CN112067826A - 基于高比活力碱性磷酸酶构建的NT-proBNP检测试剂盒及其应用 - Google Patents

基于高比活力碱性磷酸酶构建的NT-proBNP检测试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于高比活力碱性磷酸酶构建的NT‑proBNP检测试剂盒及其应用，属于免疫化学检测技术领域。本发明对酶‑抗体以及磁珠‑抗体的连接方法进行了优化，大大降低了酶和磁珠对抗原‑抗体之间结合的影响，极大提高了检测灵敏度；同时采用比活力更高的碱性磷酸酶CmAP代替现有商品化的碱性磷酸酶BIAP，使检测的灵敏度得到进一步的提高。为心力衰竭的早期诊断和治疗提供更及时、可靠的信息。

Description

基于高比活力碱性磷酸酶构建的NT-proBNP检测试剂盒及其 应用
技术领域
本发明涉及免疫化学检测技术领域，具体涉及一种基于高比活力碱性磷酸酶构建的NT-proBNP检测试剂盒及其应用。
背景技术
心力衰竭是当前一种复杂的症候群，是冠心病病情发生和发展的最终结果，临床表现是呼吸困难，水肿和无力而致体力活动受限等，预后较差，其死亡率较高。据国内相关调查，心力衰竭住院率虽然相对不高，只为同期心血管疾病的20％，但是死亡率却为40％，并且患者的预后较差。因此，早期诊断及时治疗对改善心力衰竭患者的预后具有重要意义。B型钠尿肽(BNP)在心室容积扩张和压力负荷增加时升高，能敏感而特异地反映左心功能的变化。在血浆中N氨基末端脑钠肽前体(NT-proBNP)分子与BNP分子以1：1的比例存在于血循环中，其比BNP更稳定，可以此反映心室功能的变化。
目前世界上针对NT-proBNP的主流检测方法为化学发光免疫分析法(CLIA)。将碱性磷酸酶(ALP)或吖啶酯结合的单克隆抗NT-proBNP检测抗体，连同含缓冲液的表面活性剂和样本，加入到反应容器中。在短时间孵育后，加入包被有NT-proBNP检测抗体的磁性微粒(MPs)。NT-proBNP抗原在固相上与NT-proBNP抗体结合，同时ALP或吖啶酯标记的NT-proBNP检测抗体和NT-proBNP抗原分子上不同抗原位点反应。在反应管内孵育完成后，结合在固相上的物质将置于一个磁场内被吸住，而未结合的物质被冲洗除去。然后，将化学发光底物AMPPD(针对ALP标记)或H2O2(针对吖啶酯标记)添加到反应管中，由化学发光检测仪对反应中产生的光进行测量。发光量与样本中NT-proBNP的浓度成正比。样本内分析物的量由多点校准曲线来确定。
基于ALP-AMPPD(ALP是碱性磷酸酶的缩写，AMPPD是1,2-二氧环乙烷衍生物，是一种超灵敏的ALP发光底物)的检测体系是当前应用最为广泛的化学发光免疫分析方法之一，具有灵敏度高、操作简单、发光时间长等优势。其检测灵敏度的高低主要取决于以下几个因素：(1)化学发光检测仪灵敏度的高低；(2)抗原和抗体的特异性结合能力的强弱，可以筛选针对某些特定抗原表位的高特异性单克隆抗体；(3)酶标抗体中ALP比活力的高低。酶的比活力越高，催化相同底物反应生成发光产物需要的酶分子数越少，相应可检测的抗原量就越低。
专利CN107656071A公开了一种NT-proBNP检测试剂盒，其利用Sulfo-SMCC活化碱性磷酸酶，Traut′s试剂修饰NT-proBNP抗体，使NT-proBNP抗体上带有能够与活化的碱性磷酸酶相结合的巯基，通过巯基与氨基的结合，实现抗体与酶的偶联；通过采用NHS和EDC活化磁珠，提高了NT-proBNP抗体与磁珠的偶联效率；通过碱性磷酸酶标记的NT-proBNP抗体和NT-proBNP抗体标记的磁珠与待测样本中的NT-proBNP抗原的不同表位结合，然后加入与酶促化学发光底物，利用对发光强度的检测，实现对待测样本中的NT-proBNP含量的准确测定。但该方法利用Traut′s试剂与抗体表面氨基反应生成巯基，抗体表面的氨基可能在Fab端，这样带来的负面影响是酶与抗体可变区连接，影响抗体和抗原之间的结合，降低了与抗原结合的效率，进而降低了检测的灵敏度。
