CN115078731B

CN115078731B - 一种定量测定细胞角蛋白19片段的试剂盒及其制备方法

Info

Publication number: CN115078731B
Application number: CN202210649772.2A
Authority: CN
Inventors: 张闻; 陈�峰; 陈媛; 周广亮
Original assignee: Ningbo Rui Bio Technology Co ltd
Current assignee: Ningbo Rui Bio Technology Co ltd
Priority date: 2022-06-08
Filing date: 2022-06-08
Publication date: 2023-07-11
Anticipated expiration: 2042-06-08
Also published as: CN115078731A

Abstract

本发明公开了一种定量测定细胞角蛋白19片段试剂盒的制备方法，具体制备方法为：（1）将质量比为（0.04~0.1）:1的细胞角蛋白19片段单克隆抗体和磁珠进行包被处理，得包被细胞角蛋白19片段单克隆抗体的磁珠，之后用磁珠稀释液对其稀释，得到试剂R1;（2）将吖啶酯标记抗体复合物用抗体稀释液进行稀释，得到试剂R2；（3）将细胞角蛋白19片段用抗原稀释液配制成校准品；（4）将细胞角蛋白19片段用抗原稀释液配制成质控品。本发明制备的试剂盒克服了现有试剂盒存在的CYFRA 21‑1抗原“S”型反应曲线，解决低端灵敏度差、高端线性差的问题，具有灵敏度高，线性范围较宽，特异性较好，准确度较高，精密度良好，性价比较高，相对于进口试剂盒成本低的优点，非常适于推广使用。

Description

一种定量测定细胞角蛋白19片段的试剂盒及其制备方法

技术领域

本发明涉及免疫分析医学技术领域，具体涉及一种定量测定细胞角蛋白19片段的试剂盒及其制备方法。

背景技术

细胞角蛋白19片段(CYFRA 21-1)对各种类型肺癌的诊断、病情检测、疗效评价具有一定的临床应用价值，尤其是对监测非小细胞型肺癌(NSCLC)的病程有重要的诊断价值。CYFRA 21-1对肺癌总的灵敏度为65.7％，其中，对NSCLC(非小细胞型肺癌)和SCLC(小细胞型肺癌)的灵敏度分别是80％和40％，对肺腺癌和肺鳞癌的灵敏度分别是78.9％和83.3％。当病人血清中CYFRA 21-1的浓度高于30ng/mL且影像学检测显示肺部存在不清晰的环形阴影时，则诊断为原发性支气管肺癌的可能性较高。

目前，市面上检测细胞角蛋白19片段的试剂盒主要以电化学发光法和化学发光微粒子免疫检测法为主。这两种方法的灵敏度、准确度、特异性都很高，但是罗氏、雅培等进口厂家的试剂在市场上仍然占有很大份额。为了替代昂贵的进口试剂，减轻医疗负担，越来越多的国产试剂开始研制并涌入市场。

申请号为CN200710121167.3公开了一种细胞角蛋白19片段化学发光免疫分析测定试剂盒及其制备方法，该试剂盒包括：细胞角蛋白19片段CYFRA 21-1校准品；细胞角蛋白19片段CYFRA 21-1单克隆抗体包被的固相载体；酶标记的细胞角蛋白19片段CYFRA 21-1单克隆抗体；以及上述酶所作用的化学发光底物。该专利虽然是在酶联免疫分析的基础上应用酶催化发光底物，通过检测发光底物产生的光信号代替酶联免疫分析中的显色底物，但该体系的原理是酶促发光，而不是直接化学发光，常存在不稳定的缺陷。

申请号为CN202110072767.5公开了一种磁微粒化学发光法测定细胞角蛋白19片段含量的试剂盒，该试剂盒包括细胞角蛋白19片段抗体标记的磁微粒试剂、细胞角蛋白19片段抗体标记的碱性磷酸酶试剂；细胞角蛋白19片段抗体标记的磁微粒试剂中，细胞角蛋白19片段抗体标记的磁微粒的浓度为0.05-1mg/ml；所述细胞角蛋白19片段抗体标记的碱性磷酸酶试剂中，细胞角蛋白19片段抗体标记的碱性磷酸酶浓度为0.05-2μg/ml。该专利公开的试剂盒原理和上面CN200710121167.3相同，均是酶促化学发光。

