CN115541873B - 测定三联吡啶钌浓度的方法和组合物 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及测定三联吡啶钌浓度的方法和组合物。本申请提供一种测定三联吡啶钌浓度的组合物，包括链霉亲和素包被磁珠溶液和生物素化抗钌抗体溶液。进一步，提供了一种测定三联吡啶钌浓度的方法，进而能测定标钌抗体上标记三联吡啶钌的个数。该方法能准确、有效、方便地测定标钌抗体上标记三联吡啶钌的个数。该方法可以成为一个稳定的产品检验环节，排除由于标钌不足或过度造成的风险，提升产品的品质和合格率。
Description
技术领域
本申请涉及免疫检测技术领域，具体涉及测定三联吡啶钌浓度的方法和组合物。
背景技术
免疫法是当前体外诊断试剂领域重要的检测手段。主要检测对象是多种多样的蛋白质(抗原)，主要利用了两种抗体与抗原形成“三明治”结构，实现检测目的。在多种多样的免疫检测方法中，电化学发光作为一种高效，精准，方便的检测手段获得了越来越广泛的应用。世界排行第一的罗氏诊断公司的主打产品就是以三联吡啶钌标记抗体为特征的电化学发光产品。该产品广泛应用于肿瘤标志物，心脏标志物，激素，传染病等大量的免疫诊断中。目前中国的很多企业也在开发相同或相似的电化学发光试剂产品。
在该类试剂盒的开发过程中，抗体的标钌过程(即将三联吡啶钌结构的小分子标记到抗体上)是整个工艺的的关键环节。标钌的效果直接影响最终的试剂盒的效果。而且由于绝大多数标钌是利用了抗体中的游离氨基进行反应，标钌过少信号不足，过度的标钌也会造成抗体失去原来的识别抗原的能力。所以标钌的个数需要进行比较严格的控制，标钌太多和太少都不行。目前一般是通过标钌试剂的加入量来控制标上去的钌的个数。由最终做成的试剂盒的性能来评价标钌的效果。然而这种方法只能评价出标钌的成功与否，而到底抗体上标上去了几个钌，需要向哪个方向进行调整的问题是无法回答的。如果能够准确地测定出抗体上标记的三联吡啶钌的个数，将会极大地提升对抗体标记过程和结果的把握，进而准确制订出改进的方向。该测定方法可以成为一个稳定的产品检验环节，排除由于标钌不足或过度造成的风险，提升产品的品质和合格率。
发明内容
基于此，本申请有必要提供一种基于电化学发光技术能够准确、方便的测定样本中三联吡啶钌浓度的方法。进而获得抗体上标记的三联吡啶钌的个数。
具体技术方案如下：
本申请第一方面提供了一种用于测定三联吡啶钌浓度的组合物，包括如下试剂：
试剂RM：链霉亲和素包被磁珠溶液；及
试剂R1：生物素化抗钌抗体溶液。
在其中一个实施例中，所述链霉亲和素包被磁珠的浓度为0.5mg/ml～1.0mg/ml；所述生物素化抗钌抗体的浓度为1μg/ml～10μg/ml。
在其中一个实施例中，所述试剂R1中的生物素与抗钌抗体的摩尔比为1:1～10:1。
本申请第二方面提供了一种试剂盒，包括上述任一项所述的组合物。
可选地，所述试剂盒可用于测定样本中三联吡啶钌浓度或测定标钌抗体上标记三联吡啶钌的个数。
在其中一个实施例中，所述试剂盒与罗氏诊断的e411型电化学发光免疫分析仪配套使用。
本申请第三方面提供了一种测定样本中三联吡啶钌浓度的方法，包括如下步骤：
步骤a：将三联吡啶钌标准品梯度稀释，制成多个不同浓度的标准品溶液。
步骤b：将多个不同浓度的标准品溶液或待测样本作为试剂R2与上述任一项所定义的试剂RM和试剂R1组合成完整的试剂盒，对空白样本进行标准的电化学发光测定，记录测定产生的电化学发光信号强度。
步骤c：根据标准品溶液中的三联吡啶钌摩尔浓度和对应的电化学发光信号强度拟合标准曲线。及
步骤d：根据所述标准曲线和所述待测样本的电化学发光信号强度，得出待测样本中的三联吡啶钌的摩尔浓度。
可选地，空白样本为PBS。
