CN105849562B - 可溶性gpc3蛋白质的测定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及被检试样中的可溶性GPC3蛋白质的测定方法，其特征在于，使用与GPC3蛋白质的N末端区域中存在的不同表位结合的2种不同的抗体。

Description

可溶性GPC3蛋白质的测定方法
技术领域
本发明涉及被检试样中的可溶性GPC3蛋白质的测定方法，其特征在于，使用与GPC3蛋白质的N末端区域中存在的不同表位结合的2种不同的抗体。
背景技术
有报道称，由肝细胞癌引起的死亡全年约有60万，在世界由癌症引起的死亡中位居第五位(非专利文献1)。大部分肝细胞癌患者在诊断为该疾病后1年以内死亡。不幸的是，经常出现在能够治愈的疗法不怎么奏效的后期阶段被诊断出肝细胞癌的例子。包括化学疗法、化学栓塞术、烧灼和质子束疗法在内的医疗处置对上述患者的效果依然不充分。大多数患者表现出疾病复发，该情况伴随血管浸润及多部位肝内转移迅速发展到进行阶段，其5年存活率仅为7％(非专利文献2)。可实施局部癌切除术的肝细胞癌患者的预后较好，但其5年存活率仍停留在15％～39％(非专利文献3)。
由于磷脂酰肌醇蛋白聚糖(glypican)3(GPC3)在肝癌中频繁地高度表达，所以认为GPC3能用作确定GPC3在肝癌中的作用的靶标、肝癌治疗的靶标或肝癌诊断的靶标。
已知GPC3在细胞表面表达后，在该特定部位通过转化酶、磷酯酶D或Notum的作用而受到加工(非专利文献4)。已公开了利用上述现象、通过测定存在于患者的血浆中的GPC3来筛选HCC患者的方法(专利文献1)。此外，已开发了包含与被分泌至血浆中的分泌型GPC3的表位结合的抗体的肝癌的诊断药物或诊断方法(专利文献2，3)。此外，已开发了包含下述抗体的肝癌的诊断药物或诊断方法，所述抗体是存在于从患者分离的组织标本等中的、与经加工后仍存在于细胞表面的锚定型GPC3的表位结合的抗体(专利文献4)。除了肝癌以外，还公开了通过测定血液中的GPC3水平来筛选前列腺癌患者的方法(专利文献5)。
本说明书中引用的参考文献如下所述。这些文献中记载的内容全部通过引用并入本说明书中。需要说明的是，对于本说明书而言，这些文献中的任一篇均不是现有技术。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：WO2003/100429
专利文献2：WO2004/038420
专利文献3：WO2004/023145
专利文献4：WO2009/116659
专利文献5：WO2007/081790
非专利文献
非专利文献1：Llovet JM,Burroughs A,Bruix J；Lancet(2003),362,1907-17
非专利文献2：Bosch FX,Ribes J,Cleries R；Gastroenterology(2004),127,S5-16
非专利文献3：Takenaka K,Kawahara N,Yamamoto K,Kajiyama K,Maeda T,Itasaka H,Shirabe K,Nishizaki T,Yanaga K,Sugimachi K；Arch Surg(1996),131,71-6
非专利文献4：Cheng AL,Chen Z,Tsao CJ,Qin S,Kim JS,et al.Efficacy andsafety of sorefanib in patients in the Asia-Pacific region with advancedhepatocellular carcinoma:a phase III randomized,double-blind,placebo-controlled trial.Lancet Oncol.(2009)10,25-34
发明内容
发明所要解决的课题
以往，不存在能够检测或准确定量健康人体液中含有的低浓度的可溶性GPC3的技术，因此，未能实现癌的罹患初期阶段的早期发现、使用的抗癌剂的选择取舍、精密进行治疗后的预后诊断。
本发明所要解决的课题在于提供可溶性GPC3的高灵敏度测定方法，所述测定方法能够定量性地测定健康人体液中含有的可溶性GPC3的浓度。
用于解决课题的手段
本申请的发明人为了解决上述课题而进行了锐意研究，发现通过使用与GPC3蛋白质的N末端区域中存在的不同表位结合的2种不同的抗体，能够以高灵敏度测定被检试样中的可溶性GPC3蛋白质。
即，本发明涉及以下的[1]～[12]。
[1]被检试样中的可溶性GPC3蛋白质的测定方法，其特征在于，使用2种不同的抗体，所述2种不同的抗体与包含序列号70所示的氨基酸序列的GPC3蛋白质的第128号氨基酸至第357号氨基酸的序列中含有的不同的表位结合；
[2]如上述[1]所述的测定方法，其中，不同的表位中的一者为包含选自GPC3蛋白质的第337号、339号、340号、及344号氨基酸中的至少1种氨基酸的表位；
[3]如上述[1]或[2]所述的测定方法，其中，不同的表位中的一者为包含选自GPC3蛋白质的第221号、298号、301号、302号、305号、308号及309号中的至少1种氨基酸的表位。
[4]如上述[1]所述的测定方法，其中，不同的表位为下述组合(A)或(B)；
(A)不同的表位中的一者为包含选自GPC3蛋白质的第341号、第343号、346号、347号、348号、349号及350号中的至少1种氨基酸的表位，另一者为包含选自GPC3蛋白质的第297号、300号、304号、306号、311号、312号、313号、314号及315号中的至少1种氨基酸的表位
(B)不同的表位中的一者为包含选自GPC3蛋白质的第128号、129号、131号、132号、133号、134号、135号、171号、208号、209号、210号、211号、212号、214号、215号、218号、322号、325号、326号、328号、329号、330号、332号、333号、335号、336号及338号中的至少1种氨基酸的表位，另一者为包含选自GPC3蛋白质的第220号、228号、231号、232号、235号、291号、294号及295号中的至少1种氨基酸的表位
[5]如上述[1]所述的测定方法，其中，不同的表位为下述组合(A)或(B)；
(A)不同的表位中的一者为包含选自GPC3蛋白质的第337号、339号、340号、及344号氨基酸中的至少1种氨基酸、并且包含选自第341号、343号、346号、347号、348号、349号及350号中的至少1种氨基酸的表位，另一者为包含选自GPC3蛋白质的第221号、298号、301号、302号、305号、308号及309号中的至少1种氨基酸、并且包含选自第297号、300号、304号、306号、311号、312号、313号、314号及315号中的至少1种氨基酸的表位
(B)不同的表位中的一者为包含选自GPC3蛋白质的第337号、339号、340号及344号氨基酸中的至少1种氨基酸、并且包含选自第128号、129号、131号、132号、133号、134号、135号、171号、208号、209号、210号、211号、212号、214号、215号、218号、322号、325号、326号、328号、329号、330号、332号、333号、335号、336号及338号中的至少1种氨基酸的表位，另一者为包含选自GPC3蛋白质的第221号、298号、301号、302号、305号、308号及309号中的至少1种氨基酸、并且包含选自第220号、228号、231号、232号、235号、291号、294号及295号中的至少1种氨基酸的表位；
[6]如上述[1]所述的测定方法，其中，不同的表位为：
具有与序列号38的同源性为80％以上的序列表示的重链可变区及与序列号39的同源性为80％以上的序列表示的轻链可变区的抗体结合的表位、和具有与序列号40的同源性为80％以上的序列表示的重链可变区及与序列号41的同源性为80％以上的序列表示的轻链可变区的抗体结合的表位；或，
具有与序列号44的同源性为80％以上的序列表示的重链可变区及与序列号45的同源性为80％以上的序列表示的轻链可变区的抗体结合的表位、和具有与序列号42的同源性为80％以上的序列表示的重链可变区及与序列号43的同源性为80％以上的序列表示的轻链可变区的抗体结合的表位；
[7]如上述[1]所述的测定方法，其中，2种不同的抗体为：
具有与序列号38所示的重链可变区中包含的CDR区域及序列号39所示的轻链可变区中包含的CDR区域相同的CDR区域的抗体、和具有与序列号40所示的重链可变区中包含的CDR区域及序列号41所示的轻链可变区中包含的CDR区域相同的CDR区域的抗体的组合；或，
