CN102027372A - 使用抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体的肝癌细胞的检测法 - Google Patents

使用抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体的肝癌细胞的检测法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种用于检测受试者体内肝癌细胞的存在的体外免疫测定方法。在本发明的方法中，检测肝癌组织中磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗原的表达时，通过将利用热诱导抗原活化法的抗原活化处理与利用蛋白酶抗原活化法的抗原活化处理组合，能够根据免疫组织化学染色法检测出磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗原的表达量及表达方式的差异。由此，可以根据磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的表达量，对利用现有HIER法确认到磷脂酰肌醇蛋白聚糖3高度表达的样本进行等级分类。

Description

使用抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体的肝癌细胞的检测法
技术领域
本发明涉及一种用于检测受试者体内肝癌细胞的存在的体外免疫测定方法。
背景技术
由于磷脂酰肌醇蛋白聚糖3在肝癌中频繁地高度表达，所以认为肝癌中的磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的表达概况分析可能对磷脂酰肌醇蛋白聚糖3在肝癌中的功能鉴定、肝癌的治疗或诊断及肝癌预后预测有用。通常进行蛋白质表达分析时，在病理诊断中广泛采用免疫组织化学，特别是酶抗体法。免疫组织化学是使用抗体或酶等生物学试剂以高灵敏度且特异性地检测生物体内物质(抗原)的存在和分布的方法。作为免疫组织化学的特征，可以举出以下特征：1、操作简便；2、可以广泛应用于将所得生物化学信息用于形态学信息等；3、提供生物学和病理学方面的重要信息；4、需要注意因使用生物学试剂所以与通常的方法不同。另外，免疫组织化学染色还具有下述优点，即，能够使用新鲜冷冻切片、细胞学样本或固定组织的石蜡切片等广泛的样本，将其用于目标病理诊断或形态学观察。
在免疫组织化学法中，由于基于酶抗体法的免疫染色可以采用通常病理诊断中使用的福尔马林固定石蜡包埋组织，所以其应用范围非常广泛。但是，如果不充分注意由于是福尔马林固定组织而引起的人为产物(Artifacts)等，那么不仅染色会失败，有时还会引起因福尔马林固定及包埋导致的抗原变化、及抗体的渗透和反应性的变化，结果产生假阳性或假阴性。上述假阳性或假阴性有时会导致对染色结果的曲解。
通常的组织学检索中使用的福尔马林固定对形态保持有用，但从保持与抗体的结合性的观点考虑，福尔马林不是理想的固定液。因此，除福尔马林之外有时还使用乙醇等作为固定液，但尚未确立形态保持优异、能够保存所有抗原与抗体的结合性的固定法。因此，虽然福尔马林固定在保持与抗体的结合性方面存在问题，但仍然是广泛使用的实际固定法。
因此，为了减弱福尔马林固定对保持与抗体的结合性的影响，已经公开了几种方法。第一种方法是选择识别下述表位的抗体用于免疫染色，所述表位不受福尔马林固定影响。在识别同一抗原的抗体中，通过将识别抗原中的不易受福尔马林固定影响的表位的抗体用于免疫染色，可以减少假阴性。但是磷脂酰肌醇蛋白聚糖3在细胞表面表达后，经过蛋白酶等翻译后修饰，因此限定了能够与抗体结合的表位，从而不存在用于选择合适的表位的表位多样性。
第二种方法是通过提高免疫染色的灵敏度检测出用通常的方法无法进行可视化的抗原。最简便的方法是在显色时向通常免疫染色中使用的DAB(3，3’-二氨基联苯胺四盐酸盐)中加入铜等重金属，但不能期待灵敏度显著提高。还尝试了下述方法，即ABC(抗生物素蛋白-生物素-过氧化物酶复合体(avidin-biotinylatedperoxidase complex))法及LSAB(标记链霉抗生物素蛋白生物素化抗体(labeled streptavidin biotinylated antibody))法等，所述方法通过使生物素化的二次抗体和ABC或酶标记的抗生物素蛋白与切片反复反应来提高灵敏度，但确认了存在随着反应次数增加背景的非特异性染色也增强的倾向。进而，已经开始采用下述方法，即使用酶标记葡聚糖聚合物的EPOS(增强聚合物一步染色(enhanced polymerone-step staining))法、及组合了生物素化Tyramide与ABC法的CSA(催化信号扩增(catalyzed signal amplification))法，可以显著提高染色的灵敏度。但是，采用ABC法等现有方法检测福尔马林固定组织中的抗原时，将肿瘤组织判断为阳性，并且将正常或非肿瘤组织判断为阴性，基于以上判断可以识别肿瘤组织和非肿瘤组织，但由于使用高灵敏度方法时也会检测出非肿瘤组织内的微量抗原，所以有时利用抗原也无法进行上述识别。另外，在使用高灵敏度方法的情况下，由于灵敏度高，所以仍然存在背景染色增强的问题。
第三种方法是将因福尔马林固定导致与抗体的反应性减弱的抗原的反应性活化的方法。在20世纪70年代引入的利用了蛋白酶的消化切片的方法(蛋白酶诱导表位活化法(protease-induced epitoperetrieval method)，以下称作“PIER法”或“蛋白酶抗原活化法”)中，在免疫染色之前利用胰蛋白酶、胃蛋白酶等进行消化切片。该方法存在下述问题：因切片自身被消化导致的切片从玻璃上剥离、及染色结果不稳定等。
之后，在20世纪90年代开发了热诱导抗原活化法(heat-inducedepitope retrieval method，以下称作“HIER法”或“热诱导抗原活化法”)。已知利用微波、煮沸或高压釜进行加热时，通过高温处理抗原会水解，结果表位能够与抗体结合。目前为止，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3在肝癌中的表达也通过HIER法(非专利文献1～5及专利文献1)检测。但是，由于抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体对血管及肝窦的上皮细胞显示出交叉反应性，所以需要进行下述繁琐的处理：预先进行与来自正常肝细胞的蛋白质溶胞产物的封闭反应，排除上述交叉结合(非专利文献4)。因此，目前使用的HIER法无法以下述方式准确地检测出肝癌组织中磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的表达：观察到在原有细胞膜中表达的磷脂酰肌醇蛋白聚糖3细胞质性地表达(非专利文献2)。要求开发出代替现有HIER法的准确检测该表达的方法。
[非专利文献1]Capurro M，Wanless IR，Sherman M，Deboer G，Shi W，Miyoshi E，Filmus J.，(2003)Gastroenterology 125(1)，89-97
[非专利文献2]Yamauchi N，Watanabe A，Hishinuma M，Ohashi K，Midorikawa Y，Morishita Y，Niki T，Shibahara J，Mori M，Makuuchi M，Hippo Y，Kodama T，Iwanari H，Aburatani H，Fukayama M.，(2005)Mod Pathol 18(12)，1591-8
[非专利文献3]Libbrecht L，Severi T，Cassiman D，Vander BorghtS，Pirenne J，Nevens F，Verslype C，van Pelt J，Roskams T.，(2006)Am J Surg Pathol 30(11)，1405-11
[非专利文献4]Grozdanov PN，Yovchev MI，Dabeva MD.，(2006)Lab Invest 86(12)，1272-84
[非专利文献5]Llovet，J.M.，Chen，Y.，Wurmbach，E.，Roayaie，S.，Fiel，M.I.，Schwartz，M.，Thung，S.N.，Khitroy，G.，Zhang，W.，Villanueva，A.，Battiston，C.，Mazzaferro，V.，Bruix，J.，Waxman，S.，Friedman，S.L.，(2006)Gastroenterology 131(6)，1758-1767
[专利文献1]WO2003100429
[专利文献2]WO2006006693
[专利文献3]WO2004022739
发明内容
本发明是鉴于上述情况完成的，其目的在于提供能够准确地检测出肝癌组织中磷脂酰肌醇蛋白聚糖3表达方式的方法。
本发明人等发现检测肝癌组织中的磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗原表达时，通过将利用热诱导抗原活化法的抗原活化处理和利用蛋白酶抗原活化法的抗原活化处理组合，能够采用免疫组织化学染色法检测出磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗原的表达量和表达方式的差异，从而完成了本发明。由此，可以根据磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的表达量，对利用现有HIER法确认到磷脂酰肌醇蛋白聚糖3高度表达的样本进行等级分类。
即，本申请发明提供以下发明：
[1]一种用于检测受试者体内肝癌细胞的存在的体外免疫测定方法，包括下述步骤：
(a)提供来自同一受试者的至少两种能够视为相同的一组组织标本作为石蜡包埋切片，所述组织标本在由上述受试者制备之后，被包埋在石蜡中并安装在透明性支持体上；
(b)对上述一组组织标本进行除石蜡处理；
(c)对进行了上述(b)处理的能够视为相同的一组组织标本的一方，进行利用热诱导抗原活化法的抗原活化处理，对另一方进行利用蛋白酶抗原活化法的抗原活化处理；
