JP2004527221A - 試験サンプル中のＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ生物の存在を決定するための組成物、方法およびキット - Google Patents
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Abstract
本発明は、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ生物、および特にＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ生物由来の核酸配列に標的化された新規のオリゴヌクレオチドを記載し、このオリゴヌクレオチドは試験サンプル中のＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ生物の存在を決定するのに有用である。本発明のオリゴヌクレオチドとしては、ハイブリダイゼーションアッセイプローブ、ヘルパープローブおよび増幅プライマーが挙げられる。本発明は、生存可能なオーシスト由来の精製したリボ核酸を得るための新規の方法をさらに記載する。
Description
【０００１】
本出願は、米国仮出願６０／２３２，０２８（２０００年９月１２日出願）の権利を主張し、この米国仮出願６０／２３２，０２８の内容は、本明細書中に参考として本明細書によって援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、水、糞、食物または他のサンプル媒体の試験サンプル中の、一般にＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ生物、特にＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ生物の存在を決定するのに有用な、ハイブリダイゼーションアッセイプローブ、ヘルパープローブ、増幅プライマー、核酸組成物、プローブミックス、方法およびキットに関する。
【０００３】
本発明は、さらに、生存しているオーシスト（ｏｏｃｙｓｔ）（例えば、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ生物）から精製されたリボ核酸を得るための方法に関する。次いで、この精製されたリボ核酸は、１つ以上の増幅オリゴヌクレオチドおよび／もしくはハイブリダイゼーションアッセイプローブを用いた増幅ならびに／または検出に、利用可能になり得る。
【０００４】
（参考文献の援用）
本明細書中に言及される全ての参考文献は、参考としてその全体が本明細書によって援用される。これらの参考文献の援用は、独立したものであり、これら全ての参考文献の内容の任意の部分または任意の特定の参考文献が、特許出願についての任意の国または地域の制定上の開示要件を満たすために必須の材料であるべきとみなされることを、本発明者らが断言または承認しているとして解釈されるべきではない。それにもかかわらず、本発明者らは、適切である場合、審査の権威者または裁判所によって本願発明に必須であると判断された材料を提供するためにこのような参考文献のうちのいずれかに依存するという権利を保有する。本明細書中に言及されない参考文献は、本願発明に対して先行分野であるとことを認める。
【０００５】
（発明の背景）
Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍは、種々の動物（ヒトを含む）を感染し得る胞子虫綱寄生虫である。１つの特定の種（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ）が、免疫適合性の成体または乳児において胃腸炎を引き起こすことによって、そして場合によっては、免疫不全の個体（例えば、乳児、高齢者およびＡＩＤＳ患者）において生命を脅かす下痢を時おり引き起こすことによって、ヒトに対して特定の脅威を引き起こす、コクシジウム寄生虫である。Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍに感染したＡＩＤＳ患者における死亡率は、５０％と高い死亡率である。Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍの伝染は、糞便−口腔経路または水源の汚染、水泳プール、および未処理の地表水による直接的なものである。３０個ほどの少ない微視的なオーシストが感染し得、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍは、発展途上国における持続性の下痢の主要な原因であると考えられ、そして米国の水供給に対する重大な脅威である。
【０００６】
Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍは、環境因子に対して非常に耐性である厚い壁のオーシストとして天然に存在し、低温かつ湿潤の設定に維持された場合、その環境に数ヶ月の間生存する能力を示す。オーシストは、飲料水の従来の塩素処理に対して非常に耐性であり、そしてオーシストの大きさは、地方自治体の水道局によって代表的に使用される水濾過システムに対して問題を提示している。実際、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍのオーシストは、非常に強靭であるので、完全な強度の漂白に対する２４時間の曝露後も、その完全性および生存性を維持し得る。環境手段および化学手段による崩壊に対するこれらの耐性は、生水の全供給のほぼ９０パーセントが、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍオーシストで感染しているので、特に警戒が必要である。
【０００７】
米国において、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍを検出するための環境保護団体によって最近承認された方法は、「Ｍｅｔｈｏｄ １６２２」と称される抗体染色方法である。この方法は、いくつかの欠点（これには、アッセイの主観性、高い抗体バックグラウンドが容認できない多数の偽陽性を生じること、およびその実験室に集中する局面、顕微鏡分析に数時間も必要とすることが挙げられる）有する。Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍを検出するための現在利用可能な他の方法（ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるゲノムＤＮＡの検出、酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）のような免疫学的アッセイを含む）は、有意な感度の問題および特異性の問題を有する。従って、試験サンプル中のＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ生物（そして、特に、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ）の存在を決定するために使用され得る、感度が高くかつ特異的なアッセイ、ならびに厚い壁のオーシストの内容物を放出させるための方法に対する必要性が存在する。
【０００８】
（発明の要旨）
本発明は、水、糞、食物または他のサンプル媒体のような試験サンプル中にＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ属またはＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ種に属する生物が存在するか否かを決定するのに有用な、オリゴヌクレオチドを特徴とする。この特徴であるオリゴヌクレオチドは、増幅するかならびに／またはＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ属もしくはＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ種に属する生物が試験サンプル中に存在するか否かを決定するのに有用な、増幅プライマー、ハイブリダイゼーションアッセイプローブおよび／またはヘルパープローブ中に含まれ得る。
【０００９】