具有与序列号44所示的重链可变区中包含的CDR区域及序列号45所示的轻链可变区中包含的CDR区域相同的CDR区域的抗体、和具有与序列号42所示的重链可变区中包含的CDR区域及序列号43所示的轻链可变区中包含的CDR区域相同的CDR区域的抗体的组合；
[8]如上述[7]所述的测定方法，其中，CDR区域为基于Kabat编号的CDR1、2、及3区域；
[9]如上述[1]所述的测定方法，其中，2种不同的抗体为：
重链可变区的CDR1、2及3分别具有包含序列号46、47及48所示的氨基酸序列的重链可变区、轻链可变区的CDR1、2及3分别具有包含序列号49、50及51所示的氨基酸序列的轻链可变区的抗体，与重链可变区的CDR1、2及3分别具有包含序列号52、53及54所示的氨基酸序列的重链可变区、轻链可变区的CDR1、2及3分别具有包含序列号55、56及57所示的氨基酸序列的轻链可变区的抗体的组合；或，
重链可变区的CDR1、2及3分别具有包含序列号58、59及60所示的氨基酸序列的重链可变区、轻链可变区的CDR1、2及3分别具有包含序列号61、62及63所示的氨基酸序列的轻链可变区的抗体，与重链可变区的CDR1、2及3分别具有包含序列号64、65及66所示的氨基酸序列的重链可变区、轻链可变区的CDR1、2及3分别具有包含序列号67、68及69所示的氨基酸序列的轻链可变区的抗体的组合；
[10]如上述[1]所述的测定方法，其中，2种不同的抗体为：
具有序列号38所示的重链可变区及序列号39所示的轻链可变区的抗体、与具有序列号40所示的重链可变区及序列号41所示的轻链可变区的抗体的组合；或，
具有序列号44所示的重链可变区及序列号45所示的轻链可变区的抗体、与具有序列号42所示的重链可变区及序列号43所示的轻链可变区的抗体的组合；
[11]如上述[1]～[10]中任一项所述的测定方法，其中，2种不同的抗体中的任一者与磁性粒子结合；
[12]如上述[1]～[11]中任一项所述的测定方法，其中，被测试样为从人分离的组织试样、全血试样、血浆试样、或血清试样。
发明的效果
根据本发明，通过使用与GPC3蛋白质的N末端区域中存在的不同表位结合的2种不同的抗体，能够简便地以高灵敏度测定被检试样中的可溶性GPC3蛋白质。由此，能够实现癌的罹患初期阶段的早期发现、使用的抗癌剂的选择取舍、精密进行治疗后的预后诊断。
附图说明
[图1]图1表示在还原条件下对经筛选而得到的小鼠抗体进行关于GPC3及其C片段、N片段的Western印迹的结果。
[图2]图2表示针对GT30、GT114、GT607、GT165抗体、使用表达了GPC3及其片段(AW2、AW3、AW5)的CHO细胞沉淀在还原下进行Western印迹的结果。
[图3]图3表示GT30、GT114、GT607、GT165抗体与GPC3各片段的结合试验结果。
[图4]图4示意性地示出了GT30、GT114、GT607、GT165抗体在GPC3上的结合区域。
[图5]图5表示人GPC3的立体结构中的GT30的结合区域。
[图6]图6表示人GPC3的立体结构中的GT165的结合区域。
[图7]图7表示人GPC3的立体结构中的GT607的结合区域。
[图8]图8表示人GPC3的立体结构中的GT114的结合区域。
[图9]图9表示人GPC3的立体结构中的GT30、GT165、GT607及GT114的结合区域分别重叠的形态。
[图10]图10为表示各测定体系的检测限及定量限的图。
具体实施方式
定义
本说明书中，只要没有特别的定义，则认为与本发明关联使用的化学用语及技术用语具有本领域技术人员通常所理解的含义。
不定冠词
本发明中，“一个(a)”及“一个(an)”之类的不定冠词，是指一个或两个以上的(即至少一个的)该不定冠词的语法上的对象。例如，“一个(a)要素”是指一个要素或两个以上的要素。
氨基酸
本说明书中，氨基酸以单字母代码或三字母代码、或这两种方式表述，例如，表示为Ala/A、Leu/L、Arg/R、Lys/K、Asn/N、Met/M、Asp/D、Phe/F、Cys/C、Pro/P、Gln/Q、Ser/S、Glu/E、Thr/T、Gly/G、Trp/W、His/H、Tyr/Y、Ile/I、Val/V。
氨基酸的修饰
为了对抗原结合分子的氨基酸序列中的氨基酸进行修饰，可适宜地采用位点定向诱变法(Kunkel et.al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1985)82,488-492)、重叠延伸PCR等已知的方法。此外，作为取代为天然氨基酸以外的氨基酸的氨基酸的修饰方法，也可采用多种已知的方法(Annu.Rev.Biophys.Biomol.Struct.(2006)35,225-249、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(2003)100(11),6353-6357)。例如，也可合适地使用含有tRNA的无细胞翻译系统(Clover Direct(Protein Express))等，所述无细胞翻译系统中，非天然氨基酸结合在作为终止密码子之一的UAG密码子(琥珀密码子)的互补的琥珀抑制基因tRNA上。
本说明书中，表示氨基酸的修饰部位时所使用的“及/或”的用语的含义，包括“及”与“或”适当组合而得的所有组合。具体而言，例如，所谓“第43位、52位及/或105位的氨基酸被取代”，包括下述氨基酸修饰的变化：
(a)43位、(b)52位、(c)105位、(d)43位及52位、(e)43位及105位、(f)52位及105位、(g)43位及52位及105位。
CDR的编号
本发明中，被分配为抗体的CDR的氨基酸位置按照已知的方法进行规定，例如，可按照Kabat(Sequences of Proteins of Immunological Interest(具有免疫学重要性的蛋白质序列)(National Institute of Health,Bethesda,Md.,1987年及1991年)进行规定。
被测试样
本发明中所谓“被测试样”的用语，是指从对象分离的组织或流体的试样。作为上述试样的一种非限定性的方式，包括例如血浆、血清、脑脊液、淋巴液、皮肤、呼吸道、肠道、及泌尿生殖道的外部切片、眼泪、唾液、痰、乳汁、尿、全血或所有血液组分、血液衍生物、血细胞、肿瘤、神经组织、器官或所有类型的组织、通过清洗得到的所有试样(例如支气管系统的试样)、及体外的细胞培养物的构成成分的试样。
可溶性GPC3的浓度可在从患者分离的生物学试样(被测试样)中进行测定。例如，可测定全血试样中的可溶性GPC3的浓度、或血清或血浆等血液组分的试样(本说明书中，也分别称为全血试样、血清试样或血浆试样)中的可溶性GPC3的浓度。作为一种非限定性的方式，对于患者的全血试样、血清试样或血浆试样中的可溶性GPC3的浓度，例如可使用市售的Human Glypican-3ELISA kit(BioMosaic Inc.)、或Enzyme-linked Immunosorbent AssayKit For Glypican 3(GPC3)(USCN Life Science Inc.)，使用经EDTA处理过的全血试样、血清试样或血浆试样进行测定。
所谓“分离的”，是指从其天然状态“人为性”地被改变，即，天然产生的情况下，从其本来的环境被改变和/或取出。例如，生物中存在的多核苷酸或多肽虽然并不是被分离开的，但在本发明中，从在天然状态下一同存在的材料中分离的相同的多核苷酸或多肽是分离的。进而，通过转化、遗传学操作或任意的其他重组方法导入至生物中的多核苷酸或多肽，即使仍然存在于生物(存活或未存活均可)内时，也是分离的。
可溶性GPC3
本发明中所谓“可溶性GPC3”，是指未锚定于表达GPC3的细胞上的可溶性的GPC3，包括分泌型GPC3片段(其能够在生物体内或试管内的特定条件下，从锚定于表达GPC3的细胞上的GPC3容易地解离)。作为“可溶性GPC3”的一种非限定性的方式，可例举包含序列号70规定的多肽的GPC3的第358位至氨基末端侧的多肽、包含序列号70规定的多肽的GPC3的第374位至氨基末端侧的多肽、存在于羧基末端的GPI锚钩(anchor)被分解而游离的GPC3多肽及它们的片段等(专利文献2)。为了鉴定可溶性GPC3的结构，本领域技术人员可适宜选择已知的方法。作为非限定性的方式，除了利用上述专利文献2中记载的方法等而直接检测患者或模型动物的血清或血浆中存在的可溶性GPC3并对其结构进行分析的方法以外，也可适宜使用例如下述方法：检测通过能离解可溶性GPC3的酶(转化酶、磷酯酶D或Notum等)作用于在试管内培养的细胞中表达的GPC3而产生的可溶性GPC3，并对其结构进行分析的方法等(J.Cell.Biol.(2003)163(3),625-635等)。
