CN101250585A - 一种检测dna,rna和超微量蛋白质的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测DNA,RNA和超微量蛋白质的方法,首先利用磁珠捕获探针上的捕获探针1(可为核酸或抗体)与纳米结合探针上捕获探针2(可为核酸或抗体)在液相中夹心ELISA检测靶分子,再利用磁铁吸附磁珠,很容易去除未结合的探针和其他杂质。由于纳米结合探针结合成千上万的生物素标记的条码DNA,可把检测靶分子成千上万倍放大;每分子条码DNA利用链亲和素—生物素系统可结合3分子含T7RNA启动子的DNA序列,从而可用TMA技术定量检测条码DNA,而条码DNA与靶分子含量成正比。对特定的含T7RNA启动子的DNA序列,TMA技术可在3小时内按一分子DNA模板转录出约1万分子RNA,相应地把条码DNA扩增一万倍。
Description
技术领域
本发明涉及采用DNA条码一纳米金-T7RNA转录扩增(Bio-DNA TMA)方法检测DNA,RNA和超微量蛋白质的技术。
背景技术
临床分子水平定量检测DNA,RNA和蛋白质已广泛应用于疾病诊断,疾病疗效和预后的判断。目前一般采用荧光定量PCR和RT-PCR,T7RNA转录介导的杂交保护发光(TMA-HPA)检测DNA和RNA含量,发光ELISA检测微量蛋白质。另外,还有一类不需靶分子扩增的核酸检测方法如分支DNA杂交技术(bDNA),捕获杂交技术(Hybrid Capture,HC)。近年以纳米材料发展的检测DNA,RNA,微量蛋白质技术引人注目,如Mirkin CA等发明的DNA条码-纳米金技术(Bio-coded nanoparticles technology)检测DNA,RNA和超微量蛋白质。各种技术都有其优缺点,核酸扩增技术灵敏度高,但易产生假阳性和假阴性,并且实验条件要求高;杂交技术简便易自动化,重复好,但灵敏度较低,试剂成本昂贵;纳米技术灵敏高,方便,成本较低,但定量需特需仪器,不易标准化和大规模检测。
发明内容
为了吸取各方法的优点,避免其缺陷,本发明提供一种既具有PCR法的高敏感性,又要避免PCR的缺陷,且简便易行的DNA条码-纳米金-T7RNA转录扩增(Bio-DNA TMA)方法检测DNA,RNA和超微量蛋白质,用于科研和临床分子诊断。
DNA条码-纳米金-T7RNA转录扩增(Bio-DNATMA)方法主要综合利用纳米技术和TMA扩增技术的优点,克服各自的缺陷,建立的一种新的分子水平检测DNA,RNA和超微量蛋白质技术。此技术首先利用磁珠捕获探针上的捕获探针1(可为核酸或抗体)与纳米结合探针上捕获探针2(可为核酸或抗体)在液相中夹心ELISA检测靶分子,再利用磁铁吸附磁珠,很容易去除未结合的探针和其他杂质。由于纳米结合探针结合成千上万的生物素标记的条码DNA,可把检测靶分子成千上万倍放大;每分子条码DNA利用链亲和素-生物素系统可结合3分子含T7RNA启动子的DNA序列,从而可用TMA技术定量检测条码DNA,而条码DNA与靶分子含量成正比。对特定的含T7RNA启动子的DNA序列,TMA技术可在3小时内按一分子DNA模板转录出约1万分子RNA,相应地把条码DNA扩增一万倍。转录的RNA用高灵敏度的荧光染料RiboGreen荧光光度法检测(可检测0.2ng的RNA),通过上述三步放大反应,可把靶分子扩增约3×108倍,可与PCR相媲美。
