CN112763704A - 用于抗原检测的组合物、制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及免疫检测领域，具体涉及用于抗原检测的组合物、制备方法，公开了用于抗原检测的组合物，利用长链活化剂扩增抗原抗体连接臂长，实现对抗原的高灵敏、高准确性检测。

Description

用于抗原检测的组合物、制备方法
技术领域
本发明涉及免疫检测领域，具体涉及用于抗原检测的组合物、制备方法。
背景技术
化学发光免疫分析是一种将化学发光测定技术和免疫反应相结合的分析技术，因为其同时具有了化学发光检测的高灵敏度和免疫反应的高特异性，所以被广泛应用到各种抗原、半抗原、抗体、激素、酶、脂肪酸、维生素和药物等的检测分析中，是继酶联免疫分析、荧光免疫分析和时间分辨荧光免疫分析之后发展起来的一项最新的免疫测定技术。
目前，化学发光免疫分析中常用的标记物有吖啶酯、碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、鲁米诺和三联嘧啶钌等，其中碱性磷酸酶作为标记出现较早，也是比较成熟的技术平台，有完善的原料工艺系统、成熟的工艺体系和比较容易实现的仪器配套，但碱性磷酸酶在不同的抗原/抗体检测中表现出了不同的效果，明显受到抗原/抗体本身分子量的影响，对于分子量较小的抗原，碱性磷酸酶的使用存在明显的缺陷，会直接导致检测值的异常，所以解决碱性磷酸酶在标记中存在的问题，对于化学发光方法的完善和临床研究的进一步推进有着重大意义。
发明内容
为了克服上述化学发光免疫分析在检测分子量较小的抗原/抗体中存在的碱性磷酸酶标记、结合位点少、干扰因素多等技术问题，利用长链活化剂，改变抗体识别位点的空间距离，从而实现全血中抗原的准确检测。
本发明提供了用于抗原检测的组合物，
包括如下组分：
1)包被抗体2和抗体3的磁微粒复合物：抗体2-磁珠-抗体3；
2)生物素化抗试剂：抗体1-生物素；
3)活化后得的碱性磷酸酶链霉亲和素偶联物：链霉亲和素-碱性磷酸酶-SM(PEG)n。
其中，抗体1-3为结合同种抗原的抗体；
抗体2和抗体3可以为相同序列的抗体，也可以为不同序列的抗体；
抗体1与抗体2序列不相同；
抗体1与抗体3序列不相同；
n为4，8，12或24。
优选地，n＝12
上述抗原抗体偶联物结构中的SM(PEG)n，不仅能在碱性磷酸酶和链霉亲和素偶联的过程中，活化碱性磷酸酶使其与链霉亲和素更好的连接；当存在抗原结合位点较近而不易识别的情况，还能加长碱性磷酸酶与抗原/抗体之间的连接臂长，有效的降低参入免疫反应的抗原与抗体之间由于结合位点较近而带来的位阻影响，此外，由于抗体、碱性磷酸酶为生物大分子，其表面均带有电荷，通过偶联工艺将其连接在一起后，其分子表明电荷相互作用会对两分子的构象、电荷分布带来影响，从而影响了抗体的免疫反应活性、碱性磷酸酶的酶促反应活性，甚至造成聚集。而加长的臂长有效的降低了该影响，并且保持了抗试剂的稳定性。
优选地，所述组合物还包括偶联物稀释液，所述偶联物稀释液包括：包括增强剂，所述增强剂选自葡聚糖(Dextran)、聚乙二醇(PEG)或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。所述偶联物稀释液用于稀释和保存碱性磷酸酶链霉亲和素偶联物。
更优选地，所述增强剂浓度为0.01-5％。
所述增强剂选自高分子物质，利用高分子的疏水相互作用，能有效提高抗原-抗体的免疫反应效率和形成免疫复合物的稳定性，从而达到提高试剂的检测灵敏度的目的。本发明所述增强剂的添加，可以实现免疫增强，从结果上表现为检测信号的明显增强。
优选地，所述偶联物稀释液包括：10-100mM Tris-HCl缓冲液，pH＝7.2-8.0；0.5-1.5％NaCl、0.1-5％BSA、0.05-0.5％Proclin-300、0.01-0.5％Tween-20、0.5-5％甘油、0.01-0.1％酪蛋白、0.01-5％Dextran-40。
本发明所述％为质量百分比。
