CN111381034A - 一种gpc-3抗体包被磁珠及其制备方法、试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明具体涉及一种GPC‑3抗体包被磁珠及其制备方法、试剂盒，属于生物技术领域，该方法包括：将GPC‑3抗体配制为质量浓度为8‑12mg/mL的溶液，获得GPC‑3抗体溶液；将粒径为1.5‑2.0um与2.0‑3.0um的磁性微球按质量比1：3‑1：5混合，获得磁珠溶液；将第一缓冲液与所述磁珠溶液混合，获得第一混合溶液；将所述GPC‑3抗体溶液与所述第一混合溶液按混合，并回旋振荡15‑30min，获得第二混合溶液；将碳二亚胺配制为质量浓度为5‑20mg/mL的溶液，获得碳二亚胺溶液；将所述第二混合溶液与所述碳二亚胺溶液混合，并回旋振荡1‑2h，获得第三混合溶液；将封闭液与所述三混合溶液混合，并回旋振荡15‑30min，获得第四混合溶液；将所述第四混合溶液进行离心处理，离心处理后去除上清液，获得GPC‑3抗体包被磁珠。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体为一种GPC-3抗体包被磁珠及其制备方法、试剂盒。
背景技术
Glypican-3(GPC-3)是Glypican家族中的一员，属于膜性硫酸乙酰肝素多糖蛋白。在哺乳动物的胚胎期，GPC-3通过影响多个分子信号通路而对组织器官的发育起到重要的调控作用，其功能缺失将导致过度生长和畸变综合征(SGBS)。成人GPC-3的异常表达与多种肿瘤的发生发展关系密切。GPC-3在肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)中表达上调，与HCC的生物学特性相关，在肝癌的早期诊断、生物治疗和预后评估中具有良好的应用前景。
肝细胞癌简称肝癌，是全球最常见的恶性肿瘤之一。根据世界卫生组织报告显示，我国肝癌的发病率为25.7/10万，居全球之首，每年新发和死亡患者占全球总数的一半。尽管HCC的治疗水平有了极大提高，但死亡率并无明显改善，5年以上生存率仅为10％左右，其主要原因是肝癌起病隐匿，早期没有症状或症状不明显，又缺乏有效的早期诊断手段，患者就诊时通常已经达到晚期，失去了最佳治疗的机会。因此，早期发现癌变并有效治疗是提高HCC生存期的关键。
甲胎蛋白(α-fetoprotein，AFP)及其异质体是目前临床上诊断HCC重要指标和特异性较强的肿瘤标志物，然而在多项研究及实践工作中均发现，AFP在一些良性肝病、生殖性畸胎瘤、肺癌、妊娠活动期等患者中也可出现升高，临床上大概有30％～40％的HCC患者AFP为阴性，所以存在一定的误诊率和漏诊率。2010版美国肝病研究学会指南已不再将AFP作为筛查指标。
研究表明约80％的HCC特异地表达GPC-3，肝癌组织中GPC-3阳性患者，其血液中同样可检测到GPC-3，这是由于GPC-3易受细胞的蛋白转换酶水解作用，形成游离sGPC-3进入循环系统。因此，血清中sGPC-3水平间接反映着成人机体内GPC-3阳性肝癌细胞数量水平；约有83％HCC患者血清可检测到高水平GPC-3，而肝硬化患者血清GPC-3阳性率仅为9.38％且呈低水平。这些研究结果提示血清sGPC-3含量将可能作为早期筛查、诊断HCC的依据，并以此监测患者的预后状况。我国，约30％的HCC患者血清AFP为阴性，研究发现GPC-3在血清AFP阴性HCC患者中却有很高检出率。GPC-3对于诊断HCC有较高的特异性，在一定程度上可以弥补AFP的特异性不足，因此，联合检测可显著提高HCC检出率。
虽然GPC-3有明确的临床诊断价值，但是目前GPC-3的检测多依赖传统的酶联免疫检测分析方法，该方法对人工依赖程度较高，人为影响因素对检测结果的准确定、特异性以及批间差影响较大，因此需要开发基于自动化的检测的反应体系，以满足临床检测的需求，一方面可以保证检测结果的准确性和重现性，另一方面可以降低对技术人员的依赖。此外，专利申请文件CN105759051A一种磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3的定量分析试剂盒及其制备方法，公开了一种检测GPC-3的试剂盒，但是该试剂盒以双氧水作为反映底物，双氧水本身的稳定性相对较差，对检测结果有一定的不良影响，因此，需要开发一种自动、快速、准确的GPC-3检测试剂盒来满足检测需求。