例えば、このハイブリダイゼーションアッセイプローブは、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ生物由来の核酸中に存在する標的領域に優先的にハイブリダイズし得、検出可能なプローブ：標的ハイブリッドを形成する。この検出可能なプローブ：標的ハイブリッドが、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ属に属する生物（これには、例えば、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ａｇｎｉ種、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｂａｉｌｅｙｉ種、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｂｏｖｉｓ種、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｃｒｏｔａｌｉ種、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｍｅｌｅａｇｒｉｄｉｓ種、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｍｕｒｉｓ種、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｎａｓｏｒｕｍ種、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ種、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｓｅｒｐｅｎｔｉｓ種および／またはＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｗｒａｉｒｉ種、ならびにＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ属に属する他の生物が挙げられ得る）の存在を示す。１つの実施形態において、本発明は、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ生物が試験サンプル中に存在するか否かを決定するためのハイブリダイゼーションアッセイプローブを提供し、このプローブは、好ましくは、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ生物由来の標的核酸中に存在する標的核酸配列中に存在する少なくとも１０個連続する塩基領域に対して、少なくとも８０％相補的（好ましくは、少なくとも９０％相補的、そしてより好ましくは１００％相補的）である少なくとも１０個連続する塩基領域を含み、この標的核酸配列は、以下（５’から３’に読む）：
【００１０】
【化１】
からなる群より選択される。これらのプローブは、ストリンジェントなハイブリダイゼーションアッセイ条件下で、標的核酸に優先的にハイブリダイズし、かつ非Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ生物由来の核酸にハイブリダイズしない。
【００１１】
別の実施形態において、本発明は、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ種の生物が試験サンプル中に存在するか否かを決定するためのハイブリダイゼーションアッセイプローブを提供し、このプローブは、好ましくは、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ生物由来の標的核酸中に存在する標的核酸配列中に存在する少なくとも１０個連続する塩基領域に対して、少なくとも少なくとも８０％相補的（好ましくは、少なくとも９０％相補的、そしてより好ましくは１００％相補的）である少なくとも１０個連続する塩基領域を含み、この標的核酸配列は、以下（５’から３’に読む）：
【００１２】
【化２】
からなる群より選択される。これらのプローブは、ストリンジェントなハイブリダイゼーションアッセイ条件下で、試験サンプル中に存在する、標的核酸に優先的にハイブリダイズし、かつ非Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ生物（特に、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｍｕｒｉｓ、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｂａｉｌｅｙｉおよびＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｗｒａｉｒｉ）由来の核酸にハイブリダイズしない。
【００１３】
好ましくは、本発明のＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍプローブおよびＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍプローブは、１００塩基長まで（好ましくは、１２〜５０塩基長、より好ましくは１８〜３５塩基長）のオリゴヌクレオチドを含み、かつ標的核酸配列に実質的に相補的である（好ましくは、第１の標的核酸配列に完全に相補的である）。オリゴヌクレオチドは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、ＤＮＡおよびＲＮＡの組合わせからなり得るか、あるいは、このオリゴヌクレオチドは、核酸アナログ（例えば、ペプチド核酸）であり得るか、または１つ以上の改変ヌクレオシド（例えば、リボフラノシル部分に対する２’−Ｏ−メチル置換を有する、リボヌクレオシド）を含み得る。
【００１４】
プローブは、好ましくは、検出可能な標識を含む。標識は、任意の適切な標識物質（放射性同位体、酵素、酵素補因子、酵素基質、色素、ハプテン、化学発光分子、蛍光分子、燐光性分子、電気化学発光分子、発色団、明確に規定された条件下で標的核酸に安定にハイブリダイズし得ない塩基配列領域、およびこれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない）であり得る。１つの特に好ましい実施形態において、標識は、アクリジニウムエステルである。
【００１５】
別の実施形態において、本発明は、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ生物（または、特に、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ生物）が試験サンプル中に存在するか否かを決定するのに有用な、プローブミックスを意図する。例えば、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ属由来の生物の存在を決定するために、プローブミックスは、上記のＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍプローブのうちの１つおよび１つのヘルパープローブを含み得る。好ましくは、ヘルパープローブは、１００塩基長まで、より好ましくは、１２〜５０塩基長、さらにより好ましくは１８〜３５塩基長のオリゴヌクレオチドである。好ましくは、ヘルパープローブは、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ生物由来の標的核酸中に存在する標的核酸配列中に存在する少なくとも１０個連続する塩基領域に対して、少なくとも８０％相補的（好ましくは、少なくとも９０％相補的、そしてより好ましくは１００％相補的）である少なくとも１０個連続する塩基領域を含み、この標的配列配列は、以下（５’から３’に読む）：
【００１６】
【化３】
、ならびにこれらの混合物からなる群より選択される。これらのヘルパープローブは、好ましくは標的配列に相補的であるが、必ずしもそうである必要はない。
【００１７】
試験サンプル中のＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ生物の存在を決定するために、プローブミックスは、上記のＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍプローブのうちの１つおよび１つのヘルパープローブを含み得る。好ましくは、ヘルパープローブは、１００塩基長まで、より好ましくは、１２〜５０塩基長、さらにより好ましくは１８〜３５塩基長のオリゴヌクレオチドである。好ましくは、ヘルパープローブは、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ生物由来の標的核酸中に存在する標的核酸配列中に存在する少なくとも１０個連続する塩基領域に対して、少なくとも８０％相補的（好ましくは、少なくとも９０％相補的、そしてより好ましくは１００％相補的）である少なくとも１０個連続する塩基領域を含み、この標的配列配列は、以下（５’から３’に読む）：
【００１８】
【化４】
、ならびにこれらの混合物からなる群より選択される。これらのヘルパープローブは、好ましくは標的配列に相補的であるが、必ずしもそうである必要はない。
【００１９】
Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍプローブミックスについての好ましい実施形態において、ハイブリダイゼーションアッセイプローブは、配列番号５、配列番号６、配列番号９、配列番号１０、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１７および配列番号１８からなる群より選択される配列中に存在する少なくとも１０個連続する塩基領域に対して、少なくとも８０％相同性である少なくとも１０個連続する塩基領域を有するオリゴヌクレオチドを含み；そしてヘルパープローブは、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、および配列番号４４からなる群より選択される配列中に存在する少なくとも１０個連続する塩基領域に対して、少なくとも８０％相同性である少なくとも１０個連続する塩基領域を有するオリゴヌクレオチドを含む。
【００２０】
Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍプローブミックスについての別の好ましい実施形態において、ハイブリダイゼーションアッセイプローブは、配列番号５、配列番号６、配列番号９、配列番号１０、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１７および配列番号１８からなる群より選択される配列中に存在する少なくとも１０個連続する塩基領域に対して、少なくとも８０％相同性である少なくとも１０個連続する塩基領域を有するオリゴヌクレオチドを含み；そしてプローブミックスは、第１のヘルパープローブおよび第２のヘルパープローブを含む。ここで、第１のヘルパープローブは、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３７、配列番号３８、配列番号４１、および配列番号４２からなる群より選択される配列中に存在する少なくとも１０個連続する塩基領域に対して、少なくとも８０％相同性である少なくとも１０個連続する塩基領域を有するオリゴヌクレオチドを含み、ここで、第２のヘルパープローブは、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４３、および配列番号４４からなる群より選択される配列中に存在する少なくとも１０個連続する塩基領域に対して、少なくとも８０％相同性である少なくとも１０個連続する塩基領域を有するオリゴヌクレオチドを含む。
【００２１】
Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍプローブミックスについての別の好ましい実施形態において、ハイブリダイゼーションアッセイプローブは、配列番号７、配列番号１１、配列番号１５および配列番号１９からなる群より選択される配列中に存在する少なくとも１０個連続する塩基領域に対して、少なくとも８０％相同性である少なくとも１０個連続する塩基領域を有するオリゴヌクレオチドを含み；そしてヘルパープローブは、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３７、配列番号３８、配列番号４１、および配列番号４２からなる群より選択される配列中に存在する少なくとも１０個連続する塩基領域に対して、少なくとも８０％相同性である少なくとも１０個連続する塩基領域を有するオリゴヌクレオチドを含む。
【００２２】
本発明はまた、ストリンジェントなハイブリダイゼーションアッセイ条件下で、上記のハイブリダイゼーションアッセイプローブおよび／またはヘルパープローブとそのプローブに対する標的核酸との間に形成される安定な核酸二重鎖を含む組成物を意図する。
【００２３】
本発明はまた、増幅アッセイにおけるＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ生物の存在を検出するために有用な増幅プライマーを特徴とする。１つの好ましい実施形態において、本発明は、試験サンプル中に存在するＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ生物由来の核酸を増幅するための少なくとも１つの増幅プライマーを提供し、この増幅プライマーは、好ましくは、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ生物由来の標的核酸中に存在する標的核酸配列中に存在する少なくとも１０個連続する塩基領域に対して、少なくとも８０％相補的（好ましくは、少なくとも９０％相補的、より好ましくは１００％相補的）である少なくとも１０個連続する塩基領域を含む。この標的核酸配列は、以下（５’から３’に読む）：
【００２４】
【化５】
からなる群より選択される。この増幅プライマーは、必要に応じて、ＲＮＡポリメラーゼによって認識されるか、あるいはＲＮＡポリメラーゼによる開始または伸長を促進する、５’配列を含む。含まれる場合、Ｔ７プロモーター（例えば、配列番号６９：ａａｔｔｔａａｔａｃｇａｃｔｃａｃｔａｔａｇｇｇａｇａが好ましい。
【００２５】
本発明はさらに、増幅条件下で核酸ポリメラーゼと接触させた場合に、以下：配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７および配列番号６８からなる群より選択される塩基配列を有する核酸領域を介して結合し、そして伸長をもたらす増幅プライマーを意図する。この実施形態の増幅プライマーはまた、必要に応じて、ＲＮＡポリメラーゼによって認識されるか、またはＲＮＡポリメラーゼによる開始もしくは伸長を増強する、５’配列を含む。配列番号６９のＴ７プライマーが、好ましい。
【００２６】
本発明の増幅プライマーは、好ましくは少なくとも２つの増幅プライマーのセットで使用される。好ましいセットは、少なくとも１０個連続した塩基の領域を含む第一の増幅プライマーを含み、この塩基の領域は、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５８、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６４および配列番号６７からなる群から選択される配列に存在する、少なくとも１０個連続した塩基の領域に対して少なくとも８０％相補性である。これらの好ましいセットの第二の増幅プライマーは、少なくとも１０個連続した塩基の領域を含み、この塩基の領域は、配列番号４７、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６５、配列番号６６および配列番号６８からなる群から選択される配列に存在する、少なくとも１０個連続した塩基の領域に対して少なくとも８０％相補性である。
【００２７】
本発明はさらに、増幅条件下で、上記の増幅プライマーとこのプライマーに対する標的核酸との間に形成される安定な核酸二重鎖を含む組成物を意図する。
【００２８】
本発明は、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ生物またはＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ生物が試験サンプル中に存在するか否かを決定するための方法をさらに特徴とする。一つの実施形態において、本発明は、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ生物が試験サンプル中に存在するか否かを決定する方法を提供し、この方法は、以下の工程：（ａ）プローブがＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ生物に由来する標的核酸に優先的にハイブリダイズすることを可能にする条件下で、それによって、試験サンプルを、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ生物を検出するための上記ハイブリダイゼーションアッセイプローブの一つと接触させ、検出に安定なプローブ：標的ハイブリッドを形成する、工程；および（ｂ）試験サンプル中のＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ生物の存在または非存在の指標としてこのハイブリッドが、試験サンプル中に存在するか否かを決定する工程を包含する。この方法は、試験サンプル中に存在するＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ生物の量を見積もるための手段として、試験サンプル中に存在するハイブリッドの量を定量する工程をさらに包含し得る。
【００２９】
別の実施形態において、本発明は、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ生物が試験サンプル中に存在するか否かを決定する方法を提供し、この方法は、以下の工程：（ａ）プローブが、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ生物に由来する標的核酸に優先的にハイブリダイズすることが可能な条件下で、試験サンプルをＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ生物を検出するための上記ハイブリダイゼーションアッセイプローブの一つと接触させ、それによって検出に安定なプローブ：標的ハイブリッドを形成する、工程；および（ｂ）試験サンプル中のＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ生物の存在または非存在の指標として、このハイブリッドが、試験サンプルに存在するか否かを決定する工程を包含する。この方法は、試験サンプル中に存在するＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ生物の量を見積もるための手段として、試験サンプル中に存在するハイブリッドの量を定量する工程をさらに包含し得る。
【００３０】
Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ生物またはＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ生物が試験サンプル中に存在するか否かを決定する方法、または試験サンプル中に存在するこれらの生物の量を決定する方法は、試験サンプルとＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍまたはＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍにとって適切な上記のヘルパープローブの少なくとも１つを、所望どおりに接触させる工程をさらに包含し得る。（好ましいハイブリダイゼーションアッセイプローブおよびヘルパープローブの組み合わせは、プローブミックスとして上に記載される。）ヘルパープローブに加えて、あるいは代替的に、この方法は、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ生物またはＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ生物由来の核酸に存在する標的核酸配列を増幅するのに適切な、上記の増幅プライマーの少なくとも１つを、試験サンプルと所望どおりに接触させる工程をさらに包含し得る。