由于蛋白质等大分子表面所带电荷的属性和多少与所处溶液环境的pH值有紧密关系，而免疫反应是一种非共价作用，受抗原、抗体表面所带电荷影响显著，通常的最佳免疫的反应环境pH＝6.0-8.0，所以本发明所述缓冲液的pH可选6.0-8.0，更优选为7.0-7.8。
本发明的组合物主要用于检测由于结合位点较近，会产生空间位阻效应的蛋白，包括但不限于：cTnI、TSH、CA153、NT-proBNP或PCT。
另一方面，本发明提供了一种检测试剂盒，包含所述组合物。
另一方面，本发明提供了一种制备所述抗原抗体偶联物的方法，包括如下步骤：
1)加入样本、生物素化抗试剂及活化后得的碱性磷酸酶链霉亲和素偶联物进行孵育；
2)加入包被抗体2和抗体3的磁微粒复合物，孵育。
优选地，步骤1)中所述生物素化抗试剂是由生物素∶抗体1＝40∶1-2∶1偶联形成。
优选地，所述活化后得的碱性磷酸酶链霉亲和素偶联物由以下步骤制备：
a)活化碱性磷酸酶，
b)活化链霉亲和素，
d)混合步骤a)和b)中的物质，孵育；
所述步骤a)中活化碱性磷酸酶的物质为SM(PEG)n，n为4，8，12或24；所述步骤b)中活化链霉亲和素的物质选自SPDP、DTT、TCEP或2-IT。
所述第二活化剂用于活化链霉亲和素，且第二活化剂会与上述SM(PEG)n连接，进一步改变抗原与抗体连接的空间位阻。
优选地所述SM(PEG)n和第二活化剂的浓度为1-50mg/mL。
优选地，所述链霉亲和素与碱性磷酸酶的混合比例为：1∶0.8-1∶8；更优选地，所述链霉亲和素与碱性磷酸酶的混合比例为：1∶4.5。
所述“链霉亲和素与碱性磷酸酶的偶联比例”根据预期的效果来投放两种分子的相对比例，所述比例为浓度比。
优选地，步骤2)中所述包被抗体2和抗体3的磁微粒复合物是由以下步骤制备：
a)按磁微粒∶抗体2和/或抗体3＝1∶10-1∶100混合，进行偶联；
b)封闭步骤a)中形成的偶联物，清洗。
上述步骤b)中所述封闭过程需要两种以上封闭剂，所述封闭剂包括PEG20000。
另一方面，本发明提供了一种检测抗原的方法，包括如下步骤：
1)加入样本、生物素化抗试剂及活化后得的碱性磷酸酶链霉亲和素偶联物进行孵育；
2)加入包被抗体2和抗体3的磁微粒复合物，孵育；
3)磁分离，清洗，加入底物，检测读数。
相对于现有技术，本发明具有如下有益效果：
1、用于抗原检测的组合物，各成分相互配合，有效控制碱性磷酸酶偶联物的聚合度，最后达到显著提高试剂盒的检测灵敏度以及准确性的效果。
2、在碱性磷酸酶偶联物的制备过程中使用了SM(PEG)n，当碱性磷酸酶和抗原/抗体及相关蛋白偶联时，可以增加碱性磷酸酶大分子与抗体及相关蛋白的连接臂长，显著改善了检测过程中的位阻问题，提高了试剂盒的检测准确性；
3、在抗体与碱性磷酸酶偶联上采取间接偶联的方式，在抗体和碱磷酶之间加上了生物素-链霉亲和素连接桥，进一步加长抗体-碱性磷酸酶的连接臂长及信号放大，达到更好的降低位阻的效果，并且提高了灵敏度；
3、磁微粒复合物包被过程采用PEG20000作为封闭剂，能够显著降低磁微粒非特异性吸附；
5、稀释液中采用高分子物质作为增强剂，显著提高检测信号，进而提高检测灵敏度。
在所有成分的协同下，本发明中的试剂盒可以实现对全血、血浆、血清中的抗原的高灵敏度检测，结果有良好可重现性。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1：组合物1精密度作图；
图2：本发明与贝克曼检测血浆样本中cTnI相关性；
图3：本发明检测全血样本与贝克曼检测血浆样本中cTnI相关性。
具体实施例
1、制备碱性磷酸酶标记试剂
A、碱性磷酸酶-链霉亲和素偶联物
混合试剂组分：碱性磷酸酶、链霉亲和素、第一活化剂、第二活化剂
在碱性磷酸酶与链霉亲和素偶联过程中使用第一活化剂活化碱性磷酸酶，以第二活化剂活化链霉亲和素；混合碱性磷酸酶和链霉亲和素孵育进行偶联反应，形成碱性磷酸酶-链霉亲和素偶联物。
B、将碱性磷酸酶-链霉亲和素偶联物保存在偶联物稀释液中