(d)在适合于形成存在于经过上述(c)处理的组织标本中的磷脂酰肌醇蛋白聚糖3和抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体的复合体的条件下，使抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体与上述标本接触；
(e)检测复合体的存在，此处，存在复合体时判定受试者体内存在肝癌细胞。
[2]如[1]所述的方法，其中，上述热诱导抗原活化法利用微波加热。
[3]如[1]所述的方法，其中，上述热诱导抗原活化法利用高压釜加热。
[4]如[1]至[3]中任一项所述的方法，其中，上述蛋白酶抗原活化法中使用的蛋白酶选自胃蛋白酶、胰蛋白酶及蛋白酶K。
[5]如[1]至[4]中任一项所述的方法，其中，用于检测复合体的检测反应为酶反应。
[6]如[1]至[5]中任一项所述的方法，其中，上述抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体为与磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的C末端多肽键合的抗体。
[7]如[6]所述的方法，其中，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的C末端多肽为包含序列号1表示的第359号氨基酸至第580号氨基酸的多肽，或者为包含第375号氨基酸至第580号氨基酸的多肽。
[8]如[6]或[7]所述的方法，其中，上述抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体为GC33抗体。
[9]如[1]至[5]中任一项所述的方法，其中，上述抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体为1G12抗体。
[10]如[1]至[9]中任一项所述的方法，其中，步骤(e)中，将复合体的存在经过数值化并检测。
[11]如[10]所述的方法，其中，上述数值化按照下式算出：
IRCp＝PR+(SI-Cp)+SP
式中，
IRCp为磷脂酰肌醇蛋白聚糖3表达量的评分；
PR为对显微镜下检测出上述复合体的细胞比例进行评分得到的数值；
SI-Cp为对在显微镜下上述复合体在视野中细胞的细胞质中被检测出的染色强度进行评分得到的数值；
SP为对在显微镜下的视野中细胞的细胞膜中显示出完全膜染色的细胞比例进行评分得到的数值。
[12]如[10]所述的方法，其中，上述数值化按照下式算出：
IRCm＝PR+(SI-Cm)+SP
式中，
IRCm为磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的膜局部化的评分；
PR为对在显微镜下检测出上述复合体的细胞比例进行评分得到的数值；
SI-Cm为对在显微镜下检测出上述复合体在视野中细胞的细胞膜中的染色强度进行评分得到的数值；
SP为对在显微镜下的视野中细胞的细胞膜中显示出完全膜染色的细胞比例进行评分得到的数值。
[13]一种对肝癌细胞分类的方法，上述方法基于利用[11]及[12]所述的方法算出的评分，对存在于受试者的肝癌细胞进行分类。
[14]一种确定是否给与抗癌剂的方法，上述方法基于利用[11]及[12]所述的方法算出的评分，确定是否给与受试者含有抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体的抗癌剂。
[15]一种确定抗癌剂给与量的方法，上述方法基于利用[11]及[12]所述的方法算出的评分，确定对受试者进行肝癌治疗中含有抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体的抗癌剂的给与量。
附图说明
[图1]为表示SI评分的各级的图。
[图2]为表示SP评分的各级的图。
[图3]为表示HuH-7及HepG2细胞移植模型标本的染色结果的图。
[图4]为表示由人肝癌的临床样本制备的标本的染色结果的图。
[图5A]为表示hGC33抗体在人肝癌移植小鼠模型中的抗肿瘤效果的图。
[图5B]为表示hGC33抗体在人肝癌移植小鼠模型中的抗肿瘤效果的图。
[图5C]为表示hGC33抗体在人肝癌移植小鼠模型中的抗肿瘤效果的图。
[图5D]为表示hGC33抗体在人肝癌移植小鼠模型中的抗肿瘤效果的图。
本说明书包含记载在作为本申请优先权基础的日本专利申请2008-068316号说明书中的内容。
具体实施方式
组织标本
本说明书中使用的用语“组织标本”，是指由个体、体液(例如血液、血清、血浆及脊髓液)、组织培养物或组织切片等得到的任意生物学标本。作为用作生物学标本的例子，可以优选举出受试者标本。优选的受试者标本是由受试者得到的组织，更优选受试者的肝组织。作为采集肝组织的方法，优选采用作为公知方法的活组织检查(Biopsy)。肝活组织检查是指将细长的针直接从皮肤表面刺入肝脏采集肝脏组织的方法。通常针穿刺的部位是右胸下部的肋间。手术之前，使用超声波检查装置确认穿刺部位的安全性，并且对穿刺部位进行消毒。进而，以从皮肤至肝脏表面作为麻醉对象，将穿刺部位的皮肤切开小口后，用穿刺针进行穿刺。
本发明中，由于组织标本是在显微镜下通过透射光进行观察，所以将组织标本切成薄片，并且切至显微镜中使用的光线充分地透过的程度。作为切成薄片之前的步骤，将组织标本固定。即，通过使组织·细胞的蛋白质脱水或变性使组织标本凝固，迅速杀灭构成组织的细胞，使其结构稳定及不能溶解。首先，将作为固定对象的组织标本用手术刀等刀具切成适于制作石蜡包埋切片的大小及形状的片断。接着，将该片断浸渍在用于进行固定的试剂即固定液中。作为固定液，优选使用福尔马林，更优选中性缓冲福尔马林。可以根据组织标本的特性或物性适当选择中性缓冲福尔马林的浓度。浓度可以在1～50％、优选5～25％、更优选10～15％之间适当改变后进行使用。对浸渍了组织标本的固定液使用真空泵适当脱气。固定如下进行：在常压及室温条件下将组织标本放置在固定液中数小时。固定所需要的时间可以在1小时～7日、优选2小时～3日、更优选3小时～24小时、进一步更优选4小时～16小时的范围内适当选择。固定之后再将其适当浸渍在磷酸缓冲液等中数小时(时间可以在2小时～48小时、优选3小时～24小时、更优选4小时～16小时的范围内适当选择)。
接着，可以由适于固定的组织标本利用冷冻切片法或石蜡切片法较好地制作切片。作为冷冻切片法的优选例，可以举出下述方法：向O.C.T.compound(Miles.Inc.)中加入组织并冷冻，将所得产物使用恒冷切片机(冷冻切片制作装置)切成薄片。在石蜡切片法中，通过将被固定的组织标本浸渍在包埋剂中并凝固，赋予该切片均与且适度的硬度。作为包埋剂，可以优选使用石蜡。使用乙醇对被固定的组织标本进行脱水。具体而言，通过将组织标本依次浸渍在70％乙醇、80％乙醇及100％乙醇中，对该组织标本进行脱水。浸渍所需要的时间及次数可以在1小时至数日及1次至3次的范围内适当选择。另外，也可以在室温或4℃下进行浸渍。在4℃下进行浸渍时，浸渍时间优选彻夜等其时间较长的情况。然后，将其液相置换为二甲苯后，将组织标本用石蜡包埋。将其液相置换为二甲苯所需要的时间可以在1小时～数小时的范围内适当选择。此时，可以在室温下进行置换，也可以在4℃下进行置换，但在4℃下进行置换时，置换时间优选彻夜等其时间较长的情况。石蜡包埋所需要的时间及次数可以在1小时至数小时及1次至4次的范围内适当选择。此时，可以在室温下进行包埋，也可以在4℃下进行包埋。在4℃下进行包埋时，包埋时间优选彻夜等其时间较长的情况。另外，石蜡包埋反应可以通过使用经自动化处理的石蜡包埋装置(EG1160，Leica等)较好地对组织标本进行包埋。
如上所述，通过将被石蜡包埋的组织标本与支架(Scaffold)连接来制作“组织块”(block)，使用切片机将该组织块切成从1μm至20μm厚度中选择的所期望厚度的薄片。通过将切成薄片的组织切片静置在作为透明性支持体的玻璃载片上对其进行固定。在上述情况下，为了防止组织切片的剥离，还可以优选使用在玻璃载片上涂布0.01％聚-L-赖氨酸(Sigma)并干燥的玻璃载片。被固定的组织切片可以在从数分钟至1小时之间选择的适当时间内风干。
本发明中，准备一组如上所述地制备的、安装于透明性支持体上的两种组织标本。该组织标本优选组织学上能够视为相同的两种组织标本。所谓“能够视为相同”，是指相比较的两种组织标本由提供该组织标本的受试者标本中基本相同的细胞或组织构成。例如，作为相邻切片制备的两种组织标本是能够视为相同的两种组织标本。本发明中，只要没有特别说明，“能够视为相同的两种组织标本”，是指作为相邻的切片制备的两种组织标本，除此之外，即使不是作为相邻切片制备的组织标本，只要构成两种组织标本的细胞或组织的构成在该两种组织标本之间能够视为相同，则也属于“能够视为相同的两种组织标本”。作为细胞或组织的构成在该两种组织标本之间能够视为相同的情况，例如可以优选举出下述情况：(1)在位于组织切片中的平面坐标上同一位置处存在来自同一细胞的细胞切片；(2)位于该平面坐标上的同一位置处该细胞切片存在的比例至少为50％以上，优选为60％以上，更优选为70％以上，更进一步优选为80％以上，较优选为90％以上，特别优选为95％以上。
抗原活化
本发明的方法中，对因福尔马林固定而减弱了与抗体的反应性的抗原反应性进行活化。本发明中，对两种组织标本中的一种标本使用蛋白酶诱导抗原活化法(PIER法)，对另一种标本使用热诱导抗原活化法(HIER法)，将与抗体反应时的两者间的染色程度的差异进行数值化。
热诱导抗原活化法适当采用利用微波的加热法、利用高压釜的加热法，或利用煮沸处理的加热法等。使液体温度保持为约98℃、在780W的输出功率下进行煮沸处理时，处理等活化所需要的时间从5分钟-60分钟之间适当选择，例如为10分钟。抗原活化处理可以在除10mM柠檬酸钠缓冲液之外的市售靶向活化溶液(TargetRetrieval Solution)(DakoCytomation)等中进行。在下述实施例中，使用靶向活化溶液。作为活化处理的结果，只要可以获得抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体识别的抗原中的表位与抗体的结合性，检测出下述抗原与抗体的复合体即可，可以使用任一种缓冲液、水溶液。