Bio-DNA TMA吸收了纳米金技术和TMA技术的扩增优点,灵敏度可达PCR技术水平,理论上可检测一个靶分子。由于Bio-DNATMA不是直接扩增靶分子,因而避免了PCR技术的假阳性问题,且操作简单,重复性好,易于大规模检测,也不需要贵重仪器,成本相对较低。此技术可应用于检测DNA,RNA和超微量蛋白质,特别是现在还没有成熟的分子水平检测体液中超微量蛋白质技术,因而Bio-DNA TMA具有广泛的应用价值。
附图说明
图1为磁珠捕获探针和纳米结合探针的制备示意图;
图2为磁珠捕获探针和纳米结合探针夹心ELISA检测靶DNA的过程示意图;
图3为生物素-链亲和素桥连TMA的过程示意图
图4为TMA扩增反应示意图;
图5为RiboGreen荧光定量检测RNA的示意图;
图6为Bio-DNATMA检测RNA原理示意图;
图7为Bio-DNATMA检测超微量蛋白质的原理示意图。
具体实施方式
原理
1.磁珠捕获探针的制备:表面带有游离-NH3的磁珠,与末端带有-SH的捕获探针1(3末端带有-SH,中间带有PEG和10个连续的A,作为间隔桥梁序列,5末端为与检测靶DNA 3末端互补的18-25bp碱基序列)用戊二醛的方法连接氨基和巯基,使捕获探针1标记到磁珠表面,制成磁珠捕获探针(图1)。
2.纳米结合探针的制备:纳米金颗粒的金原子与5末端带有-SH的捕获探针2和条码DNA(条码DNA/捕获探针2为100∶1)在水溶液中形成共价键,牢固结合在纳米金的表面,逐步加NaCl到终浓度为0.3M,使捕获探针2和条码DNA在纳米金表面伸展(捕获探针2其5末端带有-SH,中间带有PEG和10个连续的A,作为间隔桥梁序列,3末端为与检测靶DNA 5末端互补的18-25bp碱基序列;条码DNA其5末端带有-SH,中间带有10个连续的A,作为间隔桥梁序列,3末端为一段与检测DNA不互补且无关的18-25bp DNA,并用生物素标记),制备纳米结合探针(图1)。
3. 生物素标记的含T7启动子的DNA序列的制备:设计引物:F:5-BIOTIN-GAGAGA GGA TCC AAG TAC TAA TAC GAC TCA CTA TAG-3(5末端用生物素标记,下划线部分为T7启动子序列);R:5-ATC TTG CAA GAA AAC AGA TGG CAA GCA TGA CTC GAG GCG CCT TGT CCC AAG-3(下划线部分为T7RNA酶终止序列).以pcDNA-HCCR质粒(HCCR基因cDNA克隆入pET-30a表达质粒)为模板,PCR扩增HCCR基因的500bp序列,扩增产物纯化后作为生物素标记的含T7启动子的DNA序列。
4. Bio-DNA TMA法检测靶DNA原理:磁珠捕获探针上的捕获探针1与检测靶DNA3末端互补,纳米结合探针捕获探针2与检测DNA 5末端互补,在杂交缓冲液中夹心法结合靶DNA,磁铁吸附磁珠捕获探针,去上清液,并洗涤,去除未结合的纳米结合探针和其他杂质(图2)。再加入杂交缓冲液重悬磁珠,以及链亲和素,生物素标记的含T7启动子的DNA序列,37℃,温育30分钟,磁铁吸附磁珠捕获探针,去上清液,并洗涤,去除未结合的链亲和素,生物素标记的含T7启动子的DNA序列(图3)。加入T7RNA聚合酶缓冲液,T7RNA聚合酶和四种核苷酸(UTP,ATP,GTP,CTP),37℃,温育3小时,转录RNA(图4),RNA的量与检测靶DNA含量成正比。转录的RNA用RiboGreen荧光染料荧光光度计定量检测(图5)。
5. Bio-DNA TMA法检测DNA的扩增原理:
