JP5280214B2

JP5280214B2 - 炎症性腸疾患の診断方法

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Publication number: JP5280214B2
Application number: JP2008558008A
Authority: JP
Inventors: 真吾加藤; 康治屋嘉比; 行夫伊藤; 三奈相良
Original assignee: Perseus Proteomics Inc
Current assignee: Perseus Proteomics Inc
Priority date: 2007-02-15
Filing date: 2008-02-14
Publication date: 2013-09-04
Anticipated expiration: 2028-02-14
Also published as: WO2008099608A1; JPWO2008099608A1

Description

本発明は、炎症性腸疾患への罹患の有無および／または炎症性腸疾患の活動性を判定するための方法及び診断薬に関する。

炎症性腸疾患は、クローン病、潰瘍性大腸炎などを含む、消化管各部の慢性炎症または潰瘍の存在で特徴付けられる疾患である。

クローン病は、主として若年層に発症し、口腔より肛門に至るまでの消化管において炎症および潰瘍を生じる疾患で、回腸末端部が病変の好発部位である。腸の病変部は縦走潰瘍および敷石状変化よりなり、病変が非連続性に散在するのが特徴的である。クローン病の罹患率は世界的にも増加傾向にあり、日本においても近年は患者数が顕著に増加しており、その原因のひとつとして食生活の欧米化が関与するとされている。クローン病は、再燃・再発を繰り返し慢性の経過をたどり、完全な治癒は困難である。

潰瘍性大腸炎は、大腸の粘膜から粘膜下層にかけてびらんや潰瘍が形成される大腸の炎症性疾患である。病変は直腸から連続的に、そして上行性（口側）に広がる性質があり、最も重症例では病変部は直腸から結腸全体におよぶ。潰瘍性大腸炎の日本における平成１４年度の特定疾患医療受給者証交付件数は７７０７３件であり、患者数は毎年約５０００人増加している。また、米国においては約１００万人の患者が存在するといわれている。潰瘍性大腸炎も、クローン病と同様に完治は困難な疾患であり再燃と寛解を繰り返す。

したがって、炎症性腸疾患の治療にあたっては、症状が安定している時期（寛解期）を長く維持することが患者のクオリティオブライフ（ＱＯＬ）の向上を図る上で非常に重要である。そのためには、患者の病態を的確に把握することが治療方針を立てる上で重要である。炎症性腸疾患の活動性を判定するための血液検査としては、数ある炎症マーカーのうち最も有用なものとして、急性期Ｃ反応性タンパク（ＣＲＰ）、白血球数、赤血球沈降速度（赤沈）が従来より用いられている。しかし、ＣＲＰは強度の炎症においては上昇するが、中等度の炎症ではしばしば上昇が認められず活動性を把握するための感度が十分ではない（非特許文献１）。また、炎症性腸疾患の治療のために通常処方されるステロイド薬投与の影響を受け、炎症が存在するにも関わらず正常値程度にまで下がる傾向があり、寛解期に至ったか否かを判断できないため治療方針の策定に利用することができない。逆に、白血球数はステロイド薬の投与により増加するので（非特許文献２）、こちらも治療の指標とすることはできない。赤沈は最も古典的な炎症マーカーの１つであるが、炎症が起きてから亢進するまで、炎症が沈静化してから正常値に戻るまでに時間を要するため、タイムリーに病態を把握することができない。

血液検査以外の炎症性腸疾患の診断方法として、内視鏡検査、問診が行われている。内視鏡検査は、確実性は高いが、時間・費用を多く要し、また、症状が激しい活動期においては病状の悪化や合併症を誘発するおそれがあるため実施することができない。問診もまた疾患の活動性を把握する手段であるが、時間を要し、客観性にやや欠けるという欠点がある。炎症性腸疾患の活動性の把握は、現在は先に挙げた血液検査項目、内視鏡検査、問診を適宜組み合わせることにより行われているが、患者への負担が少なく、簡便で客観的な炎症性腸疾患の診断方法および活動性の指標が求められていた。

ＰＴＸ３は、Pentraxin、Pentaxin、ＴＳＧ−１４、ＭＰＴＸ３とも呼ばれ、インターロイキン１（ＩＬ−１）刺激を受けたヒト臍帯内皮細胞に発現しているものとして発見されたペントラキシン（Pentraxin）ファミリーに属する分泌タンパク質である（非特許文献３）。
ペントラキシンファミリーはLong PentraxinとShort Pentraxinに大別される。炎症性タンパクとして知られているC reactive protein（ＣＲＰ）やserum amyloid P component（ＳＡＰ）はShort Pentraxinに属し、炎症により生じるＩＬ−６に反応して肝臓で産生される。しかし、ＰＴＸ３はＣＲＰやＳＡＰと異なりＩＬ−６による誘導を受けないことが知られている（非特許文献３、４）。

ＰＴＸ３は、局所の炎症や組織の障害により、ＩＬ−１やＴＮＦ−α等の炎症性サイトカインの誘導により種々の細胞で産生が上昇するとされているが（非特許文献３、４）、炎症性腸疾患において、患部にＰＴＸ３が存在すること、血中ＰＴＸ３を測定し診断に利用できること、さらには活動性の判定に利用できることを示唆する文献は知られていない。
Vermeir et al.:Inflamm Bowel Dis.,10(5),661-5(2004) 今日の臨床検査2005-2006(第9版)南江堂、30-33(2005) Breviario et al.:J.Biol.Chem.,267(31),22190-7(1992) Domyaku Koka(Arteriosclerosis),24(7-8),375-80(1996)