可溶性GPC3浓度的测定方法
本发明中，对于可溶性GPC3浓度，使用与第128号氨基酸至第357号氨基酸、优选第219号氨基酸至第357号氨基酸的序列中含有的不同的表位结合的2种不同的抗体，利用免疫学方法进行测定。也可适宜采用对利用适当的酶将可溶性GPC3进一步消化而得到的可溶性GPC3片段进行检测的方法。
作为可溶性GPC3的合适的测定方法，例如，可举出酶免疫测定法(ELISA、EIA)、荧光免疫测定法(FIA)、放射免疫测定法(RIA)、发光免疫测定法(LIA)、酶抗体法、荧光抗体法、免疫色谱法、免疫比浊法、乳胶比浊法、乳胶凝集反应测定法等。此外，本发明的免疫学方法中的测定，可通过手动操作的手工艺进行，也可使用分析装置等装置进行。
本发明中的免疫学方法可按照例如夹心法等已知的方法进行。例如，使生物学试样及经标记物质修饰的第二抗体同时或依次与固定于载体上的第一抗体反应。通过上述反应,形成固定于载体上的第一抗体、可溶性GPC3及经标记物质修饰的第二抗体的复合体，对连接在该复合体所含有的第二抗体上的标记物质进行定量，由此可测定生物学试样中含有的可溶性GPC3的量(浓度)。
例如，酶免疫测定法的情况下，可合适地使用固定有第一抗体的微孔板、经系列稀释的生物学试样、经HRP等酶修饰的第二抗体、清洗缓冲液、及含有成为利用HRP等酶进行的反应的对象的底物的溶液。在一种非限定性的测定方式中，在修饰第二抗体的酶的最适条件下使基质与其反应，该酶反应生成物的量可利用光学方法等进行测定。此外，荧光免疫测定法的情况下，可合适地使用固定有第一抗体的光波导、经系列稀释的生物学试样、经荧光物质修饰的第二抗体、清洗缓冲液。在一种非限定性的测定方式中，可利用照射至修饰第二抗体的荧光物质的激发光，测定该荧光物质发出的荧光强度。
此外，放射免疫测定法的情况下，可测定由放射性物质产生的放射线量。此外，发光免疫测定法的情况下，可测定由发光反应体系产生的发光量。此外，免疫比浊法、乳胶比浊法、乳胶凝集反应测定法等的情况下，可利用终点法或速率法测定透射光、散射光。此外，免疫色谱法等通过目视进行测定的情况下，可目视测定检测线(test line)上出现的标记物质的颜色。需要说明的是，可适宜地使用分析装置等设备来代替上述目视测定。
本发明的免疫学方法中，可通过物理吸附法、化学结合法或它们的并用等方法使固定于载体上的第一抗体与载体吸附、结合。通过物理吸附法将抗体固定的方法，可适宜采用已知的方法。例如，可举出下述方法：使抗体与载体在缓冲液等溶液中混合、接触的方法；使已溶解在缓冲液等中的抗体与载体接触的方法；等。此外，通过化学结合法也能够将抗体固定在载体上。例如，可例举下述方法：使抗体和载体与戊二醛、碳二亚胺、亚氨酸酯或马来酰亚胺等二价性的交联试剂混合、接触，使抗体和载体两者的氨基、羧基、巯基、醛基、或羟基等发生反应的方法等。进行固定化时，为了抑制非特异性反应、使抗体固定化的载体的自然凝集等而需要进行处理的情况下，可利用已知的方法进行固定化后的处理。例如，可举出下述方法：使牛血清白蛋白(BSA)、酪蛋白、明胶、卵清白蛋白或它们的盐等蛋白质、表面活性剂或脱脂乳粉等接触、被覆使抗体固定化的载体的表面或内壁面的方法等。
本发明的免疫学方法中，可通过物理吸附法、化学结合法或它们的并用等方法使经标记物质修饰的第二抗体与标记物质吸附、结合。通过物理吸附法使标记物质与抗体结合的方法，可适宜采用已知的方法。例如，可举出下述方法：使抗体与标记物质在缓冲液等溶液中混合、接触的方法，使已溶解在缓冲液等中的抗体与标记物质接触的方法；等。例如，标记物质为胶体金(gold colloid)、乳胶的情况下，物理吸附法是有效的，可通过使抗体与胶体金在缓冲液中混合接触而得到具有胶体金标记的抗体。此外，通过化学结合法也能够将抗体用标记物质修饰。例如，可例举下述方法：使抗体和标记物质与戊二醛、碳二亚胺、亚氨酸酯或马来酰亚胺等二价性的交联试剂混合、接触，使抗体和标记物质两者的氨基、羧基、巯基、醛基、或羟基等发生反应的方法等。例如，标记物质为荧光物质、酶、或化学发光物质的情况下，化学结合法是有效的。进行修饰时，为了抑制非特异性反应、经标记物质修饰的抗体的自然凝集等而需要进行处理的情况下，可利用已知的方法进行标记后的处理。例如，可举出下述方法：使牛血清白蛋白(BSA)、酪蛋白、明胶、卵清白蛋白或其盐等蛋白质、表面活性剂或脱脂乳粉等接触、被覆结合有标记物质的抗体的方法等。
作为标记物质，酶免疫测定法的情况下，可使用辣根过氧化物酶(POD)、碱性磷酸酶(ALP)、β-半乳糖苷酶、脲酶、过氧化氢酶、葡糖氧化酶、乳酸脱氢酶或淀粉酶等。此外，荧光免疫测定法的情况下，可使用异硫氰酸荧光素、四甲基罗丹明异硫氰酸酯、取代罗丹明异硫氰酸酯、二氯三嗪异硫氰酸酯(dichlorotriazine isothiocyanate)、花青(cyanine)或部花青(merocyanine)等。此外，放射免疫测定法的情况下，可使用氚、碘125或碘131等。发光免疫测定法的情况下，可使用氨基苯二酰肼系、荧光素酶系、吖啶酯(acridinium ester)系、或二氧杂环丁烷(dioxetane)化合物系等。此外，免疫色谱法、免疫比浊法、乳胶比浊法、乳胶凝集反应测定法的情况下，可使用由下述材质形成的微粒，所述材质为：聚苯乙烯、苯乙烯-苯乙烯磺酸盐共聚物、丙烯腈-丁二烯-苯乙烯共聚物、氯乙烯-丙烯酸酯共聚物、乙酸乙烯酯-丙烯酸共聚物、聚丙烯醛、苯乙烯-甲基丙烯酸共聚物、苯乙烯-(甲基)丙烯酸缩水甘油酯共聚物、苯乙烯-丁二烯共聚物、甲基丙烯酸聚合物、丙烯酸聚合物、乳胶、明胶、脂质体、微囊、二氧化硅、氧化铝、炭黑、金属化合物、金属、金属胶体、陶瓷、或磁性体等。
作为本发明的免疫学方法中使用的载体，可适宜使用由聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚乙烯基甲苯、聚丙烯、聚乙烯、聚氯乙烯、尼龙、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酰胺、乳胶、脂质体、明胶、琼脂糖、纤维素、Sepharose、玻璃、金属、陶瓷或磁性体等材质形成的珠粒(beads)、微孔板、试管、棒、膜(membrane)或试验片等形状的固相载体，特别优选为磁性粒子之类的磁性体。作为磁性粒子，优选为包含磁性体、超顺磁性体的聚合物粒子，更优选为在作为核的粒子表面形成包含Fe2O3及Fe3O4中的至少一方的磁性体层、进而在磁性体层上形成聚合物层而得到的磁性粒子。
2种不同的抗体
本发明中使用的“2种不同的抗体”与GPC3的第128号氨基酸至第357号氨基酸区域中含有的“不同的表位”相结合。“不同的表位”只要处于不相互阻碍“2种不同的抗体”与可溶性GPC3的结合的关系，则没有特别限定。具体而言，例如，可举出实施例中记载的GT30抗体结合的GPC3上的表位与GT607抗体结合的GPC3上的表位的组合、或、GT114抗体结合的GPC3上的表位与GT165抗体结合的GPC3上的表位的组合。作为如上所述的不同的表位的组合，例如，可举出包含选自GPC3蛋白质的第337号、339号、340号及344号氨基酸中的至少1种氨基酸的表位(GT30和GT165)，与包含选自GPC3蛋白质的第221号、298号、301号、302号、305号、308号及309号(GT607和GT114)中的至少1种氨基酸的表位的组合。或者，可举出包含选自GPC3蛋白质的第343号、346号、347号、348号、349号及350号中的至少1种氨基酸的表位(GT30)，与包含选自GPC3蛋白质的第297号、300号、304号、306号、311号、312号、313号、314号及315号中的至少1种氨基酸的表位(GT607)的组合；或，包含选自GPC3蛋白质的第128号、129号、131号、132号、133号、134号、135号、171号、208号、209号、210号、211号、212号、214号、215号、218号、322号、325号、326号、328号、329号、330号、332号、333号、335号、336号及338号中的至少1种氨基酸的表位(GT165)，与包含选自GPC3蛋白质的第220号、228号、231号、232号、235号、291号、294号及295号中的至少1种氨基酸的表位(GT114)的组合。此外，可举出包含选自GPC3蛋白质的第337号、339号、340号及344号氨基酸中的至少1种氨基酸、并且包含选自第341号、343号、346号、347号、348号、349号及350号中的至少1种氨基酸的表位(GT30)，与包含选自GPC3蛋白质的第221号、298号、301号、302号、305号、308号及309号中的至少1种氨基酸、并且包含选自第297号、300号、304号、306号、311号、312号、313号、314号及315号中的至少1种氨基酸的表位(GT607)的组合；或，包含选自GPC3蛋白质的第337号、339号、340号及344号氨基酸中的至少1种氨基酸、并且包含选自第128号、129号、131号、132号、133号、134号、135号、171号、208号、209号、210号、211号、212号、214号、215号、218号、322号、325号、326号、328号、329号、330号、332号、333号、335号、336号及338号中的至少1种氨基酸的表位(GT165)，与包含选自GPC3蛋白质的第221号、298号、301号、302号、305号、308号及309号中的至少1种氨基酸、并且包含选自第220号、228号、231号、232号、235号、291号、294号及295号中的至少1种氨基酸的表位(GT114)的组合。