对蛋白酶诱导抗原活化法中使用的蛋白酶的种类及来源没有特别限定，可以适当选择使用通常能够购买到的蛋白酶。作为使用的蛋白酶的例子，可以优选举出0.01N盐酸中浓度为0.05％的胃蛋白酶；进一步在pH 7.6的Tris缓冲液中含有浓度为0.1％的CaCl2的浓度为0.1％胰蛋白酶；含有10mM EDTA及0.5％SDS的pH 7.8的10mM Tris-HCl缓冲液中浓度为1～50μg/ml的蛋白酶K。进而，使用蛋白酶K时，该反应液的pH在6.5至9.5之间适当选择，还可以适当使用SH试剂、胰蛋白酶抑制剂或糜蛋白酶抑制剂。本说明书实施例中记载的Histofine Her2 kit(MONO)(Nichirei Bioscience)附带的蛋白酶也可以作为上述优选的蛋白酶的具体例。蛋白酶诱导抗原活化通常在37℃下进行，但反应温度可以在25℃至50℃的范围内适当改变。蛋白酶诱导抗原活化在37℃下进行时，反应时间例如在1分钟至5小时之间适当选择，例如为15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、3小时或4小时等。活化处理结束后，将进行了该处理的组织标本用清洗用缓冲液清洗。清洗用缓冲液优选使用PBS(phosphate-buffered saline)，除此之外，还可以优选使用Tris盐酸缓冲液。作为清洗条件，通常采用在室温下清洗5分钟且重复3次的方法，但可以适当改变清洗时间及温度。
抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体
本发明中使用的抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体只要具有与磷脂酰肌醇蛋白聚糖3结合的活性即可，也可以优选使用任一种抗体。抗体的特别优选例包括下述实施例中公开的GC33抗体(专利文献2)及1G12抗体(专利文献1)。另外，除上述公知的抗体之外，也可以通过使用磷脂酰肌醇蛋白聚糖3作为免疫抗原对非人的动物进行免疫，由此获得本发明中优选使用的抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体。专利文献1、专利文献2记载了上述抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体的制作方法，对本领域技术人员来说基于该方法可以适当获得所期望的抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体。
抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体对磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的结合可以优选采用本领域技术人员公知的方法检测。例如可以采用ELISA(酶联免疫吸附测定方法)、EIA(酶免疫测定方法)、RIA(放射免疫测定方法)或荧光免疫测定方法等。一般的教科书如“Antibody A Laboratory Manual.Ed Harlow，David Lane，Cold SpringHarbor Laboratory，1988”中记载了上述方法。
作为测定抗体对表达抗原的细胞的结合活性的方法，例如可以举出Antibody A Laboratory Manual.(Ed Harlow，David Lane，ColdSpring Harbor Laboratory，1988中的359-420页中记载的方法。即，结合活性可以优选根据以细胞作为抗原的ELISA或FACS(荧光激活细胞分选术(fluorescence activated cell sorting))的原理进行评价。在ELISA format中，通过比较由酶反应产生的信号水平，定量评价抗体对细胞的结合活性。即，将受试抗体加到固定有强制表达了抗原的细胞的ELISA板上，利用识别受试抗体的酶标记抗体，检测与细胞结合的抗体。或者在FACS中，制备受试抗体的稀释系列，确定对强制表达抗原的细胞的抗体集合效价(titer)，由此可以比较其对细胞的结合活性。
可以通过FACS format测定在细胞表面上表达的抗原与对应于该抗原的抗体之间的结合，所述细胞不与ELISA板等载体结合并悬浮于缓冲液等中。作为用于上述测定的流式细胞仪，例如可以举出FACSCantoTM II、FACSAriaTM、FACSArrayTM、FACS VantageTM SE、FACSCaliburTM(以上BD Biosciences)和EPICS AL TRA HyPerSort、Cytomics FC 500、EPICS XL-MCL ADC、EPICS XL ADC、Cell LabQuanta/Cell Lab Quanta SC(以上Beckman Coulter)等。
作为测定抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体对抗原的结合活性的优选方法之一例，可以举出使用二次抗体的方法，所述二次抗体识别与表达抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体的细胞反应的受试抗体。使表达磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的细胞与受试抗体反应，用经FITC标记的二次抗体对细胞进行染色后，采用FACSCalibur(BD)进行测定，利用CELL QUEST软件(BD)解析其荧光强度。根据本方法，采用FACSCalibur进行测定时，利用CELL QUEST软件解析其荧光强度，将根据上述方法得到的几何平均值(受试Geo-Mean值)与利用对照抗体作为一次抗体时的对照Geo-Mean值进行比较，由此可以判断抗体对抗原的结合活性。求出Geo-Mean(几何平均值)的计算式记载在CELL QUEST软件用户指南(BD biosciences公司)中。
组织标本与抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体的反应
对于经过利用热诱导抗原活化法的抗原活化处理的组织标本及经过利用蛋白酶诱导抗原活化法的抗原活化处理的组织标本，以抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体作为一次抗体进行反应。在下述条件下进行该反应，所述条件适合于抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体识别抗原中的表位，并形成抗原抗体复合体。通常该反应在4℃下进行一夜，或者在37℃下进行1小时，但反应条件可以在适合抗体识别抗原中的表位并形成抗原抗体复合体的范围内改变。例如，反应温度可以在4℃至50℃的范围内改变，反应时间可以在1分钟至7日之间改变。在低温下进行反应时，优选反应较长时间。一次抗体反应结束后，将组织标本用清洗用缓冲液清洗。清洗用缓冲液优选使用PBS(phosphate-buffered saline)，除此之外，还可以优选使用Tris盐酸缓冲液。通常作为清洗条件，可以采用在室温下清洗5分钟并重复3次的方法，但可以适当改变清洗时间及温度。
接着，使经过一次抗体反应的组织标本与识别一次抗体的二次抗体反应。通常使用预先利用用于将二次抗体可见化的标记物质标记的二次抗体。作为标记物质，优选举出FITC(异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate))、Cy2(Amersham)及Alexa488(Molecular Probes)等荧光色素，过氧化物酶及碱性磷酸酶等酶，或胶体金等。
在下述条件下进行与二次抗体的反应，所述条件适合于使抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体与识别该抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体的二次抗体形成抗原抗体复合体。通常该反应在室温或37℃下进行30分钟至1小时，但可以在适合于使抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体与二次抗体形成抗原抗体复合体的范围内进行改变。例如，反应温度可以在4℃至50℃的范围内进行改变，反应时间可以在1分钟至7日的范围内进行改变。在低温下进行反应时，优选反应较长时间。二次抗体反应结束后，将组织标本用清洗用缓冲液清洗。清洗用缓冲液优选使用PBS(phosphate-buffered saline)，除此之外，还可以优选使用Tris盐酸缓冲液。通常作为清洗条件，采用在室温下清洗5分钟且重复3次的方法，但可以适当改变清洗时间及温度。
然后，使经过二次抗体反应的组织标本与将标记物质可见化的物质反应。使用过氧化物酶作为二次抗体的标记物质时，用反应液培养组织标本，所述反应液如下得到：在即将培养前将0.02％过氧化氢水与用pH 7.2的0.1M Tris盐酸缓冲液调节至浓度为0.1％的DAB(二氨基联苯胺(diaminobenzidine))溶液等量混合。除DAB之外，还可以适当选择DAB-Ni及AEC+(以上DAKO)等显色基质。在培养过程中，在时间间隔显微镜下观察显色程度，在确认到适当显色的阶段，通过将组织标本浸渍在PBS中来终止可见化反应。