所述偶联物稀释液的成分：50mM Tris-HCl缓冲液pH＝7.4；0.9％NaCl、0.5％BSA、0.1％Tween-20、0.09％Proclin-300、1％甘油、0.02％酪蛋白和1％Dextran-40。
最终碱性磷酸酶标记试剂的终浓度为2μg/mL。
2、生物素化抗试剂的制备
A：制备生物素抗试剂
在100mM的碳酸盐溶液中将cTnI抗体1脱盐并浓缩至终浓度为2mg/ml；生物素用DMSO溶解，按照10∶1比例将生物素加入第一心肌肌钙蛋白I抗体中，37℃偶联2小时，用脱盐柱去除未偶联的生物素，得到生物素抗试剂；
B：稀释生物素化抗试剂
在生物素抗试剂中加入成分如下的抗试剂稀释液：50mM This-HCl缓冲液，pH＝7.4；0.9％NaCl，0.5％BSA，0.09％Proclin-300，0.1％Tween-20，1％甘油，使其最终浓度为1μg/mL。
3、磁微粒复合物的制备
将羧基磁珠用EDC活化后清洗四次；将抗体以TCEP活化后、超滤管浓缩后更换为PBS缓冲液中；将羧基磁珠与抗体以1∶50的质量比混合偶联4小时，偶联结束后以BSA、PEG20000作封闭剂，封闭2小时后进行磁分离清洗，即得到磁微粒复合物，加入如下成分的复合物稀释液：20mM PBS、pH＝6.0、0.9％NaCl、0.5％BSA、0.09％Proclin-300、0.1％Tween-20和2％蔗糖，最终磁微粒复合物浓度为1mg/ml。
所述抗体为第二、第三cTnI抗体，通过偶联包被在磁珠的表面，所述两株抗体分别结合cTnI的不同位点。
4、eTnI化学发光检测试剂盒
试剂盒包括实施例1、2、3中的碱性磷酸酶标记试剂、生物素化抗试剂和磁微粒复合物。
A：灵敏度分析
1、操作步骤：
a、加入50μl样本、50μl样本稀释液、60μl生物素化抗试剂、60μl碱性磷酸酶标记试剂，37℃孵育5min；
b、30μl加入磁微粒复合物，37℃孵育5min；
c、清洗磁分离后，加入底物，检测读数。
其中采用的样本稀释液为：0.1％NH4Cl，0.05％Tween-20，0.1％NaN3，0.05％肝素钠，50mM Tris-HCl缓冲液，PH＝7.4；2％NaCl，3％BSA；采用的清洗液为：0.1％KCl，0.05％Tween-20，0.1％NaN3，0.05％肝素钠。
B：精密度分析
选取5个样本，每个样本每次两个重复，每天测两次，共测试20天，每个样本测得80个数据，5个样本共400个数据，对数据进行统计。
实施例1第一活化剂对检测结果的影响
试剂组分：3mg/mL碱性磷酸酶、0.66mg/mL链霉亲和素、30mg/mL第一活化剂、6.6mg/mL的SDPD。
试剂组分1中第一活化剂为SM(PEG)4；
试剂组分2中第一活化剂为SM(PEG)8；
试剂组分3中第一活化剂为SM(PEG)12；
试剂组分4中第一活化剂为SM(PEG)24；
试剂组分5中第一活化剂为SMCC；
试剂组分6中不添加第一活化剂。
本实施例中具体操作：链霉亲和素与碱性磷酸酶偶联的比例为：1∶4.5，第一活化剂与偶联物的比例为：10∶1。
3mg/mL的碱性磷酸酶与30mg/mL的第一活化剂混合，活化碱性磷酸酶，0.66mg/mL的链霉亲和素与6.6mg/mL的SDPD混合，活化链霉亲和素，(试剂组分6中不添加第一活化剂，在链霉亲和素活化后直接添加碱性磷酸酶)接着将活化后的链霉亲和素与活化后的碱性磷酸酶混合，制备碱性磷酸酶-链霉亲和素偶联物。
实验结果
试剂组分1应用到化学发光试剂盒中的效果
表1、低值样本精密度测试数据
Figure BDA0002920690300000081
Figure BDA0002920690300000091
上表所测样本，每个样本每次两个重复，每天测两次，共测试20天，每个样本测得80个数据，5个样本共400个数据，对数据进行统计得到结果见表1，根据表1的浓度及总精密度作图见图1，根据图1的方程计算对应精密度的浓度值。对结果显示，本技术方案达成的检测效果能够满足精密度20％对应浓度值为0.015ng/mL，精密度10％对应浓度值为0.028ng/mL，检测灵敏度较高。
