼠单克隆抗体)、及pan-细胞角蛋白抗体(Abcam、兔多克隆抗体)，作为第2抗体，使用Thermofisher公司山羊抗小鼠第二抗体Alexa 647、及Abcam公司山羊抗兔第二抗体Alexa488。
【1-8.流式细胞仪测定】
与参考例2同样地进行。
【1-9.利用流式细胞仪的Ki-67阳性率的算出】
与参考例3同样地进行。
【1-10.由IHC法的Ki-67阳性率算出】
第1抗体使用Ki-67抗体(Dako、克隆：MIB-1、小鼠单克隆抗体)，由热点法算出由IHC法的Ki-67阳性率。再者，考虑由镜检者的不均而作为病理医2名的平均值。
【2.结果】
在Ki-67阳性率中的与IHC法的相关性示于图11。
以IHC法作为X、以本法作为Y而确认相关性。另外，为了以阳性核的截止值作为同种型对照的95百分率值，截距设定为10。如图11所示，得到了Y＝0.5632X+10、相关系数0.7697这样的良好的结果。这表明，本法可检测FFPE组织切片中的Ki-67。
＜实施例6：在进行用各种消化酶的抗原活化时的Ki-67及细胞角蛋白的检测＞
【1.材料及方法】
使用用福尔马林固定化的乳腺癌细胞，对于用5种不同的消化酶的抗原活化而比较Ki-67及细胞角蛋白的信号强度。
【1-1.细胞】
使用在参考例2中使用的3种乳腺癌细胞株。
【1-2.细胞培养和福尔马林固定】
与参考例2同样地进行。
【1-4.由热处理的抗原活化】
进行与参考例1同样的处理。
【1-5A.由酶的抗原活化(凝血酶)】
与实施例1同样地处理。
【1-5B.由酶的抗原活化(胰蛋白酶)】
向进行由热处理的抗原活化的细胞添加胰蛋白酶试剂(25mM TBS pH7.4、1MCaCl2、1mg/mL胰蛋白酶)250μL，在37℃下加热20分钟。酶处理后用TBS清洗而去除酶。
【1-5C.由酶的抗原活化(蛋白酶K)】
将600mAnson U/mL蛋白酶K(宝生物)用25mM TBS pH7.4稀释40倍(v/v)而作为蛋白酶K溶液。向进行由热处理的抗原活化的细胞添加蛋白酶K溶液250μL，在37℃下加热20分钟。酶处理后用TBS清洗而去除酶。
【1-5D.由酶的抗原活化(分散酶)】
向25mM TBS pH7.4溶解分散酶(和光)而作为分散酶溶液(3,000PU/mL)。向抗原活化的细胞添加分散酶溶液250μL，在37℃下加热20分钟。反应结束后，添加2μL的1M EDTA溶液(和光)而颠倒混合之后，用TBS清洗而去除酶。
【1-5E.由酶的抗原活化(脯氨酸端肽酶)】
向25mM TBS pH7.4溶解脯氨酸端肽酶(东洋纺)，作为脯氨酸端肽酶溶液(10U/mL)。向进行由热处理的抗原活化的细胞添加脯氨酸端肽酶溶液250μL，在37℃下加热20分钟。反应结束后，用TBS清洗而去除酶。
【1-7.免疫荧光染色】
与参考例2同样地进行。其中，第1抗体使用Ki-67抗体(Dako、克隆：MIB-1、小鼠单克隆抗体)、及pan-细胞角蛋白抗体(Abcam、兔多克隆抗体)，作为第2抗体，使用Thermofisher公司山羊抗小鼠第二抗体Alexa 647、及Abcam公司山羊抗兔第二抗体Alexa488。
【1-8.流式细胞仪测定】
与参考例2同样地进行。
【1-9.细胞角蛋白及Ki-67阳性率的算出】
与参考例2同样地进行。
【2.结果】
在图12A及B显示使得用抗Ki-67抗体或抗细胞角蛋白抗体检测的荧光强度的直方图(黑色实线)和用它们的同种型对照抗体检测的荧光强度的直方图(灰色虚线)重合的图。细胞角蛋白在使用任何蛋白质分解酶时均能检测(图12B)。与此相比，在使用可识别切断SEQ ID NO:2的氨基酸序列的胰蛋白酶、分散酶、及蛋白酶K的3种蛋白质分解酶时，信号减少，Ki-67的阳性率显著地降低。一方面显示，不识别切断SEQ ID NO:2的氨基酸序列的凝血酶及脯氨酸端肽酶是Ki-67的阳性率升高，增强Ki-67抗原的抗原性(图12A)。
＜实施例7：使用各种消化酶时的乳腺癌组织的FFPE切片中的Ki-67及细胞角蛋白的检测＞
【1.材料及方法】
用5种不同的消化酶抗原活化乳腺癌组织的FFPE切片，对Ki-67及细胞角蛋白的信号强度进行比较。
【1-1.FFPE组织块】
使用在参考例1中使用的FFPE组织块。
【1-2.FFPE切片的制成】
与参考例3同样地进行。
【1-3.脱石蜡/亲水化】
与参考例1同样地处理。
【1-4.由热处理的抗原活化】
与参考例1同样地处理。
【1-5A.由酶的抗原活化(凝血酶)】
与实施例1同样地进行。
【1-5B.由酶的抗原活化(胰蛋白酶)】
与实施例6同样地进行。
【1-5C.由酶的抗原活化(蛋白酶K)】
与实施例6同样地进行。
【1-5D.由酶的抗原活化(分散酶)】
与实施例6同样地进行。
【1-5E.由酶的抗原活化(脯氨酸端肽酶)】
与实施例6同样地进行。
【1-6.水流破碎】
与参考例1同样地进行。
【1-7.免疫荧光染色】
与参考例2同样地进行。其中，第1抗体使用Ki-67抗体(Dako、克隆：MIB-1、小鼠单克隆抗体)、及pan-细胞角蛋白抗体(Abcam、兔多克隆抗体)，作为第2抗体，使用Thermofisher公司山羊抗小鼠第二抗体Alexa 647、及Abcam公司山羊抗兔第二抗体Alexa488。
【1-8.流式细胞仪测定】
与参考例2同样地进行。
【1-9.细胞角蛋白及Ki-67阳性率的算出】
与参考例3同样地进行。
【2.结果】
在图13A及B显示使得用抗Ki-67抗体或抗细胞角蛋白抗体检测的荧光强度的直方图(黑色实线)和用它们的同种型对照检测的荧光强度的直方图(灰色虚线)重合的图。细胞角蛋白在使用任何蛋白质分解酶时均能检测(图13B)。与此相比，与实施例6同样地，在使用可识别切断SEQ ID NO:2的肽的胰蛋白酶、分散酶、蛋白酶K的酶时，Ki-67抗体(黑色实线)的荧光强度大幅地减少(图13A)。
＜实施例8：使用识别部位不同的抗体的Ki-67的检测＞
【1.材料及方法】
用流式细胞仪确认乳腺癌组织的FFPE组织切片中的细胞角蛋白及Ki-67的信号。Ki-67抗体使用MIB-1克隆，及作为与其识别部位不同的抗体而使用S5克隆。
【1-1.FFPE组织块】
使用在参考例1中使用的FFPE组织块。
【1-2.FFPE切片的制成】
与参考例3同样地进行。
【1-3.脱石蜡/亲水化】
与参考例1同样地处理。
【1-4.由热处理的抗原活化】
与参考例1同样地处理。
【1-5.由酶的抗原活化处理】
与实施例1同样地处理。
【1-6.水流破碎】
与参考例1同样地进行。
【1-7.免疫荧光染色】
与参考例2同样地进行。其中，作为第1抗体，使用Ki67 MIB-1抗体(Dako、小鼠单克隆抗体)或Ki67 S5抗体(Millipore、小鼠单克隆抗体)、及pan-细胞角蛋白抗体(Abcam、兔多克隆抗体)，作为第2抗体，使用Thermofisher公司山羊抗小鼠第二抗体Alexa 647、及Abcam公司山羊抗兔第二抗体Alexa 488。
【1-8.流式细胞仪测定】
与参考例2同样地进行。
【1-9.细胞角蛋白及Ki-67阳性率的算出】
与参考例3同样地进行。
【2.结果】
在图14显示使得用抗Ki-67抗体或抗细胞角蛋白抗体检测的荧光强度的直方图(黑色实线)和用它们的同种型对照检测的荧光强度的直方图(灰色)重合的图(上段：Ki-67；下段：细胞角蛋白)。Ki-67抗体的峰示比同种型对照高的荧光强度。由此提示，确认FFPE组织切片中的细胞角蛋白及Ki-67的检测，不限于Ki-67的MIB-1克隆，在S5克隆中也能检测到受试体中的Ki-67。
＜比较例1：由公知的方法的FFPE组织切片中的Ki-67信号的检测＞
【1.材料及方法】
由公知的先前文献法(非专利文献4：Cytometry 27：283-289)进行乳腺癌组织的FFPR组织切片中的细胞角蛋白及Ki-67信号的检测。
【1-1.FFPE组织块】
使用在参考例1中使用的FFPE组织块。
【1-2.FFPE切片的制成】
与参考例3同样地进行。
【1-3.脱石蜡/亲水化】
与参考例1同样地处理。
【1-5.由酶的抗原活化(胰蛋白酶)：以往方法】
向亲水化处理的组织切片添加胰蛋白酶试剂(25mM PBS pH7.4、1mg/ml CaCl2、1mg/mL胰蛋白酶)250μL，在37℃下加热70分钟。酶处理后用PBS清洗而去除酶。
【1-7.免疫荧光染色】
将添加10％正常山羊血清(和光)的4％BSA/TBS添加到放入由酶的抗原活化后的试样的微管中，室温下静置30分钟，封闭处理。对于免疫荧光染色，作为第1抗体，使用Ki67MIB-1抗体(Dako、小鼠单克隆抗体)或Ki67 S5抗体(Millipore、小鼠单克隆抗体)、及细胞角蛋白抗体(Abcam、兔多克隆抗体)，第2抗体使用Thermofisher公司山羊抗小鼠第二抗体Alexa 647、及Abcam公司山羊抗兔第二抗体Alexa 488。第1抗体反应时间是在4℃过夜反应。