发明内容
针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种基于高比活力碱性磷酸酶构建的NT-proBNP检测试剂盒及其应用。本发明对酶-抗体以及磁珠-抗体的连接方法进行了优化，大大降低了酶和磁珠对抗原-抗体之间结合的影响，极大提高了检测灵敏度；同时采用比活力更高的碱性磷酸酶CmAP代替现有商品化的碱性磷酸酶BIAP，使检测的灵敏度得到进一步的提高。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面，提供一种NT-proBNP检测试剂盒，包括：碱性磷酸酶标记的NT-proBNP检测抗体和磁珠包被的NT-proBNP包被抗体；
所述碱性磷酸酶标记的NT-proBNP检测抗体由如下方法制备而成：
将NT-proBNP检测抗体与高碘酸钠(NaIO4)反应，使抗体Fc端上的糖链氧化生成醛基，得到第一产物；
将第一产物用过量的半胱氨酸盐酸盐与氰基硼氢化钠(NaBH3CN)处理，使醛基与半胱氨酸盐酸盐发生醛胺缩合反应，抗体Fc端生成有活性的巯基；
将碱性磷酸酶用琥珀酰亚胺-4-(N-马来酰亚胺)环已烷-1-1羟酸酯(SMCC)处理，暴露出有活性的马来酰胺基团；然后与Fc端生成有活性巯基的NT-proBNP检测抗体混合，使巯基与马来酰胺反应生成稳定的硫醚键；再用NEM溶液封闭反应，除盐，制备得到碱性磷酸酶标记的NT-proBNP检测抗体；
所述磁珠包被的NT-proBNP包被抗体由如下方法制备而成：
将NT-proBNP包被抗体与高碘酸钠(NaIO4)反应，使抗体Fc端上的糖链氧化生成醛基，得到第二产物；
将第二产物与生物素-LC-酰肼试剂反应，酰肼基团与醛基反应生成稳定的腙键，使抗体的Fc端修饰上生物素；
将链霉亲和素修饰的磁珠与Fc端修饰有生物素的NT-proBNP包被抗体混合，生物素与链霉亲和素反应生成稳定的共价键，即制备得到磁珠包被的NT-proBNP包被抗体。
优选的，NT-proBNP检测抗体与高碘酸钠反应具体为：将NT-proBNP检测抗体溶于buffer 1中，加入初始浓度为200mM的高碘酸钠溶液，4-6℃反应1h；
所述NT-proBNP检测抗体与高碘酸钠溶液加入量的比为5mg：(100-120)μL；
所述buffer 1为pH8.0的0.1M TEA缓冲液，含0.16M NaCl。
优选的，所述醛胺缩合反应具体为：向第一产物中加入初始浓度为0.75M的半胱氨酸盐酸盐和0.3M的氰基硼氢化钠，室温反应过夜。
优选的，碱性磷酸酶用SMCC处理具体为：将碱性磷酸酶溶于buffer 3中，加入初始浓度为3.7mg/mL的SMCC溶液，室温反应30min；
所述buffer 3为pH7.0的0.1M磷酸盐缓冲液，含0.1M NaCl、1mM MgCl2、0.1mMZnCl2。
优选的，所述碱性磷酸酶为高比活力碱性磷酸酶CmAP，所述碱性磷酸酶CmAP是由保藏编号为CGMCC NO.18926的工程菌表达得到，碱性磷酸酶CmAP的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示；记载在专利CN202010530428.2中。
优选的，第二产物与生物素-LC-酰肼试剂反应具体为：向第二产物中加入初始浓度为50mM的生物素-LC-酰肼试剂，室温反应2h。
进一步的，所述NT-proBNP检测试剂盒还包括：底物、反应液和清洗液；
所述底物为AMPPD；所述反应液为pH＝10.3的4M DEA缓冲液，含20mM MgCl2；所述清洗液为pH＝7.4的0.1M磷酸盐缓冲液，含0.1％(w/v)BSA、0.05％(w/v)NaN3、0.1％(v/v)Proclin和0.05％(v/v)Tween-20。