第一次扩增:直径200nm的纳米结合探针可结合约10000条DNA条码,可把靶DNA放大104倍。第二次扩增;每一条条码DNA可通过链亲和素结合3条生物素标记的含T7启动子的DNA序列,放大3倍。第三次扩增:每一条含T7启动子的DNA序列在T7RNA聚合酶作用下,3小时可合成约104个RNA分子,此步放大104倍。RiboGreen荧光染料最低能够检测0.2ng RNA,约对应于108个500bp的RNA分子。一分子检测靶DNA通过三次放大反应可放大到3×108倍,恰够RiboGreen荧光染料检测最低极限,因而理论上Bio-DNATMA法可检测到一分子靶DNA。
6.Bio-DNA TMA法检测RNA原理:磁珠捕获探针上的捕获探针1与检测靶RNA3末端互补,纳米结合探针上捕获探针2与检测靶RNA 5末端互补,在杂交缓冲液中夹心法结合靶RNA,磁铁吸附磁珠捕获探针,去上清液,并洗涤,去除未结合的纳米结合探针和其他杂质。再加入杂交缓冲液重悬磁珠,以及链亲和素,生物素标记的含T7启动子的DNA序列,37℃,温育30分钟,磁铁吸附磁珠捕获探针,去上清液,并洗涤,去除未结合的链亲和素,生物素标记的含T7启动子的DNA序列。加入T7RNA聚合酶缓冲液,T7RNA聚合酶和四种核苷酸(UTP,ATP,GTP,CTP),37℃,温育3小时,转录RNA,RNA的量与检测靶DNA含量成正比。转录的RNA用RiboGreen荧光染料荧光光度计定量检测(图6)。
7.Bio-DNATMA法检测超微量蛋白的原理:与检测DNA,RNA不同的是,用针对检测靶蛋白的两株结合位点不同的单抗,分别替代捕获探针1和捕获探针2,制备磁珠捕获探针和纳米结合探针。磁珠捕获探针上的抗体1与纳米结合探针上抗体2夹心法结合靶蛋白,磁铁吸附磁珠捕获探针,去上清液,并洗涤,去除未结合的纳米结合探针和其他杂质。再加入结合缓冲液重悬磁珠,以及链亲和素,生物素标记的含T7启动子的DNA序列,37℃,温育30分钟,磁铁吸附磁珠捕获探针,去上清液,并洗涤,去除未结合的链亲和素,生物素标记的含T7启动子的DNA序列。加入T7RNA聚合酶缓冲液,T7RNA聚合酶和四种核苷酸(UTP,ATP,GTP,CTP),37℃,温育3小时,转录RNA,RNA的量与检测靶DNA含量成正比。转录的RNA用RiboGreen荧光染料荧光光度计定量检测(图7)。
实施例1:DNA的检测
1.引物设计:以检测EBV的BamHI-W片段DNA为例(NCBI genbankaccession No:M15973)。
检测BamHI-W片段DNA的序列:
2091 CCATCCCTGA AGACCCAGCG GCCATTCTCT CTGGTAACGA GCAGAGAAGA
AGTAGAGGCC CGCGGCCATT GGGCCCAGAT TGAGAGACCA GTCCAGGGGC CCGAGGTTGG
AGCCAGCGGG CACCCGAGGT CC 2222。
(1),捕获探针1:5-GGG CTT GGC CGG GTC TAA-PEG-AAAAAAAAAA-SH-(C6)-3.(下划线部分与EBV BamHI-W片段DNA结合)。
(2),捕获探针2:5-SH-(C6)-AAAAAAAAAA-PEG-GGA GGG ACC GGG TGC TGG-3(下划线部分与EBV BamHI-W片段DNA结合)。
(3)条码DNA:5-SH-(C6)-AAA AAA AAA A-PEG-GGA TTC TCA ACTCGT AGC T-Biotin-3.