使第2抗体反应40分钟，在添加第2抗体后20分钟后添加对细胞核进行染色的染料DAPI Solution(和光)。第2抗体添加往后，全部于室温在遮光下进行。在抗体稀释液中使用0.5％BSA/TBS，在各工序之间进行由各1次0.5％BSA/TBS的清洗操作。另外，作为阴性对照，代替第1抗体而使用与各自对应的第1抗体同种、同浓度的抗体。小鼠抗体使用Dako公司的小鼠IgG抗体，兔抗体使用Cellsignaling technology公司的兔IgG抗体。
【1-8.流式细胞仪测定】
与参考例2同样地进行。
【1-9.利用流式细胞仪的细胞角蛋白及Ki-67阳性率的算出】
与参考例3同样地进行。
【2.结果】
如图15(上段：Ki-67；下段：细胞角蛋白)所示，在记载在非专利文献4的以往方法中使用Ki-67的S5克隆时，可检测，但在使用MIB-1克隆抗体的样品中Ki-67来源的荧光峰大幅地减少，无法检测Ki-67。
＜实施例9：FFPE切片中的ER及PgR的检测＞
【1.材料及方法】
使用ER及PgR的阳性及阴性变得已知的FFPE组织切片，用凝血酶进行抗原活化，由水流破碎提取细胞核，使用流式细胞仪而进行ER及PgR的信号确认。
【1-1.FFPE组织块】
作为ER及PgR的阳性试样，使用从Proteogenex公司购入的ER阳性受试体(All redScore ER7)、及PgR阳性受试体(All red Score PgR8)，作为ER及PgR的阴性试样，使用ER及PgR阴性受试体(All red Score ER0及PgR0)的FFPE组织切片。
【1-2.FFPE切片的制成】
与参考例3同样地制成。
【1-3.脱石蜡/亲水化】
与参考例1同样地处理。
【1-4.由热处理的抗原活化】
与参考例1同样地处理。
【1-5.由酶的抗原活化】
在由热处理的抗原活化后，ER阳性受试体用凝血酶进行抗原活化。另外，PgR阳性受试体和ER及PgR阴性受试体用凝血酶或脯氨酸端肽酶进行抗原活化。用凝血酶的抗原活化与实施例1同样地进行，用脯氨酸端肽酶的抗原活化与实施例6同样地进行。
【1-6.水流破碎】
与参考例1同样地进行。
【1-7.免疫荧光染色】
将添加10％正常山羊血清(和光)的4％BSA/TBS添加到放入水流破碎后的试样的微管中，室温下静置30分钟，封闭处理。免疫荧光染色是，作为第1抗体，使用ER抗体(Abcam、克隆：SP1、兔单克隆抗体)或PgR抗体(Thermofisher、克隆：SP2、兔单克隆抗体)，第2抗体使用Abcam公司山羊抗兔小鼠第二抗体Alexa 488。第1抗体于室温反应45分钟。第2抗体于室温反应40分钟，在添加第2抗体后20分钟后添加对细胞核进行染色的染料DAPI Solution(和光)。
【1-8.流式细胞仪测定】
与参考例2同样地进行。
【1-9.ER及PgR阳性率的算出】
在得到的测定数据的解析中使用FLOWJO LLC公司制软件FlowJo v10。以DAPI的荧光量作为横轴、以细胞(核)个数作为纵轴，以横轴的荧光量是5～150的区域作为细胞核选通。ER及PgR的阳性率作为全细胞核中的ER阳性核数及PgR的阳性核数的比例算出。阳性核的阈值作为同种型对照的90百分率值。
【2.结果】
在图16显示使得用抗ER抗体或抗PgR抗体检测的荧光强度的直方图(黑色实线)和用它们的同种型对照抗体检测的荧光强度的直方图(灰色虚线)重合的图。即使将ER阳性及PgR阳性FFPE组织切片用不识别切断SEQ ID NO:2的肽的酶处理，黑色的峰也示比灰色高的荧光强度，一同检测到ER及PgR。一方面，在ER及PgR阴性FFPE组织切片上检测不到ER及PgR。
＜实施例10：使用不同的热处理用抗原活化剂时的固定化乳腺癌细胞中的Ki-67及细胞角蛋白的信号的比较＞
【1.材料及方法】
将用福尔马林固定化的乳腺癌细胞株MDA-MB-231使用3种抗原活化剂而进行由热处理的抗原活化，凝血酶处理后，进行免疫荧光染色，将细胞角蛋白和Ki-67用流式细胞仪检测。
【1-1.细胞】
使用从ATCC(American Type Culture Collection)入手的乳腺癌细胞株MDA-MB-231。
【1-2.细胞培养和福尔马林固定】
与参考例2同样地进行。
【1-4A.由热处理的抗原活化(Histo VT ONE)】
进行与参考例1同样的处理。
【1-4B.由热处理的抗原活化(抗原活化液pH9)】
使用抗原活化液pH9(Nichirei Biosciences)。处理的顺序及条件与参考例1同样地进行。
【1-4C.由热处理的抗原活化(ImmunoSaver)】
使用抗原活化液ImmunoSaver(日新EM)。处理的顺序及条件与参考例1同样地进行。
【1-5.由酶的抗原活化】
与实施例1同样地处理。
【1-7.免疫荧光染色】
与参考例2同样地进行。
【1-8.流式细胞仪测定】
与参考例2同样地进行。
【1-9.细胞角蛋白及Ki-67的阳性率的算出】
与参考例3同样地进行。
【2.结果】
在图17显示使得用抗Ki-67抗体或抗细胞角蛋白抗体检测的荧光强度的直方图(黑色实线)和用它们的同种型对照抗体检测的荧光强度的直方图(灰色虚线)重合的图(上段：Ki-67；下段：细胞角蛋白)。在任何活化液中，黑色的峰均示比灰色高的荧光强度。由这些确认，福尔马林固定化细胞中的细胞角蛋白及Ki-67的检测，确认即使变更活化液也有用。
＜实施例11：在提取细胞核的工序中的各种破碎方法对FFPE组织切片中的细胞角蛋白及Ki-67的检测的影响＞
【1.材料及方法】
使用乳腺癌组织的FFPE组织切片，使用3种破碎方法、及破碎方法的组合而提取细胞核，使用流式细胞仪而比较细胞角蛋白及Ki-67的信号强度。
【1-1.FFPE组织块】
使用在参考例1中使用的FFPE组织块。
【1-2.FFPE切片的制成】
与参考例3同样地进行。
【1-3.脱石蜡/亲水化】
与参考例1同样地进行。
【1-4.由热处理的抗原活化】
与参考例1同样地进行。
【1-5.由酶的抗原活化】
与实施例1同样地处理。
【1-6A.捣碎器】
使用Nippi公司的生物捣碎器(注册商标)II，冰冷下、在TBS1mL中将酶处理后的组织捣碎20次。
【1-6B.研钵】
使用研钵和乳棒，在TBS1mL中捣碎酶处理后的组织。
【1-6C.超声波破碎】
使用SONICS&MATERIALS公司的超声波破碎装置(VC×130PB)，冰冷下、TBS1mL中将酶处理后的组织用输出强度40％破碎20秒钟。
【1-6D.水流破碎和超声波破碎的组合】
使用Sysmex公司的水流剪切装置(RP-10)，冰冷下、在TBS1mL中将酶处理后的组织以10,000rpm破碎1分钟。再者，使用SONICS&MATERIALS公司的超声波破碎装置(VC×130PB)，冰冷下、在TBS1mL中将水流破碎后的组织用输出强度20％破碎30秒钟。
【1-7.免疫荧光染色】
与参考例2同样地进行。
【1-8.流式细胞仪测定】
与参考例2同样地进行。
【1-9.细胞角蛋白及Ki-67阳性率的算出】
在得到的测定数据的解析中使用FLOWJO LLC公司制软件FlowJo v10。以DAPI的荧光量作为横轴、以细胞(核)个数作为纵轴，以横轴的荧光量是5～150的区域作为细胞核选通。细胞角蛋白及Ki-67的阳性率作为全细胞核中的细胞角蛋白阳性核数及Ki-67的阳性核数的比例算出。阳性核的阈值作为同种型对照的90百分率值。
【2.结果】
在图18显示使得用抗细胞角蛋白抗体或抗Ki-67抗体检测的荧光强度的直方图(黑色实线)和用它们的同种型对照抗体检测的荧光强度的直方图(灰色虚线)重合的图。在任何破碎方法中，黑色实线的峰均示比灰色虚线高的荧光强度。由这些确认，使用各种破碎方法能检测FFPE组织切片中的细胞角蛋白及Ki-67。
＜实施例12：由超声波破碎的淋巴细胞的优先的破碎＞
【1.材料及方法】
使用用福尔马林固定化的乳腺癌细胞株及成淋巴细胞性细胞株，确认超声波破碎是否影响细胞核的取得。
【1-1.细胞】
从ATCC(American Type Culture Collection)入手乳腺癌细胞株SKBr3及MDA-MB-231、以及成淋巴细胞性细胞株Jurkat而使用。
【1-2.细胞培养和福尔马林固定】
【1-4.由热处理的抗原活化】
与参考例1同样地处理。
【1-5.由酶的抗原活化处理】
与实施例1同样地处理。
【1-6.超声波破碎】
使用SONICS&MATERIALS公司的超声波破碎装置(VC×130PB)，冰冷下、在TBS1mL中将酶处理后的细胞用输出强度20％破碎30秒钟。
【1-7.细胞核染色】
添加对细胞核进行染色的染料DAPI Solution(和光)，遮光反应20分钟。
【1-8.流式细胞仪测定】
与参考例2同样地进行。
【2.结果】
在图19显示以前方散射作为横轴、以侧方散射作为纵轴的各细胞株的散点图。在乳腺癌细胞SKBr3及MDA-MB-231中，由超声波破碎的有无确认主要的细胞核区域的位置不改变。一方面，在淋巴细胞Jurkat中，由超声波破碎而主要的细胞核区域消失。从而提示，上皮细胞不由超声波破碎破坏，优先超声波破碎淋巴细胞母细胞性细胞。