上面公开的两种试剂盒均是根据酶促发光原理来检测细胞角蛋白19的含量。目前以化学发光微粒子免疫检测法研制的国产试剂盒主要由吖啶酯类化合物标记的抗体试剂、包被在磁性微球上的抗体试剂、校准品、质控品等组成。但是大部分试剂盒在实际检测过程中会出现CYFRA 21-1抗原反应线性常呈“S”型，导致低端灵敏度差，高端线性差，线性范围较窄的问题。同时一些研究实践证明，细胞角蛋白19片段在血清基质中是不稳定的。当含有细胞角蛋白19片段的校准品或质控品以液体状态长时间储存时，细胞角蛋白19片段会被破坏和变性。本发明针对以上技术难点，研制出线性范围宽、灵敏度高的，可以和进口试剂相媲美的CYFRA 21-1检测试剂盒。同时研制出一种与该试剂盒配套的高稳定性的以液体形式存在的CYFRA 21-1校准品和质控品。

发明内容

本发明的目的在于提供一种定量检测细胞角蛋白19片段的试剂盒及其制备方法，以解决现有化学发光微粒子免疫检测法试剂盒在实际检测过程中会出现CYFRA 21-1抗原反应线性常呈“S”型，导致低端灵敏度差，高端线性差，线性范围较窄的问题。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种定量测定细胞角蛋白19片段试剂盒的制备方法，包括以下步骤：

(1)将质量比为(0.04～0.1)∶1的的细胞角蛋白19片段单克隆抗体和磁珠进行包被处理，得包被细胞角蛋白19片段单克隆抗体的磁珠，之后用磁珠稀释液对其稀释，得到试剂R1；

(2)将吖啶酯标记抗体复合物用抗体稀释液进行稀释，得到试剂R2；

(3)将细胞角蛋白19片段用抗原稀释液配制成校准品溶液；

(4)将细胞角蛋白19片段用抗原稀释液配制成质控品溶液；

进一步地，所述步骤(1)试剂R1的制备方法具体如下：

(a)重悬：用交联缓冲液清洗磁珠后去除上清液，再用交联缓冲液重悬磁珠；

(b)活化：向重悬磁珠中加入活化剂得活化磁珠；

(c)交联：向活化磁珠中加入细胞角蛋白19片段单克隆抗体进行混悬反应，反应完成后去除上清液得抗体-磁珠交联物；

(d)封闭：将抗体-磁珠交联物用封闭剂封闭，封闭完成后得包被抗体的磁珠，

用磁珠稀释液重悬包被抗体的磁珠至一定浓度得试剂R1；

所述磁珠与细胞角蛋白19片段单克隆抗体的质量比为0.06∶1。

进一步地，所述步骤(a)中重悬所用交联缓冲液为20～100mM MES，pH为5.0～6.0，所述磁珠为羧基磁珠，所述羧基磁珠的粒径为1.5～3μm；

优选地，所述交联缓冲液为100mM MES，pH为5.5；

优选地，所述羧基磁珠的粒径为3μm。

进一步地，所述步骤(b)中加入的活化剂的终浓度为2mg/mL，所述活化条件为25℃下混悬活化30分钟；

优选地，所述活化剂为EDC，所述EDC的终浓度为0.5～5mg/ml；

更优选地，所述EDC的终浓度为2mg/ml。

进一步地，所述步骤(c)中混悬反应条件为20～37℃下混悬反应2-24h，所述细胞角蛋白19片段单克隆抗体与磁珠的质量比例为0.06∶1；

优选地，所述混悬反应条件为25℃下混悬反应6h。

进一步地，所述步骤(d)中封闭剂组分为10～50mM Tris，100～200mM NaCl，0.05～0.2％吐温20或吐温80，0.5～10％BSA、酪蛋白、γ球蛋白、甘氨酸、赖氨酸中的至少一种，所述封闭剂的pH为7.2～7.4，所述封闭条件为20～37℃下混悬反应6～24h；

所述洗涤液组分为10～50mM Tris，100～200mM NaCl，0.05～0.2％吐温20或吐温80，所述洗涤液的pH为7.2～7.4；

优选地，所述封闭剂组分为20mM Tris，150mM NaCl，0.1％吐温20，2％BSA，2％甘氨酸，

所述封闭条件为25℃下混悬反应24h；

优选地，所述洗涤液组分为20mM Tris，150mM NaCl，0.1％吐温20。

进一步地，所述步骤(d)中磁珠稀释液组分为20～100mM PBS，10～200mM KCl，0.1～8％BSA、酪蛋白、γ球蛋白中的至少一种，0.05～2％吐温20、吐温80、Triton X405、表面活性剂S9中的一种或两种，0.05％～1％Proclin300、Proclin950、叠氮化钠中的一种或两种，所述磁珠稀释液的pH为7.0～7.4；