在其中一个实施例中，所述待测样本包括待测标钌抗体。
可选地，所述待测标钌抗体为已知浓度的抗体。
可选地，所述待测标钌抗体浓度为0.1μg/ml～1μg/ml。
在其中一个实施例中，所述待测标钌抗体与生物素化抗钌抗体的浓度比的1:10。
本申请第四方面提供了一种测定标钌抗体上标记三联吡啶钌的个数的方法，包括如下步骤：
利用上述任一项所述的测定样本中三联吡啶钌浓度的方法得出待测标钌抗体中的三联吡啶钌的摩尔浓度；及
根据待测标钌抗体中的三联吡啶钌的摩尔浓度与待测标钌抗体的摩尔浓度的比值，得出标钌抗体上标记三联吡啶钌的个数。
与现有技术相比较，本申请具有如下有益效果：
本申请提供的测定标钌抗体上标记三联吡啶钌的个数的方法借助电化学发光免疫分析的高灵敏度以及高重现性(一般CV<2％)，显著提升了标钌个数以及标钌程度的检测效果和检测效率。浓度低至1fmol/ml浓度的三联吡啶钌都可以准确检出。同时，该方法不受溶液中包括抗体在内的蛋白成分以及防腐剂，添加剂等的干扰，具有良好的特异性和选择性。该方法使标钌结果变得可控而且量化，进而可以明显提升电化学发光试剂盒的开发效率和开发效果。
附图说明
图1为标准曲线，其中纵坐标为电化学发光信号强度(RLU值)，横坐标为三联吡啶钌摩尔浓度pmol/mL。
具体实施方式
为使本申请的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本申请的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本申请。但是本申请能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本申请内涵的情况下做类似改进，因此本申请不受下面公开的具体实施例的限制。
此外，术语“第一方面”、“第二方面”、“第三方面”“第四方面”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一方面”、“第二方面”、“第三方面”“第四方面”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本申请的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本申请的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本申请。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
术语“电化学发光免疫测定”简称ECLI，是继放射免疫、酶免疫、荧光免疫、化学发光免疫测定以后的新一代标记免疫测定技术。电化学发光法源于电化学法和化学发光法，而ECLI是电化学发光(ECL)和免疫测定相结合的产物，是一种在电极表面由电化学引发的特异性化学发光反应，包括了电化学和化学发光二个过程。ECL不仅可以应用于所有的免疫测定，而且还可用于DNA/RNA探针检测。电化学发光过程产生的光信号的强度与二价的三氯联吡啶钌[Ru(bpy)3]2+的浓度成线性关系。将二价的三氯联吡啶钌[Ru(bpy)3]2+与免疫反应体系中的一种物质结合，经免疫反应、分离后，检测免疫反应体系中剩余二价的三氯联吡啶钌[Ru(bpy)3]2+经上述过程后所发出的光，即可得知待检物的浓度。
本申请一实施方式提供了用于测定三联吡啶钌浓度的组合物，包括如下试剂：
试剂RM：链霉亲和素包被磁珠溶液；及
试剂R1：生物素化抗钌抗体溶液。
在一个具体示例中，链霉亲和素包被磁珠的浓度为0.5mg/ml～1.0mg/ml，优选为0.72mg/ml。生物素化抗钌抗体的浓度为1μg/ml～10μg/ml，具体地，可以为1μg/ml、2μg/ml、3μg/ml、4μg/ml、5μg/ml、6μg/ml、7μg/ml、8μg/ml、9μg/ml、10μg/ml，或是以上任意数值组成的范围。优选为2μg/ml。