【００３１】
本発明はまた、試験サンプル中に存在するＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ生物由来の核酸に存在する標的核酸配列を増幅するための方法を意図し、この方法は、以下の工程：（ａ）増幅条件下で、試験サンプルと上記の増幅プライマーの少なくとも１つを接触させる工程；および（ｂ）標的核酸配列を増幅する工程を包含する。この増幅された標的核酸配列は、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ生物、特にＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ生物由来の核酸に存在し得る。好ましい増幅方法は、上記の増幅プライマーの少なくとも２つのセットを含む。
【００３２】
一つの実施形態において、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ生物由来の核酸配列に存在する標的核酸配列を増幅するための方法は、さらに、以下の工程：（ａ）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、試験サンプルを標的核酸またはそれらの相補体に優先的にハイブリダイズするハイブリダイゼーションアッセイプローブと接触させ、それによって検出に安定なプローブ：標的ハイブリッドを形成する、工程；および（ｂ）試験サンプル中のＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ生物またはＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ生物の存在または非存在の指標として、ハイブリッドが、試験サンプルに存在するか否かを決定する工程を包含する。上記のハイブリダイゼーションアッセイプローブは、この方法にとって特に好ましい。
【００３３】
本発明はまた、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ生物が試験サンプル中に存在するか否かを決定するためのキットを意図する。これらのキットは、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ由来の核酸に対して特異的な上記のハイブリダイゼーションプローブの少なくとも１つを含み、そして必要に応じて、試験サンプル中のＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ生物の存在またはその量を決定するための指示書を含む。別の実施形態において、このキットは、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ由来の核酸に適切な上記のヘルパープローブの少なくとも１つをさらに含む。さらなる実施形態において、このキットまたは、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ生物由来の核酸に存在する標的核酸配列を増幅するために適切な上記の増幅プライマーの少なくとも１つを含む。なお別の実施形態において、このキットは、上記のヘルパープローブの少なくとも１つおよび上記の増幅プライマーの少なくとも１つをさらに含む。
【００３４】
同様に、本発明は、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ生物が試験サンプル中に存在するか否かを決定するためのキットを意図する。これらのキットは、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ由来の核酸に対して特異的な上記のハイブリダイゼーションプローブアッセイの少なくとも１つを含み、そして必要に応じて、試験サンプル中のＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ生物の存在またはその量を決定するための指示書を含む。別の実施形態において、このキットは、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ生物由来の核酸に適切な上記のヘルパープローブの少なくとも１つをさらに含む。さらなる実施形態において、このキットまたは、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ生物由来の核酸に存在する標的核酸配列を増幅するために適切な上記の増幅プライマーの少なくとも１つを含む。別の実施形態において、このキットは、上記のヘルパープローブの少なくとも１つおよび上記の増幅プライマーの少なくとも１つを含む
本発明はまた、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ生物またはＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ生物由来の核酸に存在する標的核酸配列を増幅するためのキットを意図する。このキットは、上記増幅プライマーの少なくとも１つ、および、必要に応じて、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ生物またはＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ生物由来の核酸を適切な場合に増幅するための指示書を含む。
【００３５】
本発明のハイブリダイゼーションアッセイプローブが、必要とされ得る特異性の程度に依存して、増幅プライマーまたは捕獲プローブとして使用され得ること、本発明の増幅プライマーが、ハイブリダイゼーションアッセイプローブまたは捕獲プローブとして使用され得ること、そして本発明のヘルパープローブが、増幅プライマーまたは捕獲プローブとして使用され得ることは、当業者に理解される。
【００３６】
本発明は、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ生物のような生オーシストから精製されたＲＮＡを得るための方法をさらに特徴とする。次いで、オーシストから単離されたリボ核酸は、上記の増幅プライマーおよび／またはハイブリダイゼーションアッセイプローブの少なくとも１つを用いて、増幅および／または検出のために利用可能となり得る。
【００３７】
好ましい実施形態において、生オーシストから精製されたＲＮＡを得るための方法は、以下の工程：（ｉ）オーシストを含むと疑われる流体サンプルを、この流体サンプルの入った容器内でオーシストを濃縮するのに十分なスピードおよび時間で遠心分離する工程；（ｉｉ）遠心分離の工程の間に形成される上清を容器から除去する工程；（ｉｉｉ）存在するならば、緩衝化溶液中に濃縮されたオーシストを再懸濁する工程；（ｉｖ）オーシストおよびそこから放出するＲＮＡを溶解するのに十分な速度および時間で、多数の粒子が存在する上記緩衝化溶液を、振動させる工程、または別の攪拌する工程（例えば、ボルテックス）；（ｖ）ＲＮＡに結合するフィルター（例えば、シリカベースのマトリックス）上に放出されたＲＮＡを固定化する工程；（ｖｉ）放出ＲＮＡ以外のオーシスト成分（例えば、タンパク質、ＤＮＡおよび他の混入物）を取り除くために、緩衝化溶液で一回以上フィルターを洗浄することによって、放出したＲＮＡを精製する工程；ならびに（ｖｉｉ）そのフィルターから精製したＲＮＡを取り出す工程、を包含する。本方法の工程（ｉｉｉ）において使用される緩衝化溶液は、好ましくは、グアニジニウム（ｇｕａｎｉｄｉｎｉｕｍ）チオシアナートのようなカオトロピック剤を含む。これは、オーシストから放出される内因性リボヌクレアーゼを不活性化する。オーシストを溶解するために使用される粒子は、例えば、ガラス、ジルコニアガラス、ジルコニア、ステンレス鋼、クロム鋼またはタングステンカーバイドであり得るが、約３．７ｇ／ｃｃの密度を有するジルコニアガラス粒子が好ましい。好ましくは、この粒子は一般的に球状を有し、そして好ましくは、約０．１〜約２．５ｍｍの範囲、より好ましくは、約０．５〜約１．０ｍｍの範囲の平均直径を有し、そして最も好ましくは約１．０ｍｍの平均直径を有する。
【００３８】
本発明の他の特徴および利点は、以下に記載の本発明の好ましい実施形態の説明および特許請求の範囲から明らかである。
【００３９】
（好ましい実施形態の説明）