(4)阳性检测靶DNA:以EBV BamHI-W片段DNA为模板,合成一段阳性对照引物,5-CCA GCA CCC GGT CCC TCC AAA AAA AAA TTA GAC CCGGCC AAG CCC-3(下划线为桥联序列)。
2.磁珠捕获探针的制备:
(1)取1ml直径1μm表面带有游离-NH3的磁珠,加4ml PBS(0.01M,pH 7.4)充分摇匀,用磁铁吸附磁珠,去上清;重复三次,去上清。
(2)用PBS配制新鲜的5%戊二醛溶液。
(3)在磁珠中加入新鲜配制的5ml 5%戊二醛溶液,充分摇匀,放在旋转摇床,室温摇3小时。
(4)用磁铁吸附磁珠,去上清;加5ml PBS充分摇匀,磁铁吸附磁珠,去上清,重复三洗次。
(5)加入5OD的捕获探针1(过量),充分摇匀,放在旋转摇床,室温摇24小时。
(6)用磁铁吸附磁珠,去上清;加5ml PBS充分摇匀,磁铁吸附磁珠,去上清,重复三洗次。
(7)加入1M的甘氨酸5ml,充分摇匀,放在旋转摇床,室温摇3小时,封闭非结合位点。
(8)用磁铁吸附磁珠,去上清;加5ml PBS充分摇匀,磁铁吸附磁珠,去上清,重复三洗次。最后用1ml PBS重悬,4℃保存。
(9)260nm测定OD值,验证捕获探针1是否标记上。
2.纳米结合探针的制备:
(1)捕获探针2和条码DNA引物用纯水溶解,按条码DNA/捕获探针2为100∶1的比例混匀。
(2)取5ml直径100nm的纳米金溶液,加入总量为5OD的条码DNA和捕获探针2混和液,充分摇匀。室温旋转摇床摇过夜。
(3)加热至60度,加入5M NaCl 50ul,10%SDS 50ul,混匀,室温旋转摇床摇2h。加热至60度,加5M NaCl 50ul混匀,室温旋转摇床摇2h;重复四次。使NaCl终浓度为0.3M。观察溶液颜色为紫红色。
(4)10000rpm离心10分钟,去上清;加入PBS含0.3M NaCl,0.1%SDS,重悬。同样离心洗涤3次,最后加入用5ml PBS含5%BSA,0.3M NaCl,0.1%SDS重悬,37℃,摇2h,封闭未结合位点。10000rpm离心10分钟,去封闭液,加1ml PBS(含0.3M NaCl,0.1%SDS)重悬,4℃保存。
(5)260nm测定OD值,验证条码DNA和捕获探针2是否标记上。
(6)260nm-800nm光谱扫描,在560nm处有一高吸收峰(100nm金特征吸收峰),根据560nm OD值估算纳米金的数量。
(7)取上面制备好的纳米结合探针10ul,倍比稀释,取1ul点在醋酸纤维薄膜上,37℃烤干,用5%的奶粉(含0.3M NaCl,0.1%SDS)37℃封闭2h;加HRP标记的链亲和素,37℃30分钟,用PBS含0.3M NaCl,0.1%SDS洗膜四次,加DAB显色。验证条码DNA标记效率。
3.Bio-DNA TMA法检测EBV DNA:
(1),取EDTA抗凝血浆500μl,用QIAamp DNA Blood MiniKit(Qiagen)试剂盒提取DNA,用50μl纯水洗脱。
(2),50μl样本DNA,50μl阳性对照DNA,50μl PBS阴性对照,分别加入10μl 5×杂交液(含0.5%SDS,5g聚蔗糖,5g聚乙烯吡咯烷酮,5g牛血清白蛋白V,1.5M NaCl,0.5M Tris-Hcl,pH 8.0)95℃5min,取出马上加入50μl磁珠捕获探针和50μl纳米结合探针,60℃10min,然后55℃旋转杂交2小时。
(3)磁分离器吸附磁珠30秒,弃去上清液,加入500μlPBS(0.3MNaCl,0.1%SDS)洗3次。
(4)磁珠重悬于50μl PBS(0.3M NaCl,0.1%SDS),依次加入50μl链亲和素(终浓度为5μg/ml,50μl生物素标记的含T7启动子的DNA序列(终浓度为250ng/ml)37℃,摇动30min。PBS(0.3M NaCl,0.1%SDS),同上洗4次。
(5)磁珠重悬于50μl T7RNA转录液(1×T7RNA转录缓冲液,60U T7RNA聚合酶,RNA酶抑制剂200U,1.25μM NTP),37℃,摇动3小时。
(6)加入20μl RiboGreen工作液(Invitrogen试剂盒带的TE缓冲液稀释200倍为工作液),激发光为485nm,发射光535nm测定荧光。
4.标准曲线的制作:
(1)把阳性检测靶DNA用PBS(0.3M NaCl,0.1%SDS)倍比稀释,使终浓度依次为100/ml,101/ml,102/ml,103/ml,104/ml,105/ml,106/ml,107/ml,按上面步骤操做,每一浓度做三个平行孔,测定荧光。
(2)取三个孔的荧光均值的对数与浓度对数做标准曲线。
(3)样品结果从标准曲线计算得去。
实施例2:RNA的检测
1.引物设计:以检测HCV的RNA为例(NCBI accession No:EU482888,检测对应序列nt 1-216)。
(1),捕获探针1:5-AAC TAC TGT CTT CAC GCA GAA AGC-PEG-AAAAAAAAAA-SH-(C6)-3.(下划线部分与HCV 5-UTR nt 1-18 RNA结合)。
(2),捕获探针2:5-SH-(C6)-AAAAAAAAAA-PEG-CCC AAC ACT ACT CGG CTA G-3(下划线部分与HCV 5-UTR nt 198-216RNA结合)。
(3)条码DNA:5-SH-(C6)-AAAAAAAAAA-PEG-GGA TTC TCA ACT CGTAGC T-Biotin-3.