本发明的反应液能够提供稳定的酶最适pH，以及酶的激活剂；清洗液主要成分是表面活性剂，添加后有利于磁珠聚集，便于清洗，如不添加表面活性剂，则清洗离心后磁珠分散，与清洗液分离不彻底，严重的有可能损失磁珠，影响结果。
本发明的第二方面，提供一种检测NT-proBNP的方法，利用上述NT-proBNP检测试剂盒进行检测，包括以下步骤：
将系列已知浓度的含NT-proBNP的血清标准品分别加入96孔板中，加入碱性磷酸酶标记的NT-proBNP检测抗体和磁珠包被的NT-proBNP包被抗体，混合均匀，于37℃孵育30min；
孵育后进行离心，离心后将强磁铁置于96孔板底部，吸走上清液，沉淀用清洗液清洗；用反应液重悬后加入底物，37℃反应10min后用化学发光酶标仪测试其发光值，建立NT-proBNP浓度与发光值的工作曲线，利用建立的工作曲线对待测样品的NT-proBNP浓度进行检测。
优选的，所述化学发光酶标仪测试的条件为：混匀时间10s，温度37℃，整合时间1000ms，延迟时间100ms，测试次数10次。
本发明的有益效果：
(1)本发明对酶-抗体以及磁珠-抗体的连接方法进行了优化，本发明利用NT-proBNP抗体的Fc端有一保守糖链的这一特点，首先通过与高碘酸钠反应，使Fc端的糖链氧化生成醛基，再通过醛胺缩合反应在Fc端制造活性巯基，与SMCC处理后的碱性磷酸酶相连，使得碱性磷酸酶能够特异性的结合抗体的Fc端，提高了抗体Fab端的利用率。
与酶标抗体类似，本发明同样利用NT-proBNP包被抗体的Fc端有一保守糖链的这一特点，利用生物素-LC-酰肼与糖链氧化后生成的醛基反应生成稳定的腙键，再通过另一端的生物素与链霉亲和素磁珠反应相连，同样不影响抗体本身性质。
本发明通过对酶-抗体以及磁珠-抗体的连接方法的优化，大大降低了酶和磁珠对抗原-抗体之间结合的影响，极大提高检测灵敏度。
(2)本发明用比活力更高的CmAP替代传统商品化高比活力BIAP，使测试体系灵敏度进一步提高。
附图说明
图1：为酶标抗体前后电泳图。从左到右依次为：M：Marker，1：CmAP，2：CmAP标记后的NT-proBNP检测抗体，3：NT-proBNP检测抗体。
图2：本发明检测NT-proBNP的原理图。
图3：NT-proBNP浓度-发光值Logistic拟合。
图4：本发明试剂盒与罗氏NT-proBNP试剂盒相关性拟合。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
正如背景技术部分所介绍的，化学发光酶免疫分析(CLEIA)具有灵敏度高，发光时间长的优势，是最常用的诊断方法之一。CLEIA体系主要由酶标抗体和磁珠包被抗体两个部分组成，酶标抗体通常要在抗体上引入巯基，比较常用的巯基化试剂是Traut’s试剂，Traut’s试剂与抗体表面的伯氨基反应，生成巯基，抗体表面的伯氨基随机发生反应。而磁珠包被抗体也存在类似问题，通常要在抗体表面进行生物素或FITC修饰，这些反应都是发生在抗体表面伯胺上的。这样可能会导致抗体的抗原结合部位被酶或磁珠占据，使抗原-抗体的结合受到影响，从而降低检测灵敏度。
基于此，本发明对酶-抗体以及磁珠-抗体的连接方法进行了优化，在本发明的一种实施方案中，给出了碱性磷酸酶标记抗体的方法，包括以下步骤：
(1)将NT-proBNP检测抗体与高碘酸钠(NaIO4)反应，使抗体Fc端上的糖链氧化生成醛基。
(2)将步骤(1)中的产物用过量的半胱氨酸盐酸盐与氰基硼氢化钠(NaBH3CN)处理，使醛基与半胱氨酸盐酸盐发生醛胺缩合反应，使检测抗体Fc端生成有活性的巯基。
(3)将碱性磷酸酶用琥珀酰亚胺-4-(N-马来酰亚胺)环已烷-1-1羟酸酯(SMCC)处理，其中SMCC上的NHS活性酯与酶分子表面的伯胺反应，暴露出有活性的马来酰胺基团。
(4)将步骤(3)中的产物与步骤(2)中的产物混合，巯基与马来酰胺反应生成稳定的硫醚键。
(5)步骤(4)生成的产物用N-乙基顺丁烯二酰亚胺(NEM)反应掉多余巯基后除盐，用保存液重悬后即酶标抗体。