优选地，所述磁珠稀释液组分为100mM PBS，50mM KCl，0.5％BSA，0.5％酪蛋白，0.05％吐温20，0.05％Proclin300，0.09％叠氮化钠。

进一步地，所述步骤(2)中试剂R2的制备方法具体如下：

将细胞角蛋白19片段单克隆抗体与吖啶酯混悬处理，除去未交联上的吖啶酯，保留吖啶酯标记抗体复合物；将吖啶酯标记抗体复合物用抗体稀释液稀释到一定浓度得试剂R2。

优选地，所述混悬反应处理条件为25℃下混悬反应30min；

优选地，所述抗体稀释液组分为50mM MES，150mM NaCl，0.5％酪蛋白，0.1％Thesit，0.1％Proclin300；

优选地，所述抗体稀释液pH为6.0～6.5；所述未交联上的吖啶酯用超滤管或者透析袋去除；优选地，所述试剂R2中吖啶酯标记抗体复合物浓度为0.2ug/mL。

进一步地，所述抗原稀释液组分为10～20mM PBS，3～15mM EDTA或EDTA-2Na中的一种，2～10％海藻糖或蔗糖中的一种，2～10％甘露醇，5～20％乙二醇或甘油，0.5～10％BSA、酪蛋白、γ球蛋白、猪皮明胶、鱼皮明胶中的一种或两种，0.05～2％吐温20、吐温80、Triton X405、表面活性剂S9中的一种或两种，0.05％～1％Proclin300、Proclin950、叠氮化钠中的一种或两种，所述抗原稀释液的pH为7.0～7.5；

优选地，所述抗原稀释液组分为20mM PBS，5mM EDTA，1％蔗糖，5％甘露醇，20％乙二醇，5％BSA，0.05％吐温20，0.05％Proclin300，0.05％Proclin950。

一种根据上述试剂盒的制备方法获得的试剂盒。

本发明的有益效果为：

1、本发明提供的一种定量测定细胞角蛋白19片段的试剂盒，克服了现有试剂盒存在的CYFRA 21-1抗原“S”型反应曲线、线性范围窄的问题，通过摸索出合适的磁珠与抗体的比例，同时优化了偶联工艺，同时搭配使用被发明中的相应稀释液，不仅能保证包被在磁珠上的抗体足量，同时最大限度的减少磁珠表面抗体间的空间位阻，使得低浓度的细胞角蛋白19片段能够被最大限度的识别和捕获，高浓度的细胞角蛋白19片段又能克服高剂量钩状效应，解决低端灵敏度差、高端线性差的问题，扩大了线性范围。

2、本发明提供的一种定量测定细胞角蛋白19片段的试剂盒，提供一了种磁珠稀释液，能够为抗体识别抗原提供有利条件，不仅能让抗体保持稳定活性，同时也有利于抗体结合抗原，让试剂发挥最优性能。

3、本发明提供的一种定量测定细胞角蛋白19片段的试剂盒，使用的校准品和质控品是用人工基质制备，含有来源于人类细胞系的抗原成分，可在2～8℃下保存一年以上，同时热稳定性良好，可在37℃下至少能放置7天，并且不影响抗体与抗原的亲和力，可作为回收标准品和线性物质使用。

4、通过本发明的制备方法获得的细胞角蛋白19片段定量测定试剂盒灵敏度高，空白限不高于0.02ng/mL，检出限不高于0.09ng/mL，线性范围较宽，线性范围为0.5ng/mL～100ng/mL。在线性范围内，试剂盒相关性系数r≥0.99，特异性较好，与AFP、CEA、CA 125、CA15-3、CA 19-9、NSE均未见交叉反应，准确度较高，采用回收实验，回收率R均在85％～115％之间，精密度良好，批内不精密度不高于5％，批间不精密度不高于10％，性价比较高，本试剂盒相对于进口试剂盒成本低，且其性能和临床使用价值不亚于进口试剂盒。