在一个具体示例中，试剂R1中的生物素化与抗钌抗体的摩尔比为1:1～10:1，优选地，5:1。
本申请一实施方式还提供了上述组合物的制备方法，包括试剂RM的制备和试剂R1的制备。具体地：
试剂RM可以为罗氏诊断的总前列腺特异性抗原(PSA)定量测定试剂盒(电化学发光法)的配套磁珠，磁珠浓度为0.72mg/ml。在其他实施方式中可以根据本领域常规的技术手段制备或通过其他商业化途径购买链霉亲和素磁颗粒经PBS缓冲液稀释为可用浓度，可选地，浓度为0.5mg/ml～1mg/ml。
试剂R1通过采用经典的生物素NHS活化酯方法制备。在一具体示例中，将N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化的生物素(NHS-biotin)与抗钌抗体按照1:1～10:1的摩尔比在2℃～8℃或室温条件下混匀反应0.5h～2h，透析或过柱除去多余的NHS活化的生物素及副产物，得生物素化抗钌抗体。
在一具体示例中，抗钌抗体的制备方法包括使用三联吡啶钌标记的蛋白免疫小鼠获得的抗体。可采用本领域技术人员熟知的常规方法制备抗钌抗体。
本申请一实施方式还提供了一种试剂盒，包括上述任一项所述的组合物。
可选地，该试剂盒或组合物可用于测定样本中三联吡啶钌浓度或测定标钌抗体上标记三联吡啶钌的个数。
在一个具体示例中，该试剂盒可以与罗氏诊断的e411型电化学发光免疫分析仪配套使用。
本申请一实施方式还提供了一种测定样本中三联吡啶钌浓度的方法，包括步骤a～步骤d。可选地，样本包括标钌抗体。
具体地：
步骤a：将三联吡啶钌标准品梯度稀释，制成多个不同浓度的标准品溶液。
在一个具体示例中，标准品溶液中三联吡啶钌的浓度为0fmol/ml-25pmol/ml。进一步地，标准品溶液中三联吡啶钌的浓度分别为0pmol/ml、0.001pmol/ml、0.03pmol/ml、0.1pmol/ml、0.3pmol/ml、1pmol/ml、2pmol/ml、4pmol/ml、6pmol/ml、8pmol/ml、10pmol/ml、15pmol/ml、20pmol/ml和25pmol/ml。
步骤b：将多个不同浓度的标准品溶液或待测样本作为试剂R2与上述任一项所定义的试剂RM和试剂R1组合成完整的试剂盒，对空白样本进行标准的电化学发光测定，记录测定产生的电化学发光信号强度。
在一个具体示例中，使用罗氏诊断的e411型电化学发光免疫分析仪对电化学发光测定。
在一个具体示例中，标准品溶液、待测标钌抗体、试剂RM或试剂R1加入的体积可以为50μl-80μl。在其他具体示例中，试剂加入量可以由罗氏诊断的e411型电化学发光免疫分析仪的标准程序自动规定。
可选地，空白样本为PBS。空白样本的加入体积为10μl-50μl。
可选地，待测样本可以为待测标钌抗体。可选地，待测标钌抗体为已知浓度的抗体，待测标钌抗体浓度为0.1μg/ml～1μg/ml，具体地，可以为0.1μg/ml、0.2μg/ml、0.3μg/ml、0.4μg/ml、0.5μg/ml、0.6μg/ml、0.7μg/ml、0.8μg/ml、0.9μg/ml、1μg/ml，或是以上任意数值组成的范围。
在一个具体示例中，待测标钌抗体与生物素化抗钌抗体的浓度比的1:10。
步骤c：根据标准品溶液中的三联吡啶钌摩尔浓度和对应的电化学发光信号拟合标准曲线。
步骤d：根据标准曲线和待测标钌抗体的电化学发光信号强度，得出待测标钌抗体中的三联吡啶钌的摩尔浓度。
具体地，可以将待测标钌抗体的电化学发光信号强度代入标准曲线中，得出待测标钌抗体中的三联吡啶钌的摩尔浓度。