＜实施例13：由表面活性剂的添加的解析细胞核数的增加＞
【1.材料及方法】
使用乳腺癌组织的FFPE组织切片，在超声波破碎时添加表面活性剂，确认是否导致细胞核的取得变化。
【1-1.FFPE组织块】
由从Proteogenex公司购入的IHC法使用从Ki-67阳性率不同的2人的乳腺癌患者得到的2种FFPE组织块。
【1-2.FFPE切片的制成】
与参考例3同样地进行。
【1-3.脱石蜡/亲水化】
与参考例1同样地进行。
【1-4.由热处理的抗原活化】
与参考例1同样地进行。
【1-5.由酶的抗原活化处理】
与实施例1同样地处理。
【1-6.超声波破碎】
使用SONICS&MATERIALS公司的超声波破碎装置(VC×130PB)，冰冷下、在TBS、含1％CHAPS(和光)的TBS、含1％NP-40(和光)的TBS、或者含1％Triton-X100(和光)的TBS1mL中将由酶抗原活化后的组织及细胞用输出强度20％破碎30秒钟。
【1-7.细胞核染色】
添加对细胞核进行染色的染料DAPI Solution(和光)，遮光反应20分钟。
【1-8.流式细胞仪测定】
与参考例2同样地进行。
【2.结果】
在图20显示在未添加表面活性剂的缓冲液中超声波破碎时和在添加上述各种表面活性剂的缓冲液中超声波破碎时，以前方散射作为横轴、以侧方散射作为纵轴的散点图，在表3显示流式细胞仪测定时的总解析细胞核数。由表面活性剂的添加，确认到总解析细胞核数增加。
【表3】
受试体A 受试体B
TBS(表面活性剂未添加) 131027 40642
+1％的CHAPS 144233 72561
+1％的NP-40 289745 91164
+1％的Triton-X100 216606 97388
＜比较例2：由不同的病理医的Ki-67阳性细胞的测定＞
【1.材料及方法】
确认由2名的病理医算出的IHC法的FFPE组织切片中的Ki-67阳性率的相关性。
【1-1.FFPE组织块】
由从Proteogenex公司购入的IHC法使用从Ki-67阳性率不同的38人的患者得到的38种FFPE组织块。
【1-10.由IHC法的Ki-67阳性率算出】
与在实施例5中言及的同样地实施。
【2.结果】
在图21显示结果。得知，即使是相同样品，也由病理医，Ki-67阳性率成为不同的值，偏差比较大。
＜参考例4：用各种消化酶的抗原活化后的识别部位不同的抗Ki-67抗体的检测＞
【1.材料及方法】
使用用福尔马林固定化的乳腺癌细胞，3种消化酶(凝血酶、分散酶、蛋白酶K)的任何进行抗原活化后，荧光免疫染色，使用流式细胞仪而检测Ki-67及细胞角蛋白。
【1-1.细胞】
使用在参考例2中使用的3种乳腺癌细胞株。
【1-2.细胞培养和福尔马林固定】
与参考例2同样地进行。
【1-4.由热处理的抗原活化】
进行与参考例1同样的处理。
【1-5A.由酶的抗原活化(凝血酶)】
与实施例1同样地处理。
【1-5B.由酶的抗原活化(分散酶)】
与实施例6同样地处理。
【1-5C.由酶的抗原活化(蛋白酶K)】
与实施例6同样地处理。
【1-7.免疫荧光染色】
与参考例2同样地进行。其中，第1抗体使用Ki-67抗体(Millipore、克隆：S5(Ki-S5)、小鼠单克隆抗体)、及pan-细胞角蛋白抗体(Abcam、兔多克隆抗体)，作为第2抗体，使用Thermofisher公司山羊抗小鼠第二抗体Alexa 647、及Abcam公司山羊抗兔第二抗体Alexa488。
【1-8.流式细胞仪测定】
与参考例2同样地进行。
【1-9.Ki-67阳性率的算出】
与参考例3同样地进行。
【2.结果】
在图22A及B显示使得用抗Ki-67抗体(Ki-S5)或抗细胞角蛋白抗体检测的荧光强度的直方图(黑色实线)和用它们的同种型对照检测的荧光强度的直方图(灰色虚线)重合的图。在用任何酶进行抗原活化时，黑色实线的峰均示比灰色虚线高的荧光强度。从这些确认在用任何酶进行抗原活化时均能保持抗Ki-67抗体(Ki-S5)及抗细胞角蛋白抗体的抗原识别部位，Ki-67及细胞角蛋白的检测。
＜实施例14：在FFPE组织切片中的细胞角蛋白及Ki-67阳性核判断中的阈值的探讨＞
【1.材料及方法】
用流式细胞仪检测FFPE组织切片中的细胞角蛋白及Ki-67来源的信号，算出使阳性核的阈值改变时的阳性率。
【1-1.FFPE组织块】
使用在参考例1中使用的FFPE组织块。
【1-2.FFPE切片的制成】
与参考例3同样地进行。
【1-3.脱石蜡/亲水化】
与参考例1同样地进行。
【1-4.由热处理的抗原活化】
与参考例1同样地进行。
【1-5.由酶的抗原活化】
与实施例1同样地进行。
【1-6.水流破碎和超声波破碎的组合】
使用Sysmex公司的水流剪切装置(RP-10)，冰冷下、在TBS1mL中将酶处理后的组织以10,000rpm破碎1分钟。再者，使用SONICS&MATERIALS公司的超声波破碎装置(VC×130PB)，冰冷下、在TBS1mL中将水流破碎后的组织用输出强度20％破碎30秒钟。
【1-7.免疫荧光染色】
与参考例2同样地进行。
【1-8.流式细胞仪测定】
与参考例2同样地进行。
【1-9.细胞角蛋白及Ki-67阳性率的算出】
在得到的测定数据的解析中使用FLOWJO LLC公司制软件FlowJo v10。以DAPI的荧光量作为横轴、以细胞(核)个数作为纵轴，以横轴的荧光量是5～150的区域作为细胞核选通。细胞角蛋白及Ki-67的阳性率作为全细胞核中的细胞角蛋白阳性核数及Ki-67的阳性核数的比例算出。阳性核的阈值作为同种型对照的60、70、80、90及95百分率值。阳性率用利用流式细胞仪的检测值-(100-阈值)算出。
【2.结果】
在图23显示使阈值改变，使得用抗细胞角蛋白抗体及抗Ki-67抗体检测的荧光强度的直方图(黑色实线)和用它们的同种型对照抗体检测的荧光强度的直方图(灰色虚线)重合的图。在使用任何阈值时均算出阳性率。从而，细胞角蛋白及Ki-67阳性率能不依据阈值而算出。
＜实施例15：FFPE组织切片中的HER2的检测＞
【1.材料及方法】
各自使用HER2阳性(受试体A：Score 3+)及阴性(受试体B：Score 0)变得已知的FFPE组织切片，由水流破碎及超声波破碎提取细胞核，由FISH法确认HER2的扩增。
【1-1.FFPE组织块】
使用在参考例1中使用的FFPE组织块。
【1-2.FFPE切片的制成】
与参考例3同样地进行。
【1-3.脱石蜡/亲水化】
与参考例1同样地进行。
【1-4.由热处理的抗原活化】
与参考例1同样地进行。
【1-5.由酶的抗原活化】
与实施例1同样地进行。
【1-6.水流破碎和超声波破碎的组合】
使用Sysmex公司的水流剪切装置(RP-10)，冰冷下、在TBS1mL中将酶处理后的组织以10,000rpm破碎1分钟。再者，使用SONICS&MATERIALS公司的超声波破碎装置(VC×130PB)，冰冷下、在TBS1mL中将水流破碎后的组织用输出强度20％破碎30秒钟。
【1-7.由FISH的HER2的检测】
将组织破碎后的样品载乘到载玻片上，干燥后，向10％中性缓冲福尔马林于室温浸渍10分钟。将载玻片用TBS清洗，风干后，使用PathVysion(R)HER-2DNA探针试剂盒(Abbot)而进行(操作FISH染色根据试剂盒附带书类)。
【1-8.荧光显微镜】
在显微镜观察中，使用一体式荧光显微镜BZ-X710(KEYENCE)。在观察时使用DAPI滤镜(Ex 360nm、Em 460nm)、TRITC滤镜(Ex 545nm、Em 605nm)。物镜使用20倍。
【2.结果】
在图24显示用荧光显微镜观测的细胞核。可在HER2阳性FFPE组织切片中检测到HER2来源的荧光信号，一方面，确认在HER2阴性FFPE组织切片中未检测到。
【产业上的利用可能性】
由本申请发明确立客观性、再现性、普遍性高的Ki-67阳性细胞的检测(定量)方法。而且，通过对ER阳性细胞、PgR阳性细胞、Her2阳性细胞进行定量，使癌的内源性亚型的分类变得可能。
通过使用由本发明提供的流程(包括含由指定的酶的抗原活化的预处理过程)，达成从FFPE组织切片增强目标抗原的抗原性的细胞核的脱离。回收的分散细胞核能作为单一的细胞核解析。例如，核膜上或核内的蛋白质、核酸等成为解析对象，通过由染料(荧光)染色的形态的观察，或使用用酶或荧光染料标记的抗体、核酸等的配体，可检测这些对象。本申请发明的方法、抗原活化剂及试剂盒可在由显微镜的形态观测、由IHC、EIA、CLEIA、数字PCR的解析或利用成像细胞仪或流式细胞仪的细胞计量术解析中利用。特别是，根据本申请发明的优选的实施方式，能在由流式细胞术解析的脱离核中的对象蛋白质的阳性核的比例(特别是Ki-67阳性率)的算出中利用。
通过使用由本发明提供的流程(包括含由指定的酶的抗原活化的预处理过程)，能提供偏差少的病理诊断的指标。