使用碱性磷酸酶作为二次抗体的标记物质时，用BCIP(5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯)/NBT(氮兰四唑(nitro bluetetrazolium))(Zymed)基质溶液(在含有浓度为10mM的MgCl2及浓度为28mM的NaCl的pH 9.8的50mM碳酸钠缓冲液中，溶解有浓度为0.4mM的NBT及浓度为0.38mM下的BCIP)对组织标本进行培养。另外，除BCIP及NBT之外，还可以适当使用PermanentRed，Fast Red、或Fuchsin+(以上DAKO)等。在培养之前，组织标本也可以用0.1M Tris盐酸缓冲液(pH 9.5)在室温下培养1分钟至数小时，所述Tris盐酸缓冲液含有浓度为1mM的鳌合碱性磷酸酶抑制剂即盐酸左旋咪唑(Nacalai)、0.1M氯化钠及50mM氯化镁。在培养过程中，在时间间隔显微镜下观察，在观察到作为反应最终产物的紫色的甲暨沉淀的阶段，将组织标本用水洗或用含有2％聚乙烯醇的TBS终止反应后，用TBST(含有0.1％Tween 20的TBS)清洗。使用胶体金作为二次抗体的标记时，通过利用银增感(silverenhancement)在金粒上附着金属银，由此使胶体金可见化。银增感的方法是本领域公知的。
使用FITC(异硫氰酸荧光素)、Cy2(Amersham)及Alexa488(Molecular Probes)等荧光色素作为二次抗体的标记物质时，无需可见化物质的反应步骤，照射该荧光物质的激发波长的光，放出的光可以通过使用荧光显微镜适当检测。
肝癌组织的分类和治疗效果的预测
已知磷脂酰肌醇蛋白聚糖3在肝癌组织中经过消化其N末端部分在血清中游离(专利文献3)。因此，本发明的方法中，使用与上述经过消化在血清中游离的磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的N末端的部分肽进行键合的抗体时，经过消化后，该抗体无法与仍锚定在细胞表面上的C末端部分的多肽进行键合。另一方面，本发明的方法中，使用与C末端部分的肽进行键合的抗体时，经过消化后，该抗体可以与仍锚定在细胞表面上的C末端部分的多肽进行键合。即，根据目的适当选择本发明中使用的抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体，由此无论消化与否都可以检测出锚定在细胞表面上的磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的部分多肽，还可以检测出直至消化锚定在细胞表面上的经过消化后血清中游离的磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的部分多肽。
已经发现抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体对肝癌的治疗及预防有用(专利文献3)。上述治疗用抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体所发挥的杀灭细胞的活性主要通过抗体依赖性细胞毒活性(ADCC活性)或补体依赖性细胞毒活性(CDC活性)发挥，所述细胞毒活性通过效应细胞或补体与Fc部分结合而开始，所述Fc部分是与在锚定在细胞表面上的C末端的部分多肽键合的抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体的部分。因此，从抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体结合的表位是否存在于肝癌组织中的观点考虑，预测利用治疗用抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体的肝癌的治疗效果时，在本发明的方法中，可以优选使用与C末端的部分多肽键合的抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体。
有文献暗示磷脂酰肌醇蛋白聚糖3在肝癌组织中经过消化的部位为序列号1表示的磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的第358号和第359号氨基酸、或第374号和第375号氨基酸的多肽键(专利文献3)。因此，作为本发明中优选使用的与C末端的部分多肽键合的抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体，可以举出与下述多肽键合的抗体，所述多肽为包含序列号1表示的磷脂酰肌醇蛋白聚糖3分子的第359号至第580号氨基酸的多肽，或者为包含第375号至第580号氨基酸的多肽。
另一方面，从磷脂酰肌醇蛋白聚糖3分子成熟的观点考虑，预测利用治疗用抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体的治疗效果时，本发明的方法中能够使用与N末端的部分多肽键合的抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体。上述情况下，将被与N末端的部分多肽键合的抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体识别的磷脂酰肌醇蛋白聚糖3分子作为没有更成熟的治疗靶分子，将表达上述磷脂酰肌醇蛋白聚糖3分子的肝癌细胞作为没有更成熟的治疗靶细胞，可以分别对其赋予性格。与磷脂酰肌醇蛋白聚糖3分子的C末端的部分多肽键合的抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体无论是否成熟，检测出磷脂酰肌醇蛋白聚糖3分子。另一方面，与磷脂酰肌醇蛋白聚糖3分子的N末端的部分多肽键合的抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体检测出成熟之前的磷脂酰肌醇蛋白聚糖3分子，但没有检测出成熟之后的磷脂酰肌醇蛋白聚糖3分子。即，通过使用与磷脂酰肌醇蛋白聚糖3分子的C末端的部分多肽键合的抗体、和与N末端的部分多肽键合的抗体这2种抗体，可以通过成熟的程度对利用本发明的方法检测出的磷脂酰肌醇蛋白聚糖3分子及表达磷脂酰肌醇蛋白聚糖3分子的肝癌细胞进行分类。
以下具体说明上述分类方法。作为一次抗体，准备2种抗体：与磷脂酰肌醇蛋白聚糖3分子的C末端的部分多肽键合的抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体，和与磷脂酰肌醇蛋白聚糖3分子的N末端的部分多肽键合的抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体。由同一受试者制备2种组织标本，使其中的1种组织标本与作为一次抗体的抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体反应，所述抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体键合于磷脂酰肌醇蛋白聚糖3分子的N末端的部分多肽；使另一种组织标本与作为一次抗体的抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体反应，所述抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体键合于磷脂酰肌醇蛋白聚糖3分子的C末端的部分多肽。使用与磷脂酰肌醇蛋白聚糖3分子的N末端的部分多肽键合的抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体检测的磷脂酰肌醇蛋白聚糖3分子，从其成熟程度的观点考虑，可以评价为没有更成熟的分子，表达上述磷脂酰肌醇蛋白聚糖3分子的肝癌细胞可以评价为没有更成熟的细胞。另外，使用与磷脂酰肌醇蛋白聚糖3分子的N末端的部分多肽键合的抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体没有检测出、但是使用与磷脂酰肌醇蛋白聚糖3分子的C末端的部分多肽键合的抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体检测出的磷脂酰肌醇蛋白聚糖3分子，从其成熟程度的观点考虑，可以评价为更成熟的分子，表达上述磷脂酰肌醇蛋白聚糖3分子的肝癌细胞，可以评价为更成熟的细胞。
与磷脂酰肌醇蛋白聚糖3分子的N末端的部分多肽键合的抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体和与磷脂酰肌醇蛋白聚糖3分子的C末端的部分多肽键合的抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体属于互不相同的抗体亚型时，或者是在不同种类的动物中产生时，可以使用1种组织标本进行测定。在上述情况下，通过将二次抗体用不同种类的酶或荧光标记，可以在1种组织标本上使用2种抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体进行检测，所述二次抗体为识别与磷脂酰肌醇蛋白聚糖3分子的N末端的部分多肽键合的抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体的二次抗体、和识别与磷脂酰肌醇蛋白聚糖3分子的C末端的部分多肽键合的抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体的二次抗体。
与抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体的反应性的数值化
本发明基于抗原活化反应(即，热诱导抗原活化法及蛋白酶诱导抗原活化法)的差异，提供下述方法：将在显微镜下检测出的由磷脂酰肌醇蛋白聚糖3和抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体形成的抗原抗体复合体的程度及形态的差异进行数值化。
在方案之一中，数值化如下进行：
式(1)：
IRCp＝PR+(SI-Cp)+SP
[式中，
IRCp为磷脂酰肌醇蛋白聚糖3表达量的评分；
PR为对显微镜下的检测出上述复合体的细胞比例进行评分得到的数值；
SI-Cp为对在显微镜下上述复合体在视野中细胞的细胞质中被检测出的染色强度进行评分得到的数值；
SP为对在显微镜下视野中的细胞的细胞膜中显示出完全膜染色的细胞比例进行评分得到的数值]。
PR评分如下算出：