表2全血及对应血浆样本精密度数据
Figure BDA0002920690300000092
Figure BDA0002920690300000101
从以上数据可以看出，采用本发明中的试剂盒检测全血的结果有良好的可靠性，平均精密度为3.9％，不受血细胞非特异性干扰。
利用同样的方法，验证试剂组分2-5的效果
结果表明：
试剂组分2：y＝0.0031x-1.001，R2＝0.994，精密度20％对应浓度值为0.016ng/mL，精密度10％对应浓度值为0.031ng/mL，检测灵敏度较高，平均精密度为4.2％。
试剂组分3：y＝0.0021x-1.076，R2＝0.997，精密度20％对应浓度值为0.014ng/mL，精密度10％对应浓度值为0.028ng/mL，检测灵敏度较高，平均精密度为3.1％。
试剂组分4：y＝0.0034x-0.99，R2＝0.9951，精密度20％对应浓度值为0.016ng/mL，精密度10％对应浓度值为0.033ng/mL，检测灵敏度较高，平均精密度为4.8％。
试剂组分5：y＝0.0034x-1.35，R2＝0.9849，精密度20％对应浓度值为0.05ng/mL，精密度10％对应浓度值为0.08ng/mL，低值区精密度不理想，灵敏度较差；平均精密度为13.3％，检测全血的结果的可靠性较差，受血细胞非特异性干扰明显。
试剂组分6：几乎不能检测到信号，主要是因为未添加第一活化剂，碱性磷酸酶未与链霉亲和素发生偶联反应，不能形成免疫发光复合物。
综上，第一活化剂对检测结果有明显影响，其中SM(PEG)n，n＝4、8、12、24，活化的碱性磷酸酶应用到试剂盒中，检测效果良好，且SM(PEG)12，效果最好，选择其进行后续试验。
实施例2第二活化剂对检测结果的影响
试剂组分：3mg/mL碱性磷酸酶、0.66mg/mL链霉亲和素、30mg/mL SM(PEG)12、6.6mg/mL的第二活化试剂。
试剂组分7中第二活化剂为DTT；
试剂组分8中第二活化剂为TCEP；
试剂组分9中第二活化剂为2-IT；
试剂组分10中不添加第二活化剂。
本实施例中具体操作为3mg/mL的碱性磷酸酶与30mg/mL的SM(PEG)12混合，活化碱性磷酸酶，0.66mg/mL的链霉亲和素与6.6mg/mL的第二活化剂混合，活化链霉亲和素，(试剂组分10中不添加第二活化剂，在碱性磷酸酶活化后直接添加链霉亲和素)接着将活化后的链霉亲和素与活化后的碱性磷酸酶混合，制备碱性磷酸酶-链霉亲和素偶联物。
结果如下：
试剂组分7：y＝0.0033x-1.007，R2＝0.988，精密度20％对应浓度值为0.017ng/mL，精密度10％对应浓度值为0.034ng/mL，检测灵敏度较高，平均精密度为4.8％。
试剂组分8：y＝0.0027x-1.042，R2＝0.987，精密度20％对应浓度值为0.016ng/mL，精密度10％对应浓度值为0.031ng/mL，检测灵敏度较高，平均精密度为4.6％。
试剂组分9：y＝0.003x-1.026，R2＝0.996，精密度20％对应浓度值为0.017ng/mL，精密度10％对应浓度值为0.033ng/mL，检测灵敏度较高，平均精密度为5.0％。
试剂组分10：y＝0.0129x-1.346，R2＝0.975，精密度20％对应浓度值为0.13ng/mL，精密度10％对应浓度值为0.22ng/mL，低值区精密度不理想，灵敏度较差，主要是未活化的链霉亲和素和碱性磷酸酶结合效率较低，所以检测灵敏度明显下降。
结果表明，第二活化剂可以更换使用，只要达到活化链霉亲和素的效果即可。
实施例3生物素化抗试剂的影响
生物素化抗试剂配方：生物素、抗体、50mM This-HCl缓冲液，pH＝7.4；0.9％NaCl，0.5％BSA，0.09％Proclin-300，0.1％Tween-20，1％甘油。
本实施例活化的碱性磷酸酶标记试剂选择实施例1中试剂组分3的配方制备。
其中抗试剂1-6，生物素∶cTnI抗体＝80∶1∶40∶1、20∶1、10∶1、5∶1、1∶1。