本発明は、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ生物体由来の核酸に標的化したオリゴヌクレオチドを記載し、このオリゴヌクレオチドは、試験サンプルにおける、一般にはＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ生物体、特にＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ生物体の存在または非存在を決定するために特に有用である。このオリゴヌクレオチドは、異なる方法におけるＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ生物体の検出を補助（例えば、ハイブリダイゼーションアッセイプローブ、ヘルパープローブおよび／または増幅プライマーとして機能することによる）し得る。本発明のハイブリダイゼーションアッセイプローブは、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ生物体由来の標的核酸中に存在する標的核酸配列に、ストリンジェントなハイブリダイゼーションアッセイ条件下で優先的にハイブリダイズし得、試験サンプル中のＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ生物体、またはより具体的にはＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ生物体の存在を示す検出可能な二重鎖を形成する。これらのプローブのいくつかは、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍとその既知の最も近い系統発生的隣接物（ｃｌｏｓｅｓｔ ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｎｅｉｇｈｂｏｒ）との間を識別し得ると考えられる。これらのプローブの他のものは、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍとその既知の最も近い系統発生的隣接物との間を識別し得ると考えられる。本発明のヘルパープローブは、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ生物体由来の核酸中に存在する標的核酸配列に、ストリンジェントなハイブリダイゼーションアッセイ条件下でハイブリダイズし得、そしてハイブリダイゼーションアッセイプローブ：標的核酸二重鎖の形成を増強するために使用され得る。本発明の増幅プライマーは、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ生物体由来の核酸配列中に存在する標的核酸配列に、増幅条件下でハイブリダイズし得、そして核酸由来のＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ、より具体的にはＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍを生成するための増幅反応におけるプライマーとして使用され得る。このプローブおよび増幅プライマーは、試験サンプルにおけるＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍまたはＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ生物体を検出および／または定量するためのアッセイにおいて使用され得る。
【００４０】
本発明はさらに、生存可能なオーシスト（例えば、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ生物体）から精製されたＲＮＡを得るための方法を記載する。この精製されたＲＮＡは、１つ以上の増幅プライマーを用いる増幅に対して利用可能になり得、そして／またはハイブリダイゼーションアッセイプローブを用いる検出に対して利用可能になり得る。
【００４１】
（Ａ．定義）
以下の用語は、異なる意味を有するように明確に示されない限り、本明細書中でこの示される意味を有する。
【００４２】
「標的核酸」または「標的」は、標的核酸配列を含む核酸を意味する。
【００４３】
「標的核酸配列」、「標的ヌクレオチド配列」、「標的配列」、または「標的領域」は、一本鎖核酸分子のヌクレオチド配列の全てまたは一部を含む、特定のデオキシリボヌクレオチド配列またはリボヌクレオチド配列を意味する。
【００４４】
「オリゴヌクレオチド」または「オリゴマー」は、互いに結合した２つ以上のヌクレオシドサブユニットまたは核酸塩基サブユニットから作製されるポリマーを意味する。このオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ、ならびにそれらのアナログであり得る。このヌクレオシドサブユニットの糖グループは、リボース、デオキシリボース、およびそれらのアナログ（例えば、リボフラノシル部分に対して２’−Ｏ−メチル置換を有するリボヌクレオシドが挙げられる）であり得る。（２’置換を有するヌクレオシドサブユニットを含み、そしてハイブリダイゼーションアッセイプローブ、ヘルパープローブ、および／または増幅プライマーとして有用なオリゴヌクレオチドは、Ｂｅｃｋｅｒら、「Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ａｍｐｌｉｆｙｉｎｇ Ｔａｒｇｅｔ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｕｓｉｎｇ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｒｉｍｅｒｓ」米国特許第６，１３０，０３８号に開示される。） ヌクレオシドサブユニットは、連結（例えば、リン酸ジエステル連結）、改変された連結、またはその相補的標的核酸配列へのヌクレオチドのハイブリダイゼーションを阻止しない非ヌクレオチド部分によって、結合され得る。改変された連結としては、標準的なリン酸ジエステル連結が、異なる連結（例えば、ホスホロチオエート連結またはメチルホスホネート連結）で置換された連結が挙げられる。核酸塩基サブユニットは、例えば、ＤＮＡの天然のリン酸デオキシリボース骨格を偽（ｐｓｅｕｏｄｏ）ペプチド骨格（例えば、カルボキシメチルリンカーによって核酸塩基サブユニットを中心の二級アミンに結合する、２−アミノエチルグリシン骨格）で置き換えることによって、結合され得る。（偽ペプチド骨格を有するＤＮＡアナログは、一般に「ペプチド核酸」または「ＰＮＡ」といわれ、そしてＮｉｅｌｓｅｎら、「Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ」、米国特許第５，５３９，０８２号に開示される）。本発明によって意図されるオリゴヌクレオチドまたはオリゴマーの他の非限定的な例としては、「ロックされた（ｌｏｃｋｅｄ）核酸」、「ロックされたヌクレオシドアナログ」または「ＬＮＡ」といわれる二環式および三環式のヌクレオシドアナログおよびヌクレオチドアナログを含む核酸アナログが挙げられる。（ロックされた核酸は、Ｗａｎｇ、「Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌｌｙ Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ａｎｄ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ」、米国特許第６，０８３，４８２号；Ｉｍａｎｉｓｈｉら、「Ｎｏｖｅｌ Ｂｉｃｙｃｌｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ａｎｄ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ」、国際公開番号ＷＯ９８／３９３５２；およびＷｅｎｇｅｌら、「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ」、国際公開番号ＷＯ９９／１４２２６に開示される。） 任意の核酸アナログ（ただし、改変されたオリゴヌクレオチドは、ストリンジェントなアッセイ条件またはストリンジェントな増幅条件下で標的核酸にハイブリダイズし得る）が、本発明によって意図される。ハイブリダイゼーションアッセイプローブの場合、この改変されたオリゴヌクレオチドはまた、ストリンジェントなハイブリダイゼーションアッセイ条件下で標的核酸に優先的にハイブリダイズし得なければならない。
【００４５】
規定された配列のオリゴヌクレオチドは、当業者に公知の技術によって（例えば、化学合成または生化学合成によって、および組換え核酸分子（例えば、細菌性ベクターまたはレトロウイルスベクター）からのインビトロまたはインビボでの発現によって）生成され得る。本開示によって意図される場合、オリゴヌクレオチドは、野生型染色体のＤＮＡまたはそのインビボ転写産物からならない。オリゴヌクレオチドの１つの用途は、ハイブリダイゼーションアッセイプローブとしての用途である。オリゴヌクレオチドはまた、インビボまたはインビトロでの治療的増幅プライマーとして、あるいは罹患した細胞、感染した細胞、または病原性細胞への遺伝子の転写または翻訳をブロックまたは阻害するためのアンチセンス因子として、使用され得る。
【００４６】
「ハイブリダイゼーションアッセイプローブ」または「プローブ」は、検出に安定なプローブ：標的ハイブリッドをストリンジェントなハイブリダイゼーションアッセイ条件下で形成するために、その標的核酸配列に対して十分に相補的な塩基配列を有する、オリゴヌクレオチドを意味する。当業者に理解されるように、プローブは、ヒトの介入なしでは天然に見出されない形態（例えば、外来核酸で組換えられた形態、単離された形態、またはある程度精製された形態）で単離された、核酸分子またはそのアナログである。本発明のプローブは、標的領域の外側にさらなるヌクレオシドまたは核酸塩基（このようなヌクレオシドまたは核酸塩基が、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でのハイブリダイゼーションを妨げず、そしてハイブリダイゼーションアッセイプローブの場合には、標的核酸への優先的なハイブリダイゼーションを妨げない限り）を有し得る。非相補的な配列（例えば、標的捕獲配列（一般的には、ホモポリマー区域（例えば、ポリＡテール、ポリＴテールまたはポリＵテール））、プロモーター配列、ＲＮＡの転写のための結合部位、制限エンドヌクレアーゼ認識部位、または所望の二次構造もしくは三次構造を与える配列（例えば、触媒的活性部位またはヘアピン構造））もまた含まれ得、これらは、検出および／または増幅を容易にするために使用され得る。規定された配列のプローブは、当業者に公知の技術によって（例えば、化学合成によって、および組換え核酸分子からのインビトロまたはインビボ発現によって）生成され得る。