发明内容
鉴于上述问题，提出了本发明以便提供一种克服上述问题或者至少部分地解决上述问题的GPC-3抗体包被磁珠及其制备方法、试剂盒。
本发明实施例提供一种GPC-3抗体包被磁珠工艺及其在试剂盒制备中的应用，包括抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体包被磁珠工艺和试剂盒的制备工艺；
一种GPC-3抗体包被磁珠的制备方法，其特征在于，包括：
将GPC-3抗体配制为质量浓度为8-12mg/mL的溶液，获得GPC-3抗体溶液；
将粒径为1.5-2.0um与2.0-3.0um的磁性微球按质量比1：3-1：5混合，获得磁珠溶液；
将第一缓冲液与所述磁珠溶液按体积比1:1-1:2混合，获得第一混合溶液；
将所述GPC-3抗体溶液与所述第一混合溶液按体积比1:2-1:3混合，并回旋振荡15-30min，获得第二混合溶液；
将所述活化剂与所述第二混合溶液按体积比1:3-1:4混合，并回旋振荡1-2h，获得第三混合溶液；
将封闭液与所述第三混合溶液按体积比1:4-1:5混合，并回旋振荡15-30min，获得第四混合溶液；
将所述第四混合溶液进行离心处理，离心处理后去除上清液，获得GPC-3抗体包被磁珠。
可选的，所述第一缓冲液包括如下一种或几种：磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、醇醚磺基琥珀酸单酯二钠盐MES缓冲溶液、磷酸盐缓冲液、Tris–盐酸缓冲液。
可选的，所述活化剂为质量浓度5-20mg/mL的碳二亚胺溶液EDAC。
可选的，所述封闭液包括如下一种或几种：PEG20000、BSA、酪蛋白。
可选的，所述将所述第四混合溶液进行离心处理，离心处理后去除上清液，获得GPC-3抗体包被磁珠，包括：
将所述第四混合溶液在转速为12000-16000rpm条件下离心处理10-30min，离心处理后去除上清液；
用第二缓冲液重悬去除上清液后的第四混合溶液；
重复所述离心处理和所述重悬2-3次，以去除GPC-3抗体包被磁珠中的杂质，获得GPC-3抗体包被磁珠；
基于同一发明构思，本发明实施例还提供一种GPC-3抗体包被磁珠，由上述一种GPC-3抗体包被磁珠的制备方法制备得到。
基于同一发明构思，本发明实施例还提供一种GPC-3抗体包被磁珠试剂盒，包括上述一种GPC-3抗体包被磁珠，其中，将所述GPC-3抗体包被磁珠与防凝液混合，以减少磁珠凝集。
可选的，还包括碱性磷酸酶标记GPC-3抗体、化学发光底物溶液和洗涤剂。
可选的，所述碱性磷酸酶标记GPC-3抗体的制备方法如下：
将摩尔浓度为10-100mmol/L的3-吗啉丙磺酸,摩尔浓度为1-5mmol/L的乙二胺四乙酸的缓冲液混合，pH值为6.5-7.5，获得第一稀释液；
将GPC-3抗体通过所述第一稀释液稀释至质量浓度为1-2mg/mL，并加入10-50uL且摩尔浓度为100-500mmol/L的2-MEA，于25-30℃反应30-60min或者于3-5℃反应1-2h后，进行脱盐处理，获得脱盐GPC-3抗体；
将摩尔浓度为10-100mmol/L的3-吗啉丙磺酸,摩尔浓度为1-5mmol/L的乙二胺四乙酸的缓冲液混合，pH值为7.5-8.5，获得第二稀释液；
将碱性磷酸酶通过所述第二稀释液稀释至质量浓度为2-5mg/mL，并加入10-30uL且摩尔浓度为100-250mmol/L的SM(PEG)6，于25-30℃反应30-60min或者于3-5℃反应1-2h后，进行脱盐处理，获得脱盐碱性磷酸酶；
将所述脱盐GPC-3抗体和所述脱盐碱性磷酸酶以体积比1:1或者2:1混合，于25-30℃反应30-60min或者于3-5℃反应1-2h，获得碱性磷酸酶标记GPC-3抗体。
可选的，所述化学发光底物溶液的组分如下：
第三缓冲液：摩尔浓度10-100mmol/L，pH值7.0-7.5；
脱脂奶粉：质量浓度1-5g/L；
白蛋白：质量浓度0.5-2.0g/L；
吐温20：质量分数0.1-0.5％；
3-(2'-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3"-磷酰氧基)苯-1,2-二氧杂环丁烷AMPPD：摩尔浓度10-100mmol/L。
