JP4646404B2 - 分子トーチ（ｔｏｒｃｈ） - Google Patents
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Description
【０００１】
本出願は、１９９８年７月２日に提出された、米国仮特許出願第６０／０９１，６１６号の利益を請求する。
発明の分野
本発明は、試料中の標的核酸配列の存在または量を検出するための方法および組成物に関する。
発明の背景
本明細書に記載される参考文献はいずれも、請求された発明に対し先行技術であると認められていない。
【０００２】
標的核酸配列は、試料に存在する可能性がある他の配列よりも、標的配列に優先的にハイブリダイズするように設計された核酸プローブを用いた多様な方法により、検出することが可能である。標的配列の例には、元来試料に存在している可能性がある配列、または増幅法の一部として産生された配列である、微生物、ウイルス、植物遺伝子、またはヒト遺伝子などの動物遺伝子に特徴的な配列などが含まれる。標的配列の存在下で検出法の一部として産生されるが標的配列に依存しない配列を有する、レポーター配列を検出することもまた可能である。
【０００３】
標的核酸配列に対するプローブのハイブリダイゼーションは、適切な条件下で、検出可能なプローブ：標的二重鎖を形成することが可能である。こうした二重鎖の検出は、標識化プローブを用い、助長される。標的配列にハイブリダイズしていない標識化プローブからのシグナルによるバックグラウンドを減少させるための異なる技術が利用可能である。こうした技術には、物理的分離工程、ハイブリダイズしていないプローブに比べてプローブ：標的二重鎖において優先的に変化させられる標識、および／または相互作用標識の使用が含まれる。
【０００４】
相互作用標識は２つ以上の標識であり、互いに近接している際には、これらの標識が遠く離れておりしたがって協同作用が減少している際に生じるシグナルとは異なるシグナルを協同で生じる。標識は１つ以上の分子実体と関連していてもよい。検出系は、標識が、標的配列の存在下または標的配列の非存在下いずれかで相互作用するよう設計してもよい。
【０００５】
Ｔａｕｂら、米国特許第４，８２０，６３０号は、標的核酸配列の存在下で、協同で、検出可能なシグナルを生じる、２つの異なる核酸分子上に存在する相互作用標識を記載する。標的配列に対する両分子のハイブリダイゼーションにより、標識が近接し、したがって、近接して協同作用しない標識とは異なるシグナルを、協同で生じることが可能である。
【０００６】
Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、欧州特許出願第８７３００１９５．２号、公告番号第０ ２３２ ９６７号は、２つの相補的な核酸プローブで構成される試薬を含む検出系を記載する。相補的なプローブの一方は第一の標識を含み、そして他の相補的プローブは第二の標識を含む。第一および第二の標識は、互いに相互作用することが可能である。標的配列および２つの相補的プローブの一方の間の複合体の形成は、２つの標識の間の相互作用を変化させる。
【０００７】
Ｌｉｚａｒｄｉら、米国特許第５，１１８，８０１号および第５，３１２，７２８号は、互いに相補的な「スイッチ」配列が隣接する標的相補的配列を含む核酸プローブを記載する。標的配列の非存在下では、スイッチ配列が共にハイブリダイズする。標的配列の存在下では、プローブが標的配列にハイブリダイズし、スイッチ配列を物理的に分離し、そしてそれにより「開いたスイッチ」を生じる。スイッチ配列の状態は、開いていても閉じていても、プローブが標的配列にハイブリダイズしているか、検出可能なシグナルを、選択的に生成するのに有用であることが示されている。
【０００８】
Ｌｉｚａｒｄｉ、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ９４／１３４１５号、国際公告ＷＯ ９５／１３３９９は、「単一の（ｕｎｉｔａｒｙ）」ハイブリダイゼーションプローブを記載する。該プローブは、標的相補的配列、標的配列の非存在下でプローブを閉じたコンホメーションに保持するアフィニティー対、およびプローブが閉じたコンホメーションにある際、相互作用する標識対を含む。標的配列に対するプローブのハイブリダイゼーションは、プローブを開いたコンホメーションにシフトさせ、該コンホメーションは、標識対間の相互作用を減少させる。
発明の概要
本発明は「分子トーチ」および標的核酸配列の存在を検出するための分子トーチの使用を特徴とする。分子トーチは、標的結合ドメイン、標的閉鎖ドメイン、およびジョイニング（ｊｏｉｎｉｎｇ）領域を含む。標的結合ドメインは、同一のハイブリダイゼーション条件下では、標的閉鎖ドメインとよりも標的配列との方が安定なハイブリッドを形成するように、標的配列の方に偏向している。ジョイニング領域は、閉じたトーチの形成または維持を助長する。
【０００９】
標的配列の存在は、分子トーチを用い、該分子トーチが開いているかまたは閉じているかを測定することにより、検出することが可能である。「閉じた（ｃｌｏｓｅｄ）トーチ」において、標的結合ドメインには、標的閉鎖ドメインがハイブリダイズしている。「開いた（ｏｐｅｎ）トーチ」において、標的結合ドメインには、標的閉鎖ドメインがハイブリダイズしていない。
【００１０】
分子トーチ標的結合ドメインの標的配列偏向、およびジョイニング領域は、（１）標的結合ドメイン変性条件および標的結合ドメインハイブリダイズ条件、または（２）鎖置換（ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ）条件と組み合わせ、標的配列を検出するのに好ましくは用いる。
【００１１】
標的結合ドメイン変性条件下では、トーチは開いており、そして標的配列に対するハイブリダイゼーションに容易に利用可能である。標的配列への標的結合ドメインの偏向によって、標的配列の存在下では標的結合ドメイン：標的配列ハイブリッドが形成されるため、試料ストリンジェンシー条件が低下した際であっても、標的結合ドメインが開いたままになることが可能になる。
【００１２】
鎖置換条件下では、標的配列は、閉じたトーチに存在する標的結合ドメインとハイブリダイズし、それにより該トーチを開くことが可能である。鎖置換条件を用いて行うアッセイは、本質的に一定の環境条件下で実行することが可能である。本質的に一定の環境条件下では、最初に変性を達成しその後ハイブリダイゼーションを達成するのに、例えば温度を上昇させそして低下させたりして環境を変化させることはしない。
【００１３】
ジョイニング領域は、以下の少なくとも１つを生じることにより、閉じたトーチの産生または維持を助長する：（１）閉じたトーチの形成速度の増加；および（２）閉じたトーチの安定性の増加。形成速度および／または安定性の増加は、ジョイニング領域の非存在下でのこうした活性に関する。
【００１４】
ジョイニング領域は、標的開放および標的閉鎖ドメインを共に、共有および／または非共有結合させる、１つ以上の基で構成される。ジョイニング領域に存在する個々の基は、共有および／または非共有相互作用、例えばイオン性相互作用、疎水性相互作用、および水素結合により、共に連結される。
【００１５】
開いたトーチの存在の検出には、開いたトーチが存在するか直接検出すること、および／または閉じたトーチが存在するか検出することが含まれる。開いたトーチを検出するのに用いることが可能な技術の例には、以下が含まれる：（１）トーチが開いているか閉じているかに応じ、異なるシグナルを生じる相互作用標識の使用を伴うもの；（２）標的結合ドメイン：標的閉鎖ドメインハイブリッドにある際、標的閉鎖ドメインが標的結合ドメインにハイブリダイズしていない際に生じるシグナルと異なるシグナルを生じる標識を含む、標的閉鎖ドメインの使用を伴うもの；および（３）開いた標的結合ドメインに利用可能なものにした配列情報の検出を伴うもの。
【００１６】
好ましくは、相互作用標識は、開いたトーチの存在を検出するのに用いられる。相互作用標識の使用を伴う技術は、閉じた標的結合ドメインによって互いに近接して置かれた際、開いた標的結合ドメインにおけるように互いに近接していない際に生じるシグナルとは異なるシグナルを生じる標識を用いて、行うことが可能である。相互作用標識の例には、酵素／基質、酵素／補因子、発光剤／消光剤、発光剤／付加物、色素二量体（ｄｙｅ ｄｉｍｅｒ）、およびフェレスター（Ｆｏｒｒｅｓｔｅｒ）エネルギー移動対が含まれる。
【００１７】
標的結合ドメインおよび標的閉鎖ドメインは、互いに実質的に相補的なヌクレオチド塩基認識配列で構成される。「ヌクレオチド塩基認識配列」は、骨格により共に共有結合されるヌクレオチド塩基認識基を指す。ヌクレオチド塩基認識基は、少なくとも、アデニン、グアニン、シトシン、チミンまたはウラシルに水素結合することが可能である。ヌクレオチド塩基認識配列「骨格」は、共に共有連結される１つ以上の基で構成され、ヌクレオチド塩基認識基を適切な配向で提供することで核酸上に存在する相補的なヌクレオチドへのハイブリダイゼーションを可能にする。
【００１８】
「実質的に相補的な配列」は、使用される条件下で安定なハイブリッドを形成することが可能な２つのヌクレオチド塩基認識配列である。実質的に相補的な配列は、同一のまたは異なる分子上に存在してもよい。
【００１９】
実質的に相補的な配列には、互いに完全に相補的な配列、およびより低い相補性の配列（ミスマッチおよびリンカーを含むもの等）が含まれる。内部非相補的ヌクレオチドによるものなどのふくらみ（ｂｕｌｇｅ）、および共にハイブリダイズしている２つの認識基の間に置かれた非ヌクレオチドリンカーもまた、存在してもよい。好ましくは、実質的に相補的な配列は、好ましくは、長さ少なくとも１０、少なくとも１５、または少なくとも２０基の領域を含む２つの配列で構成される。好ましくは、２つの領域の一方に存在する基の少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または１００％が、２つの領域のもう一方に存在する基と水素結合する。より好ましくは、水素結合は、相補的ヌクレオチド塩基Ａ−Ｔ、Ｇ−Ｃ、またはＡ−Ｕ間である。
【００２０】
「リンカー」は、２つの基を共に共有結合させる原子の鎖を指す。この原子の鎖は共に共有結合され、そして分枝および環状基などの異なる構造を含んでもよい。
【００２１】
したがって、本発明の第一の側面は、標的核酸配列が試料に存在するか決定するための、分子トーチの使用を特徴とする。該分子トーチは：（１）もし標的配列が存在するとすれば、標的配列にハイブリダイズして開いたトーチを産生するための標的検出手段；（２）標的配列の非存在下で、標的検出手段にハイブリダイズして閉じたトーチのコンホメーションを提供するためのトーチ閉鎖手段；および（３）標的検出手段およびトーチ閉鎖手段を連結するジョイニング手段を含む。開いたトーチの存在の検出は、標的配列の存在の指標を提供する。
【００２２】
「標的検出手段」は、標的配列およびトーチ閉鎖手段にハイブリダイズすることが可能な、本出願に記載される成分およびその同等物（ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ）を指す。標的検出手段は、標的配列の存在下では標的検出手段が標的配列に優先的にハイブリダイズするように、トーチ閉鎖手段に比べて標的配列の方に偏向している。
【００２３】
「トーチ閉鎖手段」は、閉じたトーチを提供するために標的検出手段にハイブリダイズすることが可能な、本出願に記載される成分およびその同等物を指す。「ジョイニング手段」は、標的検出手段およびトーチ閉鎖手段を連結し（ｊｏｉｎ）、そして標的配列の非存在下で、閉じたトーチの産生または維持を助長する、本出願に記載される成分およびその同等物を指す。
【００２４】
本発明の別の側面は、標的配列が存在するか決定するための分子トーチの使用であって、以下の工程：（ａ）試料を、ジョイニング領域により共に連結された標的結合ドメインおよび標的閉鎖ドメインを含む分子トーチと接触させ；そして（ｂ）該標的配列の存在の指標として、トーチの存在を検出する工程を伴う、前記使用を特徴とする。
【００２５】
標的結合ドメインは、標的結合ドメイン：標的配列ハイブリッドが、標的結合ドメイン：標的閉鎖ドメインハイブリッドより安定しているように、標的配列の方に偏向している。標的配列が存在しない場合には、閉じたトーチのコンホメーションが有利である。
【００２６】
試料に曝露される前には、分子トーチ標的結合ドメインは、維持されている環境に応じ、開いていてもまたは閉じていてもよい。変性条件を用い、標的結合ドメインを開くことが可能である。好ましくは、変性は熱を用い、達成される。
【００２７】
あるいは、鎖置換条件を使用してもよい。鎖置換条件を使用する場合、分子トーチは、標的配列への結合前に開いている必要はない。
本発明の別の側面は、試料および分子トーチを含む混合物をまず、変性条件に曝露し、そしてその後ハイブリダイゼーション条件に曝露する、標的配列の存在を検出する方法を記載する。開いたトーチの存在は、標的配列の存在の指標として用いられる。
【００２８】
「変性条件」は、標的結合ドメイン：標的閉鎖ドメインハイブリッドが安定でなく、そしてトーチが開いている条件である。好ましい態様において、ジョイニング領域は、変性条件下で損なわれない（ｉｎｔａｃｔ）ままである。したがって、この好ましい態様において、変性条件下で、標的結合ドメインは、標的配列に対するハイブリダイゼーションに利用可能になるが、しかしまた、続く標的配列の非存在下でのハイブリダイゼーションのために、標的閉鎖ドメインとも近接したままである。
【００２９】
「ハイブリダイゼーション条件」は、標的結合ドメイン：標的閉鎖ドメインハイブリッドおよび標的結合ドメイン：標的配列ハイブリッドの両方が安定している条件である。こうした条件下では、標的配列の非存在下で標的結合ドメインが標的閉鎖ドメインとのハイブリッド中に存在することを、ハイブリダイズしている標的配列が妨げることはない。
【００３０】
本発明の別の側面は分子トーチを記載する。分子トーチは、（１）標的配列が存在する場合には、標的配列にハイブリダイズして開いたトーチを産生するための標的検出手段；（２）、標的配列の非存在下で、標的検出手段にハイブリダイズして閉じたトーチを提供するためのトーチ閉鎖手段；および（３）標的配列の非存在下で、閉じたトーチのコンホメーションを助長するためのジョイニング手段を含む。
【００３１】
本発明の別の側面は、ジョイニング領域を通じ連結されている、標的結合ドメインおよび標的閉鎖ドメインを含む、分子トーチを記載する。標的結合および標的閉鎖ドメインは、実質的に、互いに相補的である。標的結合ドメインは、標的結合ドメインの完全なＤＮＡまたはＲＮＡ相補体、好ましくはＲＮＡ相補体である標的配列の方に偏向している。したがって、標的結合ドメインは、標的閉鎖ドメインとよりも、その完全なＤＮＡまたはＲＮＡ相補体と、より安定な二重鎖を形成する。
【００３２】
「標的結合ドメインの完全なＤＮＡまたはＲＮＡ相補体」は、標的結合ドメインに存在する各認識基に向き合う相補的なプリンまたはピリミジンヌクレオチド塩基を含む、ＤＮＡまたはＲＮＡである。相補的なプリンまたはピリミジンヌクレオチド塩基は、互いに水素結合することが可能である。
【００３３】
多様な例が本明細書に記載される。これらの例は、いかなる点でも請求される発明を限定するよう意図されない。
本発明の他の特徴および利点は、以下の図、本発明の説明、実施例、および請求項から明白になるであろう。
発明の詳細な説明
分子トーチは、好ましくは、標的配列の存在を検出するアッセイにおいて、好都合な動的および熱力学的構成要素を提供するよう、設計される。分子トーチを伴うアッセイの動的および熱力学的構成要素を用い、標的配列の特異的な検出を亢進してもよい。
【００３４】
好ましい分子トーチの熱力学は、図１に例示される。図１に関し、「Ｉ」は標的結合ドメイン：標的閉鎖ドメインハイブリッドを示す一方、「ＩＩ」は標的結合ドメイン：標的配列ハイブリッドを示す。図１において、ΔＧ*は、標的結合ドメイン：標的閉鎖ドメインを融解するのに必要な活性化の自由エネルギーを表し、そしてΔＧは、標的結合ドメイン：標的閉鎖ドメインハイブリッドおよび標的結合ドメイン：標的配列ハイブリッドの間の自由エネルギーの相違を表す。
【００３５】
本発明の熱力学的構成要素は、標的結合ドメイン：標的配列ハイブリッドが、標的結合ドメイン：標的閉鎖ドメインハイブリッドより安定していることに基づく（ΔＧ＜０）。ジョイニング領域は、標的配列の非存在下で、閉じたトーチのコンホメーションを助長する。
【００３６】
さらに、トーチ設計に応じ、ジョイニング領域を用い、以下の利点の１つ以上を提供することもできる：（１）標的開放および閉鎖ドメイン上に存在する標識が、標的の非存在下で、離れる可能性を減少させること；（２）ミスマッチしている標的への感度を亢進させるのに用いることが可能な、短い標的結合ドメインの使用を助長すること；（３）標的閉鎖ドメインおよび標的結合ドメインが、例えばミスマッチまたは無塩基性（ａｂａｓｉｃ）「ヌクレオチド」を含む際、閉じたトーチのコンホメーションを助長すること；並びに（４）アデニンおよびチミンが豊富な標的結合および標的閉鎖ドメインの相互作用を安定化させることにより、アデニンおよびチミンが豊富な標的配列の検出を助長すること。
【００３７】
変性条件
変性条件を用い、標的結合ドメイン：標的閉鎖ドメインハイブリッドを融解するのに十分なエネルギー（ΔＧ*）を提供してもよい。必要とされるエネルギーの量は、分子トーチ組成および環境条件に応じ、異なるであろう。環境条件には、アッセイ溶液組成および温度が含まれる。閉じた標的を開くのに必要とされるエネルギーは、例えば、試料を加熱することにより、供給することが可能である。
【００３８】
ハイブリッドの安定性の有用な測定値は、融解温度（Ｔm）である。融解温度では、存在するハイブリッドの５０％が変性される。
特定のアッセイ組成を用いると、ハイブリッドは、アッセイ温度がＴmを超えた場合、安定でない。アッセイの組成に応じ、ハイブリッドのＴmは異なるであろう。塩濃度および変性剤の存在などの要因が、既定のハイブリッドのＴmに影響を及ぼす可能性がある。Ｔmは、特定のアッセイ組成を用い、そして温度を変化させ、決定される。
【００３９】
本明細書に記載されるものおよび当業に周知のものなど、Ｔmに影響を及ぼす要因を考慮することにより、分子トーチは、望ましい標的結合ドメイン：標的閉鎖ドメインＴmおよび望ましい標的結合ドメイン：標的Ｔm、例えばΔＧ＜０を有するよう、容易に設計することが可能である。Ｔmは、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， １９８９、およびＨｏｇａｎら、米国特許第５，５４７，８４２号に記載されるもの（前記文献はどちらも、本明細書に援用される）などの技術を用い、測定することが可能である。
【００４０】
図２は、いくつかの異なる分子トーチの立体配置（ｃｏｎｆｉｇｒａｔｉｏｎ）を示しているが、当業者は、本発明を実施するのに用いることが可能な他の分子トーチ立体配置を、容易に認識するであろう。図２Ａは、標的結合領域およびジョイニング領域で構成される、二本鎖分子トーチを例示する。標的結合領域は、標的配列に結合する標的結合ドメインおよび標的結合ドメインに結合する標的閉鎖ドメインからなる。
【００４１】
図２Ｂ−２Ｄは、標的結合およびジョイニング領域で構成される一本鎖分子トーチを例示する一方、図２Ｅは、三本鎖分子トーチを例示する。
図２Ｆは、ジョイニング領域および２つの標的結合領域を含む分子トーチを例示する。２つの標的結合領域は、同一のまたは異なる標的配列に結合することが可能であり、そして同一のまたは異なる相互作用標識を有することが可能である。例えば、各標的結合領域上に、独立に検出可能な、異なる発光特性を有する、異なる種類のフルオロフォアを配置することにより、単一の分子トーチを用い、異なるフルオロフォアのシグナル特性を探すことにより、異なる標的配列の存在を検出することが可能である。