在本发明的又一种实施方案中，给出了磁珠包被抗体的方法，包括以下步骤：
(1)NT-proBNP包被抗体与高碘酸钠(NaIO4)反应，使抗体Fc端的糖链氧化生成醛基。
(2)将步骤(1)中的产物与生物素-LC-酰肼试剂反应，酰肼基团与醛基反应生成稳定的腙键，使抗体的Fc端修饰上生物素。
(3)将步骤(2)中生物素化后的包被抗体与链霉亲和素磁珠按比例混合，生物素与链霉亲和素反应生成稳定的共价键。
(4)步骤(3)生成的产物经超滤浓缩，再用保存液重悬后即磁珠包被抗体。
本发明的对酶-抗体以及磁珠-抗体的连接方法具有如下优点：
本发明能够将碱性磷酸酶和磁珠分别特异的连接在抗体的Fc端，同时也避免了碱性磷酸酶与磁珠非特异性结合在抗体的Fab端，显著提高了抗体Fab端的利用率，进而提高了NT-proBNP检测的灵敏度。
为进一步提高检测的灵敏度，本发明选择CmAP作为标记酶。所述碱性磷酸酶CmAP是由保藏编号为CGMCC NO.18926的工程菌表达得到，碱性磷酸酶CmAP的氨基酸序列如SEQID NO.1所示；其记载在专利CN202010530428.2中。CmAP的比活力是商品化BIAP的1.5倍左右，不但比活力高，而且稳定性好，用该酶构建CLEIA体系，能够进一步提高检测灵敏度。本发明利用Roche公司生产的碱性磷酸酶检测NT-proBNP的灵敏度为2.1pg/mL；而利用CmAP作为标记酶，NT-proBNP的检测灵敏度达1.5pg/mL。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或者按照试剂公司所推荐的条件；下述实施例中所用的试剂、耗材等，如无特殊说明，均可通过商业途径获得。其中：
NT-proBNP检测抗体，即NT-proBNP配对检测抗体，采购于Thermo Fisher；NT-proBNP包被抗体，即NT-proBNP配对包被抗体，采购于Thermo Fisher。
buffer 1为pH8.0的0.1M TEA缓冲液，含0.16M NaCl；制备方法为：称1.492g TEA，0.936g NaCl，定容至100mL，pH调至8.0。
buffer 2为pH7.0的0.1M磷酸盐缓冲液，含0.1M NaCl；制备方法为：称0.8804gNa2HPO4，0.5928g NaH2PO4·2H2O，0.585g NaCl，定容至100mL，pH调至7.0。
buffer 3为pH7.0的0.1M磷酸盐缓冲液，含0.1M NaCl，1mM MgCl2，0.1mM ZnCl2；制备方法为：buffer 2中加入0.02g MgCl2·6H2O，0.0014ZnCl2。
buffer 4为pH7.0的0.1M磷酸盐缓冲液，含0.1M NaCl，2mM EDTA；制备方法为：buffer 2中加入0.058g EDTA。
保存液为pH7.4的0.1M磷酸盐缓冲液，含0.1％(w/v)BSA，0.05％(w/v)NaN3，0.1％(v/v)Proclin，0.05％(v/v)Tween-20；制备方法为：称1.1499g Na2HPO4，0.2964gNaH2PO4·2H2O，0.1g BSA，0.05g NaN3，0.1mL Proclin，0.05mL Tween-20，定容至100mL，pH调至7.4。
高碘酸钠母液配方：称0.1711g高碘酸钠溶于4mL buffer 1中，避光保存。
半胱氨酸盐酸盐母液配方：称0.34g半胱氨酸盐酸盐溶于4mL buffer 2中，避光保存。
氰基硼氢化钠母液配方：称0.0754g氰基硼氢化钠溶于4mL buffer 2中。
SMCC母液配方：称3.7mg SMCC溶于1mL DMF中。
NEM母液配方：称0.15g NEM溶于4mL无水乙醇中。
磁珠为平均粒径1μm的链霉亲和素磁珠；采购于Thermo Fisher。
含NT-proBNP血清标准品来源于吉大一院。