(4)阳性检测靶RNA:WHO HCV标准品。
2.磁珠捕获探针的制备:
(1)取1ml直径1μm表面带有游离-NH3的磁珠,加4ml PBS(0.01M,pH 7.4,)充分摇匀,用磁铁吸附磁珠,去上清;重复三次,去上清。
(2)用PBS配制新鲜的5%戊二醛溶液。
(3)在磁珠中加入新鲜配制的5ml 5%戊二醛溶液,充分摇匀,放在旋转摇床,室温摇3小时。
(4)用磁铁吸附磁珠,去上清;加5ml PBS充分摇匀,磁铁吸附磁珠,去上清,重复三洗次。
(5)加入5OD的捕获探针1(过量),充分摇匀,放在旋转摇床,室温摇24小时。
(6)用磁铁吸附磁珠,去上清;加5ml PBS充分摇匀,磁铁吸附磁珠,去上清,重复三次。
(7)加入1M的甘氨酸5ml,充分摇匀,放在旋转摇床,室温摇3小时,封闭非结合位点。
(8)用磁铁吸附磁珠,去上清;加5ml PBS充分摇匀,磁铁吸附磁珠,去上清,重复三洗次。最后用1ml PBS(含RNA酶抑制剂100U)重悬,4℃保存。
(9)260nm测定OD值,验证捕获探针1是否标记上。
2.纳米结合探针的制备:
(1)捕获探针2和条码DNA引物用纯水溶解,按条码DNA/捕获探针2为100∶1的比例混匀。
(2)取5ml直径100nm的纳米金溶液,加入总量为50D的条码DNA和捕获探针2混和液,充分摇匀。室温旋转摇床摇过夜。
(3)加热至60度,加入5M NaCl 50ul,10%SDS 50ul,混匀,室温旋转摇床摇2h。加热至60度,加5M NaCl 50ul混匀,室温旋转摇床摇2h;重复四次。使NaCl终浓度为0.3M。观察溶液颜色为紫红色。
(4)10000rpm离心10分钟,去上清;加入PBS含0.3M NaCl,0.1%SDS,重悬。同样离心洗涤3次,最后加入用5ml PBS含5%BSA,0.3M NaCl,0.1%SDS重悬,37℃,摇2h,封闭未结合位点。10000rpm离心10分钟,去封闭液,加1ml PBS(含0.3M NaCl,0.1%SDS,RNA酶抑制剂100U)重悬,4℃保存。
(5)260nm测定OD值,验证条码DNA和捕获探针2是否标记上。
(6)260nm-800nm光谱扫描,在560nm处有一高吸收峰(100nm金特征吸收峰),根据560nm OD值估算纳米金的数量。
(7)取上面制备好的纳米结合探针10ul,倍比稀释,取1ul点在醋酸纤维薄膜上,37℃烤干,用5%的奶粉(含0.3M NaCl,0.1%SDS)37℃封闭2h;加HRP标记的链亲和素,37℃30分钟,用PBS含0.3MNaCl,0.1%SDS洗膜四次,加DAB显色。验证条码DNA标记效率。
3.Bio-DNA TMA法检测HCV RNA:
(1),取EDTA抗凝血浆500μl,用QIAamp RNA Blood MiniKit(Qiagen)试剂盒提取RNA,用50μl无RNA酶纯水洗脱。
(2),50μl样本RNA,50μl阳性对照HCV RNA,50μl PBS阴性对照,分别加入10μl 5×杂交液(含0.5%SDS,5g聚蔗糖,5g聚乙烯吡咯烷酮,5g牛血清白蛋白V,RNA酶抑制剂500U,1.5M NaCl,0.5M Tris-Hcl,pH 8.0)65℃,15min,取出马上加入50μl磁珠捕获探针和50μl纳米结合探针,60℃10min,然后55℃旋转杂交2小时。
(3)磁分离器吸附磁珠30秒,弃去上清液,加入500μl PBS(0.3M NaCl,0.1%SDS,RNA酶抑制剂100U)洗3次。