“2种不同的抗体”只要能识别上述区域内的不同的表位、处于不相互阻碍与可溶性GPC3的结合的关系，则没有特别限定。作为本发明中使用的“2种不同的抗体”的具体例，可举出GT30抗体与GT607抗体的组合、及、GT165抗体与GT114抗体的组合。
GT30抗体
GT30抗体识别包含选自GPC3蛋白质的第337号、339号、340号、341号、344号、第343号、346号、347号、348号、349号及350号中的至少1种氨基酸的表位。GT30抗体具有序列号38所示的重链可变区及序列号39所示的轻链可变区，基于Kabat编号的CDR1、2及3的氨基酸序列具有分别如序列号46、序列号47、及序列号48所示的重链CDR1、重链CDR2及重链CDR3、以及分别如序列号49、序列号50、及序列号51所示的轻链CDR1、轻链CDR2及轻链CDR3。
GT607抗体
GT607抗体识别包含选自GPC3蛋白质的第221号、298号、301号、302号、305号、308号、309号、第297号、300号、304号、306号、311号、312号、313号、314号及315号中的至少1种氨基酸的表位。GT607抗体具有序列号40所示的重链可变区及序列号41所示的轻链可变区，基于Kabat编号的CDR1、2及3的氨基酸序列具有分别如序列号52、序列号53、及序列号54所示的重链CDR1、重链CDR2及重链CDR3、以及分别如序列号55、序列号56、及序列号57所示的轻链CDR1、轻链CDR2及轻链CDR3。
GT165抗体
GT165抗体识别包含选自GPC3蛋白质的第337号、339号、340号、344号、第128号、129号、131号、132号、133号、134号、135号、171号、208号、209号、210号、211号、212号、214号、215号、218号、322号、325号、326号、328号、329号、330号、332号、333号、335号、336号及338号中的至少1种氨基酸的表位。GT165抗体具有序列号44所示的重链可变区及序列号45所示的轻链可变区，基于Kabat编号的CDR1、2及3的氨基酸序列具有分别如序列号58、序列号59、及序列号60所示的重链CDR1、重链CDR2及重链CDR3、以及分别如序列号61、序列号62、及序列号63所示的轻链CDR1、轻链CDR2及轻链CDR3。
GT114抗体
GT114抗体识别包含选自GPC3蛋白质的第221号、298号、301号、302号、305号、308号及309号中的至少1种氨基酸、并且包含选自第220号、228号、231号、232号、235号、291号、294号及295号中的至少1种氨基酸的表位。GT114抗体具有序列号42所示的重链可变区及序列号43所示的轻链可变区，基于Kabat编号的CDR1、2及3的氨基酸序列具有分别如序列号64、序列号65、及序列号66所示的重链CDR1、重链CDR2及重链CDR3、以及分别如序列号67、序列号68、及序列号69所示的轻链CDR1、轻链CDR2及轻链CDR3。
以下，记载各抗体的重链及轻链可变区的碱基序列及氨基酸序列。
GT30H链碱基序列(序列号30)
ATGGAATGGATCTGGATCTTTCTCTTCATCCTGTCAGGAACTGCAGGTGTCCAATCCCAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGAGCTGAGCTGGCGAGGCCTGGGGCTTCAGTGAAACTGTCCTGCAGGGCTTCTGGCTACACCTTCACAAGCTATGGTATAAGCTGGATGATGCAGAGAACTGGACAGGGCCTTGAGTGGATTGGAGAGATTTATCCTAGAAGTGGTATTACTTACTACAATGAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACACTGACTGCAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTTCTGTGCAAGAGATGTCTCTGATGGTTACCTTTTTCCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCAGCCAAA
GT30L链碱基序列(序列号31)
ATGAGTGTGCCCACTCAGGTCCTGGGGTTGCTGCTGCTGTGGCTTACAGGTGCCAGATGTGACATCCAGATGACTCAGTCTCCAGCCTCCCTATCTGCATCTGTGGGAGAAACTGTCACCATCACATGTCGAACAAGTGAGAATATTTACAGTTATTTAGCATGGTATCAGCAGAAACAGGGAAAATCTCCTCAGCTCCTGGTCTATAATGCAAAAACCTTACCAGAAGGTGTGCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGCACACAGTTTTCTCTGAAGATCAACAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGGGAGTTATTACTGTCAACATCATTATGGTACTCCTCCGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAACGGGCT
GT607H链碱基序列(序列号32)
ATGAACTTCGGGCTCAGCTTGATTTTCCTTGCCCTCATTTTAAAAGGTGTCCAGTGTGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGACGTAGTGAGACCTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAGTTATGGCATGTCCTGGGTTCGCCAGCTTCCAGACAAGAGGCTGGAGTGGGTCGCAAGTGTTGGTAATGGAGGTAGTTACAGGTACTATCCAGAGAATTTGAAGGGGCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATACCAAGAACACCCTATACCTGCAAATTAGTGGTCTGAAGTCTGAGGACACAGCCATTTATTACTGTGCAAGACGGGGGGCTTTCCCGTACTTCGATGTCTGGGGCGCAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCCAAA
GT607L链碱基序列(序列号33)
ATGGATTTTCAAGTGCAGATTTTCAGCTTCCTGCTAATCAGTGCCTCAGTCATAGTATCCAGAGGACAAATTGTTCTCACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACCCTGGCCTGCAGTGCCAGCTCAAGTGTAACTTACATGCACTGGTACCAGCAGAAGTCAGGCACCTCCCCCAAAAGATGGATTTATGAAACATCCAAACTGGCTTCTGGAGTCCCTCCTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATCAGCACCATGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAACAGTGGAGTAGTAACCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAACGGGCT
GT114H链碱基序列(序列号34)
ATGAGAGTGCTGATTCTTTTGTGGCTGTTCACAGCCTTTCCTGGTATCCTATCTGATGTGCAGCTTCAGGAGTCGGGACCTGGCCTGGTGAAACCTTCTCAGTCTCTGTCCCTCACCTGCACTGTCACTGGCTACTCAATCACCAGTGATTCTGCCTGGAACTGGATCCGGCAGTTTCCAGGAAACAAACTGGAGTGGATGGCCTACATAATGTACAGTGGTATCACTAGCTACAATCCATCTCTCAAAAGTCGAATCTCTATCACTCGAGACACAGCCAAGAACCAGTTCTTTCTGCAGTTGAATTCTGTGACTACTGAGGACTCAGCCACATATTACTGTTCACGAGGCTACTGGTACTTCGATGTCTGGGGCGCAGGGACTACGGTCACCGTCTCCTCAGCCAAA
GT114L链碱基序列(序列号35)
ATGGATTTTCAGGTGCAGATTTTCAGCTTCCTGCTAATCAGTGCCTCAGTCATAATGTCCAGAGGACAAATTGTTCTCACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCTAGGGGAGGAGATCACCCTAACCTGCAGTGCCAGCTCGAGTGTGAGTTACATGCACTGGTACCAGCAGAAGTCAGGCACTTCTCCCAAACTCTTGATTTATAGCACATCCATCCTGGCTTCTGGAGTCCCTTCTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTTTTATTCTCTCACAATCAGCAGTGTGGAGGCTGAAGATGCTGCCGATTATTACTGCCTTCAGTGGATTACTTATCGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAACGGGCT
GT165H链碱基序列(序列号36)
ATGTGTTGGAGCTGTATCATCCTCTTCCTGTTAGCAACAGCTGCACGTGTGCACTCCCAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCTGAGCTGGTGGGGCCTGGGGCCTCAGTGAAGATTTCCTGCAAGGCTTTTGGCTACACCTTCACAAACCATCATATAAACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACAGGGCCTGGACTGGATTGGATATATTAATCCTTATAATGATTATACTAACTACAACCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACATTGACTGTAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTATATGGAGCTTAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGATCAGACCCCGCCTGGTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCAGCCAAA
GT165L链碱基序列(序列号37)
ATGAGACCCTCCATTCAGTTCCTGGGGCTCTTGTTGTTCTGGCTTCATGGTGCTCAGTGTGACATCCAGATGACACAGTCTCCATCCTCACTGTCTGCATCTCTGGGAGGCAAAGTCACCATCACTTGCAAGGCAAGCCAAGACATTAACAAGAATATAGCTTGGTACCAACACAAGCCTGGAAAAGGTCCTAGGCTGCTCATATGGTACACATATACATTACAACCAGGCATCCCATCAAGGTTCAGTGGAAGTGGATCTGGGAGAGATTATTCCTTCAGCATCAGCAACCTGGAGCCTGAAGATATTGCAACTTATTACTGTCTACAGTATGATAATCTTCCATTCACGTTCGGCACGGGGACAAAATTGGAAATAAAACGGGCT
GT30H链可变区的氨基酸序列(序列号38)
QVQLQQSGAELARPGASVKLSCRASGYTFTSYGISWMMQRTGQGLEWIGEIYPRSGITYYNEKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCARDVSDGYLFPYWGQGTLVTVSAAK
GT30L链可变区的氨基酸序列(序列号39)
DIQMTQSPASLSASVGETVTITCRTSENIYSYLAWYQQKQGKSPQLLVYNAKTLPEGVPSRFSGSGSGTQFSLKINSLQPEDFGSYYCQHHYGTPPTFGGGTKLEIKRA
GT607H链可变区的氨基酸序列(序列号40)
EVQLVESGGDVVRPGGSLKLSCAASGFTFSSYGMSWVRQLPDKRLEWVASVGNGGSYRYYPENLKGRFTISRDNTKNTLYLQISGLKSEDTAIYYCARRGAFPYFDVWGAGTTVTVSSAK
GT607L链可变区的氨基酸序列(序列号41)
QIVLTQSPAIMSASPGEKVTLACSASSSVTYMHWYQQKSGTSPKRWIYETSKLASGVPPRFSGSGSGTSYSLTISTMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLELKRA
GT114H链可变区的氨基酸序列(序列号42)
DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGYSITSDSAWNWIRQFPGNKLEWMAYIMYSGITSYNPSLKSRISITRDTAKNQFFLQLNSVTTEDSATYYCSRGYWYFDVWGAGTTVTVSSAK
GT114L链可变区的氨基酸序列(序列号43)
QIVLTQSPAIMSASLGEEITLTCSASSSVSYMHWYQQKSGTSPKLLIYSTSILASGVPSRFSGSGSGTFYSLTISSVEAEDAADYYCLQWITYRTFGGGTKLEIKRA
GT165H链可变区的氨基酸序列(序列号44)
QVQLQQSGAELVGPGASVKISCKAFGYTFTNHHINWVKQRPGQGLDWIGYINPYNDYTNYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMELSSLTSEDSAVYYCARSDPAWFAYWGQGTLVTVSAAK
GT165L链可变区的氨基酸序列(序列号45)
DIQMTQSPSSLSASLGGKVTITCKASQDINKNIAWYQHKPGKGPRLLIWYTYTLQPGIPSRFSGSGSGRDYSFSISNLEPEDIATYYCLQYDNLPFTFGTGTKLEIKRA
以下记载各抗体的CDR序列。
GT30H链CDR序列
CDR1(序列号46) CDR2(序列号47) CDR3(序列号48)
SYGIS EIYPRSGITYYNEKFKG DVSDGYLFPY
GT30L链可变区的氨基酸序列
CDR1(序列号49) CDR2(序列号50) CDR3(序列号51)
RTSENIYSYLA NAKTLPE QHHYGTPPT
GT607H链可变区的氨基酸序列
CDR1(序列号52) CDR2(序列号53) CDR3(序列号54)
SYGMS SVGNGGSYRYYPENLKG RGAFPYFDV
GT607L链可变区的氨基酸序列
CDR1(序列号55) CDR2(序列号56) CDR3(序列号57)
SASSSVTYMH ETSKLAS QQWSSNPLT
GT165H链可变区的氨基酸序列
CDR1(序列号58) CDR2(序列号59) CDR3(序列号60)
NHHIN YINPYNDYTNYNQKFKG SDPAWFAY
GT165L链可变区的氨基酸序列(序列号53)
CDR1(序列号61) CDR2(序列号62) CDR3(序列号63)
KASQDINKNIA YTYTLQP LQYDNLPFTFGTGTKLEIK
GT114H链可变区的氨基酸序列