附图说明

图1为本发明实施例1与对比例1和对比例2的线性范围图；

图2为本发明实施例1与对比例3-7的线性范围图；

图3为本发明实施例1和市售Abbott Ireland Diagnostics Division的细胞角蛋白19片段定量测定试剂盒血清样本相关性线性图。

具体实施方式

为了更清楚说明本发明的技术方案，具体的实施方式说明如下：

所述0.1～8％BSA、酪蛋白、γ球蛋白，0.05～2％吐温20、吐温80、Triton X405、表面活性剂S9，0.05％～1％Proclin300、Proclin950、叠氮化钠，2～10％海藻糖或蔗糖，2～10％甘露醇，5～20％乙二醇或甘油，0.5～10％BSA、酪蛋白、γ球蛋白、猪皮明胶、鱼皮明胶中的百分含量均是指的质量分数。

实施例1

本实施例的定量测定细胞角蛋白19片段试剂盒包括试剂R1、试剂R2、校准品和质控品。

(1)将一定质量比的细胞角蛋白19片段单克隆抗体和羧基磁珠进行处理，得包被细胞角蛋白19片段单克隆抗体的羧基磁珠(羧基磁珠的粒径为3μm)，之后用磁珠稀释液将将包被细胞角蛋白19片段单克隆抗体的羧基磁珠稀释至1mg/mL(以磁珠浓度计)，得到试剂R1。

磁珠稀释液组分为100mM PBS，50mM KCl，0.5％BSA，0.5％酪蛋白，0.05％吐温20，0.05％Proclin300，0.09％叠氮化钠，磁珠稀释液的pH为7.0～7.4。

磁珠与细胞角蛋白19片段单克隆抗体的质量比例为1∶0.06。

试剂R1的具体制备方法为：

(a)重悬：取10mg(100μL充分混悬的100mg/mL羧基磁珠)的羧基磁珠于2mL离心管中，去除上清液，用1mL交联缓冲液清洗3次，去除上清液，最后用1mL交联缓冲液重悬羧基磁珠，交联缓冲液为100mM MES，交联缓冲液的pH为5.5。

(b)活化：向重悬磁珠中加入EDC活化剂使EDC终浓度为2mg/mL，在25℃下混悬活化30分钟。

(c)交联：向活化的羧基磁珠中加入60ug细胞角蛋白19片段单克隆抗体，在25℃下混悬反应6h，反应完成后去除上清液，得抗体-磁珠交联物。

(d)向抗体-磁珠交联物中加入1mL封闭剂，在25℃下混悬反应24h进行封闭，封闭完成后去除上清液，再用洗涤液清洗3次，去除上清液后，加入1mL磁珠稀释液重悬得到包被细胞角蛋白19片段单克隆抗体的羧基磁珠溶液，再加入9mL磁珠稀释液将抗体溶液稀释至1mg/mL(以磁珠浓度计)，得到试剂R1，保存于2～8℃备用。

封闭剂组分为20mM Tris，150mM NaCl，0.1％吐温20，2％BSA，2％甘氨酸，封闭剂的pH为7.2～7.4；洗涤液组分为20mM Tris，150mM NaCl，0.1％吐温20，洗涤液的pH为7.2～7.4。

(2)将吖啶酯标记抗体复合物用标记抗体稀释液稀释至0.2ug/mL，得到试剂R2。

抗体稀释液组分为50mM MES，150mM NaCl，0.5％酪蛋白，0.1％Thesit，0.1％Proclin300，抗体稀释液的pH为6.0～6.5。

试剂R2的制备方法具体为：

取100μg细胞角蛋白19片段单克隆抗体，加入4μg吖啶酯，在25℃下混悬反应30min。

用超滤管或者透析袋将未交联上的吖啶酯除去，尽可能的只保留吖啶酯标记抗体复合物。

用抗体稀释液将吖啶酯标记抗体复合物稀释到0.2ug/mL，得到试剂R2，保存于2～8℃备用。

抗体稀释液组分为50mM MES，150mM NaCl，0.5％酪蛋白，0.1％Thesit，0.1％Proclin300，抗体稀释液的pH为6.0～6.5

(3)将人源细胞角蛋白19片段用抗原稀释液配制成0ng/mL(校准品A)、2.5ng/mL(校准品B)、10ng/mL(校准品C)、25ng/mL(校准品D)、50ng/mL(校准品E)和100ng/mL(校准品F)。

抗原稀释液组分为20mM PBS，5mM EDTA，1％蔗糖，5％甘露醇，20％乙二醇，5％BSA，0.05％吐温20，0.05％Proclin300，0.05％Proclin950，抗原稀释液的pH为7.0～7.5。