(4)磁珠重悬于50μl PBS(0.3M NaCl,0.1%SDS,RNA酶抑制剂100U),依次加入50μl链亲和素(终浓度为5μg/ml,50μl生物素标记的含T7启动子的DNA序列(终浓度为250ng/ml)37℃,摇动30min。PBS(0.3MNaCl,0.1%SDS,RNA酶抑制剂100U),同上洗4次。
(5)磁珠重悬于50μl T7RNA转录液(1×T7RNA转录缓冲液,60U T7RNA聚合酶,RNA酶抑制剂200U,1.25μM NTP),37℃,摇动3小时。
(6)加入20μl RiboGreen工作液(Invitrogen试剂盒带的TE缓冲液稀释200倍为工作液),激发光为485nm,发射光535nm测定荧光。
4.标准曲线的制作:
(1)把WHO HCV标准品用PBS(0.3M NaCl,0.1%SDS)倍比稀释,使终浓度依次为100/ml,101/ml,102/ml,103/ml,104/ml,105/ml,106/ml,107/ml,按上面步骤操做,每一浓度做三个平行孔,测定荧光。
(2)取三个孔的荧光均值的对数与浓度对数做标准曲线。
(3)测定样品结果从标准曲线计算得去。
实施例3:微量蛋白的检测
1.引物设计:以检测血清Her-2蛋白为例。
(1)条码DNA:5-SH-(C6)-AAA AAA AAA A-PEG-GGA TTC TCA ACTCGT AGC T-Biotin-3.
2.抗Her-2单抗(克隆号6E2,Oncogene Sciences)包被ELISA板:
(1)Her-2单抗用pH9.0的碳酸盐缓冲液稀释成1μg/ml,100μl/孔,4℃过夜。
(2)去包被液,加5%奶粉200μl/孔,4℃过夜,封板。
(3)去封闭液,用PBST缓冲液洗3次,放4℃备用。
2.纳米结合抗体的制备:
(1)条码DNA引物用纯水溶解,混匀。
(2)取5ml直径100nm的纳米金溶液,加入5OD的条码DNA和500ng/mlHer-2单抗(克隆号A18,Oncogene Sciences)混和,充分摇匀。室温旋转摇床摇过夜。
(3)加入5M NaCl 50ul,10%SDS 50ul,混匀,室温旋转摇床摇2h。加5M NaCl50ul混匀,室温旋转摇床摇2h;重复四次。使NaCl终浓度为0.3M。观察溶液颜色为紫红色。
(4)10000rpm离心10分钟,去上清;加入PBS含0.3M NaCl,0.1%SDS,重悬。同样离心洗涤3次,最后加入用5ml PBS含5%BSA,0.3MNaCl,0.1%SDS重悬,37℃,摇2h,封闭未结合位点。10000rpm离心10分钟,去封闭液,加1ml PBS(含0.3MNaCl,0.1%SDS)重悬,4℃保存。
(5)260nm测定OD值,验证条码DNA和捕获探针2是否标记上。280nm测定OD值,验证Her-2单抗是否标记上。
(6)260nm-800nm光谱扫描,在560nm处有一高吸收峰(100nm金特征吸收峰),根据560nm OD值估算纳米金的数量。
(7)取上面制备好的纳米结合探针10ul,倍比稀释,取1ul点在醋酸纤维薄膜上,37℃烤干,用5%的奶粉(含0.3M NaCl,0.1%SDS)37℃封闭2h;加HRP标记的链亲和素,37℃30分钟,用PBS含0.3M NaCl,0.1%SDS洗膜四次,加DAB显色。验证条码DNA标记效率。