(a)在使用4倍或10倍物镜的显微镜下的视野中的细胞中，
(i)将检测出上述复合体的细胞比例为0的样本的评分作为0分，
(ii)将该比例小于20％的样本的评价作为1分，
(iii)将该比例为20％以上且小于50％的样本的评分作为2分，
(iv)将该比例为50％以上的样本的评分作为3分；
SI-Cp评分如下算出：
(b)在显微镜下视野中细胞的细胞质中，
(i)上述显微镜使用4倍或10倍的物镜时，将检测出上述复合体的细胞比例为0的样本的评分作为0分，
(ii)上述显微镜使用10倍的物镜时，将虽然模糊但观察到轻微的阳性反应的样本的评分作为1分，
(iii)将用4倍物镜观察到轻微的阳性反应的样本的评分作为2分，
(iv)将即使用4倍物镜也可以确认到能够充分地识别的阳性反应的样本的评分作为3分，
(v)将用4倍物镜可以清楚地识别、确认到强阳性反应的样本的评分作为4分；
SP评分如下算出：
(c)在显微镜下视野中细胞的细胞膜中的上述复合体的检测中，
(i)将未确认到细胞膜中的阳性反应的样本的评分作为0分，
(ii)将确认有阳性反应的细胞中少于20％的细胞显示出完全膜染色的样本的评分作为1分，
(iii)将确认有阳性反应的细胞中的20％以上且少于50％的细胞显示出完全膜染色的样本的评分作为2分，
(iv)将确认有阳性反应的细胞中的50％以上的细胞显示出完全膜染色的样本的评分作为3分。
另一个方案中，数值化根据下式(2)进行，
式(2)：
IRCm＝PR+(SI-Cm)+SP
[式中，
IRCm为磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的膜局部化的评分；
PR为对显微镜下检测出上述复合体的细胞比例进行评分得到的数值；
SI-Cm为对在显微镜下检测出上述复合体在视野中细胞的细胞膜中的染色强度进行评分得到的数值；
SP为在显微镜下视野中的细胞的细胞膜中显示出完全膜染色的细胞比例进行评分得到的数值]。
PR评分如下算出：
(a)在使用4倍或10倍物镜的显微镜下的视野中的细胞中，
(i)将检测出上述复合体的细胞比例为0的样本的评分作为0分，
(ii)将该比例小于20％的样本的评价作为1分，
(iii)将该比例为20％以上且小于50％的样本的评分作为2分，
(iv)将该比例为50％以上的样本的评分作为3分；
SI-Cm评分如下算出：
(b)在显微镜下视野中细胞的细胞膜中，
(i)上述显微镜使用4倍或10倍的物镜时，将检测出上述复合体的细胞比例为0的样本的评分作为0分，
(ii)上述显微镜使用10倍的物镜时，将虽然模糊但观察到轻微的阳性反应的样本的评分作为1分，
(iii)将用4倍物镜时虽然模糊但用10倍物镜时确认到可以充分识别的阳性反应的样本的评分作为2分，
(iv)将即使用4倍物镜也可以确认到能够充分地识别的阳性反应的样本的评分作为3分，
(v)将用4倍物镜可以清楚地识别、确认到强阳性反应的样本的评分作为4分；
SP评分如下进行：
(c)在显微镜下视野中细胞的细胞膜中的上述复合体的检测中，
(i)将未确认到细胞膜中的阳性反应的样本的评分作为0分，
(ii)将确认到阳性反应的细胞中少于20％的细胞显示出完全膜染色的样本的评分作为1分，
(iii)将确认到阳性反应的细胞中的20％以上且少于50％的细胞显示出完全膜染色的样本的评分作为2分，
(iv)将确认到阳性反应的细胞中的50％以上的细胞显示出完全膜染色的样本的评分作为3分。
在上述情况下，针对经过热诱导抗原活化法的组织标本和经过蛋白酶抗原活化法的组织标本，分别确定基于上述式(1)及(2)算出的评分。基于式(1)算出的评分是反映磷脂酰肌醇蛋白聚糖3表达量的评分，基于式(2)算出的评分是反映磷脂酰肌醇蛋白聚糖3在细胞膜中的表达局部化的评分。可以基于本发明的数值化方法，根据磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的表达量及表达方式，对存在于受试者的肝癌细胞进行分类。如下述实施例所示，确认到使用从实际肝癌患者中采集的组织标本，可以有效地对其进行分类。进而，确认到即使在移植了磷脂酰肌醇蛋白聚糖3表达量被确定的肝癌细胞株即HuH-7或HepG2的肝癌动物模型中，也可以有效地进行该分类。
本发明中，对肝癌动物模型给与治疗用抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体，结果证实了根据本发明的方法通过数值化进行分类的肝癌中磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的表达量及表达方式的差异，与利用治疗用抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体治疗肝癌的治疗效果的差异相关。即，表明基于根据本发明进行数值化得到的评分的差异，可以判断治疗用抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体的治疗效果的差异。基于根据本发明的数值化的方法，可以预测使用含有抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体作为有效成分的肝癌治疗剂的肝癌治疗效果。另外，基于根据本发明的数值化的方法，能够确定为了在使用抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体的肝癌治疗中获得所期望的效果所需的治疗用抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体的必需给药量。
实施例
以下，根据实施例更详细地说明本发明，但本发明并不限定于这些实施例。
(实施例1)
使用移植模型的磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的免疫染色，所述移植 模型将表达磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的人肝癌细胞株移植到小鼠腹部 皮下
(1)细胞株
作为肝癌细胞株，使用HuH-7细胞(Health Science ResearchResources Bank)、HepG2细胞(ATCC)。HuH-7在含有10％FBS(BIONET)的Dulbecco’s Modified Eagle’s培养基(SIGMA)中维持并传代培养，HepG2在含有10％FBS、1mmol/L MEM丙酮酸钠(Invitrogen)、1mmol/L MEM非必需氨基酸(Invitrogen)的Minimum Essential Medium Eagle培养基(SIGMA)中维持并传代培养。
(2)GPC3表达量的测定
(2-1)测定方法
HuH-7细胞及HepG2细胞中GPC3的表达量使用小鼠抗人GPC3单克隆抗体(克隆名：GC33，记载在WO2006/006693中)，利用QIFI-Kit(DakoCytomation)进行测定。测定方法根据附带的说明书所述的方法进行。
将使用的GC33抗体在室温下溶解后，用PBS调节至1mg/ml。作为阴性对照，使用将冻干状态的mIgG2a(1安瓿份)溶解在500μl“日本药典注射用水大塚蒸馏水”中得到的抗体。将5×105的各细胞悬浮在添加有98μl 0.5w/v％BSA(Sigma-Aldrich)的CellWASH细胞清洗溶液(Becton·Dickinson)中(以下称作FACS-PBS)中。将分别添加有2μl GC33及5μl mIgG2a的该各悬浮液在4℃下静置30分钟。之后，在4℃下将添加有1ml FACS-PBS的该各悬浮液在以5000rpm进行离心分离操作1分钟，由此对细胞进行分馏。将该细胞再次悬浮在98μl的FACS-PBS中。
另外，也可以与上述操作平行地进行以下操作。在100μlQIFIKIT附带的标准颗粒(calibration beads)及测试颗粒(setup beads)中添加1ml的FACS-PBS，在4℃下以5000rpm进行离心分离操作1分钟由此进行清洗。将该颗粒悬浮在98μl的FACS-PBS中。向上述细胞及颗粒中分别添加QIFIKIT附带的FITC标记山羊抗小鼠抗体各2ul，使该细胞及颗粒在4℃下反应45分钟。接着，在4℃下，将添加有1ml的FACS-PBS的上述反应液以5000rpm进行离心分离操作1分钟。将沉淀的细胞及颗粒悬浮在1ml的FACS-PBS中。使用全自动细胞分析装置EPICS-XL(Beckman Coulter)，调节输出功率，使通过测定经标记的测试颗粒而产生的2个峰进入测定画面内。使用全自动细胞分析装置EPICS-XL，测定用于GC33抗体反应的细胞样本、用于mIgG2a反应的细胞样本、及标准颗粒发出的各种荧光的平均荧光强度(Mean fluorescence Intensity)(MFI)值。基于标准颗粒的5个MFI值和抗体结合能力(Antibody-bindingcapacity)(ABC)值，利用Microsoft Office Excel 2003 SP2(MicrosoftCorporation)绘制最佳直线。将各细胞的MFI值代入该直线的标准曲线求出ABC值。从用于GC33抗体反应的样本的ABC值中扣除用于mIgG2a反应的样本的ABC值，将所得的值作为抗体结合部位的数量。
结果，HuH-7中磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的表达量为每个细胞1.25×105个分子。HepG2中磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的表达量为每个细胞9.67×105个分子。
(3)将人肝癌细胞株移植到小鼠腹部皮下的模型的制作
使用含有等量(1)所述的其维持传代培养用培养基和MATRIGEL Matrix(BD Biosciences)的溶液分别制备HuH-7及HepG2细胞，使每1ml溶液中有5×107个细胞。在将各细胞移植到小鼠的前一天，预先对雄性、5周龄的SCID小鼠(日本CLEA)腹腔内给与100μl抗脱唾液酸GM1抗体(和光纯药；将1安瓿的内容物溶解在1ml蒸馏水中，再用4ml生理盐水稀释)。该抗脱唾液酸GM1抗体(和光纯药)如下制备：将1安瓿的内容物溶解在1ml蒸馏水中，再用4ml生理盐水稀释。次日，向该小鼠的腹部皮下移植100μl该各细胞悬浮液(即，每一只小鼠为5×106个细胞)。