(4)将人源细胞角蛋白19片段用抗原稀释液配制成5ng/mL(低值质控品)、15ng/mL(中值质控品)和35ng/mL(高值质控品)。

检测方法：

使用全自动化学发光免疫分析仪(仪器厂家和型号：迎凯i1910和i2910)进行检测。

将待检测样本和试剂R1混合，样本中的CYFRA 21-1结合到磁性微球上，洗涤后，加入试剂R2，形成“捕获抗体交联的磁性微球-抗原-吖啶酯标记的检测抗体”反应混合物。再次洗涤后，添加激发液到反应混合物中，激发化学发光反应。

待检测样本中细胞角蛋白19片段的浓度和系统检测的相对发光值(RLU)成比例，通过校准品定标，仪器拟合出的校正曲线计算细胞角蛋白19片段的浓度。再使用本发明中配套的质控品，评价校准的准确度。

实施例2

实施例1的试剂盒与实施例1的区别在于磁珠与细胞角蛋白19片段单克隆抗体的质量比例为1∶0.04，其他均与实施例1相同。

实施例3

实施例1的试剂盒与实施例1的区别在于磁珠与细胞角蛋白19片段单克隆抗体的质量比例为1∶0.1，其他均与实施例1相同。

对比例1

对比例1的试剂盒与实施例1的区别在于磁珠与细胞角蛋白19片段单克隆抗体的质量比例为1∶0.03，其他均与实施例1相同。

对比例2

对比例2的试剂盒与实施例1的区别在于磁珠与细胞角蛋白19片段单克隆抗体的质量比例为1∶0.15，其他均与实施例1相同。

对比例3

对比例3的试剂盒与实施例1的区别在于磁珠稀释液中没有KCl，其他均与实施例1相同。

对比例4

对比例4的试剂盒与实施例1的区别在于磁珠稀释液中没有吐温20，其他均与实施例1相同。

对比例5

对比例5的试剂盒与实施例1的区别在于磁珠稀释液的pH为6.5，其他均与实施例1相同。

对比例6：

对比例6的试剂盒与实施例1的区别在于磁珠稀释液的pH为8.0，其他均与实施例1相同。

对比例7

对比例7的试剂盒与实施例1的区别在于抗原稀释液中没有乙二醇，其他均与实施例1相同。

将实施例1-3和对比例1～7配制成的试剂R1、试剂R2、校准品和质控品，在全自动化学发光免疫分析仪上进行测试，同时考察本发明制备的试剂盒的灵敏度、精密度、线性范围、血清回收、校准品和质控品的均一性和稳定性等指标，来进行综合评估。

灵敏度：主要考察空白限和检出限。

用实施例1～3同时测试校准品A 20次，得出20次测量结果的RLU值，计算其平均值

和标准差(SD)，得出/>

将/>

所对应的RLU值代入校准品A与相邻低浓度校准品B的浓度-RLU值两点回归拟合得到的一次方程中得到对应的浓度值，即为空白限(LOB)，具体结果如表1所示。

表1实施例1～3的空白限数据

根据上表1数据可知，实施例1～3的检测数据CV都较小，数据比较均一，空白限在0.02ng/mL以下，检测灵敏度较高。

用实施例1和对比例1～7同时测试校准品A20次，得出20次测量结果的RLU值，计算其平均值

和标准差(SD)，得出/>

将/>

所对应的RLU值代入校准品A与相邻低浓度校准品B的浓度-RLU值两点回归拟合得到的一次方程中得到对应的浓度值，即为空白限(LOB)，具体结果如表2所示。

表2实施例1和对比例1～6的空白限数据

根据上表2数据可知，实施例1的检测数据CV最小，更均一，空白限在0.02ng/mL以下，检测灵敏度较高。

对比例1和对比例2的空白限较高，说明了在本发明试剂盒的制备方案中，磁珠与抗体的质量比例过低或者过高都会影响检测空白限。抗体质量比例过高会让磁珠表面抗体过度拥挤，靠表面吸附而不是共价偶联的抗体占比较多，导致本底测值不均一而使空白限较高，低端灵敏度较差；抗体质量比例过低会使磁珠表面空间过大，磁珠表面抗体会吸附在其他磁珠表面而使得磁珠间相互团聚，也会导致本底测值不均一而使空白限较高，且抗体量不足还会导致检测值偏低。