【００４２】
図２Ｇは、標的結合領域およびジョイニング領域で構成される２本鎖分子トーチを例示する。該ジョイニング領域は、例えばＰＥＧまたはポリヌクレオチドで構成されるリンカーにより、標的結合または標的閉鎖ドメインに連結している相補的ポリヌクレオチドを含む。
【００４３】
鎖置換条件
鎖置換条件下では、標的結合ドメイン：標的配列ハイブリッドは、標的結合ドメイン：標的閉鎖ドメインハイブリッドより安定しており、そして標的配列が存在する場合、標的結合ドメイン：標的配列ハイブリッドの産生が有利である。
【００４４】
鎖置換は、好ましくは、標的へのハイブリダイゼーションに利用可能なヌクレオチド塩基認識基を有するトーチを用い、行われる。こうしたトーチは、好ましくは、利用可能である標的配列に相補的な、１ないし約１０のヌクレオチド塩基認識基を含む。好ましくは、１０未満、５または３ヌクレオチド塩基認識基が利用可能である。
【００４５】
異なる立体配置が可能であり、一本鎖領域が末端領域であるもの、または一本鎖領域がループ領域などの内部領域であるものが含まれる。あるいは、例えば５’または３’末端トーチ領域を「休息（ｂｒｅａｔｈ）」させる、鎖置換条件を使用してもよい。トーチの休息は、領域の安定性が、標的結合ドメイン：標的配列ハイブリッドの形成が有利となるように、該トーチが一本鎖になって標的核酸にハイブリダイズすることを可能にする条件下で起こる。
【００４６】
図３Ａ−３Ｃは、鎖置換の異なる例を提供する。図３Ａおよび３Ｃは、標的ハイブリダイゼーションに利用可能な、３つの末端ヌクレオチドを有する分子トーチを例示する。図３Ｂは、２つの末端ヌクレオチドの休息および標的ハイブリダイゼーションを例示する。
【００４７】
標的配列偏向
標的結合ドメインは、核酸ハイブリッド安定性に影響を及ぼす異なる設計考察を用いて、標的配列の方に偏向させることが可能である。こうした考察には、相補性の度合い、相補的認識基の種類、およびヌクレオチド塩基認識配列骨格が含まれる。これらの異なる要因の影響は、環境条件に応じ異なる。
【００４８】
相補性の度合いは、標的閉鎖ドメイン上に存在する認識基と水素結合し標的配列と水素結合する、標的結合ドメイン上に存在する認識基の数を考慮する。標的結合ドメインは、標的閉鎖ドメインに対してよりも標的配列に対して、より高い相補性の度合いを有するように、異なる技術を用い設計してもよい。こうした技術には、例えば、標的閉鎖ドメインとのミスマッチを有するが、標的配列とのミスマッチを持たない標的結合ドメインを設計すること、および標的閉鎖ドメインにおける非ヌクレオチドリンカーの使用が含まれる。
【００４９】
ヌクレオチド塩基認識配列に存在する非ヌクレオチドリンカーの例は、無塩基性「ヌクレオチド」である。無塩基性「ヌクレオチド」は、ヌクレオチド塩基認識基を欠く。
【００５０】
非ヌクレオチドリンカーの他の例には、多糖類、ペプチド、およびポリペプチドが含まれる。本明細書に援用される、Ａｒｎｏｌｄら、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ８８／０３１７３号、国際公告ＷＯ ８９／０２４３９、および米国特許第５，５８５，４８１号もまた、非ヌクレオチドリンカーの例を提供する。
【００５１】
存在する認識基の種類を利用して、異なるヌクレオチドプリンおよびピリミジン塩基の間の水素結合の度合いなどの要因を考慮することにより、標的結合ドメインを、標的配列の方に偏向させてもよい。例えば、Ｇ−Ｃ対形成または２，６ ジアミノプリン−チミンは、Ａ−Ｔ対形成およびイノシンなどの普遍的塩基との対形成より強い。標的結合ドメインは、標的閉鎖ドメインに比べ、標的配列に存在するヌクレオチドと、増加したＧまたはＣ対形成を有するよう設計してもよい。
【００５２】
ヌクレオチド塩基認識配列骨格の組成を異なる方式で調整し、標的結合ドメインを標的配列の方に偏向させてもよい。好ましい分子トーチ骨格は、糖・ホスホジエステル型結合、例えばリボおよびデオキシリボ核酸に存在するものである。別の種類の結合は、ペプチド結合、例えばペプチド核酸に存在するものである。
【００５３】
ペプチド核酸は、一般的に対応するＤＮＡ配列よりＲＮＡと、より安定した二重鎖を形成する。したがって、例えば、標的結合ドメインがペプチド核酸基を含み、そして標的閉鎖ドメインがＤＮＡで構成される分子トーチを用いることにより、標的結合ドメインをＲＮＡ標的配列の方に偏向させてもよい。
【００５４】
糖・ホスホジエステル型結合の場合、糖基および２つの糖基を連結する結合がハイブリッド安定性に影響を及ぼすであろう。糖が有する可能性がある影響の例は、２’−メトキシ置換ＲＮＡで見られるものである。２’−メトキシ含有核酸は、一般的に、対応するＤＮＡ配列とよりも、ＲＮＡと、より安定した二重鎖を形成する。別の例は、２’−メトキシ置換ＲＮＡと同じ種類の影響を有する、２’−フルオロ置換ＲＮＡである。
【００５５】
骨格結合基がハイブリッド安定性に影響を及ぼす可能性がある方式の例には、２つの鎖の間の荷電密度および物理的関連に影響を及ぼすことが含まれる。大きい基由来の立体相互作用はハイブリッド安定性を減少させる可能性がある。ホスホロチオエート類などの基がハイブリッド安定性を減少させる可能性がある一方、メチルホスホネート類などの非荷電基はハイブリッド安定性を増加させる可能性がある。
【００５６】
標的結合ドメイン：標的配列ハイブリッド
標的結合ドメイン：標的配列ハイブリッドの形成は、閉じたトーチより安定な開いたトーチの産生を生じる。トーチを開くための、または鎖置換のための条件を用い、標的配列の存在下で開いたトーチの産生を助長してもよい。
【００５７】
トーチの開放および閉鎖は、使用する検出法の環境条件を変化させることにより、達成することが可能である。トーチを開くそして閉じるための環境条件の変化の例には、加熱および冷却；ｐＨの上昇および低下；並びに変性剤の添加後の該剤の希釈が含まれる。
【００５８】
標的結合ドメイン：標的配列ハイブリッドは、標的結合ドメイン：標的閉鎖ドメインハイブリッドより安定である。好ましくは、検出法に用いられる条件下で、標的結合ドメイン：標的Ｔmは、標的結合ドメイン：標的閉鎖ドメインＴmより、少なくとも２℃、より好ましくは少なくとも５℃、さらにより好ましくは少なくとも１０℃高い。
【００５９】
標的配列の非存在下での閉じたトーチは、分離工程の必要なしに、標的配列にハイブリダイズしていない分子トーチからのバックグラウンドを減少させる。好ましくは、トーチが最初に開いているアッセイにおいて、標的配列の非存在下でトーチを閉鎖するハイブリダイゼーション条件は、標的結合ドメイン：標的閉鎖ドメインハイブリッドのＴmより、少なくとも２℃低く、より好ましくは少なくとも５℃低く、そしてより好ましくは少なくとも１０℃低い温度を使用する。
【００６０】
必要であれば、分離工程を使用し、標的配列にハイブリダイズしていない分子トーチから、標的配列にハイブリダイズしている分子トーチを物理的に分離してもよい。分離工程は、例えば開いた標的結合ドメインにより利用可能にされている配列情報を用い、行ってもよい。例えば標的閉鎖ドメインに相補的な核酸配列を有する捕捉プローブを用い、標的配列にハイブリダイズしている分子トーチを捕捉してもよい。捕捉プローブ自体は、直接、あるいはビーズまたはカラム上に間接的に提供されてもよい。
【００６１】
捕捉プローブ、または標的閉鎖ドメインに相補的な他の種類の核酸プローブを用いる場合、こうしたプローブが、標的結合ドメイン：標的配列ハイブリッドの非存在下で、安定な標的閉鎖ドメイン：プローブハイブリッドが形成されない条件下で、設計されて用いられることが重要である。好ましくは、標的閉鎖ドメイン：プローブハイブリッドは、標的結合ドメイン：標的閉鎖ドメインハイブリッドより、少なくとも５℃、そしてより好ましくは少なくとも１０℃低いＴmを有する。
【００６２】
標的配列の検出
分子トーチを用い、標的結合ドメイン：標的閉鎖ドメインハイブリッドが安定な条件下で、該トーチが開いているか決定することにより、標的配列の存在を検出することが可能である。開いたトーチは、（１）トーチが開いているかまたは閉じているかに応じ異なるシグナルを生じる、相互作用標識の使用を伴うもの；（２）標的結合ドメイン：標的閉鎖ドメインハイブリッド中にある際は、標的閉鎖ドメインが標的結合ドメインにハイブリダイズしていない際に生じるシグナルと異なるシグナルを生じる標識を含む、標的閉鎖ドメインの使用を伴うもの；および（３）開いた標的結合ドメインにより利用可能にされている配列情報の検出を伴うものなど、異なる技術を用い、検出してもよい。
【００６３】
異なる種類の相互作用標識を用い、トーチが開いているか決定してもよい。好ましくは、相互作用標識は、発光剤／消光剤対、発光剤／付加物対、Ｆｏｒｒｅｓｔｅｒエネルギー移動対または色素二量体のいずれかである。１つ以上の標識、および１つ以上の種類の標識が、特定の分子上に存在してもよい。
【００６４】
発光剤／消光剤対は、１つ以上の発光標識、例えば化学発光または蛍光標識、および１つ以上の消光剤で構成される。好ましくは、蛍光剤／消光剤対を用い、開いたトーチを検出する。蛍光標識は、特定の波長、または波長範囲の光を吸収し、そして特定の発光波長、または波長範囲の光を放出する。消光剤は、励起蛍光標識から放出されるシグナルを、部分的にまたは完全に鈍らせる。消光剤は、異なるフルオロフォアからのシグナル産生を鈍らせることが可能である。例えば４−（４’−ジメチル−アミノ−フェニルアキソ）安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）は、５−（２’−アミノエチル）アミノアフサリン−１−スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）、ローダミンおよびフルオレセインから生じるシグナルの約９５％を消光することが可能である。
【００６５】
異なる数および種類の蛍光および消光標識を用いてもよい。例えば、多数の蛍光標識を用い、開いたトーチからのシグナル産生を増加させてもよいし、そして多数の消光剤を用い、標的配列の非存在下では、励起蛍光分子がほとんどまたはまったくシグナルを生じないことを確実にするのを補助してもよい。フルオロフォアの例には、アクリジン、フルオレセイン、スルホローダミン１０１、ローダミン、ＥＤＡＮＳ、テキサスレッド、エオジン、Ｂｏｄｉｐｙおよびルシファイエローが含まれる。（例えば、本明細書に援用される、Ｔｙａｇｉら， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １６：４９−５３， １９９８を参照されたい）。消光剤の例には、ＤＡＢＣＹＬ、タリウム、セシウム、およびｐ−キシレン−ビス−ピリジニウムブロミドが含まれる。
【００６６】
発光剤／付加物対は、１つ以上の発光標識、および発光分子と付加物を形成し、そしてそれにより発光分子からのシグナル産生を減少させることが可能な、１つ以上の分子で構成される。溶液中に遊離のリガンドを用い、発光分子から生じるシグナルを改変するための付加物形成の使用は、本明細書に援用される、ＢｅｃｋｅｒおよびＮｅｌｓｏｎ、米国特許第５，７３１，１４８号に記載されている。付加物はまた、付加物形成因子を分子トーチに、または開いたトーチにおいて利用可能にされている配列情報とハイブリダイズする核酸プローブに結合させることにより、形成してもよい。
【００６７】
Ｆｏｒｒｅｓｔｅｒエネルギー移動対は２つの標識で構成されており、第一の標識の発光スペクトルが第二の標識の励起スペクトルと重複する。第一の標識を励起させ、そして第二の標識に特徴的な発光を測定し、標識が相互作用しているか決定してもよい。Ｆｏｒｒｅｓｔｅｒエネルギー移動対の例には、フルオレセインおよびローダミン；ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾールおよびローダミン；フルオレセインおよびテトラメチルローダミン；フルオレセインおよびフルオレセイン；ＩＡＥＤＡＮＳおよびフルオレセイン；並びにＢＯＤＩＰＹＦＬおよびＢＩＯＤＩＰＹＦＬを含む対が含まれる。
【００６８】
色素二量体は、二量体の形成に際し、相互作用し、色素が二量体コンホメーションにない場合とは異なるシグナルを生じる２つの色素で構成される。色素二量体相互作用は、例えばＰａｃｋａｒｄら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９３：１１６４０−１１６４５， １９９６（本明細書に援用される）に記載される。
【００６９】
検出工程中に生じる、標的配列の存在に特徴的な、観察されるシグナルを、標的配列を含まないまたは既知の量の標的配列を含むコントロール反応に対し、比較してもよい。既知の量の標的配列を用い、検量線を得てもよい。コントロール反応は、好ましくは、実験反応と同時に行われるが、コントロール反応は実験反応と同時に行う必要はなく、そして以前の実験から得たデータに基づいていてもよい。
【００７０】
標的配列を検出するための、相互作用標識を有する分子トーチの使用例は、図４および５に提供される。両図は、標的配列の存在を例示する。標的配列の非存在下では、分子トーチ標的結合ドメインは閉じており、シグナルの消光を生じる。
【００７１】
図４は、小さいジョイニング領域を含む一本鎖分子トーチの使用を例示する。熱を用い、標的結合ドメイン：標的閉鎖ドメインハイブリッドを融解する。該トーチは、例えば、標的結合ドメインに存在する２’−メトキシ置換リボヌクレオチドの存在により、ＲＮＡ標的配列の方に偏向している。標的配列の存在下では、消光剤（Ｑ）はもはやフルオロフォア（Ｆ）の近くに保持されておらず、したがって、フルオロフォア蛍光に影響を及ぼす消光剤の能力は減少している。
【００７２】
図５は、２つの部分、非ヌクレオチドＰＥＧリンカーおよび高いＴmがアッセイ中の融解を妨げる配列で構成されるジョイニング領域を含む二本鎖分子の使用を例示する。
【００７３】
本発明の別の態様は、標的結合ドメイン：標的閉鎖ドメインハイブリッドにある際に、標的閉鎖ドメインが標的結合ドメインにハイブリダイズしていない際に生じるシグナルとは異なるシグナルを生じる標識を使用し、開いたトーチを検出することを伴う。こうした標識には、発光分子、および異なる環境に存在する際に異なる安定性を有する標識が含まれる。
【００７４】
１つのヌクレオチド塩基認識配列上に存在する発光分子から生じるシグナルは、別のヌクレオチド塩基認識配列により影響を受ける可能性がある。例えば、１つのヌクレオチド塩基認識配列上のヌクレオチドを用い、別のヌクレオチド塩基認識配列上に存在するフルオロフォアを消光し、または該フルオロフォアの回転運動を達成することが可能である。
【００７５】
特定の標識の安定性に影響を及ぼすことが可能な環境には、ワトソン・クリック塩基対形成で形成されている核酸二重鎖が含まれる。こうした標識およびその使用の例は、共に本明細書に援用される、ＢｅｃｋｅｒおよびＮｅｌｓｏｎ、米国特許第５，７３１，１４８号、並びにＡｒｎｏｌｄら、米国特許第５，２８３，１７４号に記載される。
【００７６】
アクリジニウムエステルおよびその誘導体は、標識の環境に基づき、開いたトーチを検出するための、好ましい標識の例である。アクリジニウムエステルは、異なる技術（例えば核酸二重鎖に存在しない標識を選択的に不活性化するなど）を用いて、検出することが可能である。１つ以上のアクリジニウムエステル標識の使用例は、こうした標識を標的閉鎖ドメインに結合させ、そして一本鎖標的閉鎖ドメイン上に存在するアクリジニウムエステル標識の選択的不活性化によるシグナルの減少を、標的配列の存在の指標として用いることを伴う。
【００７７】
開いた標的結合ドメインにより利用可能にされている配列情報を用いた開いたトーチの検出は、標的閉鎖ドメインにハイブリダイズする検出プローブを用い、実行することが可能である。好ましい検出プローブには、検出可能標識が含まれる。検出可能標識は、例えば、標的閉鎖ドメイン上に存在する標識と相互作用する標識であってもよいし、または標的閉鎖ドメイン上の相互作用標識の非存在下でシグナルを生じる標識であってもよい。好ましいプローブ標識は、アクリジニウムエステルである。
【００７８】
標的配列数の増加
標的配列が、少ない数で試料に存在する場合、増幅を行い、標的配列数を増加させてもよい。多くの増幅技術が当業に周知であり、転写関連増幅、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）およびリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）を伴うものを含む。
【００７９】
好ましくは、分子トーチは、転写関連増幅と共に用いる。転写関連増幅は、二本鎖ＤＮＡプロモータ領域を認識するＲＮＡポリメラーゼを用い、ＲＮＡ転写物を生成することを伴う。
【００８０】
転写関連増幅を記載する参考文献の例には、Ｂｕｒｇら、米国特許第５，４３７，９９０号；Ｋａｃｉａｎら、米国特許第５，３９９，４９１号；Ｋａｃｉａｎら、米国特許第５，５５４，５１６号；Ｋａｃｉａｎら、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ９３／０４０１５号、国際公告ＷＯ ９３／２２４６１；Ｇｉｎｇｅｒａｓら、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ８７／０１９６６号、国際公告ＷＯ ８８／０１３０２；Ｇｉｎｇｅｒａｓら、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ８８／０２１０８号、国際公告ＷＯ ８８／１０３１５；ＤａｖｅｙおよびＭａｌｅｋ、ＥＰＯ出願第８８１１３９４８．９号、欧州公告第０ ３２９ ８２２ Ａ２号；Ｍａｌｅｋら、米国特許第５，１３０，２３８号；Ｕｒｄｅａ、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ９１／００２１３号、国際公告ＷＯ ９１／１０７４６；ＭｃＤｏｎｏｕｇｈら、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ９３／０７１３８号、国際公告ＷＯ ９４／０３４７２；並びにＲｙｄｅｒら、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ９４／０８３０７号、国際公告ＷＯ ９５／０３４３０（各々本明細書に援用される）が含まれる。
【００８１】
ＲＮアーゼＨ活性を伴う転写関連増幅法の使用が好ましい。より好ましくは、該方法は、鎖分離を助長する逆転写酵素に存在するＲＮアーゼＨ活性を利用する。Ｋａｃｉａｎら、米国特許第５，３９９，４９１号は、外因性ＲＮアーゼＨ活性の添加を伴わない、本質的に一定の条件下で起こる増幅を記載する。該方法は、鎖分離を助長する逆転写酵素に存在するＲＮアーゼＨ活性を利用する。
【００８２】
本発明を転写関連増幅と共に使用する、１つの利点は、分子トーチを増幅前に添加することが可能であり、そしてさらなる試薬を添加することなく、検出を実行することが可能であることである。標的結合ドメイン：標的閉鎖ドメインハイブリッドのＴmを、増幅中に使用される温度より高く調整することが容易に可能であるため、分子トーチは、転写関連増幅における使用によく適している。閉じた標的結合ドメインは、増幅により生成された標的配列に、分子トーチが時期尚早に結合することを妨げる。
【００８３】
増幅後、溶液を加熱し、標的結合ドメインを開き、分子トーチが標的配列にハイブリダイズすることを可能にしてもよい。溶液をその後冷却し、標的配列にハイブリダイズしていないトーチの標的結合ドメインを閉じてもよい。例えばフルオロフォア／消光剤対を有する、開いたトーチの存在を、その後、試料に適切な励起光を照射し、そしてその後、放出光を測定することにより、測定してもよい。
【００８４】