进而，能使用此偏差少的指标而向患者提供最适的诊断方案。抗癌剂治疗对于其本身患者的负担也大，在治疗开始前决定患者的治疗方案在保持患者的QOL(QualityofLife)上也是重要的。在本申请发明的情况中，不仅能应用于外科手术前的化学治疗(术前抗癌剂治疗)的治疗方案，还可在外科手术中应用于肿瘤摘出后的(预后)治疗方案。
序列表
<110> NITTO BOSEKI CO LTD
<120> 从固定化细胞或FFPE组织切片脱离增强抗原性的细胞核的方法以及用于该方法的抗原活化剂及试剂盒
<130> A00243WO01
<150> JP2018-035696
<151> 2018-02-28
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 3256
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 1
Met Trp Pro Thr Arg Arg Leu Val Thr Ile Lys Arg Ser Gly Val Asp
1 5 10 15
Gly Pro His Phe Pro Leu Ser Leu Ser Thr Cys Leu Phe Gly Arg Gly
20 25 30
Ile Glu Cys Asp Ile Arg Ile Gln Leu Pro Val Val Ser Lys Gln His
35 40 45
Cys Lys Ile Glu Ile His Glu Gln Glu Ala Ile Leu His Asn Phe Ser
50 55 60
Ser Thr Asn Pro Thr Gln Val Asn Gly Ser Val Ile Asp Glu Pro Val
65 70 75 80
Arg Leu Lys His Gly Asp Val Ile Thr Ile Ile Asp Arg Ser Phe Arg
85 90 95
Tyr Glu Asn Glu Ser Leu Gln Asn Gly Arg Lys Ser Thr Glu Phe Pro
100 105 110
Arg Lys Ile Arg Glu Gln Glu Pro Ala Arg Arg Val Ser Arg Ser Ser
115 120 125
Phe Ser Ser Asp Pro Asp Glu Lys Ala Gln Asp Ser Lys Ala Tyr Ser
130 135 140
Lys Ile Thr Glu Gly Lys Val Ser Gly Asn Pro Gln Val His Ile Lys
145 150 155 160
Asn Val Lys Glu Asp Ser Thr Ala Asp Asp Ser Lys Asp Ser Val Ala
165 170 175
Gln Gly Thr Thr Asn Val His Ser Ser Glu His Ala Gly Arg Asn Gly
180 185 190
Arg Asn Ala Ala Asp Pro Ile Ser Gly Asp Phe Lys Glu Ile Ser Ser
195 200 205
Val Lys Leu Val Ser Arg Tyr Gly Glu Leu Lys Ser Val Pro Thr Thr
210 215 220
Gln Cys Leu Asp Asn Ser Lys Lys Asn Glu Ser Pro Phe Trp Lys Leu
225 230 235 240
Tyr Glu Ser Val Lys Lys Glu Leu Asp Val Lys Ser Gln Lys Glu Asn
245 250 255
Val Leu Gln Tyr Cys Arg Lys Ser Gly Leu Gln Thr Asp Tyr Ala Thr
260 265 270
Glu Lys Glu Ser Ala Asp Gly Leu Gln Gly Glu Thr Gln Leu Leu Val
275 280 285
Ser Arg Lys Ser Arg Pro Lys Ser Gly Gly Ser Gly His Ala Val Ala
290 295 300
Glu Pro Ala Ser Pro Glu Gln Glu Leu Asp Gln Asn Lys Gly Lys Gly
305 310 315 320
Arg Asp Val Glu Ser Val Gln Thr Pro Ser Lys Ala Val Gly Ala Ser
325 330 335
Phe Pro Leu Tyr Glu Pro Ala Lys Met Lys Thr Pro Val Gln Tyr Ser
340 345 350
Gln Gln Gln Asn Ser Pro Gln Lys His Lys Asn Lys Asp Leu Tyr Thr
355 360 365
Thr Gly Arg Arg Glu Ser Val Asn Leu Gly Lys Ser Glu Gly Phe Lys
370 375 380
Ala Gly Asp Lys Thr Leu Thr Pro Arg Lys Leu Ser Thr Arg Asn Arg
385 390 395 400
Thr Pro Ala Lys Val Glu Asp Ala Ala Asp Ser Ala Thr Lys Pro Glu
405 410 415
Asn Leu Ser Ser Lys Thr Arg Gly Ser Ile Pro Thr Asp Val Glu Val
420 425 430
Leu Pro Thr Glu Thr Glu Ile His Asn Glu Pro Phe Leu Thr Leu Trp
435 440 445
Leu Thr Gln Val Glu Arg Lys Ile Gln Lys Asp Ser Leu Ser Lys Pro
450 455 460
Glu Lys Leu Gly Thr Thr Ala Gly Gln Met Cys Ser Gly Leu Pro Gly
465 470 475 480
Leu Ser Ser Val Asp Ile Asn Asn Phe Gly Asp Ser Ile Asn Glu Ser
485 490 495
Glu Gly Ile Pro Leu Lys Arg Arg Arg Val Ser Phe Gly Gly His Leu
500 505 510
Arg Pro Glu Leu Phe Asp Glu Asn Leu Pro Pro Asn Thr Pro Leu Lys
515 520 525
Arg Gly Glu Ala Pro Thr Lys Arg Lys Ser Leu Val Met His Thr Pro
530 535 540
Pro Val Leu Lys Lys Ile Ile Lys Glu Gln Pro Gln Pro Ser Gly Lys
545 550 555 560
Gln Glu Ser Gly Ser Glu Ile His Val Glu Val Lys Ala Gln Ser Leu
565 570 575
Val Ile Ser Pro Pro Ala Pro Ser Pro Arg Lys Thr Pro Val Ala Ser
580 585 590
Asp Gln Arg Arg Arg Ser Cys Lys Thr Ala Pro Ala Ser Ser Ser Lys
595 600 605
Ser Gln Thr Glu Val Pro Lys Arg Gly Gly Arg Lys Ser Gly Asn Leu
610 615 620
Pro Ser Lys Arg Val Ser Ile Ser Arg Ser Gln His Asp Ile Leu Gln
625 630 635 640
Met Ile Cys Ser Lys Arg Arg Ser Gly Ala Ser Glu Ala Asn Leu Ile
645 650 655
Val Ala Lys Ser Trp Ala Asp Val Val Lys Leu Gly Ala Lys Gln Thr
660 665 670
Gln Thr Lys Val Ile Lys His Gly Pro Gln Arg Ser Met Asn Lys Arg
675 680 685
Gln Arg Arg Pro Ala Thr Pro Lys Lys Pro Val Gly Glu Val His Ser
690 695 700
Gln Phe Ser Thr Gly His Ala Asn Ser Pro Cys Thr Ile Ile Ile Gly
705 710 715 720
Lys Ala His Thr Glu Lys Val His Val Pro Ala Arg Pro Tyr Arg Val