生物素偶联物的制备方法同前述，只需要将生物素和抗体的配比做调整。
抗试剂1：y＝0.0032x-1.012，R2＝0.989，精密度20％对应浓度值为0.016ng/mL，精密度10％对应浓度值为0.033ng/mL，检测灵敏度较高，平均精密度为4.6％。
抗试剂2：y＝0.003x-1.011，R2＝0.988，精密度20％对应浓度值为0.015ng/mL，精密度10％对应浓度值为0.034ng/mL，检测灵敏度较高，平均精密度为4.3％。
抗试剂3：y＝0.0028x-1.022，R2＝0.996，精密度20％对应浓度值为0.015ng/mL，精密度10％对应浓度值为0.03ng/mL，检测灵敏度较高，平均精密度为3.8％。
抗试剂4：y＝0.0021x-1.076，R2＝0.997，精密度20％对应浓度值为0.014ng/mL，精密度10％对应浓度值为0.028ng/mL，检测灵敏度较高，平均精密度为3.1％。
抗试剂5：y＝0.0033x-1.016，R2＝0.993，精密度20％对应浓度值为0.018ng/mL，精密度10％对应浓度值为0.033ng/mL，检测灵敏度较高，平均精密度为4.2％。
抗试剂6：y＝0.0034x-1.27，R2＝0.9849，精密度20％对应浓度值为0.04ng/mL，精密度10％对应浓度值为0.07ng/mL，低值区精密度不理想，灵敏度降低；平均精密度9.8％
结果显示，当生物素∶cTnI抗体＝40∶1-5∶1时效果均比较好，1；1时灵敏度和精密度下降。
实施例5稀释液影响
本实施例活化的碱性磷酸酶标记试剂选择实施例1中的试剂组分3的配方制备，制备方法同上述制备例，验证偶联物稀释液中增强剂的影响。
偶联物稀释液的配方：50mM Tris-HCl缓冲液pH＝7.4；0.9％NaCl、0.5％BSA、0.1％Tween-20、0.09％Proclin-300、1％甘油、0.02％酪蛋白和增强剂。
配方1-3：增强剂分别为1％的葡聚糖(Dextran)、聚乙二醇(PEG)或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。
配方4-8：增强剂分别为0.01％、0.1％、0.5％、5％、10％的Dextran-40
配方9：不添加任何增强剂。
结果如下：
配方1：y＝0.0028x-1.022，R2＝0.996，精密度20％对应浓度值为0.015ng/mL，精密度10％对应浓度值为0.03ng/mL，检测灵敏度较高，检测0.1ng/mL样本时，发光信号值26160RLU。
配方2：y＝0.0029x-1.021，R2＝0.995，精密度20％对应浓度值为0.016ng/mL，精密度10％对应浓度值为0.03ng/mL，检测灵敏度较高，检测0.1ng/mL样本时，发光信号值25392RLU。
配方3：y＝0.0028x-1.017，R2＝0.996，精密度20％对应浓度值为0.015ng/mL，精密度10％对应浓度值为0.03ng/mL，检测灵敏度较高，检测0.1ng/mL样本时，发光信号值25921RLU。
配方4：y＝0.0034x-1.16，R2＝0.983，精密度20％对应浓度值为0.03ng/mL，精密度10％对应浓度值为0.054ng/mL，检测灵敏度尚可；检测0.1ng/mL样本时，发光信号值9302RLU。
配方5：y＝0.0032x-1.14，R2＝0.985，精密度20％对应浓度值为0.026ng/mL，精密度10％对应浓度值为0.049ng/mL，检测灵敏度较好；检测0.1ng/mL样本时，发光信号值12962RLU。
配方6：y＝0.003x-1.022，R2＝0.992，精密度20％对应浓度值为0.016ng/mL，精密度10％对应浓度值为0.032ng/mL，检测灵敏度较高，检测0.1ng/mL样本时，发光信号值18753RLU