【００４７】
「安定な」または「検出について安定な」は、反応混合物の温度が、核酸二重鎖の融解温度よりも少なくとも２℃低いことを意味する。この反応混合物の温度は、この核酸二重鎖の溶融温度よりも、好ましくは少なくとも５℃低く、そしてさらにより好ましくは、この反応混合物の溶融温度よりも少なくとも１０℃低い。
【００４８】
「実質的に相同」「実質的に対応する（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ）」または「実質的に対応する（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｓ）」は、本発明のオリゴヌクレオチドが、参照塩基配列（ＲＮＡおよびＤＮＡ等価物を除く）中に存在する少なくとも１０個連続した塩基領域に対して、少なくとも８０％相同、好ましくは少なくとも９０％相同、および最も好ましくは１００％相同である、少なくとも１０個連続した塩基領域を含む塩基配列を有することを意味する。（当業者は、容認できないレベルの非特異的ハイブリダイゼーションを妨げながら、標的配列へのこのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを可能にするために、種々の相同性のパーセンテージでハイブリダイゼーションアッセイ条件に対してなされ得る改変を容易に理解する。） 類似性の程度は、２つの配列を構成する核酸塩基の順序を比較し、そしてこの２つの配列の間に存在し得る他の構造的差異（ただし、この構造的差異は、相補的な塩基との水素結合を妨げない）は考慮しないことによって、決定される。２つの配列間の相同性の程度はまた、比較した少なくとも１０個連続した塩基の各セットにおいて存在する塩基ミスマッチの数の観点から表され得、これは、０〜２塩基の差異の範囲であり得る。
【００４９】
「実質的に相補的」は、本発明のオリゴヌクレオチドが、標的核酸配列（ＲＮＡおよびＤＮＡの等価物を除く）中に存在する少なくとも１０個連続した塩基領域に対して、少なくとも８０％相補的、好ましくは少なくとも９０％相補的、および最も好ましくは１００％相補的な、少なくとも１０個連続した塩基領域を含む塩基配列を有することを意味する。（当業者は、容認できないレベルの非特異的ハイブリダイゼーションを妨げながら、標的配列へのこのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを可能にするために、種々の相補性のパーセンテージでハイブリダイゼーションアッセイ条件に対してなされ得る改変を容易に理解する。） 相補性の程度は、２つの配列を構成する核酸塩基の順序を比較し、そしてこの２つの配列の間に存在し得る他の構造的差異（ただし、この構造的差異は、相補的な塩基との水素結合を妨げない）は考慮しないことによって、決定される。２つの配列間の相補性の程度はまた、比較した少なくとも１０個連続した塩基の各セットにおいて存在する塩基ミスマッチの数の観点から表され得、これは、０〜２塩基の差異の範囲であり得る。
【００５０】
「ＲＮＡおよびＤＮＡの等価物」は、同じ相補性の塩基対ハイブリダイゼーション特性を有するＲＮＡ分子およびＤＮＡ分子を意味する。ＲＮＡおよびＤＮＡの等価物は、異なる糖部分（すなわち、リボース 対 デオキシリボース）を有し、そしてＲＮＡにおけるウラシルおよびＤＮＡにおけるチミジンの存在によって異なり得る。ＲＮＡの等価物とＤＮＡの等価物との間の差異は、相同性における差異には寄与しない。なぜなら、これらの等価物は、特定の配列に対して同じ程度の相補性を有するからである。
【００５１】
「ハイブリダイゼーション」は、平行、または好ましくは、逆平行の配向で、特定のハイブリダイゼーションアッセイ条件下で一緒になって（ｃｏｍｅ ｔｏｇｅｔｈｅｒ）二本鎖領域を有する安定な構造を形成する、２つの完全または部分的に相補的な核酸鎖の能力をいう。この二本鎖構造（ときどき、ハイブリッドと呼ばれる）の２つの構成鎖は、水素結合によって結合される。これらの水素結合は、最も一般的には、単一の核酸鎖上に、塩基のアデニンおよびチミンもしくはウラシル（ＡおよびＴもしくはＵ）またはシトシンおよびグアニン（ＣおよびＧ）を含むヌクレオチド間で形成するが、塩基対形成は、これらの「正準の」対のメンバーではない塩基間でも形成し得る。正準でない塩基対形成は、当該分野で周知である。（例えば、Ｒｏｇｅｒ Ｌ．Ｐ．Ａｄａｍｓら、Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ（第１１版、１９９２）を参照のこと。）
「優先的にハイブリダイズする」は、ストリンジェントなハイブリダイゼーションアッセイ条件下で、ハイブリダイゼーションアッセイプローブが、それらの標的核酸にハイブリダイズして少なくとも１つの目的の生物の存在を示す安定なプローブ：標的ハイブリッドを形成し得、そして非標的生物（特に、系統的に密接に関連した生物）の存在を示す、十分に多数の安定なプローブ：非標的ハイブリッドが形成されないことを意味する。従って、このプローブは、当業者が、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍまたは適切な場合、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ由来の核酸の存在（または非存在）を正確に検出することを可能にするように、非標的核酸よりも標的核酸に十分に大きな程度にハイブリダイズし、そして試験サンプル中の系統学的に密接に関連した生物の存在からその存在を区別する。一般的に、オリゴヌクレオチド配列とその標的配列との間の相補性の程度の減少は、その標的領域へのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションの程度または速度を減少させる。しかし、１つ以上の相補的でないヌクレオシドまたは核酸塩基の包含は、非標的生物を区別するオリゴヌクレオチドの能力を促進し得る。
【００５２】
好ましいハイブリダイゼーションは、以下に提供される実施例におけるように、当該分野で公知の技術および本明細書中に記載される技術を使用して測定され得る。好ましくは、試験サンプル中において標的ハイブリダイゼーションシグナルと非標的ハイブリダイゼーションシグナルとの間には、少なくとも１０倍の差異、より好ましくは、少なくとも約１００倍の差異、および最も好ましくは１，０００倍の差異が存在する。好ましくは、試験サンプル中の非標的ハイブリダイゼーションシグナルは、バックグラウンドシグナルレベルでしかない。
【００５３】
「ストリンジェントなハイブリダイゼーションアッセイ条件」、「ハイブリダイゼーションアッセイ条件」、「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」または「ストリンジェントな条件」は、ハイブリダイゼーションアッセイプローブが、標的核酸（好ましくは、ＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍまたはＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ生物由来のｒＲＮＡまたはｒＤＮＡ）に優先的にハイブリダイズし、そして密接に関連した非標的微生物に由来する核酸に優先的にハイブリダイズしないようにする条件を意味する。ストリンジェントなハイブリダイゼーションアッセイ条件は、プローブのＧＣ含量および長さ、プローブ配列と試験サンプル中に存在し得る非標的配列の配列との間の類似性の程度、および標的配列を含む要因に依存して変化し得る。ハイブリダイゼーション条件は、ハイブリダイゼーション試薬または溶液の温度および組成を含む。以下の実施例の節は、本発明のプローブを使用してＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍまたはＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ生物由来の標的核酸を検出するための好ましいハイブリダイゼーションアッセイ条件を提供するが、他の受容可能なストリンジェントな条件は、当業者によって容易に確かめられ得る。
【００５４】
本明細書中でオリゴヌクレオチドに関して使用される場合、「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」または「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」は、特定の塩基配列に実質的に相同な塩基配列を有し、そして４つまでのさらなる塩基を有し得、そして／またはそこから２つの塩基が欠失され得るオリゴヌクレオチドを意味する。従って、これらの成句は、配列の長さの制限および配列の改変の制限の両方を含む。任意の付加または欠失は、オリゴヌクレオチドがその要求される特性（例えば、非標的核酸よりもその標的核酸に対して、ストリンジェントなハイブリダイゼーションアッセイ条件下で優先的にハイブリダイゼーションし得る能力）を有することを妨げない特定の塩基配列の非物質的バリエーションである。このオリゴヌクレオチドは、任意の付加または欠失なしで特定の核酸配列に実質的に類似した塩基配列を含み得る。しかし、特定の塩基配列から本質的になるオリゴヌクレオチドを含むプローブまたはプライマーは、標的核酸へのプローブのハイブリダイゼーションに関与せず、そしてこのようなハイブリダイゼーションに影響しない他の核酸分子を含み得る。