725 730 735
Leu Asn Asn Phe Ile Ser Asn Gln Lys Met Asp Phe Lys Glu Asp Leu
740 745 750
Ser Gly Ile Ala Glu Met Phe Lys Thr Pro Val Lys Glu Gln Pro Gln
755 760 765
Leu Thr Ser Thr Cys His Ile Ala Ile Ser Asn Ser Glu Asn Leu Leu
770 775 780
Gly Lys Gln Phe Gln Gly Thr Asp Ser Gly Glu Glu Pro Leu Leu Pro
785 790 795 800
Thr Ser Glu Ser Phe Gly Gly Asn Val Phe Phe Ser Ala Gln Asn Ala
805 810 815
Ala Lys Gln Pro Ser Asp Lys Cys Ser Ala Ser Pro Pro Leu Arg Arg
820 825 830
Gln Cys Ile Arg Glu Asn Gly Asn Val Ala Lys Thr Pro Arg Asn Thr
835 840 845
Tyr Lys Met Thr Ser Leu Glu Thr Lys Thr Ser Asp Thr Glu Thr Glu
850 855 860
Pro Ser Lys Thr Val Ser Thr Ala Asn Arg Ser Gly Arg Ser Thr Glu
865 870 875 880
Phe Arg Asn Ile Gln Lys Leu Pro Val Glu Ser Lys Ser Glu Glu Thr
885 890 895
Asn Thr Glu Ile Val Glu Cys Ile Leu Lys Arg Gly Gln Lys Ala Thr
900 905 910
Leu Leu Gln Gln Arg Arg Glu Gly Glu Met Lys Glu Ile Glu Arg Pro
915 920 925
Phe Glu Thr Tyr Lys Glu Asn Ile Glu Leu Lys Glu Asn Asp Glu Lys
930 935 940
Met Lys Ala Met Lys Arg Ser Arg Thr Trp Gly Gln Lys Cys Ala Pro
945 950 955 960
Met Ser Asp Leu Thr Asp Leu Lys Ser Leu Pro Asp Thr Glu Leu Met
965 970 975
Lys Asp Thr Ala Arg Gly Gln Asn Leu Leu Gln Thr Gln Asp His Ala
980 985 990
Lys Ala Pro Lys Ser Glu Lys Gly Lys Ile Thr Lys Met Pro Cys Gln
995 1000 1005
Ser Leu Gln Pro Glu Pro Ile Asn Thr Pro Thr His Thr Lys Gln
1010 1015 1020
Gln Leu Lys Ala Ser Leu Gly Lys Val Gly Val Lys Glu Glu Leu
1025 1030 1035
Leu Ala Val Gly Lys Phe Thr Arg Thr Ser Gly Glu Thr Thr His
1040 1045 1050
Thr His Arg Glu Pro Ala Gly Asp Gly Lys Ser Ile Arg Thr Phe
1055 1060 1065
Lys Glu Ser Pro Lys Gln Ile Leu Asp Pro Ala Ala Arg Val Thr
1070 1075 1080
Gly Met Lys Lys Trp Pro Arg Thr Pro Lys Glu Glu Ala Gln Ser
1085 1090 1095
Leu Glu Asp Leu Ala Gly Phe Lys Glu Leu Phe Gln Thr Pro Gly
1100 1105 1110
Pro Ser Glu Glu Ser Met Thr Asp Glu Lys Thr Thr Lys Ile Ala
1115 1120 1125
Cys Lys Ser Pro Pro Pro Glu Ser Val Asp Thr Pro Thr Ser Thr
1130 1135 1140
Lys Gln Trp Pro Lys Arg Ser Leu Arg Lys Ala Asp Val Glu Glu
1145 1150 1155
Glu Phe Leu Ala Leu Arg Lys Leu Thr Pro Ser Ala Gly Lys Ala
1160 1165 1170
Met Leu Thr Pro Lys Pro Ala Gly Gly Asp Glu Lys Asp Ile Lys
1175 1180 1185
Ala Phe Met Gly Thr Pro Val Gln Lys Leu Asp Leu Ala Gly Thr
1190 1195 1200
Leu Pro Gly Ser Lys Arg Gln Leu Gln Thr Pro Lys Glu Lys Ala
1205 1210 1215
Gln Ala Leu Glu Asp Leu Ala Gly Phe Lys Glu Leu Phe Gln Thr
1220 1225 1230
Pro Gly His Thr Glu Glu Leu Val Ala Ala Gly Lys Thr Thr Lys
1235 1240 1245
Ile Pro Cys Asp Ser Pro Gln Ser Asp Pro Val Asp Thr Pro Thr
1250 1255 1260
Ser Thr Lys Gln Arg Pro Lys Arg Ser Ile Arg Lys Ala Asp Val
1265 1270 1275
Glu Gly Glu Leu Leu Ala Cys Arg Asn Leu Met Pro Ser Ala Gly
1280 1285 1290
Lys Ala Met His Thr Pro Lys Pro Ser Val Gly Glu Glu Lys Asp
1295 1300 1305
Ile Ile Ile Phe Val Gly Thr Pro Val Gln Lys Leu Asp Leu Thr
1310 1315 1320
Glu Asn Leu Thr Gly Ser Lys Arg Arg Pro Gln Thr Pro Lys Glu
1325 1330 1335
Glu Ala Gln Ala Leu Glu Asp Leu Thr Gly Phe Lys Glu Leu Phe
1340 1345 1350
Gln Thr Pro Gly His Thr Glu Glu Ala Val Ala Ala Gly Lys Thr
1355 1360 1365
Thr Lys Met Pro Cys Glu Ser Ser Pro Pro Glu Ser Ala Asp Thr
1370 1375 1380
Pro Thr Ser Thr Arg Arg Gln Pro Lys Thr Pro Leu Glu Lys Arg
1385 1390 1395
Asp Val Gln Lys Glu Leu Ser Ala Leu Lys Lys Leu Thr Gln Thr
1400 1405 1410
Ser Gly Glu Thr Thr His Thr Asp Lys Val Pro Gly Gly Glu Asp
1415 1420 1425
Lys Ser Ile Asn Ala Phe Arg Glu Thr Ala Lys Gln Lys Leu Asp
1430 1435 1440
Pro Ala Ala Ser Val Thr Gly Ser Lys Arg His Pro Lys Thr Lys
1445 1450 1455
Glu Lys Ala Gln Pro Leu Glu Asp Leu Ala Gly Leu Lys Glu Leu
1460 1465 1470
Phe Gln Thr Pro Val Cys Thr Asp Lys Pro Thr Thr His Glu Lys
1475 1480 1485
Thr Thr Lys Ile Ala Cys Arg Ser Gln Pro Asp Pro Val Asp Thr
1490 1495 1500
Pro Thr Ser Ser Lys Pro Gln Ser Lys Arg Ser Leu Arg Lys Val