可选的，所述洗涤剂的组分如下：
PBS溶液：摩尔浓度0.01-0.05mol/L，pH值7.0-8.0；
吐温20：质量分数0.5-3％。
本发明实施例中的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：
本发明实施例提供的GPC-3抗体包被磁珠试剂盒具有精密度、灵敏度和准确度高的特点，性能优良。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，而可依照说明书的内容予以实施，并且为了让本发明的上述和其它目的、特征和优点能够更明显易懂，以下特举本发明的具体实施方式。
具体实施方式
下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。
在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。
除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
还需要说明的是，本发明中的术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
同时，本发明中的术语“第一”、“第二”等，不表示任何顺序或次数，可将这些单词解释为名称。
本发明实施例提供一种GPC-3抗体包被磁珠工艺及其在试剂盒制备中的应用，包括抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体包被磁珠工艺和试剂盒的制备工艺；
一种GPC-3抗体包被磁珠的制备方法，其特征在于，包括：
将GPC-3抗体配制为质量浓度为8-12mg/mL的溶液，获得GPC-3抗体溶液；
将粒径为1.5-2.0um与2.0-3.0um的磁性微球按质量比1：3-1：5混合，获得磁珠溶液；
将第一缓冲液与所述磁珠溶液按体积比1:1-1:2混合，获得第一混合溶液；
将所述GPC-3抗体溶液与所述第一混合溶液按体积比1:2-1:3混合，并回旋振荡15-30min，获得第二混合溶液；
将所述活化剂与所述碳第二混合溶液按体积比1:3-1:4混合，并回旋振荡1-2h，获得第三混合溶液；
将封闭液与所述第三混合溶液按体积比1:4-1:5混合，并回旋振荡15-30min，获得第四混合溶液；
将所述第四混合溶液进行离心处理，离心处理后去除上清液，获得GPC-3抗体包被磁珠。
作为一些可选的实施方案，所述第一缓冲液包括如下一种或几种：磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、醇醚磺基琥珀酸单酯二钠盐MES缓冲溶液、磷酸盐缓冲液、Tris–盐酸缓冲液。
作为一些可选的实施方案，所述活化剂为质量浓度5-20mg/mL的碳二亚胺溶液EDAC。
作为一些可选的实施方案，所述封闭液包括如下一种或几种：PEG20000、BSA、酪蛋白。
作为一些可选的实施方案，所述将所述第四混合溶液进行离心处理，离心处理后去除上清液，获得GPC-3抗体包被磁珠，包括：
将所述第四混合溶液在转速为12000-16000rpm条件下离心处理10-30min，离心处理后去除上清液；
用第二缓冲液重悬去除上清液后的第四混合溶液；
重复所述离心处理和所述重悬2-3次，以去除GPC-3抗体包被磁珠中的杂质，获得GPC-3抗体包被磁珠；
本实施例中，第二缓冲液包括但不限于如下一种：磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、醇醚磺基琥珀酸单酯二钠盐MES缓冲溶液、磷酸盐缓冲液、Tris–盐酸缓冲液。
基于同一发明构思，本发明实施例还提供一种GPC-3抗体包被磁珠，由上述一种GPC-3抗体包被磁珠的制备方法制备得到。
基于同一发明构思，本发明实施例还提供一种GPC-3抗体包被磁珠试剂盒，包括上述一种GPC-3抗体包被磁珠，其中，将所述GPC-3抗体包被磁珠与防凝液混合，以减少磁珠凝集。
作为一些可选的实施方案，还包括碱性磷酸酶标记GPC-3抗体、化学发光底物溶液和洗涤剂。
作为一些可选的实施方案，所述碱性磷酸酶标记GPC-3抗体的制备方法如下：