本発明の目的は、炎症性腸疾患の有無および／または活動性を診断する方法を提供することにある。

本発明者らは、抗ＰＴＸ３モノクローナル抗体を用いて血中及び病変部のＰＴＸ３濃度を測定し、その濃度と種々の疾患との関係について検討してきたところ、全く意外にも炎症性腸疾患において、病変部および血中にＰＴＸ３が増加することを見出し、また、炎症性腸疾患の活動性を示すスコア（ＩＯＩＢＤ、メイヨースコア）とＰＴＸ３濃度を対比した結果、炎症性腸疾患の活動性とＰＴＸ３濃度との間に明確な相関関係を認めた。ＰＴＸ３濃度の測定により炎症性腸疾患の有無および炎症性腸疾患の活動性を判定することができ、患者毎に適切な治療指針を決定することができることを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、被検試料中のＰＴＸ３を測定することを特徴とする、炎症性腸疾患の有無および／または炎症性腸疾患の活動性判定方法を提供するものである。
また、本発明は、ＰＴＸ３測定試薬を含有する炎症性腸疾患の有無および／または炎症性腸疾患の活動性の診断薬を提供するものである。
また、本発明は、ＰＴＸ３測定試薬の、炎症性腸疾患の有無および／または炎症性腸疾患の活動性の診断薬製造のための使用を提供するものである。

本発明によれば、炎症性腸疾患の有無および／または炎症性腸疾患の活動性を簡便に短時間で診断することができる。炎症性腸疾患の活動性の診断は、寛解期と活動期の鑑別、再燃の早期把握、活動性の重篤度を把握することにより、適切な治療方針を策定するために有用である。

活動期または寛解期の潰瘍性大腸炎患者およびクローン病患者の血漿ＰＴＸ３濃度の濃度を示す。Ｎは健常人、ＵＣ−Ａは潰瘍性大腸炎（活動期）、ＵＣ−Ｎは潰瘍性大腸炎（寛解期）、ＣＤ−Ａはクローン病（活動期）、ＣＤ−Ｎはクローン病（寛解期）を意味する。縦軸に血漿ＰＴＸ３濃度をｎｇ／ｍＬの単位で示す。炎症性腸炎患者大腸の免疫組織化学染色の結果を示す。Ａ：対照（二次抗体のみ）、Ｂ：抗ＰＴＸ３抗体による免疫組織化学染色Ａ：潰瘍性大腸炎患者の血漿ＰＴＸ３濃度と部分的メイヨースコア（partial Mayo score）との相関を示す。Ｂ：潰瘍性大腸炎患者の血清ＣＲＰ濃度と部分的メイヨースコア（partial Mayo score）との相関を示す。Ａ：クローン病患者の血漿ＰＴＸ３濃度とＩＯＩＢＤスコアとの相関を示す。Ｂ：潰瘍性大腸炎患者の血清ＣＲＰ濃度とＩＯＩＢＤスコアとの相関を示す。

本発明において測定とは、定量的または非定量的な測定を含み、例えば、非定量的な測定としては、単にＰＴＸ３タンパク質が存在するか否かの測定、ＰＴＸ３タンパク質が一定の量以上存在するか否かの測定、ＰＴＸ３タンパク質の量を他の試料（例えば、コントロール試料など）と比較する測定などを挙げることができる。定量的な測定としては、ＰＴＸ３タンパク質の濃度の測定、ＰＴＸ３タンパク質の量の測定などを挙げることができる。なおＰＴＸ３遺伝子の塩基およびアミノ酸配列の情報はＧｅｎｂａｎｋ等の公共データベースより得ることができ、例えばＧｅｎｂａｎｋのアクセッション番号ＮＭ＿００２８５２に開示されている。

被検試料とは、ＰＴＸ３のタンパク質が含まれる可能性のある試料であれば特に制限されないが、哺乳類などの生物の体から採取された試料が好ましく、さらに好ましくはヒトから採取された試料である。被検試料の具体的な例としては、例えば、血液、間質液、血漿、血管外液、脳脊髄液、滑液、胸膜液、血清、リンパ液、唾液、尿、腸組織などを挙げることができるが、好ましいのは血液、血清、血漿である。又、採取された腸組織の培養液などの、被検試料から得られる試料も本発明の被検試料に含まれる。

患者より被検試料を採取し、被検試料のＰＴＸ３濃度を測定し、健常人のＰＴＸ３濃度の分布より求められた基準値と比較して高値であれば炎症性腸疾患の存在が疑われる。

炎症性腸疾患の活動性とは、炎症性腸疾患の臨床症状の重症度および炎症の重篤度をいい、活動性を把握する方法の例としてクローン病においてはＩＯＩＢＤ、潰瘍性大腸炎においてはメイヨースコア（Mayo score）を用いることができる。以下にそれぞれのスコアの算出方法を示す。

＜＜メイヨースコアの算出方法＞＞
以下の４項目のサブスコアの合計とする
１．排便回数
・潰瘍性大腸炎になる前の１日排便回数と同程度（０点）
・潰瘍性大腸炎になる前の１日排便回数より１〜２回多い（１点）
・潰瘍性大腸炎になる前の１日排便回数より３〜４回多い（２点）
・潰瘍性大腸炎になる前の１日排便回数より５回以上多い（３点）

２．直腸からの出血
・血液なし（０点）
・少量の血液、排便回数の半分以下（１点）
・はっきりした血液、ほぼ毎回（２点）
・ほぼ血液ばかり（３点）

３．内視鏡所見
・正常もしくは寛解期粘膜（０点）
・軽症（発赤、血管透見の減少、軽度の脆弱性）（１点）
・中等症（著名な発赤、血管透見の消失、脆弱性、びらん）（２点）
・重症（自然出血、潰瘍）（３点）