生物素-LC-酰肼试剂购自生工生物工程(上海)股份有限公司。碱性磷酸酶购自Roche公司。
实施例1：碱性磷酸酶标记的NT-proBNP检测抗体的制备
1.巯基化抗体的制备：
将5mg NT-proBNP检测抗体溶于1mL的buffer 1中(棕色瓶装)，向反应体系中加110μL初始浓度为200mM的高碘酸钠溶液，4-6℃反应1h后用Sephadex G-25除盐(平衡与洗脱均用buffer 2)，将样品浓缩至1mL。向反应体系中加初始浓度为0.75M的半胱氨酸盐酸盐250μL以及0.3M氰基硼氢化钠65μL，室温反应过夜后用Sephadex G-25除盐(平衡与洗脱均用buffer 4)，将样品浓缩至1mL。
2.马来酰胺化碱性磷酸酶制备：
将5mg碱性磷酸酶溶于1mL的buffer 3中，加入初始浓度为3.7mg/mL的SMCC溶液120μL，室温反应30min后用Sephadex G-25除盐(平衡与洗脱均用buffer 3)，将样品浓缩至1mL。
3.酶标抗体的制备：
将1mL步骤1制备的巯基化抗体和1mL步骤1制备的马来酰胺化碱性磷酸酶混合，4℃反应过夜，次日用终浓度为0.3mM的NEM溶液封闭反应。用Sephadex G-25除盐(平衡与洗脱均用保存液)，将样品浓缩至1mL后于4℃保存，制备得到碱性磷酸酶标记的NT-proBNP检测抗体，命名为Ra。
实施例2：磁珠包被抗体(NT-proBNP配对包被抗体)的制备
将1mg NT-proBNP包被抗体溶于0.2mL的buffer 1中(棕色瓶装)，加22μL初始浓度为200mM的高碘酸钠溶液，4-6℃反应1h后用Sephadex G-25除盐(平衡与洗脱均用buffer1)，将样品浓缩至0.2mL。向反应体系中加入初始浓度为50mM的生物素-LC-酰肼试剂50μL，室温反应2h后用Sephadex G-25除盐(平衡与洗脱均用buffer 2)，将样品浓缩至0.2mL，得到生物素化的抗体。
取10mg链霉亲和素磁珠，用500μL buffer 2反复清洗3次后(可以用磁铁进行固液分离)，与生物素化后的抗体混合，室温反应30min，再用500μL buffer 2反复清洗3次，最后用1mL保存液重悬，于4℃保存，即制备得到磁珠包被抗体，命名为Rb。
实施例3：NT-proBNP检测试剂盒的制备
所述检测试剂盒包括R1(5mL)、R2(5mL)、底物(20mL)、反应液RB(5mL)、清洗液WB(50mL)。其中：
R1是实施例1制备的Ra用保存液稀释250倍后得到的溶液；
R2是实施例2制备的Rb用保存液稀释30倍后得到的溶液；
底物为AMPPD；
反应液RB为pH10.3的4M DEA缓冲液，含20mM MgCl2。制备方法为：称21g DEA，0.2gMgCl2·6H2O，定容至50mL，pH调至10.3。
清洗液WB同上述的保存液。
实施例4：含NT-proBNP血清标准品检测
孵育：将50μL已知浓度的含NT-proBNP血清标准品分别加入96孔白板里，做好标记。取R1、R2各50μL和孔里的抗原混合均匀后，于37℃孵育30min。
清洗：将96孔板于4000r/min下离心5min，用强磁铁置于板底部，小心吸走上清液，沉淀用200μL清洗液WB清洗，重复清洗3次。
反应：用50μL反应液RB重悬后加入150μL底物AMPPD后立即用化学发光酶标仪测试。测试温度37℃，测量3组取均值。
测试：混匀时间10s，温度37℃，整合时间1000ms，延迟时间100ms，测试次数10次。
不同浓度的NT-proBNP血清标准品对应的发光值平均值见表1。
表1：反应10min后不同浓度的NT-proBNP血清标准品对应的发光值平均值
Figure BDA0002681928280000081
利用表1得到的不同浓度的NT-proBNP血清标准品对应的发光值平均值构建工作曲线，结果如图3所示。
实施例5：灵敏度测定