将摩尔浓度为10-100mmol/L的3-吗啉丙磺酸,摩尔浓度为1-5mmol/L的乙二胺四乙酸的缓冲液混合，pH值为6.5-7.5，获得第一稀释液；
将GPC-3抗体通过所述第一稀释液稀释至质量浓度为1-2mg/mL，并加入10-50uL且摩尔浓度为100-500mmol/L的2-MEA，于25-30℃反应30-60min或者于3-5℃反应1-2h后，进行脱盐处理，获得脱盐GPC-3抗体；
将摩尔浓度为10-100mmol/L的3-吗啉丙磺酸,摩尔浓度为1-5mmol/L的乙二胺四乙酸缓冲液混合，pH值为7.5-8.5，获得第二稀释液；
将碱性磷酸酶通过所述第二稀释液稀释至质量浓度为2-5mg/mL，并加入10-30uL且摩尔浓度为100-250mmol/L的SM(PEG)6，于25-30℃反应30-60min或者于3-5℃反应1-2h后，进行脱盐处理，获得脱盐碱性磷酸酶；
将所述脱盐GPC-3抗体和所述脱盐碱性磷酸酶以体积比1:1或者2:1混合，于25-30℃反应30-60min或者于3-5℃反应1-2h，获得碱性磷酸酶标记GPC-3抗体。
作为一些可选的实施方案，所述化学发光底物溶液的组分如下：
第三缓冲液：摩尔浓度10-100mmol/L，pH值7.0-7.5；
脱脂奶粉：质量浓度1-5g/L；
白蛋白：质量浓度0.5-2.0g/L；
吐温20：质量分数0.1-0.5％；
3-(2'-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3"-磷酰氧基)苯-1,2-二氧杂环丁烷AMPPD：摩尔浓度10-100mmol/L。
本实施例中，第三缓冲液包括但不限于如下一种：磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、醇醚磺基琥珀酸单酯二钠盐MES缓冲溶液、磷酸盐缓冲液、Tris–盐酸缓冲液。
作为一些可选的实施方案，所述洗涤剂的组分如下：
PBS溶液：摩尔浓度0.01-0.05mol/L，pH值7.0-8.0；
吐温20：质量分数0.5-3％。
下面将结合实施例和实验数据，对本发明实施例提供的GPC-3抗体包被磁珠及其制备方法、试剂盒进行详细说明。
实施例1
1.1碱性磷酸酶标记GPC-3抗体制备
a.以10mmol/L MOPS(3-吗啉丙磺酸),1mmol/L EDTA(乙二胺四乙酸)，pH 6.5缓冲液稀释GPC-3抗体至1mg/mL。再向其中加入10uL 100mmol/L 2-MEA(巯基乙胺盐酸盐，用二甲亚砜溶解)，室温反应30min后，以脱盐柱去除过量的交联剂。
b.以10mmol/L MOPS,1mmol/L EDTA pH 7.5-8.5缓冲液稀释碱性磷酸酶至2mg/mL。向其中加入10uL 100mmol/L SM(PEG)6(马来酰亚胺丙酰胺-六聚乙二醇-NHS酯，用二甲亚砜溶解)，室温反应30min后，以脱盐柱去除过量的交联剂。
c.将活化并脱盐后的抗体和碱性磷酸酶以1:1体积比相结合并混匀，室温反应30min备用。
1.2化学发光底物溶液
组分：
磷酸盐缓冲液：10mmol/L pH7.0
脱脂奶粉：1g/L
白蛋白：0.5g/L
吐温20：0.1％
AMPPD：10mmol/L
1.3洗涤剂
组分：
PBS溶液：0.01mol/L pH7.0
吐温20：0.5％
1.4抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体包被磁珠工艺
1.4.1溶液制备
a.将采购的GPC-3抗体(采购自R&D Systems公司)，配置成浓度为10mg/mL备用；
b.分别取粒径为1.5um和3um的磁性微球(采购自北京博尔迈生物技术有限公司)，并按照1:3的比例混合备用；
c.配置5mg/mL碳二亚胺EDAC溶液备用；
d.配置缓冲液备用：醇醚磺基琥珀酸单酯二钠盐MES缓冲溶液(0.02mol/L，ph5.5)；
1.4.2包被抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体的磁珠溶液制备
a.取1.4.1溶液制备过程中b步骤已经制备好的磁珠溶液5mL，并用加入等体积的1.4.1溶液制备中已经配制好的d缓冲液，混匀；