(8)取上面制备好的纳米结合探针10ul,倍比稀释,取1ul点在醋酸纤维薄膜上,37℃烤干,用5%的奶粉(含0.3M NaCl,0.1%SDS)37℃封闭2h;加HRP标记的抗鼠IgG,37℃ 30分钟,用PBS含0.3M NaCl,0.1%SDS洗膜四次,加DAB显色。验证Her-2单抗标记效率。
3.Bio-DNA TMA法检测血清Her-2蛋白:
(1),100μl血清,100μl阳性对照Her-2蛋白,100μl PBS阴性对照,分别加入包被好的ELISA板中,再加入100μl纳米结合抗体,37℃摇床摇120min。
(3)弃去孔中液体,加入200μl PBST(03M NaCl,0.1%SDS,0.1%Tween20)洗4次。
(4)依次加入50μl链亲和素(终浓度为5μg/ml,50μl生物素标记的含T7启动子的DNA序列(终浓度为250ng/ml)37℃,摇动30min。PBST同上洗4次。
(5)加入50μl T7RNA转录液(1×T7RNA转录缓冲液,60U T7RNA聚合酶,RNA酶抑制剂200U,1.25μM NTP),37℃,3小时。
(6)加入20μl RiboGreen工作液(Invitrogen试剂盒带的TE缓冲液稀释200倍为工作液),激发光为485nm,发射光535nm测定荧光。
4.标准曲线的制作:
(1)把Her-2蛋白(Oncogene Sciences)倍比稀释,使终浓度依次为1pg/ml,10pg/ml,100pg/ml,1ng/ml,10ng/ml,100ng/ml,1000ng/ml。按上面步骤操做,每一浓度做三个平行孔,测定荧光。
(2)取三个孔的荧光均值的对数与浓度对数做标准曲线。
(3)测定样品结果从标准曲线计算得去。
Claims (5)
1. 一种检测DNA,RNA或超微量蛋白质的方法,按照以下步骤进行:
(1)制备磁珠捕获探针1以及结合有生物素标记的条码DNA的纳米结合探针2;
(2)利用磁珠捕获探针上的捕获探针1,以及纳米结合探针上捕获探针2在液相中夹心ELISA检测靶分子;
(3)利用磁铁吸附磁珠,洗涤去除杂质;
(4)加入链亲和素以及生物素标记的含RNA启动子的DNA序列,使条码DNA与生物素标记的含RNA启动子的DNA序列结合;
(5)利用磁铁吸附磁珠,洗涤去除杂质;
(6)对含RNA启动子的DNA序列进行转录后检测转录的RNA产物。
2. 按权利要求1所述的检测DNA,RNA或超微量蛋白质的方法,其特征在于:
所述的纳米结合探针2为纳米金探针。
3. 按权利要求1或2所述的检测DNA,RNA或超微量蛋白质的方法,其特征在于:
用作检测DNA时,磁珠捕获探针上的捕获探针1与检测靶DNA 3末端或者5末端互补,纳米结合探针捕获探针2则相应地与检测DNA的另外一个末端互补。
4. 按权利要求1或2所述的检测DNA,RNA或超微量蛋白质的方法,其特征在于:
用作检测RNA时,磁珠捕获探针上的捕获探针1与检测靶RNA 3末端或5末端互补,纳米结合探针上捕获探针2则相应地与检测靶RNA的另外一个末端互补。
5. 按权利要求1或2所述的检测DNA,RNA或超微量蛋白质的方法,其特征在于:
用作检测蛋白质时,磁珠捕获探针上的捕获探针1以及纳米结合探针上捕获探针2分别是针对检测靶蛋白的两株结合位点不同的单抗。
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