(4)肿瘤组织切片的制作方法的研究
使用手术刀将从(3)中制作的HepG2移植模型中采集的均匀的移植组织片四等分。将其中一个断片在10％中性缓冲福尔马林中固定24小时。然后，使用自动包埋装置ETP-150C(Sakura FinetekJapan)，对被固定的组织片进行石蜡包埋，在4℃下保存(A法)。
接着，使用含有4％低聚甲醛的PLP固定液(浓度为10mM的NaIO4、浓度为75mM的赖氨酸、浓度为37.5mM的磷酸缓冲液、浓度为2％的低聚甲醛)，在4℃下将另一个断片固定6小时，之后，于4℃用PBS(磷酸缓冲生理盐水，10mM、pH 7.4)清洗。然后，在4℃下将该断片用丙酮脱水一夜，及在室温下用丙酮脱水2小时。进而，将该断片用苯甲酸甲酯清洗1小时及用二甲苯清洗1小时，与上述同样地对其进行包埋，在4℃下保存(B法)。
在即将用于免疫组织染色之前，将A法及B法中制作的石蜡包埋标本在恒冷切片机上切成薄片，风干后进行除石蜡处理，并进行染色。
接着，使用PLP固定液，在4℃下将另一个断片浸渍6至8小时后，在4℃下依次浸润在具有梯度蔗糖浓度的PBS中(时间为：在砂糖浓度为10％的PBS中4小时，在砂糖浓度为15％的PBS中4小时，在20％砂糖中一夜)。然后，将该断片包埋在Tissue-Tek OCTcompound(Sakura Finetechnical)中，在干冰/丙酮浴中冷冻。将冷冻后的组织块在恒冷切片机上切成薄片，风干后将薄切片在-80℃下保存(C法)。
于4℃，将另一个断片包埋在Tissue-Tek OCT compound中，在干冰/丙酮浴中冷冻。将冷冻后的组织块在恒冷切片机上切成多个薄片后，将该切片风干，用下述不同的方法将其固定。在4℃下，将其中一个切片在4％低聚甲醛中固定30分钟(D法)。在4℃下，将另一个切片在丙酮中固定10分钟(E法)。进而，在室温下，将另一个切片在10％中性缓冲福尔马林中固定30分钟(F法)。用Tris缓冲生理盐水(TBS，50mM、pH 7.4)，将利用D法、E法及F法固定的切片清洗5分钟共3次后，风干，在-80℃下保存。
将如上所述制备的组织切片用于以下所示的免疫组织化学染色。作为一次抗体，GC33抗体(IgG2a)及1G12抗体(BioMosaic，IgG1)分别以浓度为2.5μg/ml及1.0μg/ml进行使用。染色时，染色所需的试剂使用LSAB-2kit(Dako Cytomation)中附带的试剂。染色方法按照试剂盒附带的说明书所述的方法进行。由于固定时间短，所以不进行抗原活化。上述免疫组织化学染色过程中形成的抗原抗体复合体可以通过过氧化物酶-二氨基联苯胺(DAB)反应进行可见化。作为对照染色，使用苏木精。需要说明的是，作为一次抗体的对照抗体，在GC33的情况下使用小鼠IgG2，在1G12的情况下使用IgG1。对每种方法用3个例子进行评价，结果示于表1。
[表1]
Figure BPA00001254370500241
A：固定24小时，没有进行抗原活化处理
B：固定24小时，进行利用高压釜的抗原活化处理
C：固定24小时，进行利用微波的抗原活化处理
D：固定24小时，进行利用蛋白酶的抗原活化处理
E：固定7天，没有进行抗原活化处理
F：固定7天，进行利用高压釜的抗原活化处理
根据以下所示的参数对免疫染色中的染色性进行分级。即，
对于PR(细胞阳性率)分级，如下确定PR的分级：
在使用4倍或10倍物镜的显微镜下视野中的细胞中，
(i)将检测出上述复合体的细胞比例为50％以下的标本作为“L”，
(i)将检测出上述复合体的细胞比例为50％以上小于70％的标本作为“ML”，
(iii)将检测出上述复合体的细胞比例为70％以上且小于90％的标本作为“MH”，
(iv)将检测出上述复合体的细胞比例为90％以上的标本作为“H”；
对于SI(染色强度评分)，如下确定SI的评分：
(i)将显示轻微阳性染色的标本作为“+1”，
(ii)将显示弱阳性染色的标本作为“+2”，
(iii)将伴有中等程度阳性或/及强阳性的、显示弱阳性染色的标本作为“+3”，
(iv)将显示中等程度阳性染色的标本作为“+4”，
(v)将显示强阳性染色的标本作为“+5”；
对于SP(细胞膜染色性)评分，如下确定SP的评分：
在使用4倍或10倍物镜的显微镜下视野中的细胞中，
(i)将只有细胞的细胞膜的一部分被染色的标本作为“I”，
(ii)将大部分细胞的细胞膜的一部分被染色、一部分细胞的细胞膜以圆周状染色的标本作为“II”，
(iii)将大部分细胞的细胞膜以圆周状被染色的标本作为“III”。
SI评分的各级(+1、+2、+4及+5)的标准染色图像如图1所示。图1A表示SI为+1的标本，图1B表示SI为+2的标本，图1C表示SI为+4的标本，图1D表示SI为+5的标本。另外，SP评分的各级(+I、+II及+III)的染色图像如图2所示。图2A表示SP为I的标本，图2B表示SI为III的标本。
可知利用C法至F法中的任一种方法制备的标本的SI及SP分级均较低，无法得到充分的染色图像。另外，也无法保存该标本的形态学结构。在A法与B法的比较中，可以判定B法中制备的标本的SI及SP分级均较高(SI为+3至+5，SP为II或III)，还可以判定PR分级为90％以上的细胞为阳性(H)。另一方面，利用A法可以判定SI为+3至+5，SP为I或II，还可以判定PR分级为L至MH。鉴于GC33抗体与1G12抗体的差异，GC33抗体与1G12抗体相比均显示较强的染色图像。
(5)制作肿瘤组织切片时的固定时间及抗原活化法的研究
如下所述地研究从(3)中制作的HepG2移植模型中采集的均匀的移植组织片的固定时间。将使用(4)所述的A法中的10％中性缓冲福尔马林进行固定的时间设定为24小时及7天，制作标本。另外，将各固定时间内制备的标本利用以下所述的高压釜法、微波法、蛋白酶法中的任一种活化法分别进行活化。于121℃，在10倍稀释的pH 6的靶向活化溶液(target retrieval solution)(DAKO)中，将标本进行高压釜处理10分钟，由此制备被高压釜活化的标本。进而，在同一溶液中，在780W下对标本加热5分钟重复4次，由此制备被微波活化的标本。也可以另外使用Histofine Her2 kit(MONO)(Nichirei Bioscience)附带的AR试剂，在室温下反应5分钟，制备标本。
将如上所述制备的组织切片用于以下所示的免疫组织化学染色。作为一次抗体，分别以2.5μg/ml及1.0μg/ml的浓度使用GC33抗体(IgG2a)及1G12抗体(BioMosaic，IgG1)。染色时，染色所需的试剂使用LSAB-2kit(DakoCytomation)中附带的试剂。染色方法按照试剂盒附带的说明书所述的方法进行。由于固定时间短，所以不进行抗原活化。上述免疫组织化学染色过程中形成的抗原抗体复合体可以通过过氧化物酶-二氨基联苯胺(DAB)反应进行可见化。作为对比染色，使用苏木精。需要说明的是，作为一次抗体的对照抗体，在GC33的情况下使用小鼠IgG2，在1G12的情况下使用IgG1。对适用于各固定时间及各活化反应的每个标本，分别以3个例子进行评价，结果示于表2。在抗原活化法的比较中，微波法比高压釜法体现出更优异的SI及SP分级。另一方面，利用蛋白酶法经过抗原活化处理的标本的PR分级、SI评分及SP评分比经过其他抗原活化处理的标本显示出更优异的染色性。
[表2]
Figure BPA00001254370500271
A：固定24小时，没有进行抗原活化处理
B：固定24小时，进行利用高压釜的抗原活化处理
C：固定24小时，进行利用微波的抗原活化处理
D：固定24小时，进行利用蛋白酶处理的抗原活化处理
E：固定7天，没有进行抗原活化处理
F：固定7天，进行利用高压釜的抗原活化处理
G：固定7天，进行利用微波的抗原活化处理
H：固定7天，进行利用蛋白酶处理的抗原活化处理
(6)肿瘤组织切片的免疫组织化学染色
(6-1)组织标本的制作及染色
将从(2)中制作的移植模型中采集的移植组织片在10％中性缓冲福尔马林中浸渍7天，由此进行固定。然后，按照常规方法制作该组织片的石蜡包埋组织块标本。将该组织块标本切成薄片，将所得组织切片用于以下所示的免疫组织化学染色。
作为一次抗体，使用GC33抗体(IgG2a)。染色时，染色所需的试剂使用Histofine Her2 kit(MONO)(Nichirei Bioscience)中附带的试剂。除使用GC33抗体作为一次抗体之外，染色方法按照试剂盒附带的说明书所述的方法进行。需要说明的是，作为抗原活化处理，进行蛋白酶处理(使用同一试剂盒中附带的蛋白酶，在室温下进行反应5分钟的处理)，或于121℃下在稀释10倍的靶向活化溶液(DakoCytomation)中进行高压釜处理10分钟。上述免疫组织化学染色过程中形成的抗原抗体复合体可以通过过氧化物酶-二氨基联苯胺(DAB)反应进行可见化。作为对照染色，使用苏木精。需要说明的是，作为一次抗体的对照抗体，使用小鼠IgG2。
(6-2)染色结果评价
使用小鼠抗人磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体的免疫染色的染色性通过如下所示的3个参数(细胞阳性率：PR，染色强度：SI，细胞膜染色方式：SP)进行评价。
即，通过下述方法，将各参数数值化，
PR(细胞阳性率)值评分如下算出：
在使用4倍或10倍物镜的显微镜下视野中的细胞中，
(i)将检测出上述复合体的细胞比例为0的样本的评分作为0分，
(ii)将该比例小于20％的样本的评价作为1分，
(iii)将该比例为20％以上且小于50％的样本的评分作为2分，
(iv)将该比例为50％以上的样本的评分作为3分；
反映细胞质染色性的SI-Cp(细胞质染色强度)值评分如下算出：
在显微镜下视野中细胞的细胞质中，
(i)上述显微镜使用4倍或10倍的物镜时，将检测出上述复合体的细胞比例为0的样本的评分作为0分，
(ii)上述显微镜使用10倍的物镜时，将虽然模糊但观察到轻微的阳性反应的样本的评分作为1分，