他の増幅法に言及する参考文献の例には、ＰＣＲ増幅を記載するもの、例えばＭｕｌｌｉｓら、米国特許第４，６８３，１９５号、第４，６８３，３０２号、および第４，８００，１５９号、並びにＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，第１５５巻， １９８７， ３３５−３５０ページ；並びにリガーゼ連鎖反応を記載するもの、例えばＢａｃｋｍａｎ、欧州特許出願第８８３１１７４１．８号、欧州公告第０ ３２０ ３０８号（これらの参考文献の各々は、本明細書に援用される）が含まれる。
【００８５】
分子トーチ構築
分子トーチは、標的結合ドメイン、標的閉鎖ドメインおよびジョイニング領域を含む。標的結合および閉鎖ドメインは各々ヌクレオチド塩基認識基である。
【００８６】
ヌクレオチド塩基認識配列は、核酸に存在するヌクレオチド窒素含有塩基と水素結合することが可能なヌクレオチド認識基を含む。ヌクレオチド認識基は、核酸上に存在するヌクレオチドに該基を水素結合するのを可能にする、適切なコンホメーションおよび間隔を提供する骨格により、共に連結される。
【００８７】
既定のヌクレオチド認識基は、特定のヌクレオチド（例えばアデニン、グアニン、シトシン、チミン、およびウラシル）に相補的であってもよく、そしてしたがって核酸に存在するヌクレオチドと水素結合することが可能であってもよい。ヌクレオチド認識基はまた、異なる複数のヌクレオチドと水素結合することが可能であってもよい。例えば、イノシンがヌクレオチド塩基認識基である場合、異なる複数のヌクレオチド塩基と水素結合することが可能である。
【００８８】
好ましいヌクレオチド塩基認識基は、アデニン、グアニン、シトシン、チミンまたはウラシルのいずれかと水素結合することが可能な、窒素含有プリンまたはピリミジン塩基、あるいはその誘導体である。こうした認識基の例には、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル、およびその誘導体が含まれる。誘導体の例には、修飾プリンまたはピリミジン塩基、例えばＮ４−メチルデオキシグアノシン、天然プリンおよびピリミジン塩基の代わりに用いられるデアザまたはアザプリンおよびピリミジン類、５または６位に置換基を有するピリミジン塩基、並びに２、６または８位に改変されたまたは置き換えられた置換基を有するプリン塩基が含まれる。例えばＣｏｏｋ、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ９２／１１３３９号、国際公告ＷＯ ９３／１３１２１（本明細書に援用される）を参照されたい。さらなる例には、２−アミノ−６−メチルアミノプリン、Ｏ６−メチルグアニン、４−チオ−ピリミジン類、４−アミノ−ピリミジン類、４−ジメチルヒドラジン−ピリミジン類およびＯ４−アルキル−ピリミジン類が含まれる（例えばＴｈｅ Ｇｌｅｎ Ｒｅｐｏｒｔ第１巻、１９９３を参照されたい）。
【００８９】
ヌクレオチド塩基認識配列骨格は、異なる基で構成されていてもよい。異なる骨格の例には、糖・ホスホジエステル型骨格およびペプチド核酸骨格が含まれる。
【００９０】
構造Ｉは、糖基がペントフラノシル基である、糖・ホスホジエステル型骨格を例示する。糖基は、ホスホジエステル結合または他の適切な結合などの結合により、共に連結されている。
【００９１】
構造Ｉ
【００９２】
【化１】
【００９３】
Ｘは２つの糖を連結する基を表す。Ｘの例には、−ＯＰ（Ｏ）2Ｏ−、−ＮＨＰ（Ｏ）2Ｏ−、ＯＣ（Ｏ）2Ｏ−、−ＯＣＨ2Ｃ（Ｏ）2ＮＨ−、−ＯＣＨ2Ｃ（Ｏ）2Ｏ−、−ＯＰ（ＣＨ3）（Ｏ）Ｏ−、−ＯＰ（Ｓ）（Ｏ）Ｏ−および−ＯＣ（Ｏ）2ＮＨ−が含まれる。本明細書に提供される他の例のように、当業に周知のまたは入手可能となる、他の同等物もまた用いてもよい。
【００９４】
Ｙ1およびＹ2は、独立に選択される基である。Ｙ1およびＹ2の例には、Ｈ、ＯＨ、Ｃ1−Ｃ4アルコキシ、ハロゲン、およびＣ1−Ｃ6アルキルが含まれる。好ましくは、Ｙ1およびＹ2は、独立に、Ｈ、ＯＨ、Ｆ、またはＯＣＨ3のいずれかである。Ｃ1−Ｃ6アルキルおよびＣ1−Ｃ4アルコキシは直鎖、分枝、または環状である基であっても、該基を含んでもよい。
【００９５】
塩基1および塩基2は、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル、または隣接する塩基と相補的な核酸との相補的塩基対形成を阻害しない基からなる群より、独立に選択される。相補的塩基対形成を阻害しない基の例には、より小さい基、例えば水素、ＯＨ、Ｃ1−Ｃ6アルキル、およびＣ1−Ｃ4アルコキシが含まれる。好ましくは、ヌクレオチド塩基認識配列は：アデニン、グアニン、シトシン、チミン、およびウラシルからなる群より独立に選択される、約７ないし約４０、より好ましくは約１０ないし約３０塩基を含む。
【００９６】
Ｒ1およびＲ2は独立に選択される基を表す。Ｒ1およびＲ2の例には、さらなる糖・ホスホジエステル型基、水素、ヒドロキシ、ペプチド核酸、および無塩基性「ヌクレオチド」など配列情報を提供しない分子、多糖類、ポリペプチド、ペプチド、および他の非ヌクレオチド結合が含まれる。
【００９７】
ヌクレオチド塩基認識配列の構成要素となることが可能な構造Ｉの誘導体は、当業に周知であり、そして例えば、異なる種類の糖を有する分子が含まれる。例えば、ヌクレオチド塩基認識配列は、結合部分により連結しているシクロブチル部分を有してもよく、ここで該シクロブチル部分は、それに結合する複素環塩基を有する。たとえばＣｏｏｋら、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ９３／０１５７９号、国際公告ＷＯ ９４／１９０２３（本明細書に援用される）を参照されたい。
【００９８】
本発明の態様において、ヌクレオチド塩基認識分子は、ポリヌクレオチドまたはその誘導体である。「ポリヌクレオチドまたはその誘導体」は、Ｘが−ＯＰ（Ｏ）2Ｏ−であり；Ｙ1およびＹ2がＨ、ＯＨ、ＯＣＨ3、およびＦからなる群より独立に選択され；塩基1および塩基2が、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル、または隣接する塩基と相補的な核酸との相補的塩基対形成を阻害しない基からなる群より独立に選択される、構造Ｉ反復単位で構成されるヌクレオチド塩基認識分子であり；そして該分子は、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、およびウラシルからなる群より独立に選択される、約５ないし約３５塩基を含む。分子の末端部分は、ＯＨ、Ｃ1−Ｃ6アルキル、およびリン酸からなる群より独立に選択されるＲ1およびＲ2を含む。
【００９９】
ペプチド核酸はＤＮＡ類似体であり、デオキシリボースリン酸骨格が、偽ペプチド骨格により置き換えられている。ペプチド核酸は、各々本明細書に援用される、ＨｙｒｕｐおよびＮｉｅｌｓｅｎ， Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４：５−２３， １９９６、並びにＨｙｄｉｇ−ＨｉｅｌｓｅｎおよびＧｏｄｓｋｅｓｅｎ、国際出願第ＰＣＴ／ＤＫ９５／００１９５号、国際公告ＷＯ ９５／３２３０５に記載されている。
【０１００】
好ましくは、ペプチド核酸は、構造ＩＩに例示されるようなＮ−（２−アミノエチル）グリシン単位で構成される。
構造ＩＩ
【０１０１】
【化２】
【０１０２】
式中、Ｒ1、Ｒ2、および塩基1は、構造Ｉ型分子に関し記載された通りである。ヌクレオチド塩基認識配列は、標準的技術を用い、産生することが可能である。オリゴヌクレオチドおよび修飾オリゴヌクレオチドの有機合成を記載する刊行物には、オリゴヌクレオチドの有機合成を概説する、Ｅｃｋｓｔｅｉｎ， Ｆ．， Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ， Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，第１−５章， １９９１；標準的ホスホロアミダイト固相化学反応を用いたオリゴヌクレオチドの有機合成法を記載する、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓら， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，第１５４巻，ｐ．２８７（１９８７）；ホスホロチオエート結合を含む修飾オリゴヌクレオチドの有機合成法を記載する、Ｂｈａｔｔ、米国特許第５，２５２，７２３号；並びにメチルホスホネート結合を含む、異なる結合を有する修飾オリゴヌクレオチドの有機合成を記載する、Ｋｌｅｍら、ＷＯ ９２／０７８６４（これらの参考文献は各々本明細書に援用される）が含まれる。
【０１０３】
異なる種類のヌクレオチド塩基認識配列を産生するのに用いることが可能な技術を記載するさらなる参考文献には、Ｃｏｏｋ、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ９２／１１３３９号、国際公告ＷＯ ９３／１３１２１；Ｍｉｌｌｅｒら、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ９４／００１５７号、国際公告ＷＯ ９４／１５６１９；ＭｃＧｅｅら、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ９３／０６８０７号、国際公告ＷＯ ９４／０２０５１；Ｃｏｏｋら、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ９３／０１５７９号、国際公告ＷＯ ９４／１９０２３；ＨｙｒｕｐおよびＮｉｅｌｓｅｎ， Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４：５−２３， １９９６；並びにＨｙｄｉｇ−ＨｉｅｌｓｅｎおよびＧｏｄｓｋｅｓｅｎ、国際出願第ＰＣＴ／ＤＫ９５／００１９５号、国際公告ＷＯ ９５／３２３０５（これらの参考文献は各々本明細書に援用される）が含まれる。
【０１０４】
共有結合、キレート化、およびイオン性相互作用を含む多様な手段により、分子トーチに標識を結合させてもよい。好ましくは、標識は共有結合される。
増幅プロトコル中に存在する分子トーチは、好ましくは、プライマー伸長に利用可能な末端３’ＯＨを含まない。核酸ポリメラーゼによるプライマー伸長を阻害することが可能なブロッキング基を、核酸分子トーチの３’端にまたはその近傍に配置してもよい。３’端「にまたはその近傍に」は、３’末端の５塩基以内に存在するブロッキング基を指す。ブロッキング基が核酸分子トーチの３’末端に置かれていない場合には、ＤＮＡポリメラーゼがトーチに結合するのを達成するくらい、十分に大きいものであるべきである。
【０１０５】
好ましくは、核酸分子トーチは、３’末端に位置するブロッキング基を含む。ブロッキング基を末端３’ＯＨに結合させることにより、３’ＯＨ基は、もはや重合反応においてヌクレオシド三リン酸を受け入れるのに利用可能ではない。
【０１０６】
多くの異なる化学基を用い、核酸配列の３’端をブロッキングしてもよい。こうした基の例にはアルキル基、非ヌクレオチドリンカー、アルカン−ジオールジデオキシヌクレオチド残基、およびコルジセピンが含まれる。
【０１０７】
標的結合領域は、望ましい標的に特異的に結合するため、十分に長くなければならない。細菌標的結合領域は、好ましくは、少なくとも約１０認識基、より好ましくは、少なくとも１２認識基である。ヒトなどの多細胞生物のための複雑な標的結合領域は、好ましくは、少なくとも約１６認識基、より好ましくは、少なくとも１８認識基である。
【０１０８】
標的結合ドメインに関する本発明の態様において、標的結合ドメインは、各々標的閉鎖ドメインの認識基と向き合う、約７ないし約４０認識基、および０ないし約４の非ヌクレオチド単量体基で構成される。好ましい態様において、少なくとも約８、より好ましくは少なくとも約１０認識基が存在し；約３０以下、約２５以下、そして約１５以下の認識基が存在し；そして２以下、好ましくは１以下、そして最も好ましくは０の非ヌクレオチド単量体基が存在する。好ましくは、各非ヌクレオチド単量体基は、無塩基性「ヌクレオチド」である。
【０１０９】
非ヌクレオチド単量体基は、ヌクレオチド塩基を含む付加基（ａｄｊｕｎｃｔ ｇｒｏｕｐｓ）間に、核酸分子におけるのとおおよそ同じ長さの距離を提供する。したがって、２つのヌクレオチド位を連結する非ヌクレオチド単量体基は、核酸における相補的なヌクレオチドに水素結合することが可能であるように、該ヌクレオチドを配置する。
【０１１０】
標的閉鎖ドメインに関する本発明の態様において、標的閉鎖ドメインは、約７ないし約４０の認識基、および０ないし約６の非ヌクレオチド単量体基または標的結合ドメインとのミスマッチで構成される。異なる態様において、少なくとも約８、または少なくとも約１０認識基が存在し；約３０以下、約２５以下、そして約１５以下の認識基が存在し；そして０、１、２、３、４、５または６の非ヌクレオチド単量体基または標的結合ドメインとのミスマッチが存在する。好ましくは、各非ヌクレオチド単量体基は、無塩基性「ヌクレオチド」である。無塩基性ヌクレオチオドよりはミスマッチが存在することの方が好ましい。
【０１１１】
好ましくは、標的結合ドメインは、実質的に、独立に選択される２’−メトキシまたは２’−フルオロ置換リボヌクレオチドで構成され、そして標的閉鎖ドメインは、実質的に、独立に選択されるデオキシリボヌクレオチドで構成される。「実質的に構成される」または「実質的に含む」は、言及される構成要素が、標的開放ドメインまたは標的閉鎖ドメインの、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または１００％を構成することを示す。
【０１１２】
ジョイニング領域は、ジョイニング領域の組成を考慮し、当業に周知の技術を用い、産生してもよい。好ましくは、ジョイニング領域は、共に結合することが可能な、異なるメンバーの結合セットを含み、ここで標的結合ドメインに、結合セットの１つのメンバーが連結し、そして標的閉鎖領域に、結合セットの別のメンバーが連結する。いくつかの結合セットは、同一結合セットの別のメンバーに結合することが可能である。結合セットの例には、実質的に相補的なヌクレオチド塩基認識配列、抗体／抗原、酵素／基質、並びにビオチン／アビジンが含まれる。
【０１１３】
標的開放および標的閉鎖ドメインの隣に、またはその近傍に配置された結合セットのメンバーは、標的結合ドメイン：標的閉鎖ドメインハイブリッドの安定性に影響を及ぼす可能性がある。影響があまりにも大きいと、広い範囲の条件下で、標的結合ドメイン：標的閉鎖ドメインハイブリッドがそのままであるため、開いたトーチを生じるのが困難になる可能性がある。標的結合ドメイン：標的閉鎖ドメインハイブリッドの安定性に対する結合セットの影響は、例えばハイブリッドのＴmを測定することにより、決定することが可能である。
【０１１４】
結合セットのメンバーは、１つ以上のリンカーを用いて共有結合させてもよい。リンカーの例には、置換されていてもよいアルキル基、ポリヌクレオチドおよび非ヌクレオチドリンカーが含まれる。非ヌクレオチドリンカーには、多糖類、ポリペプチド、および無塩基性「ヌクレオチド」が含まれる。
【０１１５】
標的開放および標的閉鎖ドメインの間のリンカー基として用いられるポリヌクレオチドは、好ましくは、標的配列または試料に存在する可能性がある他の核酸にハイブリダイズしないよう、設計される。例えば鎖置換条件が用いられる場合等は、標的に対しある程度結合した方が有利かもしれないが。好ましいポリヌクレオチドリンカー基は、ポリＴ、ポリＡ、および混合ポリＡ−Ｔである。ポリヌクレオチドリンカー基は、好ましくは５ないし２５ヌクレオチドである。
【０１１６】
分子トーチには、標的配列に相補的な一本鎖領域を含んでもよく、該領域は、例えば標的結合ドメインの隣においてもよく、ジョイニング領域の一部であってもよい。好ましくは、こうした一本鎖領域は、標的配列に相補的なヌクレオチド塩基認識基を、約１０より多く含まない。より好ましくは、こうした一本鎖領域が存在する場合、標的配列に相補的な、１０、５、３、２、または１以下のヌクレオチド塩基認識基である。
【０１１７】
リンカー基は、結合セットメンバー並びに標的開放および標的閉鎖ドメインの間に配置し、標的結合ドメイン：標的閉鎖ドメインハイブリッドへの結合セットメンバーの影響を減少させてもよい。例えば、結合セットメンバーおよび標的結合ドメインの間にリンカー基を置くと、標的結合ドメインから結合セットメンバーが物理的に離され、それにより、標的結合ドメイン：標的閉鎖ドメインハイブリッドに対する結合セットメンバーの影響が減少する。
【０１１８】
さらなる実施例が以下に提供され、本発明の異なる側面および態様を例示する。これらの実施例は、いかなる点でも、開示される発明を限定することを意図しない。
【０１１９】
【実施例】
実施例１：標的結合ドメイン：標的閉鎖ドメインＴ m の調整
本実施例は、望ましい標的結合ドメイン：標的閉鎖ドメインハイブリッドＴmを得るための、異なる分子トーチ設計要因の使用を例示する。本実施例において、４つの異なる分子トーチのＴmを、非ヌクレオチド、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）リンカー、ミスマッチ塩基の組み合わせ、無塩基性「ヌクレオチド」（すなわちふくらみ）、および２’−メトキシ置換リボヌクレオチドを用い、調整した。
【０１２０】
本実施例で用いられる異なる分子トーチは、図６Ａおよび６Ｂに示されるように、４つの異なる鎖から構築した。これらの図において、「Ｆ」はＥＤＡＮＳフルオロフォアを指し、「Ｑ」はＤＡＢＣＹＬ消光剤を指し、そして各トーチの１つの鎖の３’端の「ｃｃｃ」基はプライマー伸長ブロッキング基として機能する３つの炭素基を指す。これらの分子トーチのヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドまたは２’−メトキシ置換リボヌクレオチド（太字／斜字で示される）のいずれかである。本実施例に用いられる分子トーチはすべて、非ヌクレオチド、２０Å ＰＥＧ基および単独で非常に高いＴm（＞９０℃）を示す、二本鎖の２’−メトキシ置換リボヌクレオチド二重鎖で構成されるジョイニング領域を含む。
【０１２１】
図６Ｂに示されるように、トーチ１は鎖２および３で構成され；トーチ２は鎖２および４で構成され；トーチ３は鎖１および３で構成され；そしてトーチ４は鎖１および４で構成される。鎖１−４の各々（図６Ａに示される）は、ＰＥＧ基により分離される２つのヌクレオチド塩基認識配列を含み、ここで鎖１は配列番号１（５’−ｃａｇｕｇｃａｇｎｇ ｇａａａｇ−３’）および配列番号２（５’−ｇｇｕｇｇａｃｕｇｃ ｇｕｇｃｇ−３’）のヌクレオチド塩基認識配列を含み；鎖２は配列番号２および配列番号３（５’−ｃａｇｕｇｃａｇｇｇ ｇａａａｇ−３’）のヌクレオチド塩基認識配列を含み；鎖３は配列番号４（５’−ｃｔｔｔｔｃｃｔｔｇ ｃｔｃｔｇ−３’）および配列番号５（５’−ｃｇｃａｃｇｃａｇｕ ｃｃａｇｃｃ−３’）のヌクレオチド塩基認識配列を含み；そして鎖４は配列番号５および配列番号６（５’−ｃｔｔｔｎｎｃｃｃｃ ｔｇｃｎｎａｃｔｇ−３’）のヌクレオチド塩基認識配列を含んだ。
【０１２２】
４つの分子トーチすべてにおいて、標的結合ドメインは２’−メトキシ置換リボヌクレオチドで構成され、そして標的閉鎖ドメインはデオキシリボヌクレオチドで構成された。下線の基はミスマッチを示し、「ｎ」は無塩基性ふくらみを表す。
【０１２３】
３５０μｌのＫＥＭＰＳ緩衝液に添加された５００ ｐｍｏｌの各鎖を含む混合物を用い、異なるハイブリッドの安定性を測定した。（ＫＥＭＰＳは１００ ｍＭ ＫＣｌ、０．１ ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ ｍＭ ＭｇＣｌ2、５０ ｍＭ ＰＩＰＥＳ（ｐＨ ６．８５）、および１ ｍＭ スペルミンで構成される。）混合物を８０℃に１５分間加熱し、そしてその後、Ｔm解析に供した。Ｂｅｃｋｍａｎ ＤＵ−６４０融解装置を用い、０．５℃／分で４５−９５℃の範囲に渡り、２６０ ｎｍで光学的にＴmを測定した。