４．医師による全般評価
・正常と区別がつかない状態（完全な寛解期）（０点）
・軽度の活動期（軽症）（１点）
・中等度の活動期（中等症）（２点）
・高度の活動期（重症）（３点）
注）内視鏡検査を実施することができなかった場合には「３．内視鏡所見」を除いた３項目のサブスコアの合計を算出し、それを部分的メイヨースコアとする。

＜＜ＩＯＩＢＤスコアの算出方法＞＞
以下の１項目を１点とし、合計点をスコアとする。スコアが０または１で、赤沈値、ＣＲＰが正常化した状態を「寛解」とする。また、スコアが２以上で、赤沈値、ＣＲＰが異常な状態を「再燃」とする。
１．腹痛
２．１日６回以上の下痢あるいは粘血便
３．肛門部病変
４．ろう孔
５．その他の合併症
６．腹部腫瘤
７．体重減少
８．３８℃以上の発熱
９．腹部圧痛
１０．１０ｇ／ｄＬ以下の血色素

本発明方法においては、ＰＴＸ３の測定は、抗ＰＴＸ３抗体を用いる免疫学的測定法が好ましい。以下、抗ＰＴＸ３抗体を用いた測定法について詳細に説明する。

本発明で用いられる抗ＰＴＸ３抗体はＰＴＸ３タンパク質に特異的に結合すればよい。好ましくは、ＰＴＸ３の立体構造に高い結合親和性を示し、より好ましくはＰＴＸ３の立体構造に高い結合親和性を示し、且つ、ＣＲＰやＳＡＰに交差反応しない抗体である。さらに好ましくは、ＰＰＭＸ０１０２（ＦＥＲＭＢＰ−１０３２６）、ＰＰＭＸ０１０４（ＦＥＲＭＢＰ−１０７１９）およびＰＰＭＸ０１０５（ＦＥＲＭＢＰ−１０７２０）であり、最も好ましくは、ＰＰＭＸ０１０４（ＦＥＲＭＢＰ−１０７１９）およびＰＰＭＸ０１０５（ＦＥＲＭＢＰ−１０７２０）である。
本明細書に記載したＰＰＭＸ０１０２（ＦＥＲＭＢＰ−１０３２６）、ＰＰＭＸ０１０４（ＦＥＲＭＢＰ−１０７１９）およびＰＰＭＸ０１０５（ＦＥＲＭＢＰ−１０７２０）は、産業技術総合研究所特許生物寄託センター（住所：茨城県つくば市東１−１−１中央第６）に寄託したものである（ＰＰＭＸ０１０２：寄託日：平成１７（２００５）年２月１０日、ＰＰＭＸ０１０４およびＰＰＭＸ０１０５：寄託日：平成１７（２００５）年９月２２日）。

抗体の由来、種類（モノクローナル、ポリクローナル）および形状を問わない。具体的には、マウス抗体、ラット抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、ヒト型化抗体などの公知の抗体を用いることができる。抗体はポリクローナル抗体でもよいが、モノクローナル抗体であることが好ましい。

また、免疫学的測定法において支持体に固定される抗ＰＴＸ３抗体と標識物質で標識される抗ＰＴＸ３抗体はＰＴＸ３分子の同じエピトープを認識してもよいし、異なるエピトープを認識してもよい。

本発明で使用される抗ＰＴＸ３抗体は、公知の手段を用いてポリクローナルまたはモノクローナル抗体として得ることができる。本発明で使用される抗ＰＴＸ３抗体として、特に哺乳動物由来のモノクローナル抗体が好ましい。哺乳動物由来のモノクローナル抗体は、ハイブリドーマにより産生されるもの、および遺伝子工学的手法により抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した宿主に産生されるものを含む。

モノクローナル抗体産生ハイブリドーマは、基本的には公知技術を使用し、以下のようにして作製できる。すなわち、ＰＴＸ３を感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナルな抗体産生細胞をスクリーニングすることによって作製できる。

具体的には、モノクローナル抗体を作製するには次のようにすればよい。
まず、抗体取得の感作抗原として使用されるＰＴＸ３を、入手可能な細胞の培養上清から精製して得る。あるいは、特表２００２−５０３６４２に開示された方法に従い得ることもできる。
次に、この精製ＰＴＸ３タンパク質を感作抗原として用いる。あるいは、ＰＴＸ３の部分ペプチドを感作抗原として使用することもできる。この際、当該部分ペプチドはヒトＰＴＸ３のアミノ酸配列より化学合成により得ることもできるし、ＰＴＸ３遺伝子の一部を発現ベクターに組込んで得ることもでき、さらに天然のＰＴＸ３をタンパク質分解酵素により分解することによっても得ることができる。部分ペプチドとして用いるＰＴＸ３の部分および大きさは特に限定されない。

感作抗原で免疫される哺乳動物としては、特に限定されるものではないが、細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましく、一般的にはげっ歯類の動物、例えば、マウス、ラット、ハムスター、その他、ウサギ、サル等が使用される。

感作抗原の動物への免疫は公知の方法に従って行うことができる。例えば、一般的方法として、感作抗原を哺乳動物の腹腔内または皮下に注射することにより行われる。具体的には、感作抗原をＰＢＳ（Phosphate-Buffered Saline）や生理食塩水等で適当量に希釈、懸濁したものに所望により通常のアジュバント、例えばフロイント完全アジュバントを適量混合し、乳化後、哺乳動物に４〜２１日毎に数回投与する。また、感作抗原免疫時に適当な担体を使用することもできる。特に分子量の小さい部分ペプチドを感作抗原として用いる場合には、アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン等の担体タンパク質と結合させて免疫することが望ましい。