配方7：y＝0.0027x-1.021，R2＝0.997，精密度20％对应浓度值为0.015ng/mL，精密度10％对应浓度值为0.029ng/mL，检测灵敏度较高，检测0.1ng/mL样本时，发光信号值27835RLU。
配方8：y＝0.0028x-1.02，R2＝0.997，精密度20％对应浓度值为0.015ng/mL，精密度10％对应浓度值为0.027ng/mL，检测灵敏度较高，检测0.1ng/mL样本时，发光信号值28811RLU。
配方9：y＝0.0032x-1.19，R2＝0.984，精密度20％对应浓度值为0.031ng/mL，精密度10％对应浓度值为0.055ng/mL，检测灵敏度尚可，检测0.1ng/mL样本时，发光信号值8595RLU。
结果显示：三种增强剂效果相当，可以替换使用，都能显著提高发光信号，从而提高检测灵敏度，其中在0.01％、0.1％、0.5％、5％，随着增强剂的添加，信号会明显增加，但到从5％-10％，变化不明显，所以，配方中没有必要添加更过量的增强剂。
实施例6试剂盒相关性研究
将本发明化学发光试剂盒与市售贝克曼试剂盒进行血浆检测结果对比
因为目前市售试剂盒尚不能直接检测全血，所以本实施例利用本发明试剂盒检测全血样本中的cTnI和血浆中的cTnI与市售试剂盒(购自贝克曼库尔特公司的cTnI检测试剂盒)直接检测血浆cTnI比较，检测结果如图2和图3所示，结果表明本发明检测血浆样本和贝克曼的相关性能达到0.99，而本发明检测全血样本和贝克曼检测血浆的相关性能也达到0.99，说明本发明不仅可以在检测全血的时候达到和进口试剂相同的优良效果，还能检测进口试剂无法实现的全血检测，这主要也是因为利用了本发明的活化剂和生物素-亲和素系统配合放大信号的同时，还利用各种稀释液相互配合排除了全血中各种干扰，达到检测全血的目的。
实施例7更换检测抗原
A：检测样本中的CA153含量
将上述cTnI更换为CA153，抗cTnI抗体，全部替换为相应的抗CA153抗体，其余操作与上述制备例相同。
利用实施例1中的试剂组分3检测结果如下：y＝0.031x-1.005，R2＝0.991，精密度20％对应浓度值为0.16U/mL，精密度10％对应浓度值为0.32U/mL，检测灵敏度较高，平均精密度为4.0％。
B：检测样本中TSH(促甲状腺激素)含量
将上述cTnI更换为TSH，抗cTnI抗体，全部替换为相应的抗TSH抗体，其余操作与上述制备例相同。
利用实施例1中试剂组分3检测结果如下：y＝0.0027x-1.024，R2＝0.997，精密度20％对应浓度值为0.015mIU/L，精密度10％对应浓度值为0.029mIU/L，检测灵敏度较高，平均精密度4.1％。
C：检测样本中NT-proBNP(氨基末端脑钠肽前体)
将上述cTnI更换为NT-proBNP，抗NT-proBNP抗体，全部替换为相应的抗NT-proBNP抗体，其余操作与上述制备例相同。
利用实施例1中试剂组分3检测结果如下：y＝0.0009x-1.053，R2＝0.988，精密度20％对应浓度值为0.006ng/mL，精密度10％对应浓度值为0.011ng/mL，检测灵敏度较高，平均精密度2.5％。
D：检测样本中PCT(降钙素原)
将上述cTnI更换为PCT，抗cTnI抗体，全部替换为相应的抗PCT抗体，其余操作与上述制备例相同。
利用实施例1中试剂组分3检测结果如下：y＝0.0029x-1.041，R2＝0.992，精密度20％对应浓度值为0.017ng/mL，精密度10％对应浓度值为0.033ng/mL，检测灵敏度较高，平均精密度4.4％
E：检测样本中β-HCG(人绒毛膜促性腺激素β亚单位)
将上述cTnI更换为β-HCG，抗cTnI抗体，全部替换为相应的抗β-HCG抗体，其余操作与上述制备例相同。
利用实施例1中试剂组分3检测结果如下：y＝0.029x-1.012，R2＝0.995，精密度20％对应浓度值为0.15mIU/mL，精密度10％对应浓度值为0.3mIU/mL，检测灵敏度较高，平均精密度4.3％