【０１２４】
表１は、試験した４つの分子トーチにおける標的結合ドメイン：標的閉鎖ドメインハイブリッドの安定性を要約する。表１はまた、ハイブリッド安定性に影響を及ぼす設計要因のいくつかを強調する。
【０１２５】
表１
【０１２６】
【表１】
【０１２７】
注：「デオキシ」はデオキシリボヌクレオチドを指し、そして「メトキシ」は２’−メトキシ置換リボヌクレオチドを指す。
表１に例示されるように、ハイブリッド安定性に影響を及ぼす異なる要因を用い、分子トーチのＴmを調整してもよい。ハイブリッド安定性に影響を及ぼす他の要因、例えば本明細書に記載されるようなものおよび当業に周知のものもまた、異なる溶液中で望ましいハイブリッドＴmを得るのに用いてもよい。
【０１２８】
実施例２：標的配列に結合する分子トーチ
トーチ５は、図６Ｂに示されるように、鎖２および３のＰＥＧリンカーがそれぞれ５’−ｔｔｔｃｔｔｔｔｃｔｔｔ−３’および５’−ｔｔｔｔｃｔｔｃｔｔｔｃ−３’のデオキシリボヌクレオチド配列で置き換えられ、したがってトーチ５のヌクレオチド塩基認識配列が、配列番号７（５’−ｃａｇｕｇｃａｇｇｇ ｇａａａｇｔｔｔｃｔ ｔｔｔｃｔｔｔｇｇｃ ｕｇｇｃａｃｕｇｃｇｕ ｇｃｇ−３’）および配列番号８（５’−ｃｇｃａｃｇｃａｇｕ ｃｃａｇｃｃｔｔｔｔ ｃｔｔｃｔｔｔｃｃｔ ｔｔｔｃｃｔｔｇｃｔ ｃｔｇ−３’）となる以外、トーチ１と同じである。トーチ５はまた、合成ＲＮＡ標的配列の存在を検出するのに用いられる、ＥＤＡＮＳフルオロフォア（「Ｆ」）およびＤＡＢＣＹＬ消光剤（「Ｑ」）も含んだ。トーチ５は、２’−メトキシ置換リボヌクレオチド（太字／斜字で示される）、およびデオキシリボヌクレオチドで構成される標的閉鎖ドメイン（配列番号４）で構成される、標的結合ドメイン（配列番号３）を有した。標的結合ドメインは、標的配列に完全に相補的であったが、標的閉鎖ドメインに対し３つのミスマッチを有した。
【０１２９】
トーチ５は、まず、ｐＨ ６．８５のＫＥＭＰＳ緩衝液（上の実施例１に記載されるようなもの）中にＥＤＡＮＳおよびＤＡＢＣＹＬ鎖を含む混合物を産生することにより、生成した。混合物を６０℃に１０分間加熱し、そしてその後、室温に冷却した。
【０１３０】
およそ８０ｐｍｏｌのトーチ５を、増加する量のＲＮＡ標的分子とインキュベーションした。試料を６０℃に２０分間加熱し、トーチを開き、そして標的結合ドメインおよび標的配列の間のハイブリダイゼーションを可能にし、そしてその後、室温に冷却し、標的配列にハイブリダイズしていないトーチを閉じた。コントロール試料は９０ ｍＭの標的を含み、そして６０℃に加熱しなかった（試料は室温に保持した）。
【０１３１】
Ｓｐｅｘ Ｆｌｕｏｒｏｌｏｇ−２分光光度計（ＩＳＡ Ｊｏｂｉｎ Ｙｖｏｎ−Ｓｐｅｘ；ニュージャージー州エジソン）を用い、蛍光を測定した。発光波長は４９５ ｎｍであり、そして励起波長は３６０ ｎｍだった。表２は実験の結果を要約する。
【０１３２】
表２
【０１３３】
【表２】
【０１３４】
結果は、本分子トーチが標的配列にほぼ化学量論的に結合することを示す。そして、使用した条件下では、標的結合ドメインは、熱の非存在下で標的配列に結合するのに利用不可能であり、したがって標的配列の存在下であってもほとんどシグナルを生じなかった。
【０１３５】
実施例３：異なる環境の影響
本実施例は、異なる溶液環境および異なるトーチ構築の使用および影響を例示する。本実施例に用いられた異なる溶液は、転写関連増幅反応のための異なる構成要素を含んだ。
【０１３６】
本実施例において、トーチ１、６および７（トーチ１および６は図６に示され、トーチ７は示されていない）を用いた。トーチ１は上の実施例１に記載され、トーチ６は、２’−メトキシ置換リボヌクレオチド標的結合ドメイン（配列番号３）（太字／斜字で示される）およびデオキシリボヌクレオチド標的閉鎖ドメイン（配列番号４）に連結している２０Å ＰＥＧジョイニング領域を含んだ。トーチ６はまた、フルオレセイン・フルオロフォア（「Ｆ」）およびＤＡＢＣＹＬ消光剤（「Ｑ」）も含んだ。トーチ７は、標的閉鎖ドメイン（配列番号４）が、ホスホロチオエート結合と置き換えられているホスホジエステル結合を有する修飾ヌクレオチドで構成される、トーチ６の類似体であった。
【０１３７】
あるとすれば明記される量の合成ＲＮＡ標的配列および２５ ｐｍｏｌの分子トーチを、以下に記載される条件Ａ、Ｂ、ＣおよびＤを生成するのに用いられる溶液１００μｌ中で共に混合した。条件Ａ、Ｂ、ＣおよびＤを生成した後、各溶液を６５℃に２０分間加熱し、そしてその後室温に１０分間冷却した。
【０１３８】
条件Ａ、Ｂ、ＣおよびＤは、以下の群の試薬から選択される試薬を含んだ：
試薬１：４０ ｍＭ トレハロース、４ ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２５ ｍＭ Ｎａｌｃ、０．０２ ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０４％ Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１０２、および０．０２ ｍＭ 酢酸亜鉛、ｐＨ ７．０；
試薬２：１２．５ ｍＭ ＭｇＣｌ2、１７．５ ｍＭ ＫＣｌ、０．１５ ｍＭ 酢酸亜鉛、５％ グリセロール、６．２５ ｍＭ ＡＴＰ、２．５ ｍＭ ＣＴＰ、６．２５ ｍＭ ＧＴＰ、２．５ ｍＭ ＵＴＰ、０．２ ｍＭ ｄＡＴＰ、０．２ ｍＭ ｄＣＴＰ、０．２ ｍＭ ｄＧＴＰ、０．２ ｍＭ ｄＴＴＰ、５０ ｍＭ Ｔｒｉｚｍａ塩基、５３ ｍＭ トレハロース、１００μＭ デスフェロキサミン、および２ ｍＭ スペルミジン、ｐＨ ８．０；
試薬３：１８ ｍＭ ＫＣｌ、４％ グリセロール、４ ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．１ ｍＭ ＥＤＴＡ、および０．０００２％ フェノールレッド、ｐＨ ７．０；並びに
試薬４：４０ ｍＭ トレハロース、４ ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２５ ｍＭ Ｎａｌｃ、０．０２ ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０４％ Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１０２、０．０２ ｍＭ 酢酸亜鉛、１８ ｍＭ ＫＣｌ、４％ グリセロール、４ ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．１ ｍＭ ＥＤＴＡ、および０．０００２％ フェノールレッド、ｐＨ７．０。
【０１３９】
条件Ａは、２５μｌの試薬２、２０μｌの試薬４、５０μｌの試料、逆転写酵素（〜３３．４μｇ）、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ（〜５４０ ｎｇ）およびプライマーで構成された。条件Ｂは、２０μｌの試薬３、２５μｌの試薬２、５０μｌの試料、およびプライマーで構成された。条件Ｃは、プライマーが存在しない以外、条件Ａと同一であった。条件Ｄは、プライマーが存在しない以外、条件Ｂと同一であった。
【０１４０】
Ｓｐｅｘ ＭｉｃｒｏＭａｘマイクロタイタープレート読み取り装置およびＦｌｕｏｒｏｌｏｇ−２分光光度計を用い、励起モノクロメーター上のバンド通過フィルター（４８５ ｎｍ）を用い、蛍光を測定した。４９１ ｎｍの励起波長および５２２ ｎｍの発光波長を用い、蛍光を測定した。結果を表３に示す。
【０１４１】
表３
【０１４２】
【表３】
【０１４３】
異なる環境で調べた異なる分子トーチの各々に関し、増加した標的配列の量として、シグナルの増加を観察した。バックグラウンドシグナルの量は、トーチ組成および環境に応じ変化した。
【０１４４】
実施例４：増幅ＲＮＡ転写物の検出
本実施例は、標的ＲＮＡ転写物の産生を検出するための転写関連増幅法（上に論じられる）中に存在する分子トーチの使用を例示する。転写関連増幅は、分子トーチの存在下で行い、そして増幅後、ＲＮＡ転写物の存在をトーチ６または一本鎖アクリジニウムエステル標識ポリヌクレオチドプローブのいずれかを用い測定した。
【０１４５】
本実施例に関し、２０ ｐｍｏｌのトーチ６の存在下で、そして５つの異なるＲＮＡ標的配列レベルの各々（すなわち標的ＲＮＡ配列の０、１００、５００、１０００および５０００コピー）で、上の実施例３に条件Ａとして特定される条件（試薬２に関し示される０．２ ｍＭの代わりに各ｄＮＴＰを１ ｍＭ使用したことを除く）を使用し、８つの別個の転写複製物を生成し、そして各標的配列レベルに関し、８つの複製物を、各々４つの複製物の２つの別個の群にプールした。増幅は４２℃で行った。増幅後、３５０μｌの各プール反応溶液を６０℃に２０分間加熱し、分子トーチを開き、それにより標的転写物に対する標的結合ドメイン（配列番号３）のハイブリダイゼーションを可能にした。標的にハイブリダイズしていないトーチが閉じるであろうように、試料をその後室温に冷却した。
【０１４６】
Ｓｐｅｘ ＭｉｃｒｏＭａｘマイクロタイタープレート読み取り装置およびＳｐｅｘ Ｆｌｕｏｒｏｌｏｇ−２分光光度計を用い、標的配列に結合しているトーチ６を測定した。４９１ ｎｍの励起波長および５２２ ｎｍの発光波長を用い、蛍光を測定した。
【０１４７】
標的配列に完全に相補的であるアクリジニウムエステル標識プローブを、増幅の度合いを決定するコントロールとして用いた。均質保護アッセイ（ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）（「ＨＰＡ」）形式を用い、アクリジニウムエステル標識プローブを使用した。約３，０００，０００総ＲＬＵのアクリジニウムエステル標識プローブおよび４００ ｐｍｏｌの未標識（ｃｏｌｄ）プローブを含むプローブ混合物を用い、５０μｌの各プール反応溶液に対し、ＨＰＡを行った。
【０１４８】
標的配列を検出するためのアクリジニウムエステル標識プローブを用いたＨＰＡ形式は、異なる参考文献に記載され、例えば、各々本明細書に援用される、Ａｒｎｏｌｄら、米国特許第５，２８３，１７４号、Ｎｅｌｓｏｎら、“Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｏｆ Ａｃｒｉｄｉｎｉｕｍ Ｅｓｔｅｒｓ Ｂｙ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ”： Ｎｏｎｉｓｏｔｏｐｉｃ ＤＮＡ Ｐｒｏｂｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ中（Ｋｒｉｃｋａ監修， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， １９９２）２７５−３１１ページ、およびＮｅｌｓｏｎら， Ｃｌｉｎ． Ｃｈｅｍ． Ａｃｔａ １９４：７３−９０， １９９０がある。
【０１４９】
表４および５は２つの異なる実験からの結果を提供する。
表４
【０１５０】
【表４】
【０１５１】
表５
【０１５２】
【表５】
【０１５３】
これらの両実験において、アクリジニウムエステル標識プローブを用いたＨＰＡにより検出される標的ＲＮＡ転写物の量および分子トーチにより検出される標的ＲＮＡ転写物の量の間に、全体的な直線関係があった。実験１において、アッセイの感度は標的配列５００コピーであった。実験２において、ＲＮＡ転写物は、標的配列１００コピーで始まる増幅反応からバックグラウンドより上に検出された。
【０１５４】
実施例５：標的配列による分子トーチの鎖置換
本実施例は、分子トーチを、本質的に一定の環境条件下で標的配列に結合しそして該配列を検出するよう設計することが可能であることを立証する。本実験のため、トーチ８（図７を参照されたい）を設計し、そしてその能力に関し試験し、溶液中のＲＮＡ標的配列を検出した。トーチ８は配列番号９（５’−ｃｇｇｃｕｇｃａｇｇ ｇｇａａａｇａａｕａ ｇｔｔｔｔｔｔｃｃｃ ｃｔｇｃａｇｃｃｇ−３’）のヌクレオチド塩基認識配列で構成され、ここで５’−ｕｇｃａｇｇｇｇａａａｇａａｕａｇ−３’部分は標的結合ドメインを表し、５’−ｔｃｃｃｃｔｇｃａｇｃｃｇ−３’部分は標的閉鎖ドメインを表し、５’−ｃｇｇｃ−３’部分は標的閉鎖ドメイン配列の一部に結合するための「クランプ」領域を表し、そして５’−ｔｔｔｔｔ−３’部分はデオキシリボヌクレオチドジョイニング領域であった。標的結合ドメインの部分（５’−ａａｇａａｕａｇ−３’）は標的による標的閉鎖ドメインの鎖置換を助長するため未結合のままであった。標的結合ドメインは、標的配列に完全に相補的であり、そして標的開放ドメインおよびクランプ領域はどちらも、２’−メトキシ置換リボヌクレオチド（太字／斜字で示される）で構成された。標的閉鎖ドメインはデオキシリボヌクレオチドで構成された。トーチ８はまた、フルオレセイン・フルオロフォア（「Ｆ」）およびＤＡＢＣＹＬ消光剤（「Ｑ」）も含んだ。
【０１５５】
本実験において、１００μｌのＫｒａｍｍｅｒ緩衝液（２０ ｍＭ ＴｒｉｓＣｌ、ｐＨ ８．０、５ ｍＭ ＭｇＣｌ、および０．２％ Ｔｗｅｅｎ（登録商標）−２０）を、白いＣｌｉｎｉｐｌａｔｅ（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ， Ｉｎｃ．；マサチューセッツ州フランクリン）の１０マイクロタイターウェルの各々に添加した。増加する濃度の標的配列を、以下の表６に示されるような増加する量で、１０の緩衝剤含有ウェルに添加し、その後、３０ ｐｍｏｌのトーチ８を１０のウェルの各々に添加した。プレートをその後、手動で１０−１５秒攪拌した後、各ウェルの流体表面を、蒸発および汚染を制限するのに用いる５０μｌの油で被覆した。プレートを室温で１０分間保持し、標的配列が標的閉鎖ドメインを置き換え、そして標的結合ドメインに結合するのに十分な時間置いた。各ウェルからの蛍光シグナルをその後、Ｓｐｅｘ ＭｉｃｒｏＭａｘプレート読み取り装置およびＳｐｅｘ Ｆｌｕｏｒｏｌｏｇ−２分光光度計を用い、４９５ ｎｍの発光波長および５２５ ｎｍの励起波長で測定した。表６は本実験の結果を提供する。
【０１５６】
表６
【０１５７】
【表６】
【０１５８】
本実験の結果は、標的配列がトーチ８に鎖侵入し、そして室温で標的結合ドメインに結合することが可能であったことを示す。さらに、この結果は、ウェル中でトーチに結合した標的配列の量が、ウェルに存在する標的配列の量と共に増加したことを示し、本発明のトーチがまた、試料に存在する可能性がある標的の量を定量化するのに有用である可能性があることも示す。
【０１５９】
他の態様は、請求項の範囲内である。したがって、いくつかの態様が示され、そして記載されているが、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、さまざまな修飾を作成することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、標的結合ドメイン：標的閉鎖ドメインハイブリッドの自由エネルギー（Ｉ）、標的結合ドメイン：標的配列ハイブリッドの安定性（ＩＩ）、ＩおよびＩＩの自由エネルギーの相違（ΔＧ）、およびＩのＩＩへの変換のための活性化自由エネルギー（ΔＧ*）の相違を例示する、エネルギー図を提供する。
【図２】 図２Ａ−２Ｇは、異なる分子トーチ構造の例を提供する。「Ｆ」はフルオロフォアを指し、そして「Ｑ」は消光剤を指す。
【図３】 図３Ａ−図３Ｃは、鎖置換の例を提供する。「Ｆ」はフルオロフォアを指し、そして「Ｑ」は消光剤を指す。標的配列は太線により示される。
【図４】 図４は、共有結合であるジョイニング領域を含む分子トーチの作用を例示する。「Ｆ」はフルオロフォアを指し、そして「Ｑ」は消光剤を指す。
【図５】 図５は、２つのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）基で構成されるジョイニング領域、および加熱中融解しないように、十分に高いＴmを有する、２つの実質的に相補的な核酸配列を含む分子トーチの機能を例示する。「Ｆ」はフルオロフォアを指し、そして「Ｑ」は消光剤を指す。
【図６】 図６Ａおよび６Ｂは、分子トーチ１−７を構成する鎖を例示する。「Ｆ」はフルオロフォアを指し、「Ｑ」は消光剤を指し、「ＰＥＧ」はポリエチレングリコールを指し、そして「ｃｃｃ」は末端糖の３’位に位置するプロピル基を指す。斜字で示された塩基は、２’−メトキシ置換リボヌクレオチドである。
【図７】 図７は、鎖置換反応で用いることが可能な分子トーチを例示する。「Ｆ」はフルオロフォアを指し、そして「Ｑ」は消光剤を指す。
【図８】 図８は、鎖置換反応における分子トーチの作用を例示する。「Ｆ」はフルオロフォアを指し、そして「Ｑ」は消光剤を指す。標的配列は太線により示される。
【配列表】
本出願は、１９９８年７月２日に提出された、米国仮特許出願第６０／０９１，６１６号の利益を請求する。
発明の分野
本発明は、試料中の標的核酸配列の存在または量を検出するための方法および組成物に関する。
発明の背景
本明細書に記載される参考文献はいずれも、請求された発明に対し先行技術であると認められていない。
【０００２】
標的核酸配列は、試料に存在する可能性がある他の配列よりも、標的配列に優先的にハイブリダイズするように設計された核酸プローブを用いた多様な方法により、検出することが可能である。標的配列の例には、元来試料に存在している可能性がある配列、または増幅法の一部として産生された配列である、微生物、ウイルス、植物遺伝子、またはヒト遺伝子などの動物遺伝子に特徴的な配列などが含まれる。標的配列の存在下で検出法の一部として産生されるが標的配列に依存しない配列を有する、レポーター配列を検出することもまた可能である。
【０００３】
標的核酸配列に対するプローブのハイブリダイゼーションは、適切な条件下で、検出可能なプローブ：標的二重鎖を形成することが可能である。こうした二重鎖の検出は、標識化プローブを用い、助長される。標的配列にハイブリダイズしていない標識化プローブからのシグナルによるバックグラウンドを減少させるための異なる技術が利用可能である。こうした技術には、物理的分離工程、ハイブリダイズしていないプローブに比べてプローブ：標的二重鎖において優先的に変化させられる標識、および／または相互作用標識の使用が含まれる。
【０００４】
相互作用標識は２つ以上の標識であり、互いに近接している際には、これらの標識が遠く離れておりしたがって協同作用が減少している際に生じるシグナルとは異なるシグナルを協同で生じる。標識は１つ以上の分子実体と関連していてもよい。検出系は、標識が、標的配列の存在下または標的配列の非存在下いずれかで相互作用するよう設計してもよい。
【０００５】
Ｔａｕｂら、米国特許第４，８２０，６３０号は、標的核酸配列の存在下で、協同で、検出可能なシグナルを生じる、２つの異なる核酸分子上に存在する相互作用標識を記載する。標的配列に対する両分子のハイブリダイゼーションにより、標識が近接し、したがって、近接して協同作用しない標識とは異なるシグナルを、協同で生じることが可能である。
【０００６】
Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、欧州特許出願第８７３００１９５．２号、公告番号第０ ２３２ ９６７号は、２つの相補的な核酸プローブで構成される試薬を含む検出系を記載する。相補的なプローブの一方は第一の標識を含み、そして他の相補的プローブは第二の標識を含む。第一および第二の標識は、互いに相互作用することが可能である。標的配列および２つの相補的プローブの一方の間の複合体の形成は、２つの標識の間の相互作用を変化させる。
【０００７】