对比例5和对比例6的空白限相对实施例1较高，说明磁珠稀释液的pH过高或者过低在一定程度上也会影响检测灵敏度。

将实施例1～3同时测试5组低分析物样本各5次，在95％概率下测出的可检测分析物最低浓度，即为检出限(LoD)。结果如表3所示。

表3实施例1～3的检出限数据

由表3数据可知，实施例1～3的检出限接近于0.09ng/mL。

将实施例1和对比例1～7同时测试5组低分析物样本各5次，在95％概率下测出的可检测分析物最低浓度，即为检出限(LoD)。结果如表4所示。

表4实施例1和对比例1～6的检出限数据

由表4数据可知，对比例1和对比例2的检出限较高，说明了磁珠与抗体的质量比例过低或者过高也会显著影响检出限。

综合表2和表4数据可知，实施例1的空白限不高于0.02ng/mL，检出限达到0.09ng/mL。磁珠与抗体的质量比例会显著影响检测灵敏度，磁珠稀释液的pH过高或者过低也会在一定程度上影响检测灵敏度。实施例1的磁珠与抗体的质量比例为1∶0.06，磁珠稀释液的pH为7.0～7.4，都是比较合适的。

精密度：在一天两个时间段内，用实施例1～3同时测试三个浓度水平的质控品和0.5ng/mL～100ng/mL的血清样本，计算测试浓度结果的不精密度总CV。结果如表5所示。

表5实施例1～3的精密度数据

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由上表5数据可知，实施例1～3的精密度较好，CV较小，且测量值准确。

在一天两个时间段内，用实施例1和对比例1～6同时测试三个浓度水平的质控品和0.5ng/mL～100ng/mL的血清样本，计算测试浓度结果的不精密度总CV。结果如表6所示。

表6实施例1和对比例1～6的精密度数据

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由上表6数据可知，对比例1和对比例2的精密度最差，CV较高，说明磁珠与抗体的质量比例过低或者过高都会影响检测精密度。其次是对比例4，说明没有吐温20会让检测精密度变差。对比例5和对比例6与实施例1相比，低值样本测值偏高，高值样本测值偏低，说明磁珠稀释液的pH过高或者过低在一定程度上还会影响线性范围。

线性范围：用实施例1～3同时测试高值血清样本用零浓度血清梯度稀释的样本，计算线性相关系数，结果如表7所示。

表7实施例1～3的线性范围数据

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由上表7数据可知，实施例1～3的线性较好，相关系数在三个九以上。

用实施例1和对比例1～6同时测试高值血清样本用零浓度血清梯度稀释的样本，计算线性相关系数。结果如表8和图1、图2所示。

表8实施例1和对比例1～6的线性范围数据

由上表8数据和图1可知，当实施例1和对比例1、2比较时，实施例1线性最好，其次是对比例2。对比例1的线性最差，出现低端灵敏度差，高端平缓，呈现“S”型曲线。说明抗体质量比例过低会使磁珠表面空间过大，磁珠表面抗体会吸附在其他磁珠表面而使得磁珠间相互团聚，抗体上识别抗原的位点可能因团聚而受阻，导致低浓度样本识别率较低，灵敏度较低；同时又因为抗体量过少不能识别过量的抗原，会使高浓度样本测值偏低，导致高值段线性变得平缓。

由表8数据和图2可知，当实施例1和对比例3、4、5、6比较时，实施例1的线性范围与对比例3、4没多大区别，说明磁珠稀释液中没有KCl，以及没有吐温20对试剂盒的线性范围没有什么影响。但是对比例5、6的线性比较差，出现了低浓度样本测值偏高，高浓度样本测值偏低，说明磁珠稀释液的pH值过低或者过高都会影响试剂盒的线性范围。

回收：在0.9mL血清样本中加入0.1mL标准溶液，用实施例1～3分别测试血清样本、标准溶液、血清样本加入标准溶液后的分析样本各3次，取平均值。按公式(1)计算回收率。

式中：R-回收率；V-加入标准溶液的体积；V0-人源样本的体积；C-人源样本加入标准溶液后的检测浓度；C0-人源样本的检测浓度；Cs-标准溶液的浓度。结果如表9所示。

表9实施例1～3的回收数据

由上表9数据可知，实施例1～3的回收率都比较均一，接近100％。

同上回收检测方法，检测实施例1和对比例1～6的回收率，具体结果如下表10所示。

表10实施例1和对比例1～6的回收数据

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由表10数据可知，实施例1的回收率更加均一，都接近100％。对比例1的回收率均偏高，可能与对比例1的线性形状(“S型”)有关。对比例3的回收率相对于实施例1而言，非常不均一，说明磁珠稀释液中的KCl的添加对回收率的均一性起到了一个关键作用。对比例4的回收率和均一性也比较差，可能与对比例4缺少吐温20导致精密度变差有关。对比例5和对比例6的回收率都偏高，可能与它们的线性形状(高值段平缓)有关。