b.向a步骤中加入5mL的1.4.1溶液制备过程中a步骤已经制备好的抗体溶液，之后放置于混匀器上混匀约30分钟；
c.向上述反应体系中加入5mL 1.4.1溶液制备过程中c步骤已经制备好的EDAC溶液，并反复混匀，后放置于混匀器上混匀约2小时；
d.向上述反应体系中加入3mL 5％的封闭液BSA，之后放置于混匀器上混匀约30分钟；
e.反应完成后离心并去除上清液，转速为16000rpm，离心时间为30分钟；
f.去除上清液，并用5mL 1.4.1溶液制备过程中d步骤已经制备好的缓冲液重悬磁性微粒，重悬过程中可以使用超声仪辅助重悬；
g.重复e、f步骤2-3次；
h.用5mL 1.4.1溶液制备过程中d步骤已经制备好的缓冲液重悬磁性微粒；
i.向h步骤的溶液中加入0.05％吐温20，以减少磁珠溶液的凝集，影响后续试剂盒的制备效果。
实施例2
GPC-3抗体包被磁珠工艺中，取粒径为1.5um和3um的磁性微球按照1:5的比例混合备用，其它步骤均与实施例1相同；
实施例3
GPC-3抗体包被磁珠工艺中，取粒径为1.5um和2.0um的磁性微球按照1:3的比例混合备用，其它步骤均与实施例1相同；
实施例4
GPC-3抗体包被磁珠工艺中，取粒径为2.0um和3.0um的磁性微球按照1:3的比例混合备用，其它步骤均与实施例1相同；
实施例5
GPC-3抗体包被磁珠工艺中，缓冲溶液选配置择磷酸盐缓冲液(0.02mol/L，ph6.0)，其它步骤均与实施例1相同；
实施例6
抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体包被磁珠工艺中，封闭液选择PEG20000，其它步骤均与实施例1相同；
试验例1
用实施例1至实施例4所述的GPC-3试剂盒，进行性能测定，具体步骤如下：
1.试验前准备：启动化学发光测定仪，设置好参数，并按照化学发光测定仪使用说明书，将试剂盒中的试剂分别放入仪器中对应的位置；
2.按照仪器使用说明书要求，设置好定标参数，并将校准品放置于仪器中对应位置，进行定标。
3.实施例1至实施例4在仪器上完成定标之后，分别对精密度、灵敏度、准确性(回收率)、稳定性等指标进行测定；
3.1精密度评价方法：测定浓度50-100ng/ml的校准品20次，计算CV值；
3.2灵敏度评价方法：测定0ng/ml的校准品20次，计算均值(M)和标准差(SD)，计算M+2SD浓度即为灵敏度值；
3.3准确度评价方法：用回收率的方法评价，将已知浓度的抗原加到已知浓度的校准品中，计算回收率。
3.4稳定性评价方法：将试剂置于37度保存7天后拿出，与未进行加速试验的试剂进行性能比对；
3.5评价指标标准：精密度CV≤5.0％，准确度在85％-115％之间，稳定性加速后性能指标仍然满足要求。
3.6评价的具体数据见表1至表5.
表1性能评价数据
| 检测项目 | 实施例1 | 实施例2 | 实施例3 | 实施例4 | 实施例5 | 实施例6 |
| 精密度 | 1.7％ | 2.4％ | 1.8％ | 2.1％ | 1.8％ | 2.0％ |
| 灵敏度 | 0.004ng/mL | 0.003ng/mL | 0.004ng/mL | 0.005ng/mL | 0.007ng/mL | 0.008ng/mL |
| 准确度 | 99％ | 102％ | 103％ | 104％ | 95％ | 104％ |
表2稳定性评价数据(实施例1)
表3稳定性评价数据(实施例2)
表4稳定性评价数据(实施例3)
表5稳定性评价数据(实施例4)
表6稳定性评价数据(实施例5)
表7稳定性评价数据(实施例6)
由上述数据可以看出，实施例1至实施例6所制备的试剂盒各项指标均符合要求，且精密度、灵敏度、准确度、稳定性结果均较好，试剂盒性能优良。
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
Claims (10)
1.一种GPC-3抗体包被磁珠的制备方法，其特征在于，包括：
将GPC-3抗体配制为质量浓度为8-12mg/mL的溶液，获得GPC-3抗体溶液；
将粒径为1.5-2.0um与2.0-3.0um的磁性微球按质量比1：3-1：5混合，获得磁珠溶液；
将第一缓冲液与所述磁珠溶液按体积比1：1-1:2混合，获得第一混合溶液；