Ｌｉｚａｒｄｉら、米国特許第５，１１８，８０１号および第５，３１２，７２８号は、互いに相補的な「スイッチ」配列が隣接する標的相補的配列を含む核酸プローブを記載する。標的配列の非存在下では、スイッチ配列が共にハイブリダイズする。標的配列の存在下では、プローブが標的配列にハイブリダイズし、スイッチ配列を物理的に分離し、そしてそれにより「開いたスイッチ」を生じる。スイッチ配列の状態は、開いていても閉じていても、プローブが標的配列にハイブリダイズしているか、検出可能なシグナルを、選択的に生成するのに有用であることが示されている。
【０００８】
Ｌｉｚａｒｄｉ、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ９４／１３４１５号、国際公告ＷＯ ９５／１３３９９は、「単一の（ｕｎｉｔａｒｙ）」ハイブリダイゼーションプローブを記載する。該プローブは、標的相補的配列、標的配列の非存在下でプローブを閉じたコンホメーションに保持するアフィニティー対、およびプローブが閉じたコンホメーションにある際、相互作用する標識対を含む。標的配列に対するプローブのハイブリダイゼーションは、プローブを開いたコンホメーションにシフトさせ、該コンホメーションは、標識対間の相互作用を減少させる。
発明の概要
本発明は「分子トーチ」および標的核酸配列の存在を検出するための分子トーチの使用を特徴とする。分子トーチは、標的結合ドメイン、標的閉鎖ドメイン、およびジョイニング（ｊｏｉｎｉｎｇ）領域を含む。標的結合ドメインは、同一のハイブリダイゼーション条件下では、標的閉鎖ドメインとよりも標的配列との方が安定なハイブリッドを形成するように、標的配列の方に偏向している。ジョイニング領域は、閉じたトーチの形成または維持を助長する。
【０００９】
標的配列の存在は、分子トーチを用い、該分子トーチが開いているかまたは閉じているかを測定することにより、検出することが可能である。「閉じた（ｃｌｏｓｅｄ）トーチ」において、標的結合ドメインには、標的閉鎖ドメインがハイブリダイズしている。「開いた（ｏｐｅｎ）トーチ」において、標的結合ドメインには、標的閉鎖ドメインがハイブリダイズしていない。
【００１０】
分子トーチ標的結合ドメインの標的配列偏向、およびジョイニング領域は、（１）標的結合ドメイン変性条件および標的結合ドメインハイブリダイズ条件、または（２）鎖置換（ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ）条件と組み合わせ、標的配列を検出するのに好ましくは用いる。
【００１１】
標的結合ドメイン変性条件下では、トーチは開いており、そして標的配列に対するハイブリダイゼーションに容易に利用可能である。標的配列への標的結合ドメインの偏向によって、標的配列の存在下では標的結合ドメイン：標的配列ハイブリッドが形成されるため、試料ストリンジェンシー条件が低下した際であっても、標的結合ドメインが開いたままになることが可能になる。
【００１２】
鎖置換条件下では、標的配列は、閉じたトーチに存在する標的結合ドメインとハイブリダイズし、それにより該トーチを開くことが可能である。鎖置換条件を用いて行うアッセイは、本質的に一定の環境条件下で実行することが可能である。本質的に一定の環境条件下では、最初に変性を達成しその後ハイブリダイゼーションを達成するのに、例えば温度を上昇させそして低下させたりして環境を変化させることはしない。
【００１３】
ジョイニング領域は、以下の少なくとも１つを生じることにより、閉じたトーチの産生または維持を助長する：（１）閉じたトーチの形成速度の増加；および（２）閉じたトーチの安定性の増加。形成速度および／または安定性の増加は、ジョイニング領域の非存在下でのこうした活性に関する。
【００１４】
ジョイニング領域は、標的開放および標的閉鎖ドメインを共に、共有および／または非共有結合させる、１つ以上の基で構成される。ジョイニング領域に存在する個々の基は、共有および／または非共有相互作用、例えばイオン性相互作用、疎水性相互作用、および水素結合により、共に連結される。
【００１５】
開いたトーチの存在の検出には、開いたトーチが存在するか直接検出すること、および／または閉じたトーチが存在するか検出することが含まれる。開いたトーチを検出するのに用いることが可能な技術の例には、以下が含まれる：（１）トーチが開いているか閉じているかに応じ、異なるシグナルを生じる相互作用標識の使用を伴うもの；（２）標的結合ドメイン：標的閉鎖ドメインハイブリッドにある際、標的閉鎖ドメインが標的結合ドメインにハイブリダイズしていない際に生じるシグナルと異なるシグナルを生じる標識を含む、標的閉鎖ドメインの使用を伴うもの；および（３）開いた標的結合ドメインに利用可能なものにした配列情報の検出を伴うもの。
【００１６】
好ましくは、相互作用標識は、開いたトーチの存在を検出するのに用いられる。相互作用標識の使用を伴う技術は、閉じた標的結合ドメインによって互いに近接して置かれた際、開いた標的結合ドメインにおけるように互いに近接していない際に生じるシグナルとは異なるシグナルを生じる標識を用いて、行うことが可能である。相互作用標識の例には、酵素／基質、酵素／補因子、発光剤／消光剤、発光剤／付加物、色素二量体（ｄｙｅ ｄｉｍｅｒ）、およびフェレスター（Ｆｏｒｒｅｓｔｅｒ）エネルギー移動対が含まれる。
【００１７】
標的結合ドメインおよび標的閉鎖ドメインは、互いに実質的に相補的なヌクレオチド塩基認識配列で構成される。「ヌクレオチド塩基認識配列」は、骨格により共に共有結合されるヌクレオチド塩基認識基を指す。ヌクレオチド塩基認識基は、少なくとも、アデニン、グアニン、シトシン、チミンまたはウラシルに水素結合することが可能である。ヌクレオチド塩基認識配列「骨格」は、共に共有連結される１つ以上の基で構成され、ヌクレオチド塩基認識基を適切な配向で提供することで核酸上に存在する相補的なヌクレオチドへのハイブリダイゼーションを可能にする。
【００１８】
「実質的に相補的な配列」は、使用される条件下で安定なハイブリッドを形成することが可能な２つのヌクレオチド塩基認識配列である。実質的に相補的な配列は、同一のまたは異なる分子上に存在してもよい。
【００１９】
実質的に相補的な配列には、互いに完全に相補的な配列、およびより低い相補性の配列（ミスマッチおよびリンカーを含むもの等）が含まれる。内部非相補的ヌクレオチドによるものなどのふくらみ（ｂｕｌｇｅ）、および共にハイブリダイズしている２つの認識基の間に置かれた非ヌクレオチドリンカーもまた、存在してもよい。好ましくは、実質的に相補的な配列は、好ましくは、長さ少なくとも１０、少なくとも１５、または少なくとも２０基の領域を含む２つの配列で構成される。好ましくは、２つの領域の一方に存在する基の少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または１００％が、２つの領域のもう一方に存在する基と水素結合する。より好ましくは、水素結合は、相補的ヌクレオチド塩基Ａ−Ｔ、Ｇ−Ｃ、またはＡ−Ｕ間である。
【００２０】
「リンカー」は、２つの基を共に共有結合させる原子の鎖を指す。この原子の鎖は共に共有結合され、そして分枝および環状基などの異なる構造を含んでもよい。
【００２１】
したがって、本発明の第一の側面は、標的核酸配列が試料に存在するか決定するための、分子トーチの使用を特徴とする。該分子トーチは：（１）もし標的配列が存在するとすれば、標的配列にハイブリダイズして開いたトーチを産生するための標的検出手段；（２）標的配列の非存在下で、標的検出手段にハイブリダイズして閉じたトーチのコンホメーションを提供するためのトーチ閉鎖手段；および（３）標的検出手段およびトーチ閉鎖手段を連結するジョイニング手段を含む。開いたトーチの存在の検出は、標的配列の存在の指標を提供する。
【００２２】
「標的検出手段」は、標的配列およびトーチ閉鎖手段にハイブリダイズすることが可能な、本出願に記載される成分およびその同等物（ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ）を指す。標的検出手段は、標的配列の存在下では標的検出手段が標的配列に優先的にハイブリダイズするように、トーチ閉鎖手段に比べて標的配列の方に偏向している。
【００２３】
「トーチ閉鎖手段」は、閉じたトーチを提供するために標的検出手段にハイブリダイズすることが可能な、本出願に記載される成分およびその同等物を指す。「ジョイニング手段」は、標的検出手段およびトーチ閉鎖手段を連結し（ｊｏｉｎ）、そして標的配列の非存在下で、閉じたトーチの産生または維持を助長する、本出願に記載される成分およびその同等物を指す。
【００２４】
本発明の別の側面は、標的配列が存在するか決定するための分子トーチの使用であって、以下の工程：（ａ）試料を、ジョイニング領域により共に連結された標的結合ドメインおよび標的閉鎖ドメインを含む分子トーチと接触させ；そして（ｂ）該標的配列の存在の指標として、トーチの存在を検出する工程を伴う、前記使用を特徴とする。
【００２５】
標的結合ドメインは、標的結合ドメイン：標的配列ハイブリッドが、標的結合ドメイン：標的閉鎖ドメインハイブリッドより安定しているように、標的配列の方に偏向している。標的配列が存在しない場合には、閉じたトーチのコンホメーションが有利である。
【００２６】
試料に曝露される前には、分子トーチ標的結合ドメインは、維持されている環境に応じ、開いていてもまたは閉じていてもよい。変性条件を用い、標的結合ドメインを開くことが可能である。好ましくは、変性は熱を用い、達成される。
【００２７】
あるいは、鎖置換条件を使用してもよい。鎖置換条件を使用する場合、分子トーチは、標的配列への結合前に開いている必要はない。
本発明の別の側面は、試料および分子トーチを含む混合物をまず、変性条件に曝露し、そしてその後ハイブリダイゼーション条件に曝露する、標的配列の存在を検出する方法を記載する。開いたトーチの存在は、標的配列の存在の指標として用いられる。
【００２８】
「変性条件」は、標的結合ドメイン：標的閉鎖ドメインハイブリッドが安定でなく、そしてトーチが開いている条件である。好ましい態様において、ジョイニング領域は、変性条件下で損なわれない（ｉｎｔａｃｔ）ままである。したがって、この好ましい態様において、変性条件下で、標的結合ドメインは、標的配列に対するハイブリダイゼーションに利用可能になるが、しかしまた、続く標的配列の非存在下でのハイブリダイゼーションのために、標的閉鎖ドメインとも近接したままである。
【００２９】
「ハイブリダイゼーション条件」は、標的結合ドメイン：標的閉鎖ドメインハイブリッドおよび標的結合ドメイン：標的配列ハイブリッドの両方が安定している条件である。こうした条件下では、標的配列の非存在下で標的結合ドメインが標的閉鎖ドメインとのハイブリッド中に存在することを、ハイブリダイズしている標的配列が妨げることはない。
【００３０】
本発明の別の側面は分子トーチを記載する。分子トーチは、（１）標的配列が存在する場合には、標的配列にハイブリダイズして開いたトーチを産生するための標的検出手段；（２）、標的配列の非存在下で、標的検出手段にハイブリダイズして閉じたトーチを提供するためのトーチ閉鎖手段；および（３）標的配列の非存在下で、閉じたトーチのコンホメーションを助長するためのジョイニング手段を含む。
【００３１】
本発明の別の側面は、ジョイニング領域を通じ連結されている、標的結合ドメインおよび標的閉鎖ドメインを含む、分子トーチを記載する。標的結合および標的閉鎖ドメインは、実質的に、互いに相補的である。標的結合ドメインは、標的結合ドメインの完全なＤＮＡまたはＲＮＡ相補体、好ましくはＲＮＡ相補体である標的配列の方に偏向している。したがって、標的結合ドメインは、標的閉鎖ドメインとよりも、その完全なＤＮＡまたはＲＮＡ相補体と、より安定な二重鎖を形成する。
【００３２】
「標的結合ドメインの完全なＤＮＡまたはＲＮＡ相補体」は、標的結合ドメインに存在する各認識基に向き合う相補的なプリンまたはピリミジンヌクレオチド塩基を含む、ＤＮＡまたはＲＮＡである。相補的なプリンまたはピリミジンヌクレオチド塩基は、互いに水素結合することが可能である。
【００３３】
多様な例が本明細書に記載される。これらの例は、いかなる点でも請求される発明を限定するよう意図されない。
本発明の他の特徴および利点は、以下の図、本発明の説明、実施例、および請求項から明白になるであろう。
発明の詳細な説明
分子トーチは、好ましくは、標的配列の存在を検出するアッセイにおいて、好都合な動的および熱力学的構成要素を提供するよう、設計される。分子トーチを伴うアッセイの動的および熱力学的構成要素を用い、標的配列の特異的な検出を亢進してもよい。
【００３４】
好ましい分子トーチの熱力学は、図１に例示される。図１に関し、「Ｉ」は標的結合ドメイン：標的閉鎖ドメインハイブリッドを示す一方、「ＩＩ」は標的結合ドメイン：標的配列ハイブリッドを示す。図１において、ΔＧ*は、標的結合ドメイン：標的閉鎖ドメインを融解するのに必要な活性化の自由エネルギーを表し、そしてΔＧは、標的結合ドメイン：標的閉鎖ドメインハイブリッドおよび標的結合ドメイン：標的配列ハイブリッドの間の自由エネルギーの相違を表す。
【００３５】
本発明の熱力学的構成要素は、標的結合ドメイン：標的配列ハイブリッドが、標的結合ドメイン：標的閉鎖ドメインハイブリッドより安定していることに基づく（ΔＧ＜０）。ジョイニング領域は、標的配列の非存在下で、閉じたトーチのコンホメーションを助長する。
【００３６】
さらに、トーチ設計に応じ、ジョイニング領域を用い、以下の利点の１つ以上を提供することもできる：（１）標的開放および閉鎖ドメイン上に存在する標識が、標的の非存在下で、離れる可能性を減少させること；（２）ミスマッチしている標的への感度を亢進させるのに用いることが可能な、短い標的結合ドメインの使用を助長すること；（３）標的閉鎖ドメインおよび標的結合ドメインが、例えばミスマッチまたは無塩基性（ａｂａｓｉｃ）「ヌクレオチド」を含む際、閉じたトーチのコンホメーションを助長すること；並びに（４）アデニンおよびチミンが豊富な標的結合および標的閉鎖ドメインの相互作用を安定化させることにより、アデニンおよびチミンが豊富な標的配列の検出を助長すること。
【００３７】
変性条件
変性条件を用い、標的結合ドメイン：標的閉鎖ドメインハイブリッドを融解するのに十分なエネルギー（ΔＧ*）を提供してもよい。必要とされるエネルギーの量は、分子トーチ組成および環境条件に応じ、異なるであろう。環境条件には、アッセイ溶液組成および温度が含まれる。閉じた標的を開くのに必要とされるエネルギーは、例えば、試料を加熱することにより、供給することが可能である。
【００３８】
ハイブリッドの安定性の有用な測定値は、融解温度（Ｔm）である。融解温度では、存在するハイブリッドの５０％が変性される。
特定のアッセイ組成を用いると、ハイブリッドは、アッセイ温度がＴmを超えた場合、安定でない。アッセイの組成に応じ、ハイブリッドのＴmは異なるであろう。塩濃度および変性剤の存在などの要因が、既定のハイブリッドのＴmに影響を及ぼす可能性がある。Ｔmは、特定のアッセイ組成を用い、そして温度を変化させ、決定される。
【００３９】
本明細書に記載されるものおよび当業に周知のものなど、Ｔmに影響を及ぼす要因を考慮することにより、分子トーチは、望ましい標的結合ドメイン：標的閉鎖ドメインＴmおよび望ましい標的結合ドメイン：標的Ｔm、例えばΔＧ＜０を有するよう、容易に設計することが可能である。Ｔmは、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， １９８９、およびＨｏｇａｎら、米国特許第５，５４７，８４２号に記載されるもの（前記文献はどちらも、本明細書に援用される）などの技術を用い、測定することが可能である。
【００４０】
図２は、いくつかの異なる分子トーチの立体配置（ｃｏｎｆｉｇｒａｔｉｏｎ）を示しているが、当業者は、本発明を実施するのに用いることが可能な他の分子トーチ立体配置を、容易に認識するであろう。図２Ａは、標的結合領域およびジョイニング領域で構成される、二本鎖分子トーチを例示する。標的結合領域は、標的配列に結合する標的結合ドメインおよび標的結合ドメインに結合する標的閉鎖ドメインからなる。
【００４１】
図２Ｂ−２Ｄは、標的結合およびジョイニング領域で構成される一本鎖分子トーチを例示する一方、図２Ｅは、三本鎖分子トーチを例示する。
図２Ｆは、ジョイニング領域および２つの標的結合領域を含む分子トーチを例示する。２つの標的結合領域は、同一のまたは異なる標的配列に結合することが可能であり、そして同一のまたは異なる相互作用標識を有することが可能である。例えば、各標的結合領域上に、独立に検出可能な、異なる発光特性を有する、異なる種類のフルオロフォアを配置することにより、単一の分子トーチを用い、異なるフルオロフォアのシグナル特性を探すことにより、異なる標的配列の存在を検出することが可能である。
【００４２】
図２Ｇは、標的結合領域およびジョイニング領域で構成される２本鎖分子トーチを例示する。該ジョイニング領域は、例えばＰＥＧまたはポリヌクレオチドで構成されるリンカーにより、標的結合または標的閉鎖ドメインに連結している相補的ポリヌクレオチドを含む。
【００４３】
鎖置換条件
鎖置換条件下では、標的結合ドメイン：標的配列ハイブリッドは、標的結合ドメイン：標的閉鎖ドメインハイブリッドより安定しており、そして標的配列が存在する場合、標的結合ドメイン：標的配列ハイブリッドの産生が有利である。
【００４４】
鎖置換は、好ましくは、標的へのハイブリダイゼーションに利用可能なヌクレオチド塩基認識基を有するトーチを用い、行われる。こうしたトーチは、好ましくは、利用可能である標的配列に相補的な、１ないし約１０のヌクレオチド塩基認識基を含む。好ましくは、１０未満、５または３ヌクレオチド塩基認識基が利用可能である。
【００４５】
異なる立体配置が可能であり、一本鎖領域が末端領域であるもの、または一本鎖領域がループ領域などの内部領域であるものが含まれる。あるいは、例えば５’または３’末端トーチ領域を「休息（ｂｒｅａｔｈ）」させる、鎖置換条件を使用してもよい。トーチの休息は、領域の安定性が、標的結合ドメイン：標的配列ハイブリッドの形成が有利となるように、該トーチが一本鎖になって標的核酸にハイブリダイズすることを可能にする条件下で起こる。
【００４６】
図３Ａ−３Ｃは、鎖置換の異なる例を提供する。図３Ａおよび３Ｃは、標的ハイブリダイゼーションに利用可能な、３つの末端ヌクレオチドを有する分子トーチを例示する。図３Ｂは、２つの末端ヌクレオチドの休息および標的ハイブリダイゼーションを例示する。
【００４７】
標的配列偏向
標的結合ドメインは、核酸ハイブリッド安定性に影響を及ぼす異なる設計考察を用いて、標的配列の方に偏向させることが可能である。こうした考察には、相補性の度合い、相補的認識基の種類、およびヌクレオチド塩基認識配列骨格が含まれる。これらの異なる要因の影響は、環境条件に応じ異なる。
【００４８】
相補性の度合いは、標的閉鎖ドメイン上に存在する認識基と水素結合し標的配列と水素結合する、標的結合ドメイン上に存在する認識基の数を考慮する。標的結合ドメインは、標的閉鎖ドメインに対してよりも標的配列に対して、より高い相補性の度合いを有するように、異なる技術を用い設計してもよい。こうした技術には、例えば、標的閉鎖ドメインとのミスマッチを有するが、標的配列とのミスマッチを持たない標的結合ドメインを設計すること、および標的閉鎖ドメインにおける非ヌクレオチドリンカーの使用が含まれる。
【００４９】
ヌクレオチド塩基認識配列に存在する非ヌクレオチドリンカーの例は、無塩基性「ヌクレオチド」である。無塩基性「ヌクレオチド」は、ヌクレオチド塩基認識基を欠く。
【００５０】
非ヌクレオチドリンカーの他の例には、多糖類、ペプチド、およびポリペプチドが含まれる。本明細書に援用される、Ａｒｎｏｌｄら、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ８８／０３１７３号、国際公告ＷＯ ８９／０２４３９、および米国特許第５，５８５，４８１号もまた、非ヌクレオチドリンカーの例を提供する。
【００５１】