【００５５】
「核酸二重鎖」、「二重鎖」、「核酸ハイブリッド」または「ハイブリッド」は、二本鎖の水素結合領域を含む安定な核酸構造を意味する。このようなハイブリッドとしては、ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＲＮＡ：ＤＮＡおよびＤＮＡ：ＤＮＡの二重鎖分子およびそれらのアナログが挙げられる。この構造は、任意の公知の手段（プローブに結合した標識を必要としない手段を含む）によって検出可能であるように十分に安定である。例えば、検出方法は、光学活性であり、かつその表面での質量における変化に感受性であるプローブコーティング基板を含み得る。質量変化は、光に応答する光学活性基板の異なる反射特性および透過特性を生じ、そして固定された標的核酸の存在および量を示すように機能する。（光学検出のこの例示的な形態は、Ｎｙｇｒｅｎら、「Ｄｅｖｉｃｅｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」米国特許第６，０６０，２３７号によって開示される。）
「増幅プライマー」または「プライマー」は、標的核酸にハイブリダイズし得、かつ核酸合成の開始のためのプライマーおよび／またはプロモーターの鋳型（例えば、相補鎖の合成のための、それにより、機能的なプロモーター配列を形成する）として作用し得るオリゴヌクレオチドを意味する。増幅プライマーがＲＮＡ構成を開始するように設計される場合、プライマーは、標的配列に相補的でないが、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼまたはＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼのようなＲＮＡポリメラーゼによって認識される塩基配列を含み得る。増幅プライマーは、プライマー伸長の速度または量を妨げるかまたは減少させるように改変された３’末端を含み得る。（ＭｃＤｏｎｏｕｇｈら、「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ａｍｐｌｉｆｙｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｕｓｉｎｇ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ−Ｐｒｉｍｅｒ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ」米国特許第５，７６６，８４９号は、改変されたかまたはブロックされた３’末端を有するプライマーおよびプロモーター−プライマーを開示する）。本発明の増幅プライマーは、化学的に合成され得るか、またはベクターから誘導され得、これらは、天然に存在する核酸分子ではない。
【００５６】
「核酸増幅」または「標的増幅」は、少なくとも１つの標的核酸配列を有する核酸分子の数を増加させることを意味する。本発明に従う標的増幅は、直線的または指数関数的のいずれかであり得るが、指数関数的増幅が好ましい。
【００５７】
「増幅条件」は、核酸増幅を可能にする条件を意味する。以下の実施例の節は、転写ベースの増幅方法で本発明のプライマーを使用して、ＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍまたはＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｕｖｕｍ生物由来の標的核酸配列を増幅するための好ましい増幅条件を提供するが、他の受容可能な増幅条件もまた、使用される特定の増幅方法に依存して当業者によって容易に確かめられ得る。
【００５８】
「アンチセンス」、「反対のセンス」または「ネガティブなセンス」は、参照、すなわち、センスの核酸分子に完全に相補的な核酸分子を意味する。
【００５９】
「センス」、「同じセンス」または「ポジティブなセンス」は、参照核酸分子に完全に相同な核酸分子を意味する。
【００６０】
「アンプリコン」は、核酸増幅反応で生成され、そして標的核酸から誘導される核酸分子を意味する。アンプリコンは、標的核酸として同じまたは反対のセンスであり得る標的核酸配列を含む。
【００６１】
「誘導された」は、生物から直接得られたか、または核酸増幅の産物である核酸に対する参照を意味する。従って、生物から「誘導された」核酸は、例えば、生物中に天然に存在しないアンチセンスＲＮＡ分子であり得る。
【００６２】
「捕獲プローブ」は、ハイブリダイゼーションアッセイプローブによって標的化される領域以外の領域で標的核酸に、そして固定されたプローブにハイブリダイズし得、それにより、試験サンプル中の標的核酸を固定しそして単離するための手段を提供する、共に結合した１つ以上のオリゴヌクレオチドを意味する。捕獲プローブは、標的核酸にハイブリダイズする標的結合領域、および固定プローブにハイブリダイズする固定プローブ結合領域の両方を含む。捕獲プローブは、標的核酸および固定プローブの両方にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得、捕獲プローブの標的結合領域および固定プローブ結合領域は、異なるハイブリダイゼーション下でこれらの標的配列に結合するように設計され得る。この様式で、捕獲プローブは、固定プローブ結合領域の固定プローブへのハイブリダイゼーションを可能にする条件を調整する前に、溶液動力学においてより好ましい条件下で標的核酸に捕獲プローブが最初にハイブリダイズするように設計され得る。標的結合領域および固定プローブ結合領域は、お互いに直接隣接するか、または１つ以上の必要に応じて改変されたヌクレオチドによって分離されて、同じオリゴヌクレオチド内に含まれ得るか、あるいはこれらの領域は、非ヌクレオチドリンカーによってお互いに結合され得る。
【００６３】
「固定プローブ」は、固定された支持体に捕獲プローブを結合させるためのオリゴヌクレオチドを意味する。固定プローブは、条件が同じか異なるかに関わらず捕獲プローブが標的核酸および固定プローブにハイブリダイズするように使用された条件下で安定したままである結合または相互作用によって、固体支持体に直接的または間接的のいずれかで結合される。固定プローブは、サンプル中の非結合物質からの、結合した標的核酸の分離を容易にする。
【００６４】
「分離する（こと）」、「精製する（こと）」、または「精製された」は、サンプル維持容器に含まれるサンプルの１つ以上の成分が、溶液中に存在する１つ以上の他のサンプル成分から物理的に取り出されるかもしくは取り出されたか、またはそれらの存在下で希釈されるかもしくは希釈されたことを意味する。分離工程または精製工程の間に取り出されるかまたは希釈され得るサンプル成分としては、タンパク質、炭水化物、脂質、インヒビター、非標的核酸および非結合プローブが挙げられる。標的捕獲手順を使用して、固定捕獲プローブに結合された標的核酸は、好ましくは、分離工程または精製工程の間、サンプル中に維持される。
【００６５】
「ヘルパープローブ」または「ヘルパーオリゴヌクレオチド」は、ハイブリダイゼーションアッセイプローブの位置と異なる位置の標的核酸にハイブリダイズするように設計され、それにより、標的核酸へのプローブのハイブリダイゼーション速度を増加させるか、プローブ：標的ハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）を上昇させるかのいずれかを行なうか、またはその両方を行なうオリゴヌクレオチドを意味する。
【００６６】
「系統学的に密接に関連した」は、生物が進化的な意味でお互いに密接に関連しており、従ってより遠く関連した生物よりも高い総核酸相同性を有することを意味する。系統樹上で隣接し、そして隣接位置の次の生物は、密接に関連している。系統樹上の隣接位置または隣接位置の次から遠く離れた位置の生物は、これらが有意な総核酸配列相同性を有する場合には、なお密接に関連している。
【００６７】
「属特異的」は、プローブに関して、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ属の少なくとも２種に属する生物から誘導された核酸中に存在する標的核酸配列に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で優先的にハイブリダイズし得ることを意味する。
【００６８】
「種特異的」は、プローブに関して、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ種に属する生物から誘導された核酸中に存在する標的核酸配列に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で優先的にハイブリダイズし得ることを意味する。
【００６９】
（Ｂ．ハイブリダイゼーション条件およびプローブ／プライマー設計）