需要注意的是，本申请在测定标钌抗体中的三联吡啶钌的摩尔浓度时，会受到标钌抗体溶液中游离状态的三联吡啶钌的干扰。因此，在步骤b之前，还包括去除待测标钌抗体中游离的三联吡啶钌。可选地，通过透析方法除待测标钌抗体中游离的三联吡啶钌。
本申请一实施方式还提供了一种测定标钌抗体上标记三联吡啶钌的个数的方法，该方法借助电化学发光免疫分析的高灵敏度以及高重现性(CV<2％)，显著提升了标钌个数以及标钌程度的检测效果和检测效率。浓度低至1fmol/ml浓度的三联吡啶钌都可以准确检出，这是其他方法所无法实现的。同时，本方法不受溶液中包括抗体在内的蛋白成分以及防腐剂，添加剂等的干扰，具有良好的特异性和选择性，这也是绝大部分的光谱学方法所不具备的。该方法使标钌结果变得可控而且量化，进而可以明显提升电化学发光试剂盒的开发效率和开发效果。从而解决了三联吡啶钌标记的过程控制和产品评价的问题。
具体地，包括步骤a和b：
步骤a：利用上述测定标钌抗体中三联吡啶钌浓度的方法得出待测标钌抗体中的三联吡啶钌的摩尔浓度。
在一个具体示例中，准备好固定浓度的试剂RM和试剂R1。将待测标钌抗体稀释到固定浓度，作为试剂R2。将以上三个组分组装成一份三联装的试剂盒，使其能与罗氏诊断e411型电化学发光免疫分析仪相匹配。使用罗氏诊断的e411型电化学发光免疫分析仪中的TPSA标准程序对空白样本电化学发光免疫测定。该仪器自动进行试剂加注，孵育反应，清洗及电化学发光测定。相应的发光底物(Procell)，清洗液(Clean cell)等配套试剂都为该仪器的常规的配套试剂。最终记录下获得的电化学发光信号强度(RLU值)。将待测标钌抗体的化学发光信号强度与标准曲线对比，获得待测标钌抗体中的三联吡啶钌的摩尔浓度。
步骤b：根据待测标钌抗体中的三联吡啶钌的摩尔浓度与待测标钌抗体的摩尔浓度的比值，得出标钌抗体上标记三联吡啶钌的个数。
本申请提供的测定标钌抗体上标记三联吡啶钌的个数的方法，首先利用生物素化的抗钌抗体捕捉待测标钌抗体溶液或标准溶液中的三联吡啶钌分子，形成结合物。随后该结合物被链霉亲和素包被的磁珠捕获。由于生物素化的抗钌抗体和链霉亲和素包被磁珠都是过量的，所以磁珠上的捕获的三联吡啶钌个数与待测物中的三联吡啶钌浓度成正比。通过电化学发光免疫测定会产生与磁珠上三联吡啶钌数量成正比的发光信号。由此建立发光信号与三联吡啶钌含量的正比例对应关系，从而建立灵敏度高，重现性高，误差小的检测方法。
本申请虽然专注于三联吡啶钌标记的分析测定，但本方法可以推广到其他类似小分子标记物的检测中，例如，地高辛、荧光探针等小分子标记物。
具体实施例
下面将结合实施例对本申请的实施方案进行详细描述。应理解，这些实施例仅用于说明本申请而不用于限制本申请的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，优先参考本申请中给出的指引，还可以按照本领域的实验手册或常规条件，还可以按照制造厂商所建议的条件，或者参考本领域已知的实验方法。
下述的具体实施例中，涉及原料组分的量度参数，如无特别说明，可能存在称量精度范围内的细微偏差。涉及温度和时间参数，允许仪器测试精度或操作精度导致的可接受的偏差。
实施例1组合物的制备
本实施例是组合物的制备示例，组合物包括试剂RM和试剂R1。
(1)试剂RM：链霉亲和素包被磁珠。
使用的链霉亲和素包被磁珠可以为罗氏诊断的总前列腺特异性抗原(PSA)定量测定试剂盒(电化学发光法)的配套磁珠，磁珠浓度为0.72mg/ml。
在其他实施例中可以根据本领域常规技术手段制备链霉亲和素包被磁珠，磁珠浓度为0.5mg/ml～1.0mg/ml。
(2)试剂R1：生物素化抗钌抗体溶液。