このように哺乳動物を免疫し、血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを確認した後に、哺乳動物から免疫細胞を採取し、細胞融合に付されるが、好ましい免疫細胞としては、特に脾細胞が挙げられる。

前記免疫細胞と融合される他方の親細胞として、哺乳動物のミエローマ細胞を用いる。このミエローマ細胞は、公知の種々の細胞株、例えば、Ｐ３（Ｐ３ｘ６３Ａｇ８．６５３）（J.Immnol.(1979)123,1548-1550）、Ｐ３ｘ６３Ａｇ８Ｕ．１（Current Topics in Microbiology and Immunology(1978)81,1-7）、ＮＳ−１（Kohler.G.and Milstein,C.Eur.J.Immunol.(1976)6,511-519）、ＭＰＣ−１１（Margulies.D.H.et al.,Cell(1976)8,405-415）、ＳＰ２／０（Shulman,M.et al.,Nature(1978)276,269-270）、ＦＯ（de St.Groth,S.F.et al.,J.Immunol.Methods(1980)35,1-21）、Ｓ１９４（Trowbridge,I.S.J.Exp.Med.(1978)148,313-323）、Ｒ２１０（Galfre,G.et al.,Nature(1979)277,131-133）等が好適に使用される。

前記免疫細胞とミエローマ細胞との細胞融合は、基本的には公知の方法、たとえば、ケーラーとミルステインらの方法（Kohler.G.and Milstein,C.,Methods Enzymol.(1981)73,3-46）等に準じて行うことができる。

より具体的には、前記細胞融合は、例えば細胞融合促進剤の存在下に通常の栄養培養液中で実施される。融合促進剤としては、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、センダイウイルス（ＨＶＪ）等が使用され、さらに所望により融合効率を高めるためにジメチルスルホキシド等の補助剤を添加使用することもできる。

免疫細胞とミエローマ細胞との使用割合は任意に設定することができる。例えば、ミエローマ細胞に対して免疫細胞を１〜１０倍とするのが好ましい。前記細胞融合に用いる培養液としては、例えば、前記ミエローマ細胞株の増殖に好適なＲＰＭＩ１６４０培養液、ＭＥＭ培養液、その他、この種の細胞培養に用いられる通常の培養液が使用可能であり、さらに、牛胎児血清（ＦＣＳ）等の血清補液を併用することもできる。

細胞融合は、前記免疫細胞とミエローマ細胞との所定量を前記培養液中でよく混合し、予め３７℃程度に加温したポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（例えば平均分子量１０００〜６０００程度）溶液を通常３０〜６０％（ｗ／ｖ）の濃度で添加し、混合することによって目的とする融合細胞（ハイブリドーマ）を形成する。続いて、適当な培養液を逐次添加し、遠心して上清を除去する操作を繰り返すことによりハイブリドーマの生育に好ましくない細胞融合剤等を除去する。

このようにして得られたハイブリドーマは、通常の選択培養液、例えばＨＡＴ培養液（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む培養液）で培養することにより選択される。上記ＨＡＴ培養液での培養は、目的とするハイブリドーマ以外の細胞（非融合細胞）が死滅するのに十分な時間（通常、数日〜数週間）継続する。ついで、通常の限界希釈法を実施し、目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングおよび単一クローニングを行う。

目的とする抗体のスクリーニングおよび単一クローニングは、公知の抗原抗体反応に基づくスクリーニング方法で行えばよい。例えば、ポリスチレン等でできたビーズや市販の９６ウェルのマイクロタイタープレート等の担体に抗原を結合させ、ハイブリドーマの培養上清と反応させ、担体を洗浄した後に酵素標識第２次抗体等を反応させることにより、培養上清中に感作抗原と反応する目的とする抗体が含まれるかどうか決定できる。目的とする抗体を産生するハイブリドーマを限界希釈法等によりクローニングすることができる。この際、抗原としては免疫に用いたものを用いればよい。

また、ヒト以外の動物に抗原を免疫して上記ハイブリドーマを得る他に、ヒトリンパ球をｉｎｖｉｔｒｏでＰＴＸ３に感作し、感作リンパ球をヒト由来の永久分裂能を有するミエローマ細胞と融合させ、ＰＴＸ３への結合活性を有する所望のヒト抗体を得ることもできる（特公平１−５９８７８号公報参照）。さらに、ヒト抗体遺伝子の全てのレパートリーを有するトランスジェニック動物に抗原となるＰＴＸ３を投与して抗ＰＴＸ３抗体産生細胞を取得し、これを不死化させた細胞からＰＴＸ３に対するヒト抗体を取得してもよい（ＷＯ９４／２５５８５号パンフレット、ＷＯ９３／１２２２７号パンフレット、ＷＯ９２／０３９１８号パンフレット、ＷＯ９４／０２６０２号パンフレット報参照）。

このようにして作製されるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、通常の培養液中で継代培養することが可能であり、また、液体窒素中で長期保存することが可能である。

当該ハイブリドーマからモノクローナル抗体を取得するには、当該ハイブリドーマを通常の方法に従い培養し、その培養上清として得る方法、あるいはハイブリドーマをこれと適合性がある哺乳動物に投与して増殖させ、その腹水として得る方法などが採用される。前者の方法は、高純度の抗体を得るのに適しており、一方、後者の方法は、抗体の大量生産に適している。