结果表明，本发明的化学发光检测试剂盒可以应用于多种抗原的检测，且检测效果均较好。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (10)

1.用于抗原检测的组合物，其特征在于，包括如下组分：
1)包被抗体2和抗体3的磁微粒复合物：抗体2-磁珠-抗体3；
2)生物素化抗试剂：抗体1-生物素；
3)活化后得的碱性磷酸酶链霉亲和素偶联物：链霉亲和素-碱性磷酸酶-SM(PEG)n；
其中，抗体1-3为结合同种抗原的抗体；
抗体2和抗体3可以为相同序列的抗体，也可以为不同序列的抗体；
抗体1与抗体2序列不相同；
抗体1与抗体3序列不相同；
n为4，8，12或24。
2.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包括偶联物稀释液，所述偶联物稀释液包括：包括增强剂，所述增强剂选自葡聚糖(Dextran)、聚乙二醇(PEG)或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。
3.如权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述增强剂为浓度为0.01-5％。
4.如权利要求2或3所述的组合物，其特征在于，所述偶联物稀释液包括：10-100mMTris-HCl缓冲液，pH＝7.2-8；0.5-1.5％NaCl、0.1-5％BSA、0.05-0.5％Proclin-300、0.01-0.5％Tween-20、0.5-5％甘油、0.01-0.1％酪蛋白、0.01-5％Dextran-40。
5.一种检测试剂盒，其特征在于，包含权利要求1-4任意一项所述的组合物。
6.一种制备权利要求1所述抗原抗体偶联物的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)加入样本、生物素化抗试剂及活化后得的碱性磷酸酶链霉亲和素偶联物进行孵育；
2)加入包被抗体2和抗体3的磁微粒复合物，孵育。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤1)中所述生物素化抗试剂是由生物素∶抗体1＝40∶1-2∶1偶联形成。
8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述活化后得的碱性磷酸酶链霉亲和素偶联物由以下步骤制备：
a)活化碱性磷酸酶，
b)活化链霉亲和素，
d)混合步骤a)和b)中的物质，孵育；
所述步骤a)中活化碱性磷酸酶的物质为SM(PEG)n，n为4，8，12或24；所述步骤b)中活化链霉亲和素的物质选自SPDP、DTT、TCEP或2-IT。
9.如权利要求6-8任意一项所述的方法，其特征在于，步骤2)中所述包被抗体2和抗体3的磁微粒复合物是由以下步骤制备：
a)磁微粒∶抗体2和/或抗体3＝1∶10-1∶100混合；
b)封闭步骤a)中形成的混合物，清洗。
上述步骤b)中所述封闭过程需要两种以上封闭剂，所述封闭剂包括PEG20000。
10.一种检测抗原的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)加入样本、生物素化抗试剂及活化后得的碱性磷酸酶链霉亲和素偶联物进行孵育；
2)加入包被抗体2和抗体3的磁微粒复合物，孵育；
3)磁分离，清洗，加入底物，检测读数。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115144582A (zh) * 2022-05-25 2022-10-04 江苏硕世生物科技股份有限公司 一种用于检测循环肿瘤细胞的免疫组合物

Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE4413545A1 (de) * 1994-04-19 1995-10-26 Nycomed Arzneimittel Gmbh Elisa zur Bestimmung des KC - Genprodukt