CDR1(序列号64) CDR2(序列号65) CDR3(序列号66)
SDSAWN YIMYSGITSYNPSLKS GYWYFDV
GT114L链可变区的氨基酸序列(序列号51)
CDR1(序列号67) CDR2(序列号68) CDR3(序列号69)
SASSSVSYMH STSILAS LQWITYRT
本发明的可溶性GPC3蛋白质的测定中，代替上述抗体，可使用具有下述重链可变区及轻链可变区的抗体，所述重链可变区及轻链可变区包含与上述抗体的重链可变区及轻链可变区的氨基酸序列分别具有高同源性或高同一性的氨基酸序列。例如，与上述抗体的重链可变区及轻链可变区的氨基酸序列的同源性为至少70％以上，优选为80％以上，更优选例如为90％、进一步优选95％、特别优选98％以上。关于同源性或同一性(类似性)，可使用任意广为人知的算法、例如Needleman-Wunsch、Smith-Waterman、BLAST或FASTA，例如，使用BLAST程序(Atschul et al，J.Molec.Biol.，1990；215：403-410)在默认(default)条件下算出。
识别同一表位的抗体
另外，与上述抗体分别结合于相同的表位的抗体的组合也可作为本发明的“2种不同的抗体”利用。对于与各抗体结合于相同的表位的抗体，可使用竞争ELISA等已知的方法，通过测定其与上述各抗体对可溶性GPC3蛋白质或各抗体识别的表位片段的竞争(交叉反应性)而得到。
重组抗体
另外，具有与GT30抗体、GT607抗体、GT165抗体及GT114抗体分别相同的重链可变区及轻链可变区的抗体的组合、或、具有与上述抗体分别相同的重链CDRs(CDR1、CDR2、CDR3)区域及轻链CDRs(CDR1、CDR2、CDR3)的抗体的组合也可作为本发明的“2种不同的抗体”利用。进而，这些抗体的嵌合抗体、人源化抗体、人抗体的组合也可以作为本发明的“2种不同的抗体”利用。
具有与GT30抗体、GT607抗体、GT165抗体及GT114抗体分别相同的重链可变区及轻链可变区的抗体、或具有相同的重链CDRs及轻链CDRs的抗体可利用重组技术制成。即，将编码作为目标的抗GPC3N端肽抗体或抗GPC3C端肽抗体的重链可变区及轻链可变区的DNA组入至含有编码所期望的抗体恒定区域(C区域)的DNA的表达载体(vector)中，利用该表达载体对宿主细胞进行转化，使其表达抗体。
对于抗体基因的表达而言，可以将编码抗体重链(H链)或轻链(L链)的DNA分别组入表达载体中而使宿主细胞同时转化，或者可以将编码H链及L链的DNA组入至单一的表达载体中而使宿主细胞转化(参见WO94/11523号公报)。
此外，重组型抗体的产生中，不仅可使用上述宿主细胞，而且还可使用转基因动物。例如，将抗体基因插入至编码在乳汁中固有地产生的蛋白质(山羊β酪蛋白等)的基因内部，以融合基因的形式制备。将包含插入了抗体基因的融合基因的DNA片段注入山羊胚胎中，将该胚胎导入雌性山羊中。从由接受了胚胎的山羊生育的转基因山羊或其后代产生的乳汁中，获得所期望的抗体。此外，为了增加包含由转基因山羊产生的所期望的抗体的乳汁量，可适宜地对转基因山羊使用激素(Ebert,K.M.et al.,Bio/Technology(1994)12,699-702)。
本发明中，除了上述抗体以外，还可使用经人为修饰的基因重组型抗体、例如嵌合抗体(人源化(Humanized)抗体等)。这些修饰抗体可利用已知的方法制造。将本发明的抗体用作治疗用抗体时，优选使用基因重组型抗体。
嵌合抗体可通过下述方式得到：将编码如上所述得到的抗体V区域的DNA与编码人抗体C区域的DNA连接，将其组入至表达载体中，导入至宿主中而使其产生嵌合抗体。可采用已知的方法得到可用于本发明的嵌合抗体。
人源化抗体也被称为改型(reshaped)人抗体，其是将人以外的哺乳动物、例如小鼠抗体的互补性决定区(CDR；complementarity determining region)移植给人抗体的互补性决定区而得到的，其一般性的基因重组方法也是已知的(参见欧州专利申请公开号EP125023号公报、WO96/02576号公报)。
与例如日本专利4283227号公报中记载的发明同样地，本发明的测定方法是对于通过检测从受试者分离的被检试样中的可溶化GPC3蛋白质来检查上述受试者患肝癌的可能性的方法而言有用的发明。此外，与日本专利4658926号公报中记载的发明同样地，是对于含有抗GPC3抗体的肝癌治疗后的复发预测判定药物而言也有用的发明。本发明的测定方法可利用于以本发明的测定方法为特征的诊断方法、复发预测判定方法。如后述的实施例所示，本发明的测定方法能够以数pg/mL的量级测定健康人的血中含有的可溶性GPC3蛋白质，与上述两件专利涉及的发明相比，可以说是对肝癌的早期发现、预后诊断更加有用的技术。
更具体而言，健康人的可溶性GPC3的浓度范围为15～174pg/mL左右，因此，在检测到了超出该范围的可溶性GPC3的情况下，显示出罹患肝癌、或肝癌复发的可能性，表明能够通过早期发现而降低风险。
本发明还可提供用于本发明的可溶性GPC3蛋白质的测定方法的、包含上述与不同的表位结合的2种不同的抗体的测定试剂盒。该抗体可以以上述的固定于载体上的状态被提供，也可以以与载体分开的方式被提供。此外，该试剂盒中可附加性地包含经系列稀释的可溶性GPC3的标准液。关于本发明的免疫学测定试剂盒所使用的测定原理等，与上述的免疫学方法同样。本发明的测定试剂盒中，可使用各种水系溶剂作为溶剂。作为该水系溶剂，例如，可举出纯化水、生理盐水、或Tris缓冲液、磷酸缓冲液或磷酸缓冲液生理盐水等各种缓冲液。作为该缓冲液的pH，可适宜地选择合适的pH。pH的值没有特别限定，但通常选择使用pH3～12范围内的pH。
此外，本发明的测定试剂盒中，除上述成分以外，还可适宜地含有下述物质中的一种或二种以上，所述物质为：牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)、酪蛋白或其盐等的蛋白质、各种盐类、各种糖类、脱脂乳粉、正常兔血清等各种动物血清、叠氮化钠或抗生素等各种防腐剂、活化物质、反应促进物质、聚乙二醇等增加灵敏度的物质、非特异性反应抑制物质、或者非离子性表面活性剂、两性表面活性剂或阴离子性表面活性剂等各种表面活性剂等。并且，使测定试剂中含有上述物质时的浓度没有特别限定，优选为0.001～10％(W/V)，尤其是可以在0.01～5％(W/V)的范围内适宜地选择合适的浓度。
此外，本发明的测定试剂盒中，还可在上述成分以外与其他试剂组合。作为其他试剂，例如，可举出缓冲液、用于生物学试样的稀释液、试剂稀释液、含有标记物质的试剂、含有可产生显色等信号的物质的试剂、含有与显色等信号的产生有关的物质的试剂、含有用于进行校正(校准)的物质的试剂、或含有用于进行精度管理的物质的试剂等。
作为本发明的测定试剂盒的形态，没有特别限定，但为了短时间且简便地进行测定，也可以以一体型测定试剂盒(其中，本发明的测定试剂盒的构成成分成为了一体)的形态提供。作为上述一体型测定试剂盒，例如，可举出ELISA试剂盒、荧光免疫测定试剂盒、免疫色谱试剂盒等。例如作为ELISA试剂盒的形态，包含固定有第一抗体的微孔板、经系列稀释的可溶性GPC3标准液、经HRP等酶修饰的第二抗体、清洗缓冲液、及该酶反应的基质溶液等。此外，荧光免疫测定试剂盒的情况下，包含固定有第一抗体的光波导、经系列稀释的可溶性GPC3标准液、经荧光物质修饰的第二抗体、及清洗缓冲液等。此外，免疫色谱试剂盒的情况下，在反应盒(cassette)内收纳有膜，上述第一抗体固定化于该膜上的一端(下游侧)。此外，可举出下述方式：在膜上的相反的一端(上游侧)，装有展开液，在其附近的下游侧配置有添加了上述标记剂的基质的垫(pad)，在膜的中间部配置有添加了第二抗体(其如上所述进行了标记)的垫的方式等。
实施例
以下，给出实施例来详细说明本发明，但本发明并不限定于这些实施例。
[实施例1]
在将人磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3：序列号70)的2个硫酸肝素结合部位(495位及509位)的丝氨酸转化为丙氨酸而形成的变异体GPC3核心(core)的细胞外结构域(25位-563位)的C末端上赋予His标签，得到的GPC3核心(sGPC3-His)蛋白，将该GPC3核心(sGPC3-His)蛋白对Balb/c或MRL/lpr小鼠免疫共计6～9次，在最终免疫的3天后，利用使用了PEG1500的常规方法或HVJ-E(石原产业)，将小鼠的脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合。