これら抗体断片をコードする遺伝子を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させる方法がもちいられる。

また、これらの抗体は、ＰＴＸ３遺伝子によってコードされる蛋白質の全長または一部を認識する特性を失わない限り、抗体断片（フラグメント）等の低分子化抗体や抗体の修飾物などであってもよい。抗体断片の具体例としては、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、Ｄｉａｂｏｄｙなどを挙げることができる。このような抗体断片を得るには、ペプシンやパパインによりＩｇＧのＦｃ部分を消化する方法や、これら抗体断片をコードする遺伝子を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させればよい（例えば、Co,M.S.et al.,J.Immunol.(1994)152,2968-2976; Better,M.and Horwitz,A.H.,Methods Enzymol.(1989)178,476-496; Pluckthun,A.and Skerra,A.,Methods Enzymol.(1989)178,497-515; Lamoyi,E.,Methods Enzymol.(1986)121,652-663; Rousseaux,J.et al.,Methods Enzymol.(1986)121,663-669;Bird,R.E.and Walker,B.W.,Trends Biotechnol.(1991)9,132-137参照）。

前記のように産生された抗体は、細胞、宿主動物から分離し均一にまで精製することができる。本発明で使用される抗体の分離、精製はアフィニティーカラムを用いて行うことができる。例えば、プロテインＡカラムを用いたカラムとして、ＨｙｐｅｒＤ、ＰＯＲＯＳ、ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦ．Ｆ．（ＧＥヘルスケア社製）等が挙げられる。その他、通常のタンパク質で使用されている分離、精製方法を使用すればよく、何ら限定されるものではない。例えば、上記アフィニティーカラム以外のクロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、透析等を適宜選択、組み合わせることにより、抗体を分離、精製することができる（Antibodies A Laboratory Manual.Ed Harlow,David Lane,Cold Spring Harbor Laboratory,1988）。

抗体の修飾物として、標識物質等の各種分子と結合した抗ＰＴＸ３抗体を使用することもできる。本発明における「抗体」にはこれらの抗体修飾物も包含される。このような抗体修飾物は、得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。なお、抗体の修飾方法はこの分野においてすでに確立されている。

本発明において測定するＰＴＸ３は、特に限定されず、全長ＰＴＸ３でも、その断片でもよい。

被検試料に含まれるＰＴＸ３タンパク質の検出方法は特に限定されないが、抗ＰＴＸ３抗体を用いた免疫学的方法により検出することが好ましい。免疫学的方法としては、例えば、ラジオイムノアッセイ、エンザイムイムノアッセイ、蛍光イムノアッセイ、発光イムノアッセイ、免疫沈降法、免疫比濁法、ウエスタンブロット、免疫染色、免疫拡散法などを挙げることができるが、好ましくはエンザイムイムノアッセイであり、特に好ましいのは酵素結合免疫吸着定量法（enzyme-linked immunosorbent assay：ＥＬＩＳＡ）（例えば、ｓａｎｄｗｉｃｈＥＬＩＳＡ）である。ＥＬＩＳＡなどの上述した免疫学的方法は当業者に公知の方法により行うことが可能である。

抗ＰＴＸ３抗体を用いた一般的な検出方法としては、例えば、抗ＰＴＸ３抗体を支持体に固定し、ここに被検試料を加え、インキュベートを行い抗ＰＴＸ３抗体とＰＴＸ３タンパク質を結合させた後に洗浄して、抗ＰＴＸ３抗体を介して支持体に結合したＰＴＸ３タンパク質を検出することにより、被検試料中のＰＴＸ３タンパク質の検出を行う方法を挙げることができる。

本発明において用いられる支持体としては、例えば、アガロース、セルロースなどの不溶性の多糖類、シリコーン樹脂、ポリスチレン樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、ナイロン樹脂、ポリカーボネイト樹脂などの合成樹脂や、ガラスなどの不溶性の支持体を挙げることができる。これらの支持体は、ビーズやプレートなどの形状で用いることが可能である。ビーズの場合、これらが充填されたカラムなどを用いることができる。プレートの場合、マルチウェルプレート（９６穴マルチウェルプレート等）やバイオセンサーチップなどを用いることができる。抗ＰＴＸ３抗体と支持体との結合は、化学結合や物理的な吸着などの通常用いられる方法により結合することができる。これらの支持体はすべて市販のものを用いることができる。

抗ＰＴＸ３抗体とＰＴＸ３タンパク質との結合は、通常、緩衝液中で行われる。緩衝液としては、例えば、リン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、クエン酸緩衝液、ホウ酸塩緩衝液、炭酸塩緩衝液、などが使用される。また、インキュベーションの条件としては、すでによく用いられている条件、例えば、４℃〜室温にて１時間〜２４時間のインキュベーションが行われる。インキュベート後の洗浄は、ＰＴＸ３タンパク質と抗ＰＴＸ３抗体の結合を妨げないものであれば何でもよく、例えば、Ｔｗｅｅｎ２０等の界面活性剤を含む緩衝液などが使用される。

本発明のＰＴＸ３タンパク質測定方法においては、ＰＴＸ３タンパク質を検出したい被検試料の他に、コントロール試料を設置してもよい。コントロール試料としては、ＰＴＸ３タンパク質を含まない陰性コントロール試料やＰＴＸ３タンパク質を含む陽性コントロール試料などがある。この場合、ＰＴＸ３タンパク質を含まない陰性コントロール試料で得られた結果、ＰＴＸ３タンパク質を含む陽性コントロール試料で得られた結果と比較することにより、被検試料中のＰＴＸ３タンパク質を検出することが可能である。また、濃度を段階的に変化させた一連のコントロール試料を調製し、各コントロール試料に対する検出結果を数値として得て、標準曲線を作成し、被検試料の数値から標準曲線に基づいて、被検試料に含まれるＰＴＸ３タンパク質を定量的に検出することも可能である。