将实施例3中制备的试剂盒其中1批，测定20次零浓度样本，计算平均值M及标准差(SD)，得出M+2SD，根据零浓度标准品和相邻标准品之间的浓度-发光值平均值进行两点回归拟合得出一次方程，将M+2SD代入方程，得出相应浓度值即为试剂盒灵敏度为2.1pg/mL。
表2：灵敏度第一点发光值
Figure BDA0002681928280000082
第一点发光均值M＝11505.5，SD＝1323.9，M+2SD＝14152.8。
表3：灵敏度第2点发光值
Figure BDA0002681928280000091
第二点发光均值为62005.6。拟合方程为y＝1240.8x+11505.5。
实施例6：相关性测试
取50份血清样本，比较本发明的试剂盒与罗氏的NT-proBNP检测试剂盒检测结果的相关性，结果如图4所示。其中：横坐标为罗氏公司试剂盒的检测结果(pg/mL)，纵坐标为本发明试剂盒的检测结果(pg/mL)，相关系数R2＝0.9919，由图4可知，本发明样本检测结果与本行业知名公司产品检测结果相比，结果无明显差异。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 济南国科医工科技发展有限公司
<120> 基于高比活力碱性磷酸酶构建的NT-proBNP检测试剂盒及其应用
<130> 2020
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 535
<212> PRT
<213> 碱性磷酸酶(CmAP)
<400> 1
Met Pro His Gln Asn Arg Gln Gly Arg Trp Cys Arg Lys Gly Trp Ala
1 5 10 15
Val Val Ala Leu Thr Gly Ser Met Ser Trp Met Pro Leu Ala Asn Ala
20 25 30
Ala Glu Ile Lys Asn Val Ile Leu Met Ile Gly Asp Gly Met Gly Pro
35 40 45
Gln Gln Val Gly Met Leu Glu Thr Tyr Ala Asn Arg Ala Pro Asp Ser
50 55 60
Ile Tyr Gln Gly Arg Ser Thr Ala Leu Tyr Gln Leu Ala Lys Glu Gly
65 70 75 80
Val Val Gly Ala Ser Leu Thr His Pro Glu Asp Ala Val Val Val Asp
85 90 95
Ser Ala Cys Ser Ala Thr Gln Leu Ser Thr Gly Ile Phe Thr Gly Gly
100 105 110
Glu Val Ile Gly Ile Asp Ser Glu Gly Asn Arg Val Glu Thr Val Leu
115 120 125
Glu Leu Ala Lys Arg Val Gly Lys Ala Thr Gly Leu Val Ser Asp Thr
130 135 140
Arg Leu Thr His Ala Thr Pro Ala Ala Phe Ala Ala His Gln Pro His
145 150 155 160
Arg Ser Leu Glu Asn Ala Ile Ala Glu Asp Met Leu Met Thr Gly Pro
165 170 175
Asp Val Met Leu Ser Gly Gly Leu Arg His Phe Val Pro Tyr Ser Val
180 185 190
Ser Glu Pro Gly Glu Ser Ala Gly Ser Val Glu Thr Leu Met Gln Gly
195 200 205
Ala Trp Ser Pro Thr Ser Lys Arg Lys Asp Glu Arg Asn Leu Leu Gln