存在する認識基の種類を利用して、異なるヌクレオチドプリンおよびピリミジン塩基の間の水素結合の度合いなどの要因を考慮することにより、標的結合ドメインを、標的配列の方に偏向させてもよい。例えば、Ｇ−Ｃ対形成または２，６ ジアミノプリン−チミンは、Ａ−Ｔ対形成およびイノシンなどの普遍的塩基との対形成より強い。標的結合ドメインは、標的閉鎖ドメインに比べ、標的配列に存在するヌクレオチドと、増加したＧまたはＣ対形成を有するよう設計してもよい。
【００５２】
ヌクレオチド塩基認識配列骨格の組成を異なる方式で調整し、標的結合ドメインを標的配列の方に偏向させてもよい。好ましい分子トーチ骨格は、糖・ホスホジエステル型結合、例えばリボおよびデオキシリボ核酸に存在するものである。別の種類の結合は、ペプチド結合、例えばペプチド核酸に存在するものである。
【００５３】
ペプチド核酸は、一般的に対応するＤＮＡ配列よりＲＮＡと、より安定した二重鎖を形成する。したがって、例えば、標的結合ドメインがペプチド核酸基を含み、そして標的閉鎖ドメインがＤＮＡで構成される分子トーチを用いることにより、標的結合ドメインをＲＮＡ標的配列の方に偏向させてもよい。
【００５４】
糖・ホスホジエステル型結合の場合、糖基および２つの糖基を連結する結合がハイブリッド安定性に影響を及ぼすであろう。糖が有する可能性がある影響の例は、２’−メトキシ置換ＲＮＡで見られるものである。２’−メトキシ含有核酸は、一般的に、対応するＤＮＡ配列とよりも、ＲＮＡと、より安定した二重鎖を形成する。別の例は、２’−メトキシ置換ＲＮＡと同じ種類の影響を有する、２’−フルオロ置換ＲＮＡである。
【００５５】
骨格結合基がハイブリッド安定性に影響を及ぼす可能性がある方式の例には、２つの鎖の間の荷電密度および物理的関連に影響を及ぼすことが含まれる。大きい基由来の立体相互作用はハイブリッド安定性を減少させる可能性がある。ホスホロチオエート類などの基がハイブリッド安定性を減少させる可能性がある一方、メチルホスホネート類などの非荷電基はハイブリッド安定性を増加させる可能性がある。
【００５６】
標的結合ドメイン：標的配列ハイブリッド
標的結合ドメイン：標的配列ハイブリッドの形成は、閉じたトーチより安定な開いたトーチの産生を生じる。トーチを開くための、または鎖置換のための条件を用い、標的配列の存在下で開いたトーチの産生を助長してもよい。
【００５７】
トーチの開放および閉鎖は、使用する検出法の環境条件を変化させることにより、達成することが可能である。トーチを開くそして閉じるための環境条件の変化の例には、加熱および冷却；ｐＨの上昇および低下；並びに変性剤の添加後の該剤の希釈が含まれる。
【００５８】
標的結合ドメイン：標的配列ハイブリッドは、標的結合ドメイン：標的閉鎖ドメインハイブリッドより安定である。好ましくは、検出法に用いられる条件下で、標的結合ドメイン：標的Ｔmは、標的結合ドメイン：標的閉鎖ドメインＴmより、少なくとも２℃、より好ましくは少なくとも５℃、さらにより好ましくは少なくとも１０℃高い。
【００５９】
標的配列の非存在下での閉じたトーチは、分離工程の必要なしに、標的配列にハイブリダイズしていない分子トーチからのバックグラウンドを減少させる。好ましくは、トーチが最初に開いているアッセイにおいて、標的配列の非存在下でトーチを閉鎖するハイブリダイゼーション条件は、標的結合ドメイン：標的閉鎖ドメインハイブリッドのＴmより、少なくとも２℃低く、より好ましくは少なくとも５℃低く、そしてより好ましくは少なくとも１０℃低い温度を使用する。
【００６０】
必要であれば、分離工程を使用し、標的配列にハイブリダイズしていない分子トーチから、標的配列にハイブリダイズしている分子トーチを物理的に分離してもよい。分離工程は、例えば開いた標的結合ドメインにより利用可能にされている配列情報を用い、行ってもよい。例えば標的閉鎖ドメインに相補的な核酸配列を有する捕捉プローブを用い、標的配列にハイブリダイズしている分子トーチを捕捉してもよい。捕捉プローブ自体は、直接、あるいはビーズまたはカラム上に間接的に提供されてもよい。
【００６１】
捕捉プローブ、または標的閉鎖ドメインに相補的な他の種類の核酸プローブを用いる場合、こうしたプローブが、標的結合ドメイン：標的配列ハイブリッドの非存在下で、安定な標的閉鎖ドメイン：プローブハイブリッドが形成されない条件下で、設計されて用いられることが重要である。好ましくは、標的閉鎖ドメイン：プローブハイブリッドは、標的結合ドメイン：標的閉鎖ドメインハイブリッドより、少なくとも５℃、そしてより好ましくは少なくとも１０℃低いＴmを有する。
【００６２】
標的配列の検出
分子トーチを用い、標的結合ドメイン：標的閉鎖ドメインハイブリッドが安定な条件下で、該トーチが開いているか決定することにより、標的配列の存在を検出することが可能である。開いたトーチは、（１）トーチが開いているかまたは閉じているかに応じ異なるシグナルを生じる、相互作用標識の使用を伴うもの；（２）標的結合ドメイン：標的閉鎖ドメインハイブリッド中にある際は、標的閉鎖ドメインが標的結合ドメインにハイブリダイズしていない際に生じるシグナルと異なるシグナルを生じる標識を含む、標的閉鎖ドメインの使用を伴うもの；および（３）開いた標的結合ドメインにより利用可能にされている配列情報の検出を伴うものなど、異なる技術を用い、検出してもよい。
【００６３】
異なる種類の相互作用標識を用い、トーチが開いているか決定してもよい。好ましくは、相互作用標識は、発光剤／消光剤対、発光剤／付加物対、Ｆｏｒｒｅｓｔｅｒエネルギー移動対または色素二量体のいずれかである。１つ以上の標識、および１つ以上の種類の標識が、特定の分子上に存在してもよい。
【００６４】
発光剤／消光剤対は、１つ以上の発光標識、例えば化学発光または蛍光標識、および１つ以上の消光剤で構成される。好ましくは、蛍光剤／消光剤対を用い、開いたトーチを検出する。蛍光標識は、特定の波長、または波長範囲の光を吸収し、そして特定の発光波長、または波長範囲の光を放出する。消光剤は、励起蛍光標識から放出されるシグナルを、部分的にまたは完全に鈍らせる。消光剤は、異なるフルオロフォアからのシグナル産生を鈍らせることが可能である。例えば４−（４’−ジメチル−アミノ−フェニルアキソ）安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）は、５−（２’−アミノエチル）アミノアフサリン−１−スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）、ローダミンおよびフルオレセインから生じるシグナルの約９５％を消光することが可能である。
【００６５】
異なる数および種類の蛍光および消光標識を用いてもよい。例えば、多数の蛍光標識を用い、開いたトーチからのシグナル産生を増加させてもよいし、そして多数の消光剤を用い、標的配列の非存在下では、励起蛍光分子がほとんどまたはまったくシグナルを生じないことを確実にするのを補助してもよい。フルオロフォアの例には、アクリジン、フルオレセイン、スルホローダミン１０１、ローダミン、ＥＤＡＮＳ、テキサスレッド、エオジン、Ｂｏｄｉｐｙおよびルシファイエローが含まれる。（例えば、本明細書に援用される、Ｔｙａｇｉら， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １６：４９−５３， １９９８を参照されたい）。消光剤の例には、ＤＡＢＣＹＬ、タリウム、セシウム、およびｐ−キシレン−ビス−ピリジニウムブロミドが含まれる。
【００６６】
発光剤／付加物対は、１つ以上の発光標識、および発光分子と付加物を形成し、そしてそれにより発光分子からのシグナル産生を減少させることが可能な、１つ以上の分子で構成される。溶液中に遊離のリガンドを用い、発光分子から生じるシグナルを改変するための付加物形成の使用は、本明細書に援用される、ＢｅｃｋｅｒおよびＮｅｌｓｏｎ、米国特許第５，７３１，１４８号に記載されている。付加物はまた、付加物形成因子を分子トーチに、または開いたトーチにおいて利用可能にされている配列情報とハイブリダイズする核酸プローブに結合させることにより、形成してもよい。
【００６７】
Ｆｏｒｒｅｓｔｅｒエネルギー移動対は２つの標識で構成されており、第一の標識の発光スペクトルが第二の標識の励起スペクトルと重複する。第一の標識を励起させ、そして第二の標識に特徴的な発光を測定し、標識が相互作用しているか決定してもよい。Ｆｏｒｒｅｓｔｅｒエネルギー移動対の例には、フルオレセインおよびローダミン；ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾールおよびローダミン；フルオレセインおよびテトラメチルローダミン；フルオレセインおよびフルオレセイン；ＩＡＥＤＡＮＳおよびフルオレセイン；並びにＢＯＤＩＰＹＦＬおよびＢＩＯＤＩＰＹＦＬを含む対が含まれる。
【００６８】
色素二量体は、二量体の形成に際し、相互作用し、色素が二量体コンホメーションにない場合とは異なるシグナルを生じる２つの色素で構成される。色素二量体相互作用は、例えばＰａｃｋａｒｄら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９３：１１６４０−１１６４５， １９９６（本明細書に援用される）に記載される。
【００６９】
検出工程中に生じる、標的配列の存在に特徴的な、観察されるシグナルを、標的配列を含まないまたは既知の量の標的配列を含むコントロール反応に対し、比較してもよい。既知の量の標的配列を用い、検量線を得てもよい。コントロール反応は、好ましくは、実験反応と同時に行われるが、コントロール反応は実験反応と同時に行う必要はなく、そして以前の実験から得たデータに基づいていてもよい。
【００７０】
標的配列を検出するための、相互作用標識を有する分子トーチの使用例は、図４および５に提供される。両図は、標的配列の存在を例示する。標的配列の非存在下では、分子トーチ標的結合ドメインは閉じており、シグナルの消光を生じる。
【００７１】
図４は、小さいジョイニング領域を含む一本鎖分子トーチの使用を例示する。熱を用い、標的結合ドメイン：標的閉鎖ドメインハイブリッドを融解する。該トーチは、例えば、標的結合ドメインに存在する２’−メトキシ置換リボヌクレオチドの存在により、ＲＮＡ標的配列の方に偏向している。標的配列の存在下では、消光剤（Ｑ）はもはやフルオロフォア（Ｆ）の近くに保持されておらず、したがって、フルオロフォア蛍光に影響を及ぼす消光剤の能力は減少している。
【００７２】
図５は、２つの部分、非ヌクレオチドＰＥＧリンカーおよび高いＴmがアッセイ中の融解を妨げる配列で構成されるジョイニング領域を含む二本鎖分子の使用を例示する。
【００７３】
本発明の別の態様は、標的結合ドメイン：標的閉鎖ドメインハイブリッドにある際に、標的閉鎖ドメインが標的結合ドメインにハイブリダイズしていない際に生じるシグナルとは異なるシグナルを生じる標識を使用し、開いたトーチを検出することを伴う。こうした標識には、発光分子、および異なる環境に存在する際に異なる安定性を有する標識が含まれる。
【００７４】
１つのヌクレオチド塩基認識配列上に存在する発光分子から生じるシグナルは、別のヌクレオチド塩基認識配列により影響を受ける可能性がある。例えば、１つのヌクレオチド塩基認識配列上のヌクレオチドを用い、別のヌクレオチド塩基認識配列上に存在するフルオロフォアを消光し、または該フルオロフォアの回転運動を達成することが可能である。
【００７５】
特定の標識の安定性に影響を及ぼすことが可能な環境には、ワトソン・クリック塩基対形成で形成されている核酸二重鎖が含まれる。こうした標識およびその使用の例は、共に本明細書に援用される、ＢｅｃｋｅｒおよびＮｅｌｓｏｎ、米国特許第５，７３１，１４８号、並びにＡｒｎｏｌｄら、米国特許第５，２８３，１７４号に記載される。
【００７６】
アクリジニウムエステルおよびその誘導体は、標識の環境に基づき、開いたトーチを検出するための、好ましい標識の例である。アクリジニウムエステルは、異なる技術（例えば核酸二重鎖に存在しない標識を選択的に不活性化するなど）を用いて、検出することが可能である。１つ以上のアクリジニウムエステル標識の使用例は、こうした標識を標的閉鎖ドメインに結合させ、そして一本鎖標的閉鎖ドメイン上に存在するアクリジニウムエステル標識の選択的不活性化によるシグナルの減少を、標的配列の存在の指標として用いることを伴う。
【００７７】
開いた標的結合ドメインにより利用可能にされている配列情報を用いた開いたトーチの検出は、標的閉鎖ドメインにハイブリダイズする検出プローブを用い、実行することが可能である。好ましい検出プローブには、検出可能標識が含まれる。検出可能標識は、例えば、標的閉鎖ドメイン上に存在する標識と相互作用する標識であってもよいし、または標的閉鎖ドメイン上の相互作用標識の非存在下でシグナルを生じる標識であってもよい。好ましいプローブ標識は、アクリジニウムエステルである。
【００７８】
標的配列数の増加
標的配列が、少ない数で試料に存在する場合、増幅を行い、標的配列数を増加させてもよい。多くの増幅技術が当業に周知であり、転写関連増幅、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）およびリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）を伴うものを含む。
【００７９】
好ましくは、分子トーチは、転写関連増幅と共に用いる。転写関連増幅は、二本鎖ＤＮＡプロモータ領域を認識するＲＮＡポリメラーゼを用い、ＲＮＡ転写物を生成することを伴う。
【００８０】
転写関連増幅を記載する参考文献の例には、Ｂｕｒｇら、米国特許第５，４３７，９９０号；Ｋａｃｉａｎら、米国特許第５，３９９，４９１号；Ｋａｃｉａｎら、米国特許第５，５５４，５１６号；Ｋａｃｉａｎら、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ９３／０４０１５号、国際公告ＷＯ ９３／２２４６１；Ｇｉｎｇｅｒａｓら、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ８７／０１９６６号、国際公告ＷＯ ８８／０１３０２；Ｇｉｎｇｅｒａｓら、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ８８／０２１０８号、国際公告ＷＯ ８８／１０３１５；ＤａｖｅｙおよびＭａｌｅｋ、ＥＰＯ出願第８８１１３９４８．９号、欧州公告第０ ３２９ ８２２ Ａ２号；Ｍａｌｅｋら、米国特許第５，１３０，２３８号；Ｕｒｄｅａ、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ９１／００２１３号、国際公告ＷＯ ９１／１０７４６；ＭｃＤｏｎｏｕｇｈら、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ９３／０７１３８号、国際公告ＷＯ ９４／０３４７２；並びにＲｙｄｅｒら、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ９４／０８３０７号、国際公告ＷＯ ９５／０３４３０（各々本明細書に援用される）が含まれる。
【００８１】
ＲＮアーゼＨ活性を伴う転写関連増幅法の使用が好ましい。より好ましくは、該方法は、鎖分離を助長する逆転写酵素に存在するＲＮアーゼＨ活性を利用する。Ｋａｃｉａｎら、米国特許第５，３９９，４９１号は、外因性ＲＮアーゼＨ活性の添加を伴わない、本質的に一定の条件下で起こる増幅を記載する。該方法は、鎖分離を助長する逆転写酵素に存在するＲＮアーゼＨ活性を利用する。
【００８２】
本発明を転写関連増幅と共に使用する、１つの利点は、分子トーチを増幅前に添加することが可能であり、そしてさらなる試薬を添加することなく、検出を実行することが可能であることである。標的結合ドメイン：標的閉鎖ドメインハイブリッドのＴmを、増幅中に使用される温度より高く調整することが容易に可能であるため、分子トーチは、転写関連増幅における使用によく適している。閉じた標的結合ドメインは、増幅により生成された標的配列に、分子トーチが時期尚早に結合することを妨げる。
【００８３】
増幅後、溶液を加熱し、標的結合ドメインを開き、分子トーチが標的配列にハイブリダイズすることを可能にしてもよい。溶液をその後冷却し、標的配列にハイブリダイズしていないトーチの標的結合ドメインを閉じてもよい。例えばフルオロフォア／消光剤対を有する、開いたトーチの存在を、その後、試料に適切な励起光を照射し、そしてその後、放出光を測定することにより、測定してもよい。
【００８４】
他の増幅法に言及する参考文献の例には、ＰＣＲ増幅を記載するもの、例えばＭｕｌｌｉｓら、米国特許第４，６８３，１９５号、第４，６８３，３０２号、および第４，８００，１５９号、並びにＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，第１５５巻， １９８７， ３３５−３５０ページ；並びにリガーゼ連鎖反応を記載するもの、例えばＢａｃｋｍａｎ、欧州特許出願第８８３１１７４１．８号、欧州公告第０ ３２０ ３０８号（これらの参考文献の各々は、本明細書に援用される）が含まれる。
【００８５】
分子トーチ構築
分子トーチは、標的結合ドメイン、標的閉鎖ドメインおよびジョイニング領域を含む。標的結合および閉鎖ドメインは各々ヌクレオチド塩基認識基である。
【００８６】
ヌクレオチド塩基認識配列は、核酸に存在するヌクレオチド窒素含有塩基と水素結合することが可能なヌクレオチド認識基を含む。ヌクレオチド認識基は、核酸上に存在するヌクレオチドに該基を水素結合するのを可能にする、適切なコンホメーションおよび間隔を提供する骨格により、共に連結される。
【００８７】
既定のヌクレオチド認識基は、特定のヌクレオチド（例えばアデニン、グアニン、シトシン、チミン、およびウラシル）に相補的であってもよく、そしてしたがって核酸に存在するヌクレオチドと水素結合することが可能であってもよい。ヌクレオチド認識基はまた、異なる複数のヌクレオチドと水素結合することが可能であってもよい。例えば、イノシンがヌクレオチド塩基認識基である場合、異なる複数のヌクレオチド塩基と水素結合することが可能である。
【００８８】
好ましいヌクレオチド塩基認識基は、アデニン、グアニン、シトシン、チミンまたはウラシルのいずれかと水素結合することが可能な、窒素含有プリンまたはピリミジン塩基、あるいはその誘導体である。こうした認識基の例には、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル、およびその誘導体が含まれる。誘導体の例には、修飾プリンまたはピリミジン塩基、例えばＮ４−メチルデオキシグアノシン、天然プリンおよびピリミジン塩基の代わりに用いられるデアザまたはアザプリンおよびピリミジン類、５または６位に置換基を有するピリミジン塩基、並びに２、６または８位に改変されたまたは置き換えられた置換基を有するプリン塩基が含まれる。例えばＣｏｏｋ、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ９２／１１３３９号、国際公告ＷＯ ９３／１３１２１（本明細書に援用される）を参照されたい。さらなる例には、２−アミノ−６−メチルアミノプリン、Ｏ６−メチルグアニン、４−チオ−ピリミジン類、４−アミノ−ピリミジン類、４−ジメチルヒドラジン−ピリミジン類およびＯ４−アルキル−ピリミジン類が含まれる（例えばＴｈｅ Ｇｌｅｎ Ｒｅｐｏｒｔ第１巻、１９９３を参照されたい）。
【００８９】
ヌクレオチド塩基認識配列骨格は、異なる基で構成されていてもよい。異なる骨格の例には、糖・ホスホジエステル型骨格およびペプチド核酸骨格が含まれる。
【００９０】
構造Ｉは、糖基がペントフラノシル基である、糖・ホスホジエステル型骨格を例示する。糖基は、ホスホジエステル結合または他の適切な結合などの結合により、共に連結されている。
【００９１】
構造Ｉ
【００９２】
【化１】