抗ＰＴＸ３抗体を介して支持体に結合したＰＴＸ３タンパク質の測定の好ましい態様として、標識物質で標識された抗ＰＴＸ３抗体を用いる方法を挙げることができる。
例えば、支持体に固定された抗ＰＴＸ３抗体に被検試料を接触させ、洗浄後に、ＰＴＸ３タンパク質を特異的に認識する標識抗体を用いて検出する。

抗ＰＴＸ３抗体の標識は通常知られている方法により行うことが可能である。標識物質としては、蛍光色素、酵素、補酵素、化学発光物質、放射性物質などの当業者に公知の標識物質を用いることが可能であり、具体的な例としては、ラジオアイソトープ（^３２Ｐ、^１４Ｃ、^１２５Ｉ、^３Ｈ、^１３１Ｉなど）、フルオレセイン、ローダミン、ダンシルクロリド、ウンベリフェロン、ルシフェラーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、ホースラディッシュパーオキシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、サッカリドオキシダーゼ、マイクロペルオキシダーゼ、ビオチンなどを挙げることができる。標識物質としてビオチンを用いる場合には、ビオチン標識抗体を添加後に、アルカリホスファターゼなどの酵素を結合させたアビジンをさらに添加することが好ましい。標識物質と抗ＰＴＸ３抗体との結合には、グルタルアルデヒド法、マレイミド法、ピリジルジスルフィド法、過ヨウ素酸法、などの公知の方法を用いることができる。

抗体の酵素標識法としては、ヒンジ法とノンヒンジ法の２つが挙げられるがこれに限定しない。ヒンジ法は、抗体ＩｇＧの抗原結合能を有するＦ（ａｂ’）２部分との間のヒンジ部と呼ばれる部分にあるジルスフィド結合を還元して生成するチオール基を利用してＦａｂ’と酵素分子を結合する方法である。一方、ノンヒンジ法は、抗体のいずれの反応基を利用するかは特定しないが、多くの場合、抗体のアミノ基を利用して抗体分子と酵素分子を結合する方法である。

具体的には、抗ＰＴＸ３抗体を含む溶液をプレートなどの支持体に加え、抗ＰＴＸ３抗体を支持体に固定する。プレートを洗浄後、タンパク質の非特異的な結合を防ぐため、例えばＢＳＡ、ゼラチン、アルブミンなどでブロッキングする。再び洗浄し、被検試料をプレートに加える。インキュベートの後、洗浄し、標識抗ＰＴＸ３抗体を加える。適度なインキュベーションの後、プレートを洗浄し、プレートに残った標識抗ＰＴＸ３抗体を検出する。検出は当業者に公知の方法により行うことができ、例えば、放射性物質による標識の場合には液体シンチレーションやＲＩＡ法により検出することができる。酵素による標識の場合には基質を加え、基質の酵素的変化、例えば発色を吸光度計により検出することができる。基質の具体的な例としては、２，２−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）ジアンモニウム塩（ＡＢＴＳ）、１，２−フェニレンジアミン（オルソ−フェニレンジアミン）、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）などを挙げることができる。蛍光物質の場合には蛍光光度計により検出することができる。

本発明のＰＴＸ３タンパク質測定方法の特に好ましい態様として、抗体ＩｇＧの抗原結合能とは関係のないＦｃ部分を除去し、一般的な酵素標識法記載の方法で標識をした抗体を用いる方法を挙げることができる。

具体的には、抗ＰＴＸ３抗体を含む溶液をプレートなどの支持体に加え、抗ＰＴＸ３抗体を固定する。プレートを洗浄後、タンパク質の非特異的な結合を防ぐため、例えばＢＳＡなどでブロッキングする。再び洗浄し、被検試料をプレートに加える。インキュベートの後、洗浄し、ペルオキシダーゼ直接標識抗ＰＴＸ３抗体を加える。適度なインキュベーションの後、プレートを洗浄し、酵素に対応した基質を加え、基質の酵素的変化などを指標にＰＴＸ３タンパク質を検出する。

本発明のＰＴＸ３タンパク質測定方法の他の態様として、ＰＴＸ３タンパク質を特異的に認識する一次抗体を一種類以上、および該一次抗体を特異的に認識する二次抗体を一種類以上用いる方法を挙げることができる。

例えば、支持体に固定された一種類以上の抗ＰＴＸ３抗体に被検試料を接触させ、インキュベーションした後、洗浄し、洗浄後に結合しているＰＴＸ３タンパク質を、一次抗ＰＴＸ３抗体および該一次抗体を特異的に認識する一種類以上の二次抗体により検出する。この場合、二次抗体は好ましくは標識物質により標識されている。

本発明のＰＴＸ３タンパク質の測定方法の他の態様としては、凝集反応を利用した検出方法を挙げることができる。該方法においては、抗ＰＴＸ３抗体を感作した担体を用いてＰＴＸ３を検出することができる。抗体を感作する担体としては、不溶性で、非特異的な反応を起こさず、かつ安定である限り、いかなる担体を使用してもよい。例えば、ラテックス粒子、ベントナイト、コロジオン、カオリン、固定羊赤血球等を使用することができるが、ラテックス粒子を使用するのが好ましい。ラテックス粒子としては、例えば、ポリスチレンラテックス粒子、スチレン−ブタジエン共重合体ラテックス粒子、ポリビニルトルエンラテックス粒子等を使用することができるが、ポリスチレンラテックス粒子を使用するのが好ましい。感作した粒子を試料と混合し、一定時間攪拌する。試料中に抗ＰＴＸ３抗体が高濃度で含まれるほど粒子の凝集度が大きくなるので、凝集を肉眼でみることによりＰＴＸ３を検出することができる。また、凝集による濁度を分光光度計等により測定することによっても検出することが可能である。