接下来，利用将sGPC3-His直接固定化的ELISA、将抗His抗体固定化后使sGPC3-His结合的ELISA、或使用了恒定表达GPC3的CHO细胞的细胞ELISA(Cell ELISA)，实施杂交瘤细胞的筛选(参见WO 2006/006693)。
[实施例2]
已经发现，sGPC3-His蛋白质在还原条件下的SDS-PAGE中可见带约86kDa、约43kDa、约33kDa的条(band)，分别为全长型、被蛋白酶切断而得的N端片段、C端片段(WO2006/006693)。使用通过上述筛选得到的小鼠抗体，针对sGPC3-His进行Western印迹，选出不识别C端片段的抗体。结果，得到了作为N端片段识别抗体的GT30、GT114、GT607、识别部位不确定的GT165(图1)。
接着，使CHO细胞中表达在GPC3的1位至196位(AW2)、1位至218位(AW3)、1位至357位(AW5)的各C末端附加有His标签的重组品，使用各CHO细胞沉淀，进行Western印迹。结果，如图2、表1所示，对于GT30、GT114、GT607而言，虽然确认到其与AW5或sGPC3-His的反应性，但在AW2及AW3中未确认到反应性，由此表明，GT30、GT114、GT607结合在GPC3的219位至357位。另一方面，GT165在任意情况下均未确认到反应性，由此认为，GT165可能特异性强地识别立体结构。
[表1]
[实施例3]
为了更详细地确定上述抗体的表位，将GPC3的氨基酸序列分割成包含10个残基的重叠的30个残基的肽，合成对应的肽(表2序列号1-29)。将合成肽以成为1mg/mL的方式溶解于二甲基亚砜后，使用PBS稀释至1μg/mL。向96孔板中以每孔70μL的量添加稀释后的肽溶液，在室温下进行1小时固定化。除去未固定的肽，以每孔200μL的量添加封闭缓冲液20％Blocking-one(Nacalai Tesque,Inc.)，进行一晚封闭。除去封闭缓冲液，用TBS-T清洗3次后，以70μL/孔的量添加抗体(用封闭缓冲液稀释成了2μg/mL)。一小时后除去抗体，以每孔200μL的量添加TBS-T，清洗3次。向各孔中以每孔70μL的量添加HRP结合抗小鼠抗体，反应一小时。除去抗体，用每孔200μL的TBS-T清洗3次后，以70μL/孔的量添加显色试剂ABTSPeroxidase Substrate System(1component,KPL公司)，在室温下显色15～30分钟，添加每孔70μL的1％SDS，停止反应，用平板读取器(Plate Reader)测定405nm处的吸光度。结果，如图3所示，确认到GT30与序列号第17号的肽结合，但未发现与GT114、GT165及GT607特异性地结合的肽。
由上述结果表明，GT30结合在GPC3的321位至350位的部位，以及，除了GT165以外，GT114及GT607也可能识别立体结构。
[表2]
氨基酸编号 序列 序列号
1-30 MAGTVRTACLVVAMLLSLDFPGQAQPPPPP 1
21-50 PGQAQPPPPPPDATCHQVRSFFQRLQPGLK 2
41-70 FFQRLQPGLKWVPETPVPGSDLQVCLPKGP 3
61-90 DLQVCLPKGPTCCSRKMEEKYQLTARLNME 4
81-110 YQLTARLNMEQLLQSASMELKFLIIQNAAV 5
101-130 KFLIIQNAAVFQEAFEIVVRHAKNYTNAMF 6
121-150 HAKNYTNAMFKNNYPSLTPQAFEFVGEFFT 7
141-170 AFEFVGEFFTDVSLYILGSDINVDDMVNEL 8
161-190 INVDDMVNELFDSLFPVIYTQLMNPGLPDS 9
181-210 QLMNPGLPDSALDINECLRGARRDLKVFGN 10
201-230 ARRDLKVFGNFPKLIMTQVSKSLQVTRIFL 11
221-250 KSLQVTRIFLQALNLGIEVINTTDHLKFSK 12
241-270 NTTDHLKFSKDCGRMLTRMWYCSYCQGLMM 13
261-290 YCSYCQGLMMVKPCGGYCNVVMQGCMAGVV 14
281-310 VMQGCMAGVVEIDKYWREYILSLEELVNGM 15
301-330 LSLEELVNGMYRIYDMENVLLGLFSTIHDS 16
321-350 LGLFSTIHDSIQYVQKNAGKLTTTIGKLCA 17
341-370 LTTTIGKLCAHSQQRQYR^SAYYPEDLFIDK 18
361-390 YYPEDLFIDKKVLKVAHVEHEETLSSRRRE 19
381-410 EETLSSRRRELIQKLKSFISFYSALPGYIC 20
401-430 FYSALPGYICSHSPVAENDTLCWNGQELVE 21
421-450 LCWNGQELVERYSQKAARNGMKNQFNLHEL 22
441-470 MKNQFNLHELKMKGPEPVVSQIIDKLKHIN 23
461-490 QIIDKLKHINQLLRTMSMPKGRVLDKNLDE 24
481-510 GRVLDKNLDEEGFESGDCGDDEDECIGGSG 25
501-530 DEDECIGGSGDGMIKVKNQLRFLAELAYDL 26
521-550 RFLAELAYDLDVDDAPGNSQQATPKDNEIS 27
541-570 QATPKDNEISTFHNLGNVHSPLKLLTSMAI 28
551-580 TFHNLGNVHSPLKLLTSMAlSVVCFFFLVH 29
[实施例4]
接下来，为了分析识别GPC3N末端侧片段的各抗体的结合竞争性，使用各抗体进行了结合抑制试验。
具体而言，向96孔透明微孔板(Thermo Scientific公司制MaxiSoap)中加入50μL的1μg/mL的sGPC3溶液(PBS)，在室温下静置一晚。接着，用清洗液(包含0.01％Triton X-100的TBS)将微孔板清洗1次后，加入200μL封闭溶液(Nacalai Tesque,Inc.制BlockingOne)，在室温下静置1小时。此外，用清洗液将微孔板清洗3次后，加入25μL的50μg/mL的未标记的抗GPC3抗体溶液(包含20％BlockingOne的PBS)，在室温下搅拌1分钟。进一步，加入25μL的0.5μg/mL的经生物素标记的抗GPC3抗体溶液(包含20％BlockingOne的PBS)，在室温下搅拌1小时。接着，用清洗液将微孔板清洗3次后，加入50μL将StreptAvidin-HRP(Prozyme公司制)用稀释液(包含10％Block Ace、0.1％Tween 20的TBS)稀释10,000倍而得的溶液，在室温下搅拌30分钟。此外，用清洗液将微孔板清洗5次后，加入50μL显色基质液(Thermo Scientific公司制1-Step Turbo TMB)，用微孔板读取器测定450nm处的吸光度(O.D.450)。
[表3]
如表3所示，GT30和GT165抑制各自向GPC3的结合，由此认为，GT165和GT30的表位临近。此外，GT114和GT607虽然不受GT30的抑制，但在GT114和GT607的共存下确认到抑制向GPC3的结合，由此认为GT114和GT607的表位临近；另一方面，GT114也不受GT165的抑制，而与此相对，GT607受到由GT165导致的结合抑制，由此确认到，GT607的结合部位虽不与GT30的结合部位重叠，但与GT165的结合区域接近(图4)。
[实施例5]
根据以上的结果，表明GT114、GT165及GT607识别立体结构，尤其是GT165结合在作为GT30的表位区域的321位至350位的部位的附近，因此，利用人GPC3的立体结构模型确定了认为可能结合的区域。
首先，将与人GPC3的同源性高、并且X射线晶体结构分析已被报道的果蝇的Dally-like蛋白质的结构(PDB ID:3ODN,Kim M.S.et al.,Proc Natl Acad Sci USA 2011；108:13112-13117)假定为人GPC3的立体结构(包含29位的脯氨酸残基至486位的赖氨酸残基，但是不包含357位的酪氨酸至372位的缬氨酸)，使用PyMOL Molecular Graphics System,Version 1.5.0.4(Schrodinger LLC公司制)推断各抗体的相互作用。需要说明的是，已有报道称磷脂酰肌醇蛋白聚糖分子的立体结构超越物种界限而被良好地保存(SvenssonG.et al.,J Biol Chem 2012；287:14040-14051)。