210 215 220
Glu Ala Ala Asp Gln Gly Tyr Gly Leu Ala Phe Thr Arg Asp Gln Met
225 230 235 240
Ala Ala Leu Asn Gly Thr Lys Val Leu Gly Leu Phe Ala Asn Ser Gly
245 250 255
Met Ala Asp Gly Ile Ser Phe Arg Asp Ser His Asp Asp Pro Gln Arg
260 265 270
Gln Gln Pro Thr Leu His Glu Met Thr Gln Lys Ala Leu Ser Met Leu
275 280 285
Glu Gln Asp Asp Asp Gly Phe Phe Leu Met Val Glu Gly Gly Gln Ile
290 295 300
Asp Trp Ala Ala His Ser Asn Asp Ala Gly Thr Met Leu Asn Glu Leu
305 310 315 320
Ile Lys Phe Asp Glu Ala Val Gln Gly Val Phe Asp Trp Ala Arg Asp
325 330 335
Arg Asp Asp Thr Ile Ile Leu Val Thr Ala Asp His Glu Thr Gly Ala
340 345 350
Phe Gly Phe Ser Tyr Ser Ser Ala Asn Leu Pro Ala Ala Gln Lys Lys
355 360 365
Ser Gly Pro Ala Phe Ala Asp Gln Asp Tyr Ala Pro Asn Phe Asn Phe
370 375 380
Gly Asp Phe Ser Ile Leu Asp Ser Leu Tyr Glu Gln Lys Gln Thr Tyr
385 390 395 400
Tyr Glu Leu Leu Ser Asp Phe Glu Ala Leu Pro Gln Gly Glu Arg Thr
405 410 415
Pro Ala Arg Leu Met Ala Ala Val Asn Gly Asn Ser Asp Phe Gln Ile
420 425 430
Thr Glu Ala Gln Ala Ala Glu Val Leu Ala Asn Lys Pro Asn Pro Tyr
435 440 445
His Val Asp Gly His Ser Tyr Leu Gly Val Ser Glu Val Pro Ala Val
450 455 460
His Asp Phe Asp Ala Phe Phe Pro Tyr Asn Asp Arg Gly Asn Leu Leu
465 470 475 480
Ala Arg Ala Leu Ala Thr Gln Gln Asn Thr Val Trp Gly Thr Gly Thr
485 490 495
His Thr His Thr Pro Val Asn Val Phe Ala Trp Gly Pro Ala Asn Asp
500 505 510
Ile Leu Pro Val Ser Ser Ile Leu His His Ser Glu Ile Gly Gln Tyr
515 520 525
Leu Lys Thr Val Val Ala Lys
530 535

Claims (10)

1.一种NT-proBNP检测试剂盒，其特征在于，包括：碱性磷酸酶标记的NT-proBNP检测抗体和磁珠包被的NT-proBNP包被抗体；
所述碱性磷酸酶标记的NT-proBNP检测抗体由如下方法制备而成：
将NT-proBNP检测抗体与高碘酸钠反应，使抗体Fc端上的糖链氧化生成醛基，得到第一产物；