(iii)将用4倍物镜观察到轻微的阳性反应的样本的评分作为2分，
(iv)将即使用4倍物镜也可以确认到能够充分地识别的阳性反应的样本的评分作为3分，
(v)将用4倍物镜可以清楚地识别、确认到强阳性反应的样本的评分作为4分；
反映细胞膜染色性的SI-Cm(细胞膜染色强度)值评分如下算出：在显微镜下视野中细胞的细胞膜中，
(i)上述显微镜使用4倍或10倍的物镜时，将检测出上述复合体的细胞比例为0的样本的评分作为0分，
(ii)上述显微镜使用10倍的物镜时，将虽然模糊但观察到轻微的阳性反应的样本的评分作为1分，
(iii)将用4倍物镜时虽然模糊但用10倍物镜时确认到能够充分识别的阳性反应的样本的评分作为2分，
(iv)将即使用4倍物镜也可以确认到能够充分地识别的阳性反应的样本的评分作为3分，
(v)将用4倍物镜可以清楚地识别、确认到强阳性反应的样本的评分作为4分；
SP(细胞膜染色方式)值评分如下算出：
在显微镜下视野中细胞的细胞膜中的上述复合体的检测中，
(i)将未确认到细胞膜中的阳性反应的样本的评分作为0分，
(ii)将确认到阳性反应的细胞中少于20％的细胞显示出完全膜染色的样本的评分作为1分，
(iii)将确认到阳性反应的细胞中的20％以上且少于50％的细胞显示出完全膜染色的样本的评分作为2分，
(iv)将确认到阳性反应的细胞中的50％以上的细胞显示出完全膜染色的样本的评分作为3分。
需要说明的是，使用SI-Cm算出的总评分用IRCm表示，使用SI-Cp算出的总评分用IRCp表示。
(6-3)染色性评价
来自移植了HuH-7及HepG2的动物模型的组织标本经过高压釜处理时的染色图像如图3所示。图3A表示对由HuH-7移植模型制备的切片进行利用高压釜处理的热诱导抗原活化处理得到的标本的染色图像；图3B表示对由HuH-7移植模型制备的切片进行蛋白酶抗原活化处理得到的标本的染色图像；图3C表示对由HepG2移植模型制备的切片进行利用高压釜处理的热诱导抗原活化处理得到的标本的染色图像；图3D表示对由HepG2移植模型制备的切片进行蛋白酶抗原活化处理得到的标本的染色图像。
另外，个别的染色参数的评分示于表3。根据来自移植了HuH-7及HepG2的动物模型的组织标本算出的IRCp值均为7，未观察到在HuH-7与HepG2之间该值存在差异。另外，上述IRCm值均为5，未见二者之间该值存在差异(表3及图3)。
[表3]
Figure BPA00001254370500301
另一方面，对来自移植了HuH-7及HepG2的动物模型的组织标本进行蛋白酶处理时个别染色参数的评分也示于表3。观察到由经过蛋白酶处理的组织标本得到的SI-Cm及SI-Cp评分高于由经过高压釜处理的标本得到的上述值的倾向。作为由个别染色参数算出的总评分，由移植了HuH-7及HepG2的组织标本得到的IRCp值分别为4和8。另外，由移植了HuH-7及HepG2的组织标本得到的IRCm值分别为4和9(表3及图3)。如图3最后一段的照片所示，对经过蛋白酶处理的组织标本进行染色时，可以分别明确地区分没有表达磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的细胞、中等程度表达磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的细胞、较强地表达磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的细胞。相对于此，对经过高压釜处理的组织标本进行染色时，没有得到上述定量性。进而，对经过高压釜处理的组织标本进行染色时，频繁地确认到对炎症细胞等的非特异性反应。
以上结果表明，与高压釜处理相比利用蛋白酶处理的抗原活化是更正确地反映磷脂酰肌醇蛋白聚糖3表达量差异的方法。另外，从组织标本细胞膜的染色性的观点考虑，表明蛋白酶处理比高压釜处理优异。
(实施例2)
使用人肝细胞癌组织标本的GPC3免疫染色中蛋白酶的抗原活 化效果
(1)人肝细胞癌样本中的免疫组织化学染色
(1-1)标本制作及染色方法
将人肝细胞癌样本在10％中性缓冲福尔马林中浸渍固定一定时间以上。然后，按照常规方法制作石蜡包埋的组织块标本。将上述组织块标本切成薄片，将所得组织切片用于免疫组织化学染色。免疫组织化学染色按照与实施例1同样的方法进行。
(1-2)染色结果的评价方法
基于实施例(6-2)的记载，小鼠抗人GPC3抗体免疫染色的染色性根据下述3个参数(细胞阳性率：PR，染色强度：SI，细胞膜染色方式：SP)进行评价。
即，通过下述方法，将各参数数值化，
PR(细胞阳性率)评分如下算出：
在使用4倍或10倍物镜的显微镜下视野中的细胞中，
(i)将检测出上述复合体的细胞比例为0的样本的评分作为0分，
(ii)将该比例小于20％的样本的评价作为1分，
(iii)将该比例为20％以上且小于50％的样本的评分作为2分，
(iv)将该比例为50％以上的样本的评分作为3分；
反映细胞质染色性的SI-Cp(细胞质染色强度)评分如下算出：
在显微镜下视野中细胞的细胞质中，
(i)上述显微镜使用4倍或10倍的物镜时，将检测出上述复合体的细胞比例为0的样本的评分作为0分，
(ii)上述显微镜使用10倍的物镜时，将虽然模糊但观察到轻微的阳性反应的样本的评分作为1分，
(iii)将用4倍物镜观察到轻微的阳性反应的样本的评分作为2分，
(iv)将即使用4倍物镜也可以确认能够充分地识别的阳性反应的样本的评分作为3分，
(v)将用4倍物镜可以清楚地识别、确认到强阳性反应的样本的评分作为4分；
反映细胞膜染色性的SI-Cm(细胞膜染色强度)值的评分如下算出：在显微镜下视野中细胞的细胞膜中，
(i)上述显微镜使用4倍或10倍的物镜时，将检测出上述复合体的细胞比例为0的样本的评分作为0分，
(ii)上述显微镜使用10倍的物镜时，将虽然模糊但观察到轻微的阳性反应的样本的评分作为1分，
(iii)将用4倍物镜时虽然模糊但用10倍物镜时确认到能够充分识别的阳性反应的样本的评分作为2分，
(iv)将即使用4倍物镜也可以确认到能够充分地识别的阳性反应的样本的评分作为3分，
(v)将用4倍物镜可以清楚地识别、确认到强阳性反应的样本的评分作为4分；
SP(细胞膜染色方式)评分如下算出：
在显微镜下视野中细胞的细胞膜中的上述复合体的检测中，
(i)将未确认到细胞膜中的阳性反应的样本的评分作为0分，
(ii)将确认到阳性反应的细胞中少于20％的细胞显示出完全膜染色的样本的评分作为1分，
(iii)将确认到阳性反应的细胞中的20％以上且少于50％的细胞显示出完全膜染色的样本的评分作为2分，
(iv)将确认到阳性反应的细胞中的50％以上的细胞显示出完全膜染色的样本的评分作为3分。
另外，对非特异性染色(背景)的程度(由炎症细胞及间质的染色性判断)也进行评价。
(1-3)结果及结论
经过抗原活化处理的标本的染色图像如图4所示。图4A表示对由病例A的样本制备的切片进行利用高压釜处理的热诱导抗原活化处理得到的标本的染色图像；图4B对由病例A的样本制备的切片进行蛋白酶抗原活化处理得到的标本的染色图像；图4C表示对由病例B的样本制备的切片进行利用高压釜处理的热诱导抗原活化处理得到的标本的染色图像；图4D表示对由病例B的样本制备的切片进行蛋白酶抗原活化处理得到的标本的染色图像；图4E表示对由病例C的样本制备的切片进行利用高压釜处理的热诱导抗原活化处理得到的标本的染色图像；图4F表示对由病例C的样本制备的切片进行蛋白酶抗原活化处理得到的标本的染色图像。
如图4及表4所示，经过高压釜处理的组织标本中，病例A、B、C在图中的肝细胞癌区域中的PR评分均为3(50％以上的区域为阳性)。另外，对于膜染色强度及膜染色方式，未确认到病例A及B的膜局部化(SI-Cm＝0及SP-Cm＝0)，相对于此，病例C中确认到膜表达，评分为SI-Cm＝1及SP-Cm＝2。需要说明的是，所有病例中均存在下述倾向：在炎症细胞及间质中确认到如图4病例B的照片所示的非特异性阳性反应。
[表4]
Figure BPA00001254370500331
另一方面，在经过蛋白酶处理的组织标本中，PR评分在病例A为1(小于20％的区域为阳性)，病例B中为2(20-50％的区域为阳性)，病例C中为3(50％以上的区域为阳性)。另外，对于膜染色强度及膜染色方式，病例A的各评分为SI-Cm＝1及SP-Cm＝1。另外，病例B的各评分为SI-Cm＝3及SP-Cm＝2。病例C中，确认到明显的膜表达，其各评分分别为SI-Cm＝4及SP-Cm＝3。需要说明的是，与经过高压釜处理的组织标本不同，经过蛋白酶处理的组织标本中基本未确认到非特异性的反应性。
以上结果暗示，在使用临床肝细胞癌样本的GPC3免疫染色中，与高压釜处理相比利用蛋白酶处理的抗原活化法是能够更准确地反映出GPC3的表达量差异的方法。另外，对于细胞膜染色性，表明蛋白酶处理也优异。进而，表明在蛋白酶法中由于非特异性阳性反应为最低限度，所以可以更准确地把握抗GPC3抗体的特异性阳性反应。
(实施例3)
抗GPC3抗体对表达GPC3的人肝癌细胞株移植小鼠模型的药效
(1)细胞株
使用HuH-7细胞及HepG2细胞作为用于移植的细胞。HuH-7细胞在含有10％FBS(BIONET)的Dulbecco’s Modified Eagle’s培养基(SIGMA)中维持并传代培养，HepG2细胞在含有10％FBS、1mmol/l MEM丙酮酸钠(Invitrogen)、1mmol/l MEM非必需氨基酸(Invitrogen)的Minimum Essential Medium Eagle培养基(SIGMA)中维持并传代培养。
(2)人肝癌细胞株移植小鼠模型的制作
使用分别含有等量上述传代培养用培养基和MATRIGEL Matrix(BD Biosciences)的溶液，使每1ml溶液中有5×107个细胞，制备各细胞。在移植的前一天，预先对SCID小鼠(雄性、5周龄、日本CLEA)腹腔内给与100μl抗脱唾液酸GM1抗体(和光纯药；将1安瓿用5ml PBS溶解)，向该小鼠的腹部皮下移植100μl该细胞悬浮液。即，每一只小鼠给与5×106个细胞。肿瘤体积用下式算出，在肿瘤体积的平均值为117～330mm3的时刻，形成模型。
式1：肿瘤体积＝长径×短径×短径/2.