抗钌抗体为使用三联吡啶钌标记的蛋白免疫小鼠获得的抗体。具体地，通过使用标记了三联吡啶钌的BSA(牛血清白蛋白)对小鼠进行免疫获得的。该抗体能够有效地结合各种形式地三联吡啶钌，如游离的或标记到抗体上的。
之后，通过经典的生物素NHS活化酯方法将该抗体生物素化。具体地，将N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化的生物素(NHS-biotin)与抗钌抗体按照1:1～10:1(优选为5：1)的摩尔比在2℃～8℃或室温条件下混匀反应0.5h～2h，透析或过柱除去多余的NHS活化的生物素及副产物，得生物素化抗钌抗体。用0.1M PBS水溶液(pH7.4)将其浓度调整为1μg/ml～10μg/ml。
该组合物可用于测定三联吡啶钌浓度或测定标钌抗体上标记三联吡啶钌的个数。在一具体示例中，可使用罗氏诊断的e411型电化学发光免疫分析仪进行测定，需将待测的标钌抗体作为试剂R2与上述组合物中的试剂RM和试剂R1组装成一份适用于罗氏诊断的e411型电化学发光免疫分析仪配套的试剂盒。具体地，可取一套罗氏诊断的三联装电化学发光免疫分析试剂盒(适用机型为cobas e411型)的空盒，向其中的RM，R1，R2瓶子分别加注上述三种试剂。
试剂R2为待测的抗体浓度已知的三联吡啶钌标记抗体(简称为待测标钌抗体)。将该抗体彻底透析去除游离的三联吡啶钌，之后用0.1M PBS水溶液(pH7.4)稀释为0.1μg/ml～1μg/ml，待测标钌抗体工作浓度为生物素化抗钌抗体工作浓度的十分之一。当制作标准曲线时，试剂R2为系列不同浓度的三联吡啶钌溶液。
测定时以0.1M PBS水溶液(pH7.4)为空白样本。其他试剂如清洗液，发光底物等都为罗氏诊断的常规配套试剂。试剂添加量和检测流程按照罗氏诊断TPSA(总前列腺特异抗原)检测程序自动进行。
实施例2标准曲线的绘制
在本实施例中，试剂RM：链霉亲和素包被磁珠，磁珠浓度为0.72mg/ml；试剂R1：生物素化抗钌抗体溶液浓度为2μg/ml(摩尔浓度为13.3pmol/ml)；试剂R2：三联吡啶钌(采购自Merck公司，货号为544981，化合物名称为Tris(2,2′-bipyridyl)dichlororuthenium(II)hexahydrate)，三联吡啶钌的系列标准溶液(介质为0.1M PBS，pH7.4)的浓度分布为0fmol/ml-25pmol/ml，具体浓度分别为0pmol/ml、0.001pmol/ml、0.03pmol/ml、0.1pmol/ml、0.3pmol/ml、1pmol/ml、2pmol/ml、4pmol/ml、6pmol/ml、8pmol/ml、10pmol/ml、15pmol/ml、20pmol/ml和25pmol/ml。并以空白的0.1M PBS水溶液(pH7.4)为标准曲线的起点。
测定空白样本为0.1M PBS水溶液(pH7.4)，加入量为10μl。
测定时使用罗氏诊断的TPSA标准程序，使用仪器为罗氏诊断e411型电化学发光免疫分析仪。由该仪器自动进行试剂加注，试剂RM、R1和R2各加注50μl，孵育反应，清洗及电化学发光测定。相应的发光底物(Procell)，清洗液(Clean cell)等配套试剂都为该仪器的常规配套试剂。记录电化学发光信号强度(RLU值)绘制标准曲线，如图1所示。由此建立了低浓度三联吡啶钌的测定方法。
实施例3标钌抗体上标钌个数的测定
在本实施例中，试剂RM：链霉亲和素包被磁珠，磁珠浓度为0.72mg/ml；试剂R1：生物素化抗钌抗体溶液浓度为2μg/ml(摩尔浓度为13.3pmol/ml)，试剂R2：待测的标钌抗体，经透析去除游离的三联吡啶钌，用0.1M PBS(pH7.4)将该抗体浓度稀释至0.2μg/ml(摩尔浓度为1.3pmol/ml)。