将所述GPC-3抗体溶液与所述第一混合溶液按体积比1:2-1:3混合，并回旋振荡15-30min，获得第二混合溶液；
将所述活化剂与所述第二混合溶液按体积比1：3-1:4混合，并回旋振荡1-2h，获得第三混合溶液；
将封闭液与所述第三混合溶液按体积比1：4-1:5混合，并回旋振荡15-30min，获得第四混合溶液；
将所述第四混合溶液进行离心处理，离心处理后去除上清液，获得GPC-3抗体包被磁珠。
2.根据权利要求1所述的一种GPC-3抗体包被磁珠的制备方法，其特征在于，所述第一缓冲液包括如下一种：磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、醇醚磺基琥珀酸单酯二钠盐MES缓冲溶液、磷酸盐缓冲液、Tris–盐酸缓冲液，优选地，所述封闭液包括如下至少一种：PEG20000、BSA、酪蛋白。
3.根据权利要求1所述的一种GPC-3抗体包被磁珠的制备方法，其特征在于，所述活化剂为质量浓度5-20mg/mL的碳二亚胺溶液EDAC。
4.根据权利要求1所述的一种GPC-3抗体包被磁珠的制备方法，其特征在于，所述将所述第四混合溶液进行离心处理，离心处理后去除上清液，获得GPC-3抗体包被磁珠，包括：
将所述第四混合溶液在转速为12000-16000rpm条件下离心处理10-30min，离心处理后去除上清液；
用第二缓冲液重悬去除上清液后的第四混合溶液；
重复所述离心处理和所述重悬2-3次，以去除GPC-3抗体包被磁珠中的杂质，获得GPC-3抗体包被磁珠。
5.一种GPC-3抗体包被磁珠，其特征在于，由如权利要求1-4任一项所述的一种GPC-3抗体包被磁珠的制备方法制备得到。
6.一种GPC-3抗体包被磁珠试剂盒，其特征在于，包括如权利要求5所述的一种GPC-3抗体包被磁珠，其中，将所述GPC-3抗体包被磁珠与防凝液混合，以减少磁珠凝集。
7.根据权利要求6所述的一种GPC-3抗体包被磁珠试剂盒，其特征在于，还包括碱性磷酸酶标记GPC-3抗体、化学发光底物溶液和洗涤剂。
8.根据权利要求7所述的一种GPC-3抗体包被磁珠试剂盒，其特征在于，所述碱性磷酸酶标记GPC-3抗体的制备方法如下：
将摩尔浓度为10-100mmol/L的3-吗啉丙磺酸,摩尔浓度为1-5mmol/L的乙二胺四乙酸和pH值为6.5-7.5的缓冲液混合，获得第一稀释液；
将GPC-3抗体通过所述第一稀释液稀释至质量浓度为1-2mg/mL，并加入10-50uL且摩尔浓度为100-500mmol/L的2-MEA，于25-30℃反应30-60min或者于3-5℃反应1-2h后，进行脱盐处理，获得脱盐GPC-3抗体；
将摩尔浓度为10-100mmol/L的3-吗啉丙磺酸,摩尔浓度为1-5mmol/L的乙二胺四乙酸和pH值为7.5-8.5缓冲液混合，获得第二稀释液；
将碱性磷酸酶通过所述第二稀释液稀释至质量浓度为2-5mg/mL，并加入10-30uL且摩尔浓度为100-250mmol/L的SM(PEG)6，于25-30℃反应30-60min或者于3-5℃反应1-2h后，进行脱盐处理，获得脱盐碱性磷酸酶；
将所述脱盐GPC-3抗体和所述脱盐碱性磷酸酶以体积比1:1或者2:1混合，于25-30℃反应30-60min或者于3-5℃反应1-2h，获得碱性磷酸酶标记GPC-3抗体。
9.根据权利要求7所述的一种GPC-3抗体包被磁珠试剂盒，其特征在于，所述化学发光底物溶液的组分如下：
第三缓冲液：摩尔浓度10-100mmol/L，pH值7.0-7.5；
脱脂奶粉：质量浓度1-5g/L；
白蛋白：质量浓度0.5-2.0g/L；
吐温20：质量分数0.1-0.5％；
3-(2'-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3"-磷酰氧基)苯-1,2-二氧杂环丁烷AMPPD：摩尔浓度10-100mmol/L。
10.根据权利要求7所述的一种GPC-3抗体包被磁珠试剂盒，其特征在于，所述洗涤剂的组分如下：
PBS溶液：摩尔浓度0.01-0.05mol/L，pH值7.0-8.0；
吐温20：质量分数0.5-3％。
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