结果，推断作为GT30的表位区域的321位至350位具有α-螺旋结构。为了分析对该区域的结合模式，使用了已知可识别α-螺旋结构、并且X射线晶体结构分析已被报道的3种小鼠单克隆抗体Fab(PDB IDs:2CMR,2XRA,3V6Z)作为螺旋结构识别模型。进一步，将小鼠IgG1抗体的X射线晶体结构(PDB ID:1IGY)与上述3种Fab分别叠合。结果推断，作为识别人GPC3的321位至350位的两个螺旋部分的小鼠IgG1抗体，可能有包括321位至350位的2种螺旋结合部位、3种Fab(2CMR,2XRA,3V6Z)的结合模式、及两种小鼠IgG1的Fab的全部组合在内的12种结合模式。
针对上述12种IgG1结合模型,分别地，将与Fab在4埃以内接触的人GPC3的区域确定为GT165(其为与GT30竞争抗原结合的抗体)的结合区域。进而，同样地，将能与GT165的结合区域竞争的区域确定为GT607的结合区域，接着，基于GT607的结合区域，将能与其竞争的区域确定为GT114的结合区域。根据这些结果、实施例2及实施例3的结果、表3及图4的竞争关系的结果，作为GT30、GT165、GT607及GT114的结合区域，分别确定为图5～9所示的区域。此次所确定的识别区域中，依据实施例2及实施例3的结果，将对于各抗体的抗原结合而言重要的人GPC3氨基酸残基记载在表4中。此外，将从结构模型推测的能够成为各抗体的识别区域的全部人GPC3氨基酸残基示于表5。
[表4]
[表5]
[实施例6]
(使用磁性粒子的ELISA测定体系的构建)
根据实施例4的结果，作为能够构建可溶性GPC3的测定体系的抗体的组合，选出了表6所示的2种。
[表6]
需要说明的是，对于表6所示的测定体系，为了实现高灵敏度化，在固相侧，将抗体固定于磁性粒子(JSR Life Sciences株式会社制Magnosphere MS300/Carboxyl(羧基))上，在标记侧，在抗体上标记碱性磷酸酶。
[实施例7]
(基于使用磁性粒子的化学发光酶免疫测定法的可溶性GPC3的测定)
基于使用磁性粒子的化学发光酶免疫测定法的可溶性GPC3的测定，利用以下方法实施。
向96孔白色微孔板(Corning公司制)中，添加25μL的结合有GT30或GT114的0.06％(w/v)的抗体结合磁性粒子。接着，添加25μL包含可溶性GPC3的溶液样品。进一步，添加25μL经碱性磷酸酶标记的GT607或GT165抗体的各溶液。然后，于25℃对96孔白色微孔板搅拌20分钟，使用微孔板清洗机(Tecan公司制HydroFlex)，一边集磁一边用清洗液(包含0.01％TritonX-100的TBS)将抗体结合磁性粒子清洗5次。进一步，添加50μL发光基质液(FUJIREBIO株式会社制Lumipulse基质液)后，在5分钟后使用化学发光检测器(Promega公司制GloMax96)测定发光量。
[实施例8]
(检测限及定量限)
对于检测限，将制备成0～10pg/mL的可溶性GPC3溶液样品各测定10次，算出各浓度的测定发光量的平均值及标准偏差(SD)后，将测定发光量平均值±3SD的范围不与浓度0pg/mL的发光量平均值±3SD的范围重叠的最低的浓度作为检测限。
对于定量限，将制备成0～10pg/mL的可溶性GPC3溶液样品各测定10次，将从标准曲线算出的测定值的CV成为10％以下的浓度作为定量限。
结果，如图10所示，构建的所有测定体系的检测限及定量限均为10pg/mL以下，确认了能够以高灵敏度测定可溶性GPC3。
[实施例9]
(肝癌待测试样的稀释线性试验)
使用制备成0、10、25、50、100、250、500、1000pg/mL的各可溶性GPC3溶液绘制标准曲线，利用与实施例7同样的步骤测定经阶段稀释的肝癌待测试样中的可溶性GPC3。
结果，如表7所示，算出将测定值乘以稀释倍率而得的值并评价稀释线性，结果确认了稀释线性。
[表7]
[实施例10]
(健康人待测试样的测定)
使用制备成0、10、25、50、100、250、500、1000pg/mL的各可溶性GPC3溶液绘制标准曲线，利用与实施例7同样的步骤测定健康人血清中的可溶性GPC3。需要说明的是，对于健康人血清，测定21例，求出平均值。
[表8]
结果，如表8所示，健康人血清中的可溶性GPC3测定值均为各测定体系的检测限及定量限以上，可溶性GPC3的浓度范围为15～174pg/mL。由以上结果确认到，构建的所有测定体系均能够检测到在健康人血清中以数十至数百pg/mL被含有的微量的可溶性GPC3。
[实施例11]
获得的抗体的序列分析
从上述得到的产生抗体GT30、GT114、GT165、GT607及GT30的杂交瘤中提取出全部RNA，使用逆转录酶合成cDNA后，利用PCR对小鼠抗体基因进行扩增，从氨基末端确定可变区的碱基序列(序列号30-37)。将可变区的氨基酸序列示于序列号38-45。此外，将其各CDR区域的序列示于序列号46～69。
[实施例12]
为了确认GC33在进行性及/或复发性肝细胞癌(HCC)患者中的有效性、安全性，实施了多中心共同随机双盲安慰剂对照II期临床试验(NP27884试验)，即，以具有前治疗史的无法实施切除的进行性或转移性肝细胞癌成人患者作为对象，隔周施予GC331600mg。需要说明的是，GC33是与人GPC3以高亲和性结合的基因重组人源化IgG1单克隆抗体(WO2006/006693)。
确认到了对于在GPC3靶向治疗中被施予GC33或安慰剂的症例的初次施予前的血清中的可溶性GPC3的浓度，能够利用与2种不同的可溶性GPC3结合的抗体的组合(包含GT30抗体和GT607抗体的组合、或包含GT114和GT165的组合)进行测定。
向96孔微孔板中添加使GT30或GT114结合于磁性粒子(JSR公司制MS300)而得到的抗体结合粒子液各25μL，接着，添加标准曲线用标准试样液、或经适宜稀释的血清试样各25μL，进而添加经碱性磷酸酶标记的GT607或GT165各25μL。于25℃振荡20分钟振后，使用Dyna-Mag-96Side Skirted(VERITAS公司制)，在集磁的状态下用清洗液清洗5次，各添加预先加热至37℃的发光基质液50μL。在室温下振荡1分钟振后，静置4分钟而使其发光。化学发光强度使用光度计(VERITAS公司制)进行测定。需要说明的是，标准曲线用标准试样液中，作为GPC3标准物质，使用了将495位及509位的丝氨酸残基转化为丙氨酸残基而使得硫酸肝素糖链不结合的重组GPC3(Hippo et.al.,Cancer Res.(2004)64,2418-2423)。
使用基于包含重组GPC3的标准试样而制成的标准曲线(校准曲线)，从得到的各孔的化学发光强度算出各患者的血清中GPC3抗原。
产业上的可利用性
本发明对于癌、特别是肝癌中的罹患初期阶段内的早期发现、使用的抗癌剂的选择取舍、治疗后的预后诊断是有用的。

Claims (4)

1.2种不同的抗体用于制造下述测定试剂盒的用途，所述测定试剂盒用于测定被检试样中的可溶性GPC3蛋白质，
其特征在于，2种不同的抗体为：
具有重链可变区的CDR1、2及3分别包含序列号46、47及48所示的氨基酸序列的重链可变区、和轻链可变区的CDR1、2及3分别包含序列号49、50及51所示的氨基酸序列的轻链可变区的抗体，与具有重链可变区的CDR1、2及3分别包含序列号52、53及54所示的氨基酸序列的重链可变区、和轻链可变区的CDR1、2及3分别包含序列号55、56及57所示的氨基酸序列的轻链可变区的抗体的组合；或，
具有重链可变区的CDR1、2及3分别包含序列号58、59及60所示的氨基酸序列的重链可变区、和轻链可变区的CDR1、2及3分别包含序列号61、62及63所示的氨基酸序列的轻链可变区的抗体，与具有重链可变区的CDR1、2及3分别包含序列号64、65及66所示的氨基酸序列的重链可变区、和轻链可变区的CDR1、2及3分别包含序列号67、68及69所示的氨基酸序列的轻链可变区的抗体的组合。
2.如权利要求1所述的用途，其中，2种不同的抗体为：
具有序列号38所示的重链可变区及序列号39所示的轻链可变区的抗体、与具有序列号40所示的重链可变区及序列号41所示的轻链可变区的抗体的组合；或，
具有序列号44所示的重链可变区及序列号45所示的轻链可变区的抗体、与具有序列号42所示的重链可变区及序列号43所示的轻链可变区的抗体的组合。
3.如权利要求1所述的用途，其中，2种不同的抗体中的任一者与磁性粒子结合。
4.如权利要求1所述的用途，其中，被测试样为从人分离的全血试样、血浆试样、或血清试样。
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