(3)给与抗体的制备
作为治疗用抗体，在给与当天使用经过滤灭菌的PBS制备人源化抗人GPC3单克隆抗体(克隆名：hGC33，记载在公开申请WO2006/006693中)使其为0.5mg/ml、0.1mg/ml或0.05mg/ml，分别将其作为给与试剂用于5mg/kg给与组、1mg/kg给与组、0.5mg/kg给与组的的形式进行使用。
(4)抗体给与
对于如(2)所述制作的HuH-7细胞移植小鼠模型从移植后的第20天开始，对于HepG2细胞移植小鼠模型从其移植后26天开始，将上述(3)中制备的给与试剂以10ml/kg的用量通过尾静脉进行给与，每周1次共3周。作为阴性对照，将经过过滤灭菌的PBS(介质)以10ml/kg的用量通过尾静脉进行给与，与上述同样地每周给与1次共3周。所有组均按每1组5～6只小鼠构成。
(5)抗肿瘤效果的评价
根据肿瘤体积的经时变化(图5A)及从最后给与日开始1周后的肿瘤湿重量(图5B)，评价hGC33抗体的人肝癌移植小鼠模型中的抗肿瘤效果。图5A为表示HepG2移植小鼠模型中的肿瘤体积的经时变化的图。菱形表示给与介质的组的肿瘤体积的经时变化，四边形表示以1mg/kg给与hGC33抗体的组的肿瘤体积的经时变化，圆形表示以5mg/kg给与hGC33抗体的组的肿瘤体积的经时变化。用箭头表示给与hGC33抗体的时刻。图中*表示显著性检验的显著水平P为P＜0.05。另外，图中**表示显著性检验的显著水平P为P＜0.0001。图5B为表示HuH-7移植小鼠模型中的肿瘤体积的经时变化的图。菱形表示给与介质的组的肿瘤体积的经时变化，四边形表示以1mg/kg给与hGC33抗体的组的肿瘤体积的经时变化，圆形表示以5mg/kg给与hGC33抗体的组的肿瘤体积的经时变化。用箭头表示给与hGC33抗体的时刻。图中*表示显著性检验的显著水平P为P＜0.05。另外，图中**表示显著性检验的显著水平P为P＜0.0001。图5C为表示HepG2移植小鼠模型中的从最后给与日开始一周后的肿瘤湿重量的图。图中*表示显著性检验的显著水平P为P＜0.05。另外，图中**表示显著性检验的显著水平P为P＜0.0001。图5D为表示HuH-7移植小鼠模型中的从最后给与日开始一周后的肿瘤湿重量的图。图中*表示显著性检验的显著水平P为P＜0.05。另外，图中**表示显著性检验的显著水平P为P＜0.0001。
统计分析时，使用SAS临床前软件包(SAS Institute)。使用最后测定日的肿瘤体积，通过Dunnett型多重比较法评价显著性检验。结果，如图5A及5B所示，hGC33抗体给与组中的肿瘤的增殖与介质给与组中的肿瘤的增殖相比，显著地被抑制。另外，可知抗体的药效在HepG2细胞移植模型中较强，在HuH-7细胞移植模型中较弱。
以上，由利用蛋白酶抗原活化法制备的组织标本的免疫组织染色的分析结果可知，上述抗体对移植了HepG2细胞的小鼠模型显示出高的抗肿瘤效果，所述小鼠模型被判定为抗原的表达量高且显示出细胞膜局部化的表达方式。相对于此，上述抗体对移植了HuH-7细胞的小鼠模型显示出低的抗肿瘤效果，且根据上述分析结果可以诊断所述小鼠模型的抗原表达量低。结论是利用现有热诱导抗原活化法的分析无法推导出上述差异，表明通过将现有热诱导抗原活化法与蛋白酶抗原活化法组合，可以有效地判断GPC3抗体的药效。
将本说明书中引用的全部刊物、专利及专利申请作为参考直接引入本说明书中。
Figure IPA00001254370100011
Figure IPA00001254370100021

Claims (15)

1.一种用于检测受试者体内肝癌细胞的存在的体外免疫测定方法，包括下述步骤：
(a)提供来自同一受试者的至少两种能够视为相同的一组组织标本作为石蜡包埋切片，所述组织标本由所述受试者制备之后，被包埋在石蜡中并安装在透明性支持体上；
(b)对所述一组组织标本进行除石蜡处理；
(c)对进行了所述(b)处理的能够视为相同的一组组织标本中的一方，进行利用热诱导抗原活化法的抗原活化处理，对另一方进行利用蛋白酶抗原活化法的抗原活化处理；
(d)在适合于形成存在于经过所述(c)处理的组织标本中的磷脂酰肌醇蛋白聚糖3和抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体的复合体的条件下，使抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体与所述标本接触；
(e)检测复合体的存在，其中，当存在复合体时判定受试者体内存在肝癌细胞。
2.如权利要求1所述的方法，其中，所述热诱导抗原活化法利用微波加热。
3.如权利要求1所述的方法，其中，所述热诱导抗原活化法利用高压釜加热。
4.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中，所述蛋白酶抗原活化法中使用的蛋白酶选自胃蛋白酶、胰蛋白酶及蛋白酶K。
5.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中，用于检测复合体的检测反应为酶反应。
6.如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中，所述抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体为与磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的C末端多肽键合的抗体。
7.如权利要求6所述的方法，其中，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的C末端多肽为包含序列号1表示的第359号氨基酸至第580号氨基酸的多肽，或者为包含第375号氨基酸至第580号氨基酸的多肽。
8.如权利要求6或7所述的方法，其中，所述抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体为GC33抗体。
9.如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中，所述抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体为1G12抗体。
10.如权利要求1至9中任一项所述的方法，其中，步骤(e)中，将复合体的存在进行数值化并检测。
11.如权利要求10所述的方法，其中，所述数值化按照下式算出：
IRCp＝PR+(SI-Cp)+SP
式中，
IRCp为磷脂酰肌醇蛋白聚糖3表达量的评分；
PR为对显微镜下检测出所述复合体的细胞比例进行评分得到的数值；
SI-Cp为对在显微镜下所述复合体在视野中细胞的细胞质中被检测出的染色强度进行评分得到的数值；
SP为对在显微镜下的视野中细胞的细胞膜中显示出完全膜染色的细胞比例进行评分得到的数值。
12.如权利要求10所述的方法，其中，所述数值化按照下式算出：
IRCm＝PR+(SI-Cm)+SP
式中，
IRCm为磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的膜局部化的评分；
PR为对显微镜下检测出所述复合体的细胞比例进行评分得到的数值；
SI-Cm为对在显微镜下所述复合体在视野中细胞的细胞膜中被检测出的染色强度进行评分得到的数值；
SP为对在显微镜下的视野中细胞的细胞膜中显示出完全膜染色的细胞比例进行评分得到的数值。
13.一种对肝癌细胞分类的方法，所述方法基于利用权利要求11及12所述的方法算出的评分，对存在于受试者体内的肝癌细胞进行分类。
14.一种确定是否给与抗癌剂的方法，所述方法基于利用权利要求11及12所述的方法算出的评分，确定是否给与受试者含有抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体的抗癌剂。
15.一种确定抗癌剂给与量的方法，所述方法基于利用权利要求11及12所述的方法算出的评分，确定对受试者进行肝癌治疗中含有抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体的抗癌剂的给与量。
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