1505 1510 1515
Asp Val Glu Glu Glu Phe Phe Ala Leu Arg Lys Arg Thr Pro Ser
1520 1525 1530
Ala Gly Lys Ala Met His Thr Pro Lys Pro Ala Val Ser Gly Glu
1535 1540 1545
Lys Asn Ile Tyr Ala Phe Met Gly Thr Pro Val Gln Lys Leu Asp
1550 1555 1560
Leu Thr Glu Asn Leu Thr Gly Ser Lys Arg Arg Leu Gln Thr Pro
1565 1570 1575
Lys Glu Lys Ala Gln Ala Leu Glu Asp Leu Ala Gly Phe Lys Glu
1580 1585 1590
Leu Phe Gln Thr Arg Gly His Thr Glu Glu Ser Met Thr Asn Asp
1595 1600 1605
Lys Thr Ala Lys Val Ala Cys Lys Ser Ser Gln Pro Asp Pro Asp
1610 1615 1620
Lys Asn Pro Ala Ser Ser Lys Arg Arg Leu Lys Thr Ser Leu Gly
1625 1630 1635
Lys Val Gly Val Lys Glu Glu Leu Leu Ala Val Gly Lys Leu Thr
1640 1645 1650
Gln Thr Ser Gly Glu Thr Thr His Thr His Thr Glu Pro Thr Gly
1655 1660 1665
Asp Gly Lys Ser Met Lys Ala Phe Met Glu Ser Pro Lys Gln Ile
1670 1675 1680
Leu Asp Ser Ala Ala Ser Leu Thr Gly Ser Lys Arg Gln Leu Arg
1685 1690 1695
Thr Pro Lys Gly Lys Ser Glu Val Pro Glu Asp Leu Ala Gly Phe
1700 1705 1710
Ile Glu Leu Phe Gln Thr Pro Ser His Thr Lys Glu Ser Met Thr
1715 1720 1725
Asn Glu Lys Thr Thr Lys Val Ser Tyr Arg Ala Ser Gln Pro Asp
1730 1735 1740
Leu Val Asp Thr Pro Thr Ser Ser Lys Pro Gln Pro Lys Arg Ser
1745 1750 1755
Leu Arg Lys Ala Asp Thr Glu Glu Glu Phe Leu Ala Phe Arg Lys
1760 1765 1770
Gln Thr Pro Ser Ala Gly Lys Ala Met His Thr Pro Lys Pro Ala
1775 1780 1785
Val Gly Glu Glu Lys Asp Ile Asn Thr Phe Leu Gly Thr Pro Val
1790 1795 1800
Gln Lys Leu Asp Gln Pro Gly Asn Leu Pro Gly Ser Asn Arg Arg
1805 1810 1815
Leu Gln Thr Arg Lys Glu Lys Ala Gln Ala Leu Glu Glu Leu Thr
1820 1825 1830
Gly Phe Arg Glu Leu Phe Gln Thr Pro Cys Thr Asp Asn Pro Thr
1835 1840 1845
Thr Asp Glu Lys Thr Thr Lys Lys Ile Leu Cys Lys Ser Pro Gln
1850 1855 1860
Ser Asp Pro Ala Asp Thr Pro Thr Asn Thr Lys Gln Arg Pro Lys
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Arg Ser Leu Lys Lys Ala Asp Val Glu Glu Glu Phe Leu Ala Phe
1880 1885 1890
Arg Lys Leu Thr Pro Ser Ala Gly Lys Ala Met His Thr Pro Lys
1895 1900 1905
Ala Ala Val Gly Glu Glu Lys Asp Ile Asn Thr Phe Val Gly Thr
1910 1915 1920
Pro Val Glu Lys Leu Asp Leu Leu Gly Asn Leu Pro Gly Ser Lys
1925 1930 1935
Arg Arg Pro Gln Thr Pro Lys Glu Lys Ala Lys Ala Leu Glu Asp
1940 1945 1950
Leu Ala Gly Phe Lys Glu Leu Phe Gln Thr Pro Gly His Thr Glu
1955 1960 1965
Glu Ser Met Thr Asp Asp Lys Ile Thr Glu Val Ser Cys Lys Ser
1970 1975 1980
Pro Gln Pro Asp Pro Val Lys Thr Pro Thr Ser Ser Lys Gln Arg
1985 1990 1995
Leu Lys Ile Ser Leu Gly Lys Val Gly Val Lys Glu Glu Val Leu
2000 2005 2010
Pro Val Gly Lys Leu Thr Gln Thr Ser Gly Lys Thr Thr Gln Thr
2015 2020 2025
His Arg Glu Thr Ala Gly Asp Gly Lys Ser Ile Lys Ala Phe Lys
2030 2035 2040
Glu Ser Ala Lys Gln Met Leu Asp Pro Ala Asn Tyr Gly Thr Gly
2045 2050 2055
Met Glu Arg Trp Pro Arg Thr Pro Lys Glu Glu Ala Gln Ser Leu
2060 2065 2070
Glu Asp Leu Ala Gly Phe Lys Glu Leu Phe Gln Thr Pro Asp His
2075 2080 2085
Thr Glu Glu Ser Thr Thr Asp Asp Lys Thr Thr Lys Ile Ala Cys
2090 2095 2100
Lys Ser Pro Pro Pro Glu Ser Met Asp Thr Pro Thr Ser Thr Arg
2105 2110 2115
Arg Arg Pro Lys Thr Pro Leu Gly Lys Arg Asp Ile Val Glu Glu
2120 2125 2130
Leu Ser Ala Leu Lys Gln Leu Thr Gln Thr Thr His Thr Asp Lys
2135 2140 2145
Val Pro Gly Asp Glu Asp Lys Gly Ile Asn Val Phe Arg Glu Thr
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Ala Lys Gln Lys Leu Asp Pro Ala Ala Ser Val Thr Gly Ser Lys
2165 2170 2175
Arg Gln Pro Arg Thr Pro Lys Gly Lys Ala Gln Pro Leu Glu Asp
2180 2185 2190
Leu Ala Gly Leu Lys Glu Leu Phe Gln Thr Pro Ile Cys Thr Asp
2195 2200 2205
Lys Pro Thr Thr His Glu Lys Thr Thr Lys Ile Ala Cys Arg Ser
2210 2215 2220
Pro Gln Pro Asp Pro Val Gly Thr Pro Thr Ile Phe Lys Pro Gln
2225 2230 2235
Ser Lys Arg Ser Leu Arg Lys Ala Asp Val Glu Glu Glu Ser Leu
2240 2245 2250
Ala Leu Arg Lys Arg Thr Pro Ser Val Gly Lys Ala Met Asp Thr