测定空白样本为0.1M PBS水溶液(pH7.4)，加入10μl。
测定时使用罗氏诊断的TPSA标准程序，使用仪器为罗氏诊断e411型电化学发光免疫分析仪。由该仪器自动进行试剂加注，试剂RM、R1和R2各加注50μl，孵育反应，清洗及电化学发光测定。相应的发光底物(Procell)，清洗液(Clean cell)等配套试剂都为正常的该仪器的配套试剂。记录电化学发光信号强度(RLU值)。
将该RLU值与实施例2中获得的标准曲线进行比较。可获得待测样本中三联吡啶钌标记分子的摩尔浓度M为7.5pmol/ml。将M/1.3pmol/ml就可获得平均每个抗体上的标钌个数为5.8个。
使用上述方法对罗氏诊断的TPSA的电化学发光免疫试剂进行测定，发现其每个抗体平均标记的三联吡啶钌个数为6.5-7.0个。而对其他市面上的标钌抗体的研究结果显示，大部分抗体的标钌个数为5-8时，整个试剂的信号处于较高的水平。而在检测的所有标钌抗体中抗体最多可以标记上12-14个三联吡啶钌，达到这个标记量后，再增加标钌试剂或延长标钌时间对标钌结果几乎无影响，可认为抗体上的所有氨基都被标记饱和了。虽然抗体标钌的个数最多，但试剂的信号却明显下降了。这说明如果全部氨基都被标记了，抗体失去了原来的与抗原结合的能力。由此可见，在标记抗体时，标记量并非越多越好。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本申请的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。因此，本申请专利的保护范围应以所附权利要求为准，说明书及附图可以用于解释权利要求的内容。
Claims (4)
1.一种测定标钌抗体上标记三联吡啶钌的个数的方法，其特征在于，包括如下步骤：
测定待测标钌抗体中的三联吡啶钌的摩尔浓度；
根据待测标钌抗体中的三联吡啶钌的摩尔浓度与待测标钌抗体的摩尔浓度的比值，得出标钌抗体上标记三联吡啶钌的个数；
其中，测定样本中三联吡啶钌浓度的方法，包括如下步骤：
步骤a：将三联吡啶钌标准品梯度稀释，制成多个不同浓度的标准品溶液；
步骤b：将多个不同浓度的标准品溶液或待测样本作为试剂R2与试剂RM和试剂R1组合成完整的试剂盒，对空白样本进行标准的电化学发光测定，记录测定产生的电化学发光信号强度；
步骤c：根据标准品溶液中的三联吡啶钌摩尔浓度和对应的电化学发光信号强度拟合标准曲线；及
步骤d：根据所述标准曲线和所述待测样本的电化学发光信号强度，得出待测样本中的三联吡啶钌的摩尔浓度；
所述待测样本包括待测标钌抗体；
试剂RM：链霉亲和素包被磁珠溶液；及
试剂R1：生物素化抗钌抗体溶液；
所述链霉亲和素包被磁珠的浓度为0.5mg/ml～1.0mg/ml；
所述生物素化抗钌抗体的浓度为2μg/ml～10μg/ml；
所述待测标钌抗体浓度为0.2μg/ml～1μg/ml；
所述待测标钌抗体与生物素化抗钌抗体的浓度比为1:10；
在测定待测标钌抗体中的三联吡啶钌的摩尔浓度之前，还包括去除待测标钌抗体中游离的三联吡啶钌的步骤。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述试剂R1中的生物素与抗钌抗体的摩尔比为1:1～10:1。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述试剂盒与罗氏诊断的e411型电化学发光免疫分析仪配套使用。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述空白样本为PBS。
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