校准品和质控品的稳定性：实施例1和对比例7中各抽取6套校准品和质控品，置于2-8℃，分别在0、12、15个月时每批各抽取2套测试浓度，计算与0个月时的浓度偏差，结果如表11所示。

实施例1和对比例7中各抽取4套校准品和质控品，置于37℃，分别在0、7天时各抽取2套测试浓度，计算与0天时的浓度偏差。结果如表12所示。

表11实施例1和对比例7的校准品和质控品的2-8℃稳定性数据

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表12实施例1和对比例7的校准品和质控品的37℃稳定性数据

由表11数据可知，实施例1中抗原稀释液可让校准品和质控品在2-8℃下至少储存一年，而对比例7中抗原稀释液缺少乙二醇使得校准品和质控品在2-8℃下储存一年后就下降了23％-60％。

由表12数据可知，实施例1中抗原稀释液可让校准品和质控品在37℃下至少储存7天，而对比例7中抗原稀释液缺少乙二醇使得校准品和质控品在37℃下储存7天后就下降了38％-66％。

特异性：用实施例1测试AFP(800ng/mL)、CEA(600ng/mL)、CA 125(1200U/mL)、CA15-3(800U/mL)、CA 19-9(500U/mL)、NSE(300ng/mL)均未见交叉反应，结果见表13。在血清样本中分别加入潜在干扰物(胆红素、血红蛋白、甘油三酯、总蛋白)，加入的潜在干扰物体积应不会产生基质的变化，用生理盐水作为对照，用实施例1测试上述各样本浓度，计算与对照的浓度偏差，结果如表14所示。

将含其他潜在干扰物(RF800、HAMA高值)的样本加入不同浓度的抗原，用实施例1做回收试验，计算回收率，结果如表15所示。

表13实施例1试剂盒与其他肿瘤标志物交叉反应性数据

表14实施例1试剂盒与潜在干扰物干扰反应数据

由表14数据可知，当潜在干扰物胆红素≤20mg/dL，血红蛋白≤500mg/dL，甘油三酯≤3000mg/dL，总蛋白≤12g/dL时，对实施例1的检测结果无影响。

表15实施例1试剂盒与其他潜在干扰性的临床情形干扰反应数据

由表15数据可知，实施例1用含其他潜在干扰物(如RF800、HAMA高值)的样本对该项目的特异性进行评估，测试回收率在90％～100％之间，未见显著交叉。

血清样本相关性：用实施例1测试不同浓度且覆盖线性范围的样本共100份，与Abbott Ireland Diagnostics Division的细胞角蛋白19片段定量测定试剂盒(化学发光微粒子免疫检测法)作为比对试剂盒进行比对，线性回归方程为：Y＝1.0015x-0.3176，线性回归的判定系数R²＝0.9920，结果如图3所示。

试剂稳定性：将实施例1试剂盒置于2-8℃，分别在0、12、15个月时各抽取2套，分别定标，测试检出限、精密度、血清样本，与0个月时进行比较，结果如表16所示。将实施例1试剂盒置于37℃，7天后抽取2套分别定标，测试检出限、精密度、血清样本，与2-8℃的试剂盒进行比较，结果如表17所示。

表16实施例1试剂盒2-8℃稳定性数据

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由表16数据可知，实施例1的试剂盒在2-8℃至少能稳定1年，不影响其灵敏度、精密度和血清样本相关性。

表17实施例1试剂盒37℃稳定性数据

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由表17数据可知，实施例1的试剂盒在37℃下至少能稳定7天，不影响其灵敏度、精密度和血清样本相关性。

综上对本发明试剂盒性能评价的结果，本发明采用化学发光免疫分析双抗体夹心两步法研制定量检测细胞角蛋白19片段(CYFRA 21-1)的试剂盒。采用合适的磁珠与抗体的质量比例，克服CYFRA 21-1抗原“S”型反应曲线，扩大线性范围。同时配合本发明特定组分的稀释液液，如磁珠稀释液、抗体稀释液和抗原稀释液等，能够为抗体识别抗原提供有利条件，使得试剂盒的各方面性能达到最优。

Claims

1.一种定量测定细胞角蛋白19片段试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）将质量比为（0.04~0.1）:1的细胞角蛋白19片段单克隆抗体和磁珠进行包被处理，得包被细胞角蛋白19片段单克隆抗体的磁珠，之后用磁珠稀释液对其稀释，得到试剂R1；