2255 2260 2265
Pro Lys Pro Ala Gly Gly Asp Glu Lys Asp Met Lys Ala Phe Met
2270 2275 2280
Gly Thr Pro Val Gln Lys Leu Asp Leu Pro Gly Asn Leu Pro Gly
2285 2290 2295
Ser Lys Arg Trp Pro Gln Thr Pro Lys Glu Lys Ala Gln Ala Leu
2300 2305 2310
Glu Asp Leu Ala Gly Phe Lys Glu Leu Phe Gln Thr Pro Gly Thr
2315 2320 2325
Asp Lys Pro Thr Thr Asp Glu Lys Thr Thr Lys Ile Ala Cys Lys
2330 2335 2340
Ser Pro Gln Pro Asp Pro Val Asp Thr Pro Ala Ser Thr Lys Gln
2345 2350 2355
Arg Pro Lys Arg Asn Leu Arg Lys Ala Asp Val Glu Glu Glu Phe
2360 2365 2370
Leu Ala Leu Arg Lys Arg Thr Pro Ser Ala Gly Lys Ala Met Asp
2375 2380 2385
Thr Pro Lys Pro Ala Val Ser Asp Glu Lys Asn Ile Asn Thr Phe
2390 2395 2400
Val Glu Thr Pro Val Gln Lys Leu Asp Leu Leu Gly Asn Leu Pro
2405 2410 2415
Gly Ser Lys Arg Gln Pro Gln Thr Pro Lys Glu Lys Ala Glu Ala
2420 2425 2430
Leu Glu Asp Leu Val Gly Phe Lys Glu Leu Phe Gln Thr Pro Gly
2435 2440 2445
His Thr Glu Glu Ser Met Thr Asp Asp Lys Ile Thr Glu Val Ser
2450 2455 2460
Cys Lys Ser Pro Gln Pro Glu Ser Phe Lys Thr Ser Arg Ser Ser
2465 2470 2475
Lys Gln Arg Leu Lys Ile Pro Leu Val Lys Val Asp Met Lys Glu
2480 2485 2490
Glu Pro Leu Ala Val Ser Lys Leu Thr Arg Thr Ser Gly Glu Thr
2495 2500 2505
Thr Gln Thr His Thr Glu Pro Thr Gly Asp Ser Lys Ser Ile Lys
2510 2515 2520
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Arg Ala Leu Glu Asp Leu Val Asp Phe Lys Glu Leu Phe Ser Ala
2555 2560 2565
Pro Gly His Thr Glu Glu Ser Met Thr Ile Asp Lys Asn Thr Lys
2570 2575 2580
Ile Pro Cys Lys Ser Pro Pro Pro Glu Leu Thr Asp Thr Ala Thr
2585 2590 2595
Ser Thr Lys Arg Cys Pro Lys Thr Arg Pro Arg Lys Glu Val Lys
2600 2605 2610
Glu Glu Leu Ser Ala Val Glu Arg Leu Thr Gln Thr Ser Gly Gln
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Ser Thr His Thr His Lys Glu Pro Ala Ser Gly Asp Glu Gly Ile
2630 2635 2640
Lys Val Leu Lys Gln Arg Ala Lys Lys Lys Pro Asn Pro Val Glu
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2675 2680 2685
Ser Gly His Thr Gln Glu Ser Leu Thr Ala Gly Lys Ala Thr Lys
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Ser Thr Lys Arg His Leu Arg Thr Arg Val Gln Lys Val Gln Val
2720 2725 2730
Lys Glu Glu Pro Ser Ala Val Lys Phe Thr Gln Thr Ser Gly Glu
2735 2740 2745
Thr Thr Asp Ala Asp Lys Glu Pro Ala Gly Glu Asp Lys Gly Ile
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Ala Gln Ala Ile Glu Asp Leu Ala Gly Phe Lys Asp Pro Ala Ala
2795 2800 2805
Gly His Thr Glu Glu Ser Met Thr Asp Asp Lys Thr Thr Lys Ile
2810 2815 2820
Pro Cys Lys Ser Ser Pro Glu Leu Glu Asp Thr Ala Thr Ser Ser
2825 2830 2835
Lys Arg Arg Pro Arg Thr Arg Ala Gln Lys Val Glu Val Lys Glu
2840 2845 2850
Glu Leu Leu Ala Val Gly Lys Leu Thr Gln Thr Ser Gly Glu Thr
2855 2860 2865
Thr His Thr Asp Lys Glu Pro Val Gly Glu Gly Lys Gly Thr Lys
2870 2875 2880
Ala Phe Lys Gln Pro Ala Lys Arg Lys Leu Asp Ala Glu Asp Val
2885 2890 2895
Ile Gly Ser Arg Arg Gln Pro Arg Ala Pro Lys Glu Lys Ala Gln
2900 2905 2910
Pro Leu Glu Asp Leu Ala Ser Phe Gln Glu Leu Ser Gln Thr Pro
2915 2920 2925
Gly His Thr Glu Glu Leu Ala Asn Gly Ala Ala Asp Ser Phe Thr
2930 2935 2940
Ser Ala Pro Lys Gln Thr Pro Asp Ser Gly Lys Pro Leu Lys Ile
2945 2950 2955
Ser Arg Arg Val Leu Arg Ala Pro Lys Val Glu Pro Val Gly Asp
2960 2965 2970
Val Val Ser Thr Arg Asp Pro Val Lys Ser Gln Ser Lys Ser Asn
2975 2980 2985
Thr Ser Leu Pro Pro Leu Pro Phe Lys Arg Gly Gly Gly Lys Asp
2990 2995 3000
Gly Ser Val Thr Gly Thr Lys Arg Leu Arg Cys Met Pro Ala Pro
3005 3010 3015
Glu Glu Ile Val Glu Glu Leu Pro Ala Ser Lys Lys Gln Arg Val
3020 3025 3030
Ala Pro Arg Ala Arg Gly Lys Ser Ser Glu Pro Val Val Ile Met
3035 3040 3045
Lys Arg Ser Leu Arg Thr Ser Ala Lys Arg Ile Glu Pro Ala Glu
3050 3055 3060
Glu Leu Asn Ser Asn Asp Met Lys Thr Asn Lys Glu Glu His Lys
3065 3070 3075
Leu Gln Asp Ser Val Pro Glu Asn Lys Gly Ile Ser Leu Arg Ser
3080 3085 3090