CN103743722A (zh) * 2014-01-02 2014-04-23 东南大学 一种基于纳米颗粒和化学发光的核酸适体传感器及制备方法和应用
CN107918022A (zh) * 2017-11-17 2018-04-17 南通伊仕生物技术股份有限公司 一种cTnI检测试剂盒及其使用方法
CN109596835A (zh) * 2018-11-23 2019-04-09 深圳天辰医疗科技有限公司 一种检测试剂盒及其制备方法和肌钙蛋白t的检测方法
CN109781986A (zh) * 2019-03-11 2019-05-21 复旦大学附属妇产科医院 一种磁微粒化学发光免疫检测CA125表面Tn抗原的试剂盒及其制备方法
CN110672844A (zh) * 2019-10-29 2020-01-10 华中科技大学 一种新城疫病毒抗体磁免疫化学发光检测试剂盒及其应用
CN110873711A (zh) * 2018-09-04 2020-03-10 华瑞同康生物技术（深圳）有限公司 一种基于全自动化学发光分析仪的血清tk1检测试剂盒
CN111381034A (zh) * 2020-03-03 2020-07-07 武汉生之源生物科技股份有限公司 一种gpc-3抗体包被磁珠及其制备方法、试剂盒
CN112067826A (zh) * 2020-09-15 2020-12-11 济南国科医工科技发展有限公司 基于高比活力碱性磷酸酶构建的NT-proBNP检测试剂盒及其应用

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE4413545A1 (de) * 1994-04-19 1995-10-26 Nycomed Arzneimittel Gmbh Elisa zur Bestimmung des KC - Genprodukt
CN103743722A (zh) * 2014-01-02 2014-04-23 东南大学 一种基于纳米颗粒和化学发光的核酸适体传感器及制备方法和应用
CN107918022A (zh) * 2017-11-17 2018-04-17 南通伊仕生物技术股份有限公司 一种cTnI检测试剂盒及其使用方法
CN110873711A (zh) * 2018-09-04 2020-03-10 华瑞同康生物技术（深圳）有限公司 一种基于全自动化学发光分析仪的血清tk1检测试剂盒
CN109596835A (zh) * 2018-11-23 2019-04-09 深圳天辰医疗科技有限公司 一种检测试剂盒及其制备方法和肌钙蛋白t的检测方法
CN109781986A (zh) * 2019-03-11 2019-05-21 复旦大学附属妇产科医院 一种磁微粒化学发光免疫检测CA125表面Tn抗原的试剂盒及其制备方法
CN110672844A (zh) * 2019-10-29 2020-01-10 华中科技大学 一种新城疫病毒抗体磁免疫化学发光检测试剂盒及其应用
CN111381034A (zh) * 2020-03-03 2020-07-07 武汉生之源生物科技股份有限公司 一种gpc-3抗体包被磁珠及其制备方法、试剂盒
CN112067826A (zh) * 2020-09-15 2020-12-11 济南国科医工科技发展有限公司 基于高比活力碱性磷酸酶构建的NT-proBNP检测试剂盒及其应用

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115144582A (zh) * 2022-05-25 2022-10-04 江苏硕世生物科技股份有限公司 一种用于检测循环肿瘤细胞的免疫组合物
CN115144582B (zh) * 2022-05-25 2023-11-07 江苏硕世生物科技股份有限公司 一种用于检测循环肿瘤细胞的免疫组合物

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