（2）将吖啶酯标记抗体复合物用抗体稀释液进行稀释，得到试剂R2；

（3）将细胞角蛋白19片段用抗原稀释液配制成校准品；

（4）将细胞角蛋白19片段用抗原稀释液配制成质控品;

所述磁珠稀释液组分为100mM PBS，50mM KCl，0.5%BSA，0.5%酪蛋白，0.05% 吐温20，0.05%Proclin300，0.09%叠氮化钠，所述磁珠稀释液的pH为7.0~7.4;

所述步骤（2）中试剂R2的制备方法具体如下：

将细胞角蛋白19片段单克隆抗体与吖啶酯混悬处理，除去未交联上的吖啶酯，保留吖啶酯标记抗体复合物；将吖啶酯标记抗体复合物用抗体稀释液稀释到一定浓度得试剂R2；所述抗体稀释液组分为50mM MES，150mM NaCl，0.5% 酪蛋白，0.1% Thesit，0.1%Proclin300；所述抗体稀释液的pH为6.0~6.5；所述试剂R2中吖啶酯标记抗体复合物浓度为0.2ug/mL；

所述抗原稀释液组分为20mM PBS，5mM EDTA，1%蔗糖，5%甘露醇，20%乙二醇，5% BSA，0.05% 吐温20，0.05% Proclin300，0.05% Proclin950，所述抗原稀释液的pH为7.0~7.5。

2.根据权利要求1所述的试剂盒的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）试剂R1的具体制备方法如下：

（a）重悬：用交联缓冲液清洗磁珠后去除上清液，再用交联缓冲液重悬磁珠；

（b）活化：向重悬磁珠中加入活化剂得活化磁珠；

（c）交联：向活化磁珠中加入细胞角蛋白19片段单克隆抗体进行混悬反应，反应完成后去除上清液得抗体-磁珠交联物；

（d）封闭：将抗体-磁珠交联物用封闭剂封闭，封闭完成后得包被抗体的磁珠，用磁珠稀释液重悬包被抗体的磁珠至一定浓度得试剂R1；

所述细胞角蛋白19片段单克隆抗体与磁珠的质量比为0.06：1。

3. 根据权利要求2所述的试剂盒的制备方法，其特征在于，所述步骤（a）中重悬所用交联缓冲液为20~100mM MES, pH为5.0~6.0，所述磁珠为羧基磁珠，所述羧基磁珠的粒径为1.5~3μm。

4. 根据权利要求3所述的试剂盒的制备方法，其特征在于，所述交联缓冲液为100mMMES, pH为5.5。

5.根据权利要求3所述的试剂盒的制备方法，其特征在于，所述羧基磁珠的粒径为3μm。

6.根据权利要求2所述的试剂盒的制备方法，其特征在于，所述步骤（b）中活化条件为25℃下混悬活化30分钟。

7.根据权利要求2所述的试剂盒的制备方法，其特征在于，所述活化剂为EDC，所述EDC的终浓度为0.5~5mg/ml。

8.根据权利要求7所述的试剂盒的制备方法，其特征在于，所述EDC的终浓度为2mg/ml。

9.根据权利要求2所述的试剂盒的制备方法，其特征在于，所述步骤（c）中混悬反应条件为20~37℃下混悬反应2-24h。

10.根据权利要求9所述的试剂盒的制备方法，其特征在于，所述混悬反应条件为25℃下混悬反应6h。

11. 根据权利要求2所述的试剂盒的制备方法，其特征在于，所述步骤（d）中封闭剂组分为10~50mM Tris，100~200mM NaCl，0.05~0.2%吐温20或吐温80，0.5~10%BSA、酪蛋白、γ球蛋白、甘氨酸、赖氨酸中的至少一种，所述封闭剂的pH为7.2~7.4，所述封闭条件为20~37℃下混悬反应6~24h。

12. 根据权利要求11所述的试剂盒的制备方法，其特征在于，所述封闭剂组分为20mMTris，150mM NaCl，0.1%吐温20，2%BSA，2%甘氨酸，所述封闭条件为25℃下混悬反应24h。

13.根据权利要求1所述的试剂盒的制备方法，其特征在于，所述混悬处理条件为25℃下混悬反应30min；所述未交联上的吖啶酯用超滤管或者透析袋去除。

14.一种根据权利要求1至13任一项所述的试剂盒的制备方法获得的试剂盒。