Arg Arg Gln Asn Lys Thr Glu Ala Glu Gln Gln Ile Thr Glu Val
3095 3100 3105
Phe Val Leu Ala Glu Arg Ile Glu Ile Asn Arg Asn Glu Lys Lys
3110 3115 3120
Pro Met Lys Thr Ser Pro Glu Met Asp Ile Gln Asn Pro Asp Asp
3125 3130 3135
Gly Ala Arg Lys Pro Ile Pro Arg Asp Lys Val Thr Glu Asn Lys
3140 3145 3150
Arg Cys Leu Arg Ser Ala Arg Gln Asn Glu Ser Ser Gln Pro Lys
3155 3160 3165
Val Ala Glu Glu Ser Gly Gly Gln Lys Ser Ala Lys Val Leu Met
3170 3175 3180
Gln Asn Gln Lys Gly Lys Gly Glu Ala Gly Asn Ser Asp Ser Met
3185 3190 3195
Cys Leu Arg Ser Arg Lys Thr Lys Ser Gln Pro Ala Ala Ser Thr
3200 3205 3210
Leu Glu Ser Lys Ser Val Gln Arg Val Thr Arg Ser Val Lys Arg
3215 3220 3225
Cys Ala Glu Asn Pro Lys Lys Ala Glu Asp Asn Val Cys Val Lys
3230 3235 3240
Lys Ile Arg Thr Arg Ser His Arg Asp Ser Glu Asp Ile
3245 3250 3255
<210> 2
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> MIB-1抗体的Ki-67表位
<400> 2
Thr Pro Lys Glu Lys Ala Gln Ala Leu Glu Asp Leu Ala Gly Phe Lys
1 5 10 15
Glu Leu Phe Gln Thr
20

Claims (47)

1.使用抗Ki-67抗体检测含固定化的细胞群中的Ki-67阳性细胞核的细胞的方法，其包括：
(1)将固定化的细胞群用不识别切断SEQ ID NO:2的肽的水解酶预处理而使抗原活化的工序、其后
(2)使用抗Ki-67抗体免疫染色的工序、及
(3)检测被染色的Ki-67阳性细胞或Ki-67阳性细胞核的工序。
2.权利要求1所述的方法，其中所述抗体是选自MIB-1、DAKO-PC、Ki-S5及A-0047的至少一种。
3.权利要求1或2所述的方法，其中所述酶是选自凝血酶、Arg-C(梭菌蛋白酶)肽酶、脯氨酸端肽酶及透明质酸酶的至少一种。
4.权利要求1所述的方法，其中
所述酶是凝血酶及/或透明质酸酶，
所述抗体是MIB-1。
5.权利要求1～4之任一项所述的方法，其中所述固定化的细胞群用选自福尔马林、戊二醛、醇、丙酮及它们的组合的固定化剂固定。
6.权利要求1～5之任一项所述的方法，其中在工序(1)之前包括由热处理活化。
7.权利要求1～6之任一项所述的方法，其还包括：
对细胞核特异性地进行染色，
检测被染色的细胞核。
8.权利要求1～7之任一项所述的方法，其还包括：
使用抗细胞角蛋白抗体免疫染色细胞角蛋白，
检测被染色的阳性细胞。
9.权利要求1～8之任一项所述的方法，其还包括：
使用抗雌激素受体(ER)抗体及/或抗黄体酮受体(PgR)抗体免疫染色ER及/或PgR，
检测被染色的阳性细胞或阳性细胞核。
10.权利要求1～9之任一项所述的方法，其还包括使用与HER2基因杂交的探针检测HER2基因被扩增的细胞或细胞核。
11.权利要求1～10之任一项所述的方法，其中所述固定化的细胞群含在组织切片中。
12.权利要求11所述的方法，其中
所述组织切片用包理剂包理，
在用所述水解酶活化抗原的工序之前，包括除去该包理剂，使该组织切片亲水化的工序。
13.权利要求11或权利要求12所述的方法，其中在工序(1)和工序(2)之间包括破碎所述细胞而提取细胞核的工序。
14.权利要求13所述的方法，其中由剪切应力破碎所述细胞而提取细胞核。
15.权利要求13或14所述的方法，其中在含表面活性剂的缓冲液中提取所述细胞核。
16.权利要求15所述的方法，其中所述表面活性剂是选自CHAPS、NP-40及Triton-X100的至少一种。
17.权利要求1～16之任一项所述的方法，其中对所述被染色的Ki-67阳性细胞或Ki-67阳性细胞核的数进行计数。
18.权利要求1～17之任一项所述的方法，其中
对所述Ki-67阳性细胞或所述Ki-67阳性细胞核进行荧光染色，
使用流式细胞术进行计数。
19.权利要求1～18之任一项所述的方法，其中所述固定化的细胞或所述组织切片是患者来源的。
20.权利要求1～18之任一项所述的方法，其中所述固定化的细胞或所述组织切片是患者的肿瘤组织来源的。
21.权利要求20所述的方法，其中所述固定化的细胞或所述肿瘤组织是乳腺癌细胞或乳腺癌组织。
22.权利要求20或21所述的方法，其用于辅助癌的诊断。
23.权利要求20或21所述的方法，其用于辅助诊断癌治疗的预后。
24.用于确定癌的治疗方案的方法，其由权利要求20或21所述的方法计算细胞群内的Ki-67阳性细胞的比例，
在比例是截止值以上的情况中，选择内分泌疗法和化学疗法的联用；
在比例是低于截止值的情况中，选择单独的内分泌疗法。
25.治疗癌的方法，其由权利要求20或21所述的方法计算细胞群内的Ki-67阳性细胞的比例，
在比例是截止值以上的情况中，选择内分泌疗法和化学疗法的联用而向患者实施；
在比例是低于截止值的情况中，选择单独的内分泌疗法而向患者实施。
26.使Ki-67活化的方法，其中将固定化的肿瘤细胞群或肿瘤组织用不识别切断SEQ IDNO:2的肽的水解酶预处理。
27.在将Ki-67用免疫染色检测的细胞或组织试样中使用的抗原活化剂，其中含不识别切断SEQ ID NO:2的肽的水解酶。
28.权利要求27所述的抗原活化剂，其中所述酶是选自凝血酶、Arg-C(梭菌蛋白酶)肽酶、脯氨酸端肽酶及透明质酸酶的至少一种。
29.权利要求28所述的抗原活化剂，其中所述酶是凝血酶及/或透明质酸酶。
30.在将Ki-67及细胞角蛋白用免疫染色同时检测的细胞或组织试样中使用的抗原活化剂，其中含不识别切断SEQ ID NO:2的肽的水解酶。
31.权利要求27～30之任一项所述的抗原活化剂，其还在将ER及/或PgR免疫染色而检测的细胞或组织试样中使用。
32.权利要求27～31之任一项所述的抗原活化剂，其还在检测扩增HER2基因的细胞的试样中使用。
33.用于检测固定化的细胞中的Ki-67阳性细胞的试剂盒，其含：
不识别切断SEQ ID NO:2的肽的水解酶，和
抗Ki-67抗体。
34.权利要求33所述的试剂盒，其中所述水解酶是选自凝血酶、Arg-C(梭菌蛋白酶)肽酶、脯氨酸端肽酶及透明质酸酶的至少一种。
35.权利要求34所述的试剂盒，其中所述水解酶是凝血酶及/或透明质酸酶。
36.权利要求33～35之任一项所述的试剂盒，其中所述抗Ki-67抗体是选自MIB-1、DAKO-PC、Ki-S5及A-0047的至少一种。
37.权利要求33～36之任一项所述的试剂盒，其还与Ki-67组合而含用于检测为了辅助癌的诊断或为了辅助诊断癌的治疗的预后而使用的其他标志物的配体。
38.权利要求37所述的试剂盒，其中所述配体是选自抗细胞角蛋白抗体、抗ER抗体、抗PgR抗体、及与HER2基因杂交的探针的至少一种。
39.权利要求33～38之任一项所述的试剂盒，其中还含核染色用的化合物。
40.权利要求33～39之任一项所述的试剂盒，其中还含用于使细胞分散的缓冲液，该缓冲液含有表面活性剂。
41.权利要求33～40之任一项所述的试剂盒，其中还含热处理用抗原活化剂。
42.权利要求33～41之任一项所述的试剂盒，其用于辅助癌的诊断。
43.权利要求33～41之任一项所述的试剂盒，其用于辅助诊断癌治疗的预后。
44.权利要求33～41之任一项所述的试剂盒，其用于确定癌的治疗方案。
45.试剂盒，其中所述治疗方案的决定通过计算细胞群内的Ki-67阳性细胞的比例来进行，
在比例是截止值以上的情况中，选择内分泌疗法和化学疗法的联用；
在比例是低于截止值的情况中，选择单独的内分泌疗法。
46.由剪切应力破碎固定化的细胞而用于提取细胞核的试剂盒，其包含含有表面活性剂的细胞分散用缓冲液。
47.由用水流、超声波等发生的剪切应力破碎固定化的细胞而提取细胞核的方法，其中将该固定化的细胞分散于含有表面活性剂的缓冲液而进行该细胞的破碎。
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