将第一产物用过量的半胱氨酸盐酸盐与氰基硼氢化钠处理，使醛基与半胱氨酸盐酸盐发生醛胺缩合反应，抗体Fc端生成有活性的巯基；
将碱性磷酸酶用SMCC处理，暴露出有活性的马来酰胺基团；然后与Fc端生成有活性巯基的NT-proBNP检测抗体混合，使巯基与马来酰胺反应生成稳定的硫醚键；再用NEM溶液封闭反应，除盐，制备得到碱性磷酸酶标记的NT-proBNP检测抗体；
所述磁珠包被的NT-proBNP包被抗体由如下方法制备而成：
将NT-proBNP包被抗体与高碘酸钠反应，使抗体Fc端上的糖链氧化生成醛基，得到第二产物；
将第二产物与生物素-LC-酰肼试剂反应，酰肼基团与醛基反应生成稳定的腙键，使抗体的Fc端修饰上生物素；
将链霉亲和素修饰的磁珠与Fc端修饰有生物素的NT-proBNP包被抗体混合，生物素与链霉亲和素反应生成稳定的共价键，即制备得到磁珠包被的NT-proBNP包被抗体。
2.根据权利要求1所述的NT-proBNP检测试剂盒，其特征在于，NT-proBNP检测抗体与高碘酸钠反应具体为：将NT-proBNP检测抗体溶于buffer 1中，加入初始浓度为200mM的高碘酸钠溶液，4-6℃反应1h；
所述NT-proBNP检测抗体与高碘酸钠溶液加入量的比为5mg：(100-120)μL；
所述buffer 1为pH8.0的0.1M TEA缓冲液，含0.16M NaCl。
3.根据权利要求1所述的NT-proBNP检测试剂盒，其特征在于，所述醛胺缩合反应具体为：向第一产物中加入初始浓度为0.75M的半胱氨酸盐酸盐和0.3M的氰基硼氢化钠，室温反应过夜。
4.根据权利要求1所述的NT-proBNP检测试剂盒，其特征在于，碱性磷酸酶用SMCC处理具体为：将碱性磷酸酶溶于buffer 3中，加入初始浓度为3.7mg/mL的SMCC溶液，室温反应30min；
所述buffer 3为pH7.0的0.1M磷酸盐缓冲液，含0.1M NaCl、1mM MgCl2、0.1mM ZnCl2。
5.根据权利要求1所述的NT-proBNP检测试剂盒，其特征在于，所述碱性磷酸酶为高比活力碱性磷酸酶CmAP。
6.根据权利要求1所述的NT-proBNP检测试剂盒，其特征在于，第二产物与生物素-LC-酰肼试剂反应具体为：向第二产物中加入初始浓度为50mM的生物素-LC-酰肼试剂，室温反应2h。
7.根据权利要求1-6任一项所述的NT-proBNP检测试剂盒，其特征在于，所述NT-proBNP检测试剂盒还包括：底物、反应液和清洗液。
8.根据权利要求7所述的NT-proBNP检测试剂盒，其特征在于，所述底物为AMPPD；所述反应液为pH＝10.3的4M DEA缓冲液，含20mM MgCl2；所述清洗液为pH＝7.4的0.1M磷酸盐缓冲液，含0.1％BSA、0.05％NaN3、0.1％Proclin和0.05％Tween-20。
9.一种检测NT-proBNP的方法，其特征在于，利用权利要求1-8任一项所述的NT-proBNP检测试剂盒进行检测，包括以下步骤：
将系列已知浓度的含NT-proBNP的血清标准品分别加入96孔板中，加入碱性磷酸酶标记的NT-proBNP检测抗体和磁珠包被的NT-proBNP包被抗体，混合均匀，于37℃孵育30min；
孵育后进行离心，离心后将强磁铁置于96孔板底部，吸走上清液，沉淀用清洗液清洗；用反应液重悬后加入底物，37℃反应10min后用化学发光酶标仪测试其发光值，建立NT-proBNP浓度与发光值的工作曲线，利用建立的工作曲线对待测样品的NT-proBNP浓度进行检测。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述化学发光酶标仪测试的条件为：混匀时间10s，温度37℃，整合时间1000ms，延迟时间100ms，测试次数10次。
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