Ｘは２つの糖を連結する基を表す。Ｘの例には、−ＯＰ（Ｏ）2Ｏ−、−ＮＨＰ（Ｏ）2Ｏ−、ＯＣ（Ｏ）2Ｏ−、−ＯＣＨ2Ｃ（Ｏ）2ＮＨ−、−ＯＣＨ2Ｃ（Ｏ）2Ｏ−、−ＯＰ（ＣＨ3）（Ｏ）Ｏ−、−ＯＰ（Ｓ）（Ｏ）Ｏ−および−ＯＣ（Ｏ）2ＮＨ−が含まれる。本明細書に提供される他の例のように、当業に周知のまたは入手可能となる、他の同等物もまた用いてもよい。
【００９４】
Ｙ1およびＹ2は、独立に選択される基である。Ｙ1およびＹ2の例には、Ｈ、ＯＨ、Ｃ1−Ｃ4アルコキシ、ハロゲン、およびＣ1−Ｃ6アルキルが含まれる。好ましくは、Ｙ1およびＹ2は、独立に、Ｈ、ＯＨ、Ｆ、またはＯＣＨ3のいずれかである。Ｃ1−Ｃ6アルキルおよびＣ1−Ｃ4アルコキシは直鎖、分枝、または環状である基であっても、該基を含んでもよい。
【００９５】
塩基1および塩基2は、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル、または隣接する塩基と相補的な核酸との相補的塩基対形成を阻害しない基からなる群より、独立に選択される。相補的塩基対形成を阻害しない基の例には、より小さい基、例えば水素、ＯＨ、Ｃ1−Ｃ6アルキル、およびＣ1−Ｃ4アルコキシが含まれる。好ましくは、ヌクレオチド塩基認識配列は：アデニン、グアニン、シトシン、チミン、およびウラシルからなる群より独立に選択される、約７ないし約４０、より好ましくは約１０ないし約３０塩基を含む。
【００９６】
Ｒ1およびＲ2は独立に選択される基を表す。Ｒ1およびＲ2の例には、さらなる糖・ホスホジエステル型基、水素、ヒドロキシ、ペプチド核酸、および無塩基性「ヌクレオチド」など配列情報を提供しない分子、多糖類、ポリペプチド、ペプチド、および他の非ヌクレオチド結合が含まれる。
【００９７】
ヌクレオチド塩基認識配列の構成要素となることが可能な構造Ｉの誘導体は、当業に周知であり、そして例えば、異なる種類の糖を有する分子が含まれる。例えば、ヌクレオチド塩基認識配列は、結合部分により連結しているシクロブチル部分を有してもよく、ここで該シクロブチル部分は、それに結合する複素環塩基を有する。たとえばＣｏｏｋら、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ９３／０１５７９号、国際公告ＷＯ ９４／１９０２３（本明細書に援用される）を参照されたい。
【００９８】
本発明の態様において、ヌクレオチド塩基認識分子は、ポリヌクレオチドまたはその誘導体である。「ポリヌクレオチドまたはその誘導体」は、Ｘが−ＯＰ（Ｏ）2Ｏ−であり；Ｙ1およびＹ2がＨ、ＯＨ、ＯＣＨ3、およびＦからなる群より独立に選択され；塩基1および塩基2が、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル、または隣接する塩基と相補的な核酸との相補的塩基対形成を阻害しない基からなる群より独立に選択される、構造Ｉ反復単位で構成されるヌクレオチド塩基認識分子であり；そして該分子は、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、およびウラシルからなる群より独立に選択される、約５ないし約３５塩基を含む。分子の末端部分は、ＯＨ、Ｃ1−Ｃ6アルキル、およびリン酸からなる群より独立に選択されるＲ1およびＲ2を含む。
【００９９】
ペプチド核酸はＤＮＡ類似体であり、デオキシリボースリン酸骨格が、偽ペプチド骨格により置き換えられている。ペプチド核酸は、各々本明細書に援用される、ＨｙｒｕｐおよびＮｉｅｌｓｅｎ， Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４：５−２３， １９９６、並びにＨｙｄｉｇ−ＨｉｅｌｓｅｎおよびＧｏｄｓｋｅｓｅｎ、国際出願第ＰＣＴ／ＤＫ９５／００１９５号、国際公告ＷＯ ９５／３２３０５に記載されている。
【０１００】
好ましくは、ペプチド核酸は、構造ＩＩに例示されるようなＮ−（２−アミノエチル）グリシン単位で構成される。
構造ＩＩ
【０１０１】
【化２】
式中、Ｒ1、Ｒ2、および塩基1は、構造Ｉ型分子に関し記載された通りである。ヌクレオチド塩基認識配列は、標準的技術を用い、産生することが可能である。オリゴヌクレオチドおよび修飾オリゴヌクレオチドの有機合成を記載する刊行物には、オリゴヌクレオチドの有機合成を概説する、Ｅｃｋｓｔｅｉｎ， Ｆ．， Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ， Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，第１−５章， １９９１；標準的ホスホロアミダイト固相化学反応を用いたオリゴヌクレオチドの有機合成法を記載する、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓら， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，第１５４巻，ｐ．２８７（１９８７）；ホスホロチオエート結合を含む修飾オリゴヌクレオチドの有機合成法を記載する、Ｂｈａｔｔ、米国特許第５，２５２，７２３号；並びにメチルホスホネート結合を含む、異なる結合を有する修飾オリゴヌクレオチドの有機合成を記載する、Ｋｌｅｍら、ＷＯ ９２／０７８６４（これらの参考文献は各々本明細書に援用される）が含まれる。
【０１０３】
異なる種類のヌクレオチド塩基認識配列を産生するのに用いることが可能な技術を記載するさらなる参考文献には、Ｃｏｏｋ、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ９２／１１３３９号、国際公告ＷＯ ９３／１３１２１；Ｍｉｌｌｅｒら、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ９４／００１５７号、国際公告ＷＯ ９４／１５６１９；ＭｃＧｅｅら、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ９３／０６８０７号、国際公告ＷＯ ９４／０２０５１；Ｃｏｏｋら、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ９３／０１５７９号、国際公告ＷＯ ９４／１９０２３；ＨｙｒｕｐおよびＮｉｅｌｓｅｎ， Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４：５−２３， １９９６；並びにＨｙｄｉｇ−ＨｉｅｌｓｅｎおよびＧｏｄｓｋｅｓｅｎ、国際出願第ＰＣＴ／ＤＫ９５／００１９５号、国際公告ＷＯ ９５／３２３０５（これらの参考文献は各々本明細書に援用される）が含まれる。
【０１０４】
共有結合、キレート化、およびイオン性相互作用を含む多様な手段により、分子トーチに標識を結合させてもよい。好ましくは、標識は共有結合される。
増幅プロトコル中に存在する分子トーチは、好ましくは、プライマー伸長に利用可能な末端３’ＯＨを含まない。核酸ポリメラーゼによるプライマー伸長を阻害することが可能なブロッキング基を、核酸分子トーチの３’端にまたはその近傍に配置してもよい。３’端「にまたはその近傍に」は、３’末端の５塩基以内に存在するブロッキング基を指す。ブロッキング基が核酸分子トーチの３’末端に置かれていない場合には、ＤＮＡポリメラーゼがトーチに結合するのを達成するくらい、十分に大きいものであるべきである。
【０１０５】
好ましくは、核酸分子トーチは、３’末端に位置するブロッキング基を含む。ブロッキング基を末端３’ＯＨに結合させることにより、３’ＯＨ基は、もはや重合反応においてヌクレオシド三リン酸を受け入れるのに利用可能ではない。
【０１０６】
多くの異なる化学基を用い、核酸配列の３’端をブロッキングしてもよい。こうした基の例にはアルキル基、非ヌクレオチドリンカー、アルカン−ジオールジデオキシヌクレオチド残基、およびコルジセピンが含まれる。
【０１０７】
標的結合領域は、望ましい標的に特異的に結合するため、十分に長くなければならない。細菌標的結合領域は、好ましくは、少なくとも約１０認識基、より好ましくは、少なくとも１２認識基である。ヒトなどの多細胞生物のための複雑な標的結合領域は、好ましくは、少なくとも約１６認識基、より好ましくは、少なくとも１８認識基である。
【０１０８】
標的結合ドメインに関する本発明の態様において、標的結合ドメインは、各々標的閉鎖ドメインの認識基と向き合う、約７ないし約４０認識基、および０ないし約４の非ヌクレオチド単量体基で構成される。好ましい態様において、少なくとも約８、より好ましくは少なくとも約１０認識基が存在し；約３０以下、約２５以下、そして約１５以下の認識基が存在し；そして２以下、好ましくは１以下、そして最も好ましくは０の非ヌクレオチド単量体基が存在する。好ましくは、各非ヌクレオチド単量体基は、無塩基性「ヌクレオチド」である。
【０１０９】
非ヌクレオチド単量体基は、ヌクレオチド塩基を含む付加基（ａｄｊｕｎｃｔ ｇｒｏｕｐｓ）間に、核酸分子におけるのとおおよそ同じ長さの距離を提供する。したがって、２つのヌクレオチド位を連結する非ヌクレオチド単量体基は、核酸における相補的なヌクレオチドに水素結合することが可能であるように、該ヌクレオチドを配置する。
【０１１０】
標的閉鎖ドメインに関する本発明の態様において、標的閉鎖ドメインは、約７ないし約４０の認識基、および０ないし約６の非ヌクレオチド単量体基または標的結合ドメインとのミスマッチで構成される。異なる態様において、少なくとも約８、または少なくとも約１０認識基が存在し；約３０以下、約２５以下、そして約１５以下の認識基が存在し；そして０、１、２、３、４、５または６の非ヌクレオチド単量体基または標的結合ドメインとのミスマッチが存在する。好ましくは、各非ヌクレオチド単量体基は、無塩基性「ヌクレオチド」である。無塩基性ヌクレオチオドよりはミスマッチが存在することの方が好ましい。
【０１１１】
好ましくは、標的結合ドメインは、実質的に、独立に選択される２’−メトキシまたは２’−フルオロ置換リボヌクレオチドで構成され、そして標的閉鎖ドメインは、実質的に、独立に選択されるデオキシリボヌクレオチドで構成される。「実質的に構成される」または「実質的に含む」は、言及される構成要素が、標的開放ドメインまたは標的閉鎖ドメインの、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または１００％を構成することを示す。
【０１１２】
ジョイニング領域は、ジョイニング領域の組成を考慮し、当業に周知の技術を用い、産生してもよい。好ましくは、ジョイニング領域は、共に結合することが可能な、異なるメンバーの結合セットを含み、ここで標的結合ドメインに、結合セットの１つのメンバーが連結し、そして標的閉鎖領域に、結合セットの別のメンバーが連結する。いくつかの結合セットは、同一結合セットの別のメンバーに結合することが可能である。結合セットの例には、実質的に相補的なヌクレオチド塩基認識配列、抗体／抗原、酵素／基質、並びにビオチン／アビジンが含まれる。
【０１１３】
標的開放および標的閉鎖ドメインの隣に、またはその近傍に配置された結合セットのメンバーは、標的結合ドメイン：標的閉鎖ドメインハイブリッドの安定性に影響を及ぼす可能性がある。影響があまりにも大きいと、広い範囲の条件下で、標的結合ドメイン：標的閉鎖ドメインハイブリッドがそのままであるため、開いたトーチを生じるのが困難になる可能性がある。標的結合ドメイン：標的閉鎖ドメインハイブリッドの安定性に対する結合セットの影響は、例えばハイブリッドのＴmを測定することにより、決定することが可能である。
【０１１４】
結合セットのメンバーは、１つ以上のリンカーを用いて共有結合させてもよい。リンカーの例には、置換されていてもよいアルキル基、ポリヌクレオチドおよび非ヌクレオチドリンカーが含まれる。非ヌクレオチドリンカーには、多糖類、ポリペプチド、および無塩基性「ヌクレオチド」が含まれる。
【０１１５】
標的開放および標的閉鎖ドメインの間のリンカー基として用いられるポリヌクレオチドは、好ましくは、標的配列または試料に存在する可能性がある他の核酸にハイブリダイズしないよう、設計される。例えば鎖置換条件が用いられる場合等は、標的に対しある程度結合した方が有利かもしれないが。好ましいポリヌクレオチドリンカー基は、ポリＴ、ポリＡ、および混合ポリＡ−Ｔである。ポリヌクレオチドリンカー基は、好ましくは５ないし２５ヌクレオチドである。
【０１１６】
分子トーチには、標的配列に相補的な一本鎖領域を含んでもよく、該領域は、例えば標的結合ドメインの隣においてもよく、ジョイニング領域の一部であってもよい。好ましくは、こうした一本鎖領域は、標的配列に相補的なヌクレオチド塩基認識基を、約１０より多く含まない。より好ましくは、こうした一本鎖領域が存在する場合、標的配列に相補的な、１０、５、３、２、または１以下のヌクレオチド塩基認識基である。
【０１１７】
リンカー基は、結合セットメンバー並びに標的開放および標的閉鎖ドメインの間に配置し、標的結合ドメイン：標的閉鎖ドメインハイブリッドへの結合セットメンバーの影響を減少させてもよい。例えば、結合セットメンバーおよび標的結合ドメインの間にリンカー基を置くと、標的結合ドメインから結合セットメンバーが物理的に離され、それにより、標的結合ドメイン：標的閉鎖ドメインハイブリッドに対する結合セットメンバーの影響が減少する。
【０１１８】
さらなる実施例が以下に提供され、本発明の異なる側面および態様を例示する。これらの実施例は、いかなる点でも、開示される発明を限定することを意図しない。
【０１１９】
【実施例】
実施例１：標的結合ドメイン：標的閉鎖ドメインＴ m の調整
本実施例は、望ましい標的結合ドメイン：標的閉鎖ドメインハイブリッドＴmを得るための、異なる分子トーチ設計要因の使用を例示する。本実施例において、４つの異なる分子トーチのＴmを、非ヌクレオチド、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）リンカー、ミスマッチ塩基の組み合わせ、無塩基性「ヌクレオチド」（すなわちふくらみ）、および２’−メトキシ置換リボヌクレオチドを用い、調整した。
【０１２０】
本実施例で用いられる異なる分子トーチは、図６Ａおよび６Ｂに示されるように、４つの異なる鎖から構築した。これらの図において、「Ｆ」はＥＤＡＮＳフルオロフォアを指し、「Ｑ」はＤＡＢＣＹＬ消光剤を指し、そして各トーチの１つの鎖の３’端の「ｃｃｃ」基はプライマー伸長ブロッキング基として機能する３つの炭素基を指す。これらの分子トーチのヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドまたは２’−メトキシ置換リボヌクレオチド（太字／斜字で示される）のいずれかである。本実施例に用いられる分子トーチはすべて、非ヌクレオチド、２０Å ＰＥＧ基および単独で非常に高いＴm（＞９０℃）を示す、二本鎖の２’−メトキシ置換リボヌクレオチド二重鎖で構成されるジョイニング領域を含む。
【０１２１】
図６Ｂに示されるように、トーチ１は鎖２および３で構成され；トーチ２は鎖２および４で構成され；トーチ３は鎖１および３で構成され；そしてトーチ４は鎖１および４で構成される。鎖１−４の各々（図６Ａに示される）は、ＰＥＧ基により分離される２つのヌクレオチド塩基認識配列を含み、ここで鎖１は配列番号１（５’−ｃａｇｕｇｃａｇｎｇ ｇａａａｇ−３’）および配列番号２（５’−ｇｇｕｇｇａｃｕｇｃ ｇｕｇｃｇ−３’）のヌクレオチド塩基認識配列を含み；鎖２は配列番号２および配列番号３（５’−ｃａｇｕｇｃａｇｇｇ ｇａａａｇ−３’）のヌクレオチド塩基認識配列を含み；鎖３は配列番号４（５’−ｃｔｔｔｔｃｃｔｔｇ ｃｔｃｔｇ−３’）および配列番号５（５’−ｃｇｃａｃｇｃａｇｕ ｃｃａｇｃｃ−３’）のヌクレオチド塩基認識配列を含み；そして鎖４は配列番号５および配列番号６（５’−ｃｔｔｔｎｎｃｃｃｃ ｔｇｃｎｎａｃｔｇ−３’）のヌクレオチド塩基認識配列を含んだ。
【０１２２】
４つの分子トーチすべてにおいて、標的結合ドメインは２’−メトキシ置換リボヌクレオチドで構成され、そして標的閉鎖ドメインはデオキシリボヌクレオチドで構成された。下線の基はミスマッチを示し、「ｎ」は無塩基性ふくらみを表す。
【０１２３】
３５０μｌのＫＥＭＰＳ緩衝液に添加された５００ ｐｍｏｌの各鎖を含む混合物を用い、異なるハイブリッドの安定性を測定した。（ＫＥＭＰＳは１００ ｍＭ ＫＣｌ、０．１ ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ ｍＭ ＭｇＣｌ2、５０ ｍＭ ＰＩＰＥＳ（ｐＨ ６．８５）、および１ ｍＭ スペルミンで構成される。）混合物を８０℃に１５分間加熱し、そしてその後、Ｔm解析に供した。Ｂｅｃｋｍａｎ ＤＵ−６４０融解装置を用い、０．５℃／分で４５−９５℃の範囲に渡り、２６０ ｎｍで光学的にＴmを測定した。
【０１２４】
表１は、試験した４つの分子トーチにおける標的結合ドメイン：標的閉鎖ドメインハイブリッドの安定性を要約する。表１はまた、ハイブリッド安定性に影響を及ぼす設計要因のいくつかを強調する。
【０１２５】
表１
【０１２６】
【表１】
注：「デオキシ」はデオキシリボヌクレオチドを指し、そして「メトキシ」は２’−メトキシ置換リボヌクレオチドを指す。
表１に例示されるように、ハイブリッド安定性に影響を及ぼす異なる要因を用い、分子トーチのＴmを調整してもよい。ハイブリッド安定性に影響を及ぼす他の要因、例えば本明細書に記載されるようなものおよび当業に周知のものもまた、異なる溶液中で望ましいハイブリッドＴmを得るのに用いてもよい。
【０１２８】
実施例２：標的配列に結合する分子トーチ
トーチ５は、図６Ｂに示されるように、鎖２および３のＰＥＧリンカーがそれぞれ５’−ｔｔｔｃｔｔｔｔｃｔｔｔ−３’および５’−ｔｔｔｔｃｔｔｃｔｔｔｃ−３’のデオキシリボヌクレオチド配列で置き換えられ、したがってトーチ５のヌクレオチド塩基認識配列が、配列番号７（５’−ｃａｇｕｇｃａｇｇｇ ｇａａａｇｔｔｔｃｔ ｔｔｔｃｔｔｔｇｇｃ ｕｇｇｃａｃｕｇｃｇｕ ｇｃｇ−３’）および配列番号８（５’−ｃｇｃａｃｇｃａｇｕ ｃｃａｇｃｃｔｔｔｔ ｃｔｔｃｔｔｔｃｃｔ ｔｔｔｃｃｔｔｇｃｔ ｃｔｇ−３’）となる以外、トーチ１と同じである。トーチ５はまた、合成ＲＮＡ標的配列の存在を検出するのに用いられる、ＥＤＡＮＳフルオロフォア（「Ｆ」）およびＤＡＢＣＹＬ消光剤（「Ｑ」）も含んだ。トーチ５は、２’−メトキシ置換リボヌクレオチド（太字／斜字で示される）、およびデオキシリボヌクレオチドで構成される標的閉鎖ドメイン（配列番号４）で構成される、標的結合ドメイン（配列番号３）を有した。標的結合ドメインは、標的配列に完全に相補的であったが、標的閉鎖ドメインに対し３つのミスマッチを有した。
【０１２９】
トーチ５は、まず、ｐＨ ６．８５のＫＥＭＰＳ緩衝液（上の実施例１に記載されるようなもの）中にＥＤＡＮＳおよびＤＡＢＣＹＬ鎖を含む混合物を産生することにより、生成した。混合物を６０℃に１０分間加熱し、そしてその後、室温に冷却した。
【０１３０】
およそ８０ｐｍｏｌのトーチ５を、増加する量のＲＮＡ標的分子とインキュベーションした。試料を６０℃に２０分間加熱し、トーチを開き、そして標的結合ドメインおよび標的配列の間のハイブリダイゼーションを可能にし、そしてその後、室温に冷却し、標的配列にハイブリダイズしていないトーチを閉じた。コントロール試料は９０ ｍＭの標的を含み、そして６０℃に加熱しなかった（試料は室温に保持した）。
【０１３１】
Ｓｐｅｘ Ｆｌｕｏｒｏｌｏｇ−２分光光度計（ＩＳＡ Ｊｏｂｉｎ Ｙｖｏｎ−Ｓｐｅｘ；ニュージャージー州エジソン）を用い、蛍光を測定した。発光波長は４９５ ｎｍであり、そして励起波長は３６０ ｎｍだった。表２は実験の結果を要約する。
【０１３２】
表２
【０１３３】
【表２】
結果は、本分子トーチが標的配列にほぼ化学量論的に結合することを示す。そして、使用した条件下では、標的結合ドメインは、熱の非存在下で標的配列に結合するのに利用不可能であり、したがって標的配列の存在下であってもほとんどシグナルを生じなかった。