ハイブリダイゼーション反応条件（最も重要には、ハイブリダイゼーションの温度およびハイブリダイゼーション溶液における塩濃度）は、本発明のハイブリダイゼーションアッセイプローブまたは増幅プライマーが、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ標的核酸配列を有する核酸に優先的にハイブリダイズし、試験サンプル中に存在することが疑われている他の非標的核酸にはハイブリダイズしないことを可能にするように選択され得る。減少した塩濃度および／または増加した温度（増加したストリンジェンシー条件）で、核酸ハイブリダイゼーションの程度は、二本鎖ハイブリッド分子中の対になったヌクレオチド塩基の間の水素結合が破壊される場合、減少する。このプロセスは、「融解」として公知である。
【００７０】
一般的に言うと、最も安定なハイブリッドは、最も大きい数の連続した完全に一致した（すなわち、水素結合した）ヌクレオチド塩基対を有するハイブリッドである。このようなハイブリッドは、通常、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーが増加する場合に、最後に融解すると予想される。しかし、１つ以上のミスマッチの「非正準の」塩基対または不完全な塩基対（核酸のヌクレオチド配列における位置においてより弱い塩基対形成または既存でない塩基対形成を生じる）を含む二本鎖核酸領域は、核酸ハイブリッドが、試験サンプル中に存在し得る他の選択されていない核酸と交差反応することなく、ハイブリダイゼーションアッセイ中で形成および検出されることを可能にする比較的高いストリンジェンシーの条件下でなお十分に安定であり得る。
【００７１】
従って、標的核酸のヌクレオチド配列と他方の系統学的に別であるが密接に関連した生物に属する非標的核酸のヌクレオチド配列の間の類似性の程度、および特定のハイブリダイゼーションアッセイプローブまたは増幅プライマーのヌクレオチド配列と、他方の標的核酸および非標的核酸のヌクレオチド配列の間の相補性の程度に依存して、１つ以上のミスマッチは、標的核酸にハイブリダイズしかつ非標的核酸にハイブリダイズしないプローブまたはプライマーに含まれるオリゴヌクレオチドの能力を必ずしも無効にしない。
【００７２】
本発明のハイブリダイゼーションアッセイプローブは、プローブ：標的ハイブリッドの融解温度（Ｔｍ、潜在的に二本鎖の分子の半分が、所定の反応混合物中で一本鎖の変性状態である温度として定義される）と、試験サンプル中に存在すると予想されるが、プローブと検出されることを求められていない系統学的に最も密接に関連した生物のｒＲＮＡまたはｒＤＮＡとの間で形成されたミスマッチのハイブリッドのＴｍとの間の差異を最大化するように、選択（ｃｈｏｓｅｎ）、選択（ｓｅｌｅｃｔｅｄ）、および／または設計された。非標識の増幅プライマーおよびヘルパープローブは、本発明において有用であるハイブリダイゼーションアッセイプローブとして極端に高度な特異性を有することは必要でないが、これらは、特定の増幅またはハイブリダイゼーションアッセイ条件下で他の核酸より多くの１つ以上の標的核酸に優先的にハイブリダイズする同様の様式で設計される。
【００７３】
プローブの設計において使用される核酸配列の同定を容易にするために、異なる生物由来のヌクレオチド配列を、相同性を最大化するために最初に整列した。この比較のためのヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋデータベースから得られ、そして以下の登録番号を有した：Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ（登録番号Ｌ１６９９６、Ｌ１６９９７、Ｌ２５６４２、ＡＦ０４０７２５およびＡＦ０１５７７２）、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｍｕｒｉｓ（登録番号Ｌ１９０６９）、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｂａｉｌｅｙｉ（登録番号Ｌ１９０６８）、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｗｒａｉｒｉ（登録番号Ｕ１１４４０）、Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（登録番号Ｚ８３２０４）、Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒａ ｃａｙｅｔａｎｅｎｓｉｓ（登録番号ＡＦ１１１１８３）、Ｓａｒｃｏｃｙｓｔｉｓ ｈｏｍｉｎｉｓ（登録番号ＡＦ００６４７０）、Ｅｎｔａｍｏｅｂａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ（登録番号Ｘ６４１４２）およびＥｉｍｅｒｉａ ｐｒａｅｃｏｘ（登録番号Ｕ６７１２０）。
【００７４】
ｒＲＮＡ分子内に、二次構造（分子内水素結合によって部分的に引き起こされる）と機能との間の密接な関係が存在する。この事実は、維持される二次構造を生じる一次ヌクレオチド配列における進化的変化に対して制限を課す。例えば、塩基が、二重らせんの一本の「鎖」において変化する場合（分子内水素結合に起因して、両方の「鎖」は、同じｒＲＮＡ分子の１部である）、相補性（これは、共分散と呼ばれる）、すなわち、必要な二次構造を保持するために、他の「鎖」の一次配列において、相殺的置換が通常生じる。これは、２つの非常に異なるｒＲＮＡ配列が、保存された一次配列および保存された二次構造エレメントの両方に基づいて整列されることを可能にする。本明細書中に記載されたハイブリダイゼーションアッセイプローブについての潜在的な標的配列は、整列された配列の相同性におけるバリエーションに注目することによって同定された。
【００７５】
各々の可変領域における配列の進化は、大部分が分岐している。この分岐に起因して、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍの系統学的により遠緑種の対応するｒＲＮＡ可変領域は、系統学的により近緑種のｒＲＮＡが示すよりも、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｒＲＮＡとより大きな相違を示す。同様に、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍの系統学的により遠緑種の対応するｒＲＮＡ可変領域は、系統学的により近緑種のｒＲＮＡが示すよりも、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ ｒＲＮＡとより大きな相違を示す。Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ（すなわち、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｍｕｒｉｓ、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｂａｉｌｅｙｉ、およびＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｗｒａｉｒｉ）とＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒａ ｃａｙｅｔａｎｅｎｓｉｓ、Ｓａｒｃｏｃｙｓｔｉｓ ｈｏｍｉｎｉｓ、Ｅｎｔａｍｏｅｂａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａおよびＥｉｍｅｒｉａ ｐｒａｅｃｏｘとの間の十分な変動を観察して、好ましい標的部位を同定し、そして非Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ生物体とＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ生物体とを区別するために有用なハイブリダイゼーションアッセイプローブを設計した。同様に、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍとＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｍｕｒｉｓ、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｂａｉｌｅｙｉおよびＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｗｒａｉｒｉとの間の十分な変動を観察して、好ましい標的部位を同定し、そして非Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ生物体（特に、その示されたＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ種）とＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ生物体とを区別するために有用なハイブリダイゼーションアッセイプローブを設計した。
【００７６】
本発明者らは、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍと他のＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ種との間で異なる配列、およびＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ属のメンバーと他の生物体との間で