本発明のＰＴＸ３タンパク質の測定方法の他の態様としては、例えば、表面プラズモン共鳴現象を利用したバイオセンサーを用いた方法を挙げることができる。表面プラズモン共鳴現象を利用したバイオセンサーはタンパク質−タンパク質間の相互作用を微量のタンパク質を用いてかつ標識することなく、表面プラズモン共鳴シグナルとしてリアルタイムに観察することが可能である。例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ（Pharmacia社製）等のバイオセンサーを用いることによりＰＴＸ３タンパク質と抗ＰＴＸ３抗体の結合を検出することが可能である。具体的には、抗ＰＴＸ３抗体を固定化したセンサーチップに、被検試料を接触させ、抗ＰＴＸ３抗体に結合するＰＴＸ３タンパク質を共鳴シグナルの変化として検出することができる。

本発明の測定方法は、種々の自動検査装置を用いて自動化することもでき、一度に大量の試料について検査を行うことも可能である。

本発明は、免疫組織化学染色に用いることもできる。バイオプシーや手術によって得られた組織を当業者に公知の方法で抗ＰＴＸ３抗体を用いて染色することができる。

本発明は、炎症性腸疾患の有無および／または炎症性腸疾患の活動性の判定に用いる診断薬の提供をも目的とするが、該診断薬は抗ＰＴＸ３抗体を含むことが好ましい。ここで診断薬には、キットも含まれる。該診断薬がＥＬＩＳＡ法に基づく場合は、抗体を固相化する担体を含んでいてもよく、抗体があらかじめ担体に結合していてもよい。該診断薬がラテックス等の担体を用いた凝集法に基づく場合は抗体が吸着した担体を含んでいてもよい。また、該診断薬は、適宜、ブロッキング溶液、反応溶液、反応停止液、試料を処理するための試薬等を含んでいてもよい。

以下、実施例により、本発明を具体的に説明する。但し、本発明はこれらの実施例に限定されるものでない。

＜実施例１ＥＬＩＳＡ系の構築と血中ＰＴＸ３濃度の測定＞
血中のＰＴＸ３タンパク質を検出するため、ＰＴＸ３のサンドイッチＥＬＩＳＡ系を以下のように構築した。すなわち、９６ウェルプレートにコートする抗体にはＦ（ａｂ’）２化ＰＰＭＸ０１０４（ＦＥＲＭＢＰ−１０７１９）を５μｇ／ｍＬ、１００μＬ／ｗｅｌｌ、４℃、一晩インキュベーションし固相化を行った。
翌日３００μＬ／ｗｅｌｌの洗浄緩衝液（０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０，ＰＢＳ）で３回洗浄後、ＡＢＩ社のイムノアッセイスタビライザー（ＡＢＩ＃１０−６０１−００１）を１５０μＬ加え、ブロッキングを行い、４℃で一晩保管した。本ＥＬＩＳＡ法については、出願番号PCT/JP2006/322505に開示されている。潰瘍性大腸炎患者（活動期９名、寛解期６名）、クローン病患者（活動期７名、寛解期６名）、対照として健常人６名より血漿を採取しＰＴＸ３−ＥＬＩＳＡ法の測定試料とした。血漿を、動物血清などを含む希釈緩衝液（50mM Tris-Cl pH8.0, 0.15M NaCl）で適当に希釈したものを加え２時間室温でインキュベートした。次いで、動物血清などを含むＰＢＳ（−）で２０μｇ／ｍＬとなるように希釈したＨＲＰＯ（ホースラディッシュペルオキシダーゼ）標識Ｆａｂ’化ＰＰＭＸ０１０５抗体を加え２時間室温でインキュベートした。反応液を捨てた後、３００μＬ／ｗｅｌｌの洗浄緩衝液で５回洗浄した後、添付のプロトコールに従いＳｃｙｔｅｋ社のＴＭＢ（Ｃａｔ＃ＴＭ４９９９）を用いて発色させ、マイクロプレートリーダーで吸光度を測定した。サンプル中のＰＴＸ３タンパク質濃度の換算には、表計算ソフトＧｌａｐｈＰａｄＰＲＩＳＭ（GlaphPad software Inc.ver.3.0）を用いて解析した。
ＰＴＸ３測定の結果、健常人の平均値±標準偏差（ＳＤ）は１．３８±０．４８ｎｇ／ｍＬ、潰瘍性大腸炎の活動期患者では７．９８±１．４ｎｇ／ｍＬ、潰瘍性大腸炎の寛解期患者では１．８８±０．２ｎｇ／ｍＬ、クローン病患者の活動期患者では５．３１±０．７４ｎｇ／ｍＬ、クローン病患者の寛解期患者では２．０３±０．３８ｎｇ／ｍＬであった。
クルスカルワーリス検定の後、多重比較検定で分散分析したところ、潰瘍性大腸炎の活動期と寛解期、潰瘍性大腸炎の活動期と健常人との間には有意差が認められた（ｐ＜０．０５）（図１）。マンーホイットニー検定では、潰瘍性大腸炎の活動期と、寛解期および健常人それぞれとの間、クローン病の活動期と、寛解期および健常人それぞれとの間に有意差が認められた（ｐ＜０．０５）。