【０１３５】
実施例３：異なる環境の影響
本実施例は、異なる溶液環境および異なるトーチ構築の使用および影響を例示する。本実施例に用いられた異なる溶液は、転写関連増幅反応のための異なる構成要素を含んだ。
【０１３６】
本実施例において、トーチ１、６および７（トーチ１および６は図６に示され、トーチ７は示されていない）を用いた。トーチ１は上の実施例１に記載され、トーチ６は、２’−メトキシ置換リボヌクレオチド標的結合ドメイン（配列番号３）（太字／斜字で示される）およびデオキシリボヌクレオチド標的閉鎖ドメイン（配列番号４）に連結している２０Å ＰＥＧジョイニング領域を含んだ。トーチ６はまた、フルオレセイン・フルオロフォア（「Ｆ」）およびＤＡＢＣＹＬ消光剤（「Ｑ」）も含んだ。トーチ７は、標的閉鎖ドメイン（配列番号４）が、ホスホロチオエート結合と置き換えられているホスホジエステル結合を有する修飾ヌクレオチドで構成される、トーチ６の類似体であった。
【０１３７】
あるとすれば明記される量の合成ＲＮＡ標的配列および２５ ｐｍｏｌの分子トーチを、以下に記載される条件Ａ、Ｂ、ＣおよびＤを生成するのに用いられる溶液１００μｌ中で共に混合した。条件Ａ、Ｂ、ＣおよびＤを生成した後、各溶液を６５℃に２０分間加熱し、そしてその後室温に１０分間冷却した。
【０１３８】
条件Ａ、Ｂ、ＣおよびＤは、以下の群の試薬から選択される試薬を含んだ：
試薬１：４０ ｍＭ トレハロース、４ ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２５ ｍＭ Ｎａｌｃ、０．０２ ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０４％ Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１０２、および０．０２ ｍＭ 酢酸亜鉛、ｐＨ ７．０；
試薬２：１２．５ ｍＭ ＭｇＣｌ2、１７．５ ｍＭ ＫＣｌ、０．１５ ｍＭ 酢酸亜鉛、５％ グリセロール、６．２５ ｍＭ ＡＴＰ、２．５ ｍＭ ＣＴＰ、６．２５ ｍＭ ＧＴＰ、２．５ ｍＭ ＵＴＰ、０．２ ｍＭ ｄＡＴＰ、０．２ ｍＭ ｄＣＴＰ、０．２ ｍＭ ｄＧＴＰ、０．２ ｍＭ ｄＴＴＰ、５０ ｍＭ Ｔｒｉｚｍａ塩基、５３ ｍＭ トレハロース、１００μＭ デスフェロキサミン、および２ ｍＭ スペルミジン、ｐＨ ８．０；
試薬３：１８ ｍＭ ＫＣｌ、４％ グリセロール、４ ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．１ ｍＭ ＥＤＴＡ、および０．０００２％ フェノールレッド、ｐＨ ７．０；並びに
試薬４：４０ ｍＭ トレハロース、４ ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２５ ｍＭ Ｎａｌｃ、０．０２ ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０４％ Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１０２、０．０２ ｍＭ 酢酸亜鉛、１８ ｍＭ ＫＣｌ、４％ グリセロール、４ ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．１ ｍＭ ＥＤＴＡ、および０．０００２％ フェノールレッド、ｐＨ７．０。
【０１３９】
条件Ａは、２５μｌの試薬２、２０μｌの試薬４、５０μｌの試料、逆転写酵素（〜３３．４μｇ）、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ（〜５４０ ｎｇ）およびプライマーで構成された。条件Ｂは、２０μｌの試薬３、２５μｌの試薬２、５０μｌの試料、およびプライマーで構成された。条件Ｃは、プライマーが存在しない以外、条件Ａと同一であった。条件Ｄは、プライマーが存在しない以外、条件Ｂと同一であった。
【０１４０】
Ｓｐｅｘ ＭｉｃｒｏＭａｘマイクロタイタープレート読み取り装置およびＦｌｕｏｒｏｌｏｇ−２分光光度計を用い、励起モノクロメーター上のバンド通過フィルター（４８５ ｎｍ）を用い、蛍光を測定した。４９１ ｎｍの励起波長および５２２ ｎｍの発光波長を用い、蛍光を測定した。結果を表３に示す。
【０１４１】
表３
【０１４２】
【表３】
異なる環境で調べた異なる分子トーチの各々に関し、増加した標的配列の量として、シグナルの増加を観察した。バックグラウンドシグナルの量は、トーチ組成および環境に応じ変化した。
【０１４４】
実施例４：増幅ＲＮＡ転写物の検出
本実施例は、標的ＲＮＡ転写物の産生を検出するための転写関連増幅法（上に論じられる）中に存在する分子トーチの使用を例示する。転写関連増幅は、分子トーチの存在下で行い、そして増幅後、ＲＮＡ転写物の存在をトーチ６または一本鎖アクリジニウムエステル標識ポリヌクレオチドプローブのいずれかを用い測定した。
【０１４５】
本実施例に関し、２０ ｐｍｏｌのトーチ６の存在下で、そして５つの異なるＲＮＡ標的配列レベルの各々（すなわち標的ＲＮＡ配列の０、１００、５００、１０００および５０００コピー）で、上の実施例３に条件Ａとして特定される条件（試薬２に関し示される０．２ ｍＭの代わりに各ｄＮＴＰを１ ｍＭ使用したことを除く）を使用し、８つの別個の転写複製物を生成し、そして各標的配列レベルに関し、８つの複製物を、各々４つの複製物の２つの別個の群にプールした。増幅は４２℃で行った。増幅後、３５０μｌの各プール反応溶液を６０℃に２０分間加熱し、分子トーチを開き、それにより標的転写物に対する標的結合ドメイン（配列番号３）のハイブリダイゼーションを可能にした。標的にハイブリダイズしていないトーチが閉じるであろうように、試料をその後室温に冷却した。
【０１４６】
Ｓｐｅｘ ＭｉｃｒｏＭａｘマイクロタイタープレート読み取り装置およびＳｐｅｘ Ｆｌｕｏｒｏｌｏｇ−２分光光度計を用い、標的配列に結合しているトーチ６を測定した。４９１ ｎｍの励起波長および５２２ ｎｍの発光波長を用い、蛍光を測定した。
【０１４７】
標的配列に完全に相補的であるアクリジニウムエステル標識プローブを、増幅の度合いを決定するコントロールとして用いた。均質保護アッセイ（ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）（「ＨＰＡ」）形式を用い、アクリジニウムエステル標識プローブを使用した。約３，０００，０００総ＲＬＵのアクリジニウムエステル標識プローブおよび４００ ｐｍｏｌの未標識（ｃｏｌｄ）プローブを含むプローブ混合物を用い、５０μｌの各プール反応溶液に対し、ＨＰＡを行った。
【０１４８】
標的配列を検出するためのアクリジニウムエステル標識プローブを用いたＨＰＡ形式は、異なる参考文献に記載され、例えば、各々本明細書に援用される、Ａｒｎｏｌｄら、米国特許第５，２８３，１７４号、Ｎｅｌｓｏｎら、“Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｏｆ Ａｃｒｉｄｉｎｉｕｍ Ｅｓｔｅｒｓ Ｂｙ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ”： Ｎｏｎｉｓｏｔｏｐｉｃ ＤＮＡ Ｐｒｏｂｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ中（Ｋｒｉｃｋａ監修， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， １９９２）２７５−３１１ページ、およびＮｅｌｓｏｎら， Ｃｌｉｎ． Ｃｈｅｍ． Ａｃｔａ １９４：７３−９０， １９９０がある。
【０１４９】
表４および５は２つの異なる実験からの結果を提供する。
表４
【０１５０】
【表４】
表５
【０１５２】
【表５】
これらの両実験において、アクリジニウムエステル標識プローブを用いたＨＰＡにより検出される標的ＲＮＡ転写物の量および分子トーチにより検出される標的ＲＮＡ転写物の量の間に、全体的な直線関係があった。実験１において、アッセイの感度は標的配列５００コピーであった。実験２において、ＲＮＡ転写物は、標的配列１００コピーで始まる増幅反応からバックグラウンドより上に検出された。
【０１５４】
実施例５：標的配列による分子トーチの鎖置換
本実施例は、分子トーチを、本質的に一定の環境条件下で標的配列に結合しそして該配列を検出するよう設計することが可能であることを立証する。本実験のため、トーチ８（図７を参照されたい）を設計し、そしてその能力に関し試験し、溶液中のＲＮＡ標的配列を検出した。トーチ８は配列番号９（５’−ｃｇｇｃｕｇｃａｇｇ ｇｇａａａｇａａｕａ ｇｔｔｔｔｔｔｃｃｃ ｃｔｇｃａｇｃｃｇ−３’）のヌクレオチド塩基認識配列で構成され、ここで５’−ｕｇｃａｇｇｇｇａａａｇａａｕａｇ−３’部分は標的結合ドメインを表し、５’−ｔｃｃｃｃｔｇｃａｇｃｃｇ−３’部分は標的閉鎖ドメインを表し、５’−ｃｇｇｃ−３’部分は標的閉鎖ドメイン配列の一部に結合するための「クランプ」領域を表し、そして５’−ｔｔｔｔｔ−３’部分はデオキシリボヌクレオチドジョイニング領域であった。標的結合ドメインの部分（５’−ａａｇａａｕａｇ−３’）は標的による標的閉鎖ドメインの鎖置換を助長するため未結合のままであった。標的結合ドメインは、標的配列に完全に相補的であり、そして標的開放ドメインおよびクランプ領域はどちらも、２’−メトキシ置換リボヌクレオチド（太字／斜字で示される）で構成された。標的閉鎖ドメインはデオキシリボヌクレオチドで構成された。トーチ８はまた、フルオレセイン・フルオロフォア（「Ｆ」）およびＤＡＢＣＹＬ消光剤（「Ｑ」）も含んだ。
【０１５５】
本実験において、１００μｌのＫｒａｍｍｅｒ緩衝液（２０ ｍＭ ＴｒｉｓＣｌ、ｐＨ ８．０、５ ｍＭ ＭｇＣｌ、および０．２％ Ｔｗｅｅｎ（登録商標）−２０）を、白いＣｌｉｎｉｐｌａｔｅ（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ， Ｉｎｃ．；マサチューセッツ州フランクリン）の１０マイクロタイターウェルの各々に添加した。増加する濃度の標的配列を、以下の表６に示されるような増加する量で、１０の緩衝剤含有ウェルに添加し、その後、３０ ｐｍｏｌのトーチ８を１０のウェルの各々に添加した。プレートをその後、手動で１０−１５秒攪拌した後、各ウェルの流体表面を、蒸発および汚染を制限するのに用いる５０μｌの油で被覆した。プレートを室温で１０分間保持し、標的配列が標的閉鎖ドメインを置き換え、そして標的結合ドメインに結合するのに十分な時間置いた。各ウェルからの蛍光シグナルをその後、Ｓｐｅｘ ＭｉｃｒｏＭａｘプレート読み取り装置およびＳｐｅｘ Ｆｌｕｏｒｏｌｏｇ−２分光光度計を用い、４９５ ｎｍの発光波長および５２５ ｎｍの励起波長で測定した。表６は本実験の結果を提供する。
【０１５６】
表６
【０１５７】
【表６】
本実験の結果は、標的配列がトーチ８に鎖侵入し、そして室温で標的結合ドメインに結合することが可能であったことを示す。さらに、この結果は、ウェル中でトーチに結合した標的配列の量が、ウェルに存在する標的配列の量と共に増加したことを示し、本発明のトーチがまた、試料に存在する可能性がある標的の量を定量化するのに有用である可能性があることも示す。
【０１５９】
他の態様は、請求項の範囲内である。したがって、いくつかの態様が示され、そして記載されているが、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、さまざまな修飾を作成することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、標的結合ドメイン：標的閉鎖ドメインハイブリッドの自由エネルギー（Ｉ）、標的結合ドメイン：標的配列ハイブリッドの安定性（ＩＩ）、ＩおよびＩＩの自由エネルギーの相違（ΔＧ）、およびＩのＩＩへの変換のための活性化自由エネルギー（ΔＧ*）の相違を例示する、エネルギー図を提供する。
【図２】 図２Ａ−２Ｇは、異なる分子トーチ構造の例を提供する。「Ｆ」はフルオロフォアを指し、そして「Ｑ」は消光剤を指す。
【図３】 図３Ａ−図３Ｃは、鎖置換の例を提供する。「Ｆ」はフルオロフォアを指し、そして「Ｑ」は消光剤を指す。標的配列は太線により示される。
【図４】 図４は、共有結合であるジョイニング領域を含む分子トーチの作用を例示する。「Ｆ」はフルオロフォアを指し、そして「Ｑ」は消光剤を指す。
【図５】 図５は、２つのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）基で構成されるジョイニング領域、および加熱中融解しないように、十分に高いＴmを有する、２つの実質的に相補的な核酸配列を含む分子トーチの機能を例示する。「Ｆ」はフルオロフォアを指し、そして「Ｑ」は消光剤を指す。
【図６】 図６Ａおよび６Ｂは、分子トーチ１−７を構成する鎖を例示する。「Ｆ」はフルオロフォアを指し、「Ｑ」は消光剤を指し、「ＰＥＧ」はポリエチレングリコールを指し、そして「ｃｃｃ」は末端糖の３’位に位置するプロピル基を指す。斜字で示された塩基は、２’−メトキシ置換リボヌクレオチドである。
【図７】 図７は、鎖置換反応で用いることが可能な分子トーチを例示する。「Ｆ」はフルオロフォアを指し、そして「Ｑ」は消光剤を指す。
【図８】 図８は、鎖置換反応における分子トーチの作用を例示する。「Ｆ」はフルオロフォアを指し、そして「Ｑ」は消光剤を指す。標的配列は太線により示される。
【配列表】
Claims (25)
- 分子トーチであって：
ヌクレオチド塩基認識基及び第一の標識を含む標的結合ドメイン；
ヌクレオチド塩基認識基及び第二の標識を含む標的閉鎖ドメインであって、前記標的結合ドメインが前記標的閉鎖ドメインよりも標的核酸配列とより安定にハイブリッドを形成できるように、前記標的結合ドメインが前記標的核酸配列に偏向し、ここで、前記標的結合ドメインが前記標的閉鎖ドメインとハイブリダイズする場合は、前記分子トーチは、前記標的核酸配列とはハイブリダイズせず、及び、前記第一及び第二の標識が相互作用して、前記標的結合ドメイン及び前記標的閉鎖ドメインが標的結合ドメイン：標的閉鎖ドメインハイブリッドを形成する場合には第一のシグナルを産生し、前記標的結合ドメイン及び前記標的閉鎖ドメインが前記標的結合ドメイン：標的閉鎖ドメインハイブリッドを形成しない場合には第二のシグナルを産生し、前記第一及び第二シグナルは区別でき、ここで、前記第一及び第二の標識の少なくとも１つが前記分子トーチの３’末端についており、そして、前記標的結合ドメインの５’末端または３’末端が、鎖置換条件下で前記標的配列に利用可能な１〜１０の前記ヌクレオチド塩基認識基を含み；並びに
前記標的結合を前記標的閉鎖ドメインに連結する、非ヌクレオチドジョイニング領域であって、前記ジョイニング領域は前記標的結合ドメインの前記標的閉鎖ドメインへのハイブリダイゼーションを助長し、ここで、各ヌクレオチド塩基認識基は、プリンもしくはピリミジン塩基またはその誘導体であり、前記ヌクレオチド塩基認識基の複数が骨格により連結され；
を含む、前記分子トーチ。 - 請求項１記載の分子トーチであって、前記標的結合ドメインは、デオキシリボヌクレオチドよりもリボヌクレオチドとより安定して結合するヌクレオチド塩基認識基から構成され、ここで前記標的閉鎖ドメインは、デオキシリボヌクレオチドから構成される、前記分子トーチ。
- 請求項２記載の分子トーチであって、前記標的結合ドメインが、２’−メトキシまたは２’−フルオロ置換リボヌクレオチドを含む、前記分子トーチ。
- 請求項２または３記載の分子トーチであって、前記標的核酸配列がＲＮＡである、前記分子トーチ。
- 請求項１〜４のいずれか１項記載の分子トーチであって、前記非ヌクレオチドジョイニング領域が、多糖類又はポリペプチドからなる、前記分子トーチ。
- 請求項１〜４のいずれか１項記載の分子トーチであって、前記非ヌクレオチドジョイニング領域がポリエチレングリコールからなる、前記分子トーチ。
- 請求項１〜６のいずれか１項記載の分子トーチであって、前記第一及び第二の標識が、発光剤／消光剤対をふくむ、前記分子トーチ。
- 請求項１〜６のいずれか１項記載の分子トーチであって、前記第一及び第二の標識が、フルオロフォア／消光剤対をふくむ、前記分子トーチ。
- 請求項１〜６のいずれか１項記載の分子トーチであって、前記第一及び第二の標識が、発光剤／付加物対をふくむ、前記分子トーチ。
- 請求項１〜６のいずれか１項記載の分子トーチであって、前記第一及び第二の標識が、Ｆｏｒｒｅｓｔｅｒエネルギー移動対をふくむ、前記分子トーチ。
- 請求項１〜６のいずれか１項記載の分子トーチであって、前記第一及び第二の標識が、色素二量体対をふくむ、前記分子トーチ。
- 請求項１〜１０のいずれか１項記載の分子トーチであって、前記分子トーチが、核酸ポリメラーゼによるプライマーの伸長を阻害しうるブロッキング基をさらに含む、前記分子トーチ。
- 請求項１２記載の分子トーチであって、前記ブロッキング基が前記分子トーチの３’末端かまたはその近傍に位置する、前記分子トーチ。
- 請求項１３記載の分子トーチであって、前記ブロッキング基がアルキル基、非ヌクレオチドリンカー、アルカン−ジオールジデオキシヌクレオチド残基、およびコルジセピンからなる群から選択される、前記分子トーチ。
- 請求項１〜１４のいずれか１項記載の分子トーチであって、前記標的結合ドメインが、７〜４０の前記ヌクレオチド塩基認識基、および０〜４の非ヌクレオチド単量体基を含み、各前記非ヌクレオチド単量体基が標的閉鎖ドメインにある前記ヌクレオチド塩基認識基のうちの一つと向き合う、前記分子トーチ。
- 請求項１〜１４のいずれか１項記載の分子トーチであって、前記標的閉鎖ドメインが、７〜４０の前記ヌクレオチド塩基認識基、および０〜６の非ヌクレオチド単量体基又は前記標的結合ドメインとのミスマッチを含む、前記分子トーチ。
- 請求項１５又は１６記載の分子トーチであって、各前記非ヌクレオチド単量体基が無塩基性ヌクレオチドである、前記分子トーチ。
- 請求項１〜１７のいずれか１項記載の分子トーチであって、前記標的結合ドメインのヌクレオチド塩基認識基の少なくとも７０％がハイブリダイゼーション条件下で前記標的閉鎖ドメインのヌクレオチド塩基認識基と結合する、前記分子トーチ。
- 請求項１〜１７のいずれか１項記載の分子トーチであって、前記標的結合ドメインのヌクレオチド塩基認識基の少なくとも８０％がハイブリダイゼーション条件下で前記標的閉鎖ドメインのヌクレオチド塩基認識基と結合する、前記分子トーチ。
- 請求項１〜１７のいずれか１項記載の分子トーチであって、前記標的結合ドメインのヌクレオチド塩基認識基の少なくとも９０％がハイブリダイゼーション条件下で前記標的閉鎖ドメインのヌクレオチド塩基認識基と結合する、前記分子トーチ。
- 試料中の標的核酸配列の存在を決定するための方法であって、
ａ）前記試料を、請求項１〜２０のいずれか１項記載の分子トーチと接触させる工程；
ｂ）前記試料を一定の温度条件に曝露する工程；及び
ｃ）前記試料中の前記標的核酸配列の存在又は不存在の指標として、試料中に前記標的結合ドメイン：標的配列ハイブリッドが存在するか否かを決定する工程；
を含む前記方法。 - 請求項２１記載の方法が、さらに、前記標的結合ドメイン：標的核酸配列ハイブリッドを形成した前記分子トーチを、前記試料中にある標的結合ドメイン：標的配列ハイブリッドを形成しなかった分子トーチから分離することを含む、前記方法。
- 請求項２１記載の方法であって、前記標的核酸配列が増幅反応産生物である、前記方法。
- 請求項２３記載の方法であって、前記標的核酸配列が転写関連増幅反応産生物であり、前記分子トーチが前記増幅反応の開始前に前記試料に添加される、前記方法。
- 請求項２１〜２４のいずれか１項記載の方法であって、前記第一又は第二のシグナルが前記決定工程で検出される、前記方法。
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