＜実施例２クローン病および潰瘍性大腸炎患者の生検検体におけるＰＴＸ３の免疫組織化学染色＞
潰瘍性大腸炎患者３名、クローン病患者４名、対照として大腸癌患者３名より採取した大腸組織の免疫組織化学染色を行った。バイオプシーにより得た検体を、通常の方法により固定し、パラフィン包埋し、組織切片を作製した。一次抗体として、抗ＰＴＸ３モノクローナル抗体（ＰＰＭＸ０１０２（ＢＰ−１０３２６））、抗ＣＤ４５ＲＯ（ＵＣＨＬ−１）モノクローナル抗体、抗ＣＤ２０（Ｌ２０）モノクローナル抗体、抗ミエロペルオキシダーゼモノクローナル抗体の４通りを用いた。二次抗体として、抗マウスＩｇＧモノクローナル抗体を用いた。ＡＢＣ法により反応を行い光学顕微鏡で観察した。対照として、一次抗体であるＰＰＭＸ０１０２を使用せず、二次抗体であるマウスモノクローナルＩｇＧのみを用いた染色を行った。
免疫組織化学染色の結果、ＰＴＸ３は浸潤するリンパ球、好中球および炎症を有する腸管の血管に存在した（図２）。

＜実施例３疾患活動性の評価＞
（Ａ）潰瘍性大腸炎の活動性は治療薬の治験等においても疾患の活動性の指標として広く用いられているメイヨースコアを用いて評価した。

クローン病の活動性は、治療薬の治験等においても疾患の活動性の指標として広く用いられているＩＯＩＢＤスコアを用いて評価した。

＜＜ＩＯＩＢＤスコアの算出方法＞＞
以下の１項目を１点とし、合計点をスコアとする。スコアが０または１で、赤沈値、ＣＲＰが正常化した状態を「寛解」とする。また、スコアが２以上で、赤沈値、ＣＲＰが異常な状態を「再燃」とする。
１１．腹痛
１２．１日６回以上の下痢あるいは粘血便
１３．肛門部病変
１４．ろう孔
１５．その他の合併症
１６．腹部腫瘤
１７．体重減少
１８．３８℃以上の発熱
１９．腹部圧痛
２０．１０ｇ／ｄＬ以下の血色素

（Ｂ）疾患活動性指標と血中ＰＴＸ３濃度との相関
潰瘍性大腸炎患者１７名、クローン病患者２５名について、血漿ＰＴＸ３濃度と血清ＣＲＰ濃度を測定した。ＰＴＸ３は実施例１に記載の方法、ＣＲＰは免疫免濁法を用いて測定を行った。また、潰瘍性大腸炎患者１５名の内視鏡所見を除く部分的なメイヨースコア、クローン病患者２５名のＩＯＩＢＤスコアを得た。
ピアソンの方法に従って、潰瘍性大腸炎患者の部分的なメイヨースコアと血漿ＰＴＸ３濃度との間の相関を検討したところ、ｒ＝０．６３、ｐ＜０．０１と、血清ＣＲＰ濃度との相関（ｒ＝０．５１、ｐ＜０．０５）より優れた相関を示した（図３Ａ、Ｂ）。
ＰＴＸ３の潰瘍性大腸炎患者における疾患活動性判定の感度は９１％、特異性は７５％であり、ＣＲＰでは感度は４５％、特異性は１００％であった（表１、表２）。

クローン病患者におけるＩＯＩＢＤスコアと血漿ＰＴＸ３濃度との相関はｒ＝０．４９、ｐ＜０．０１であり、血清ＣＲＰ濃度との相関（ｒ＝０．６１、ｐ＜０．０１）とほぼ同等であった（図４Ａ、Ｂ）。
ＰＴＸ３のクローン病患者における疾患活動性判定の感度は７１％、特異性は６２％であり、ＣＲＰでは感度は７１％、特異性は５６％であり、特異性に関してやや良好な結果を示した（表３、表４）。

Claims

被検試料中のＰＴＸ３を測定することを特徴とする、炎症性腸疾患の有無および／または炎症性腸疾患の活動性の判定方法。
ＰＴＸ３の測定が、抗ＰＴＸ３抗体を用いる免疫学的測定である請求項１記載の判定方法。
抗ＰＴＸ３抗体が、抗ＰＴＸ３モノクローナル抗体である請求項２記載の判定方法。
被検試料が、血液、血清または血漿である請求項１〜３のいずれか１項記載の判定方法。
ＰＴＸ３測定試薬を含有する炎症性腸疾患の有無および／または炎症性腸疾患の活動性の診断薬。
ＰＴＸ３の測定が、抗ＰＴＸ３抗体を用いる免疫学的測定である請求項５記載の診断薬。
抗ＰＴＸ３抗体が、抗ＰＴＸ３モノクローナル抗体である請求項６記載の診断薬。
血液、血清または血漿中のＰＴＸ３濃度を測定するものである請求項５〜７のいずれか１項記載の診断薬。
ＰＴＸ３測定試薬の、炎症性腸疾患の有無および／または炎症性腸疾患の活動性の診断薬製造のための使用。
ＰＴＸ３の測定が、抗ＰＴＸ３抗体を用いる免疫学的測定である請求項９記載の診断薬製造のための使用。
抗ＰＴＸ３抗体が、抗ＰＴＸ３モノクローナル抗体である請求項１０記載の診断薬製造のための使用。
血液、血清または血漿中のＰＴＸ３濃度を測定するものである請求項９〜１１のいずれか１項記載の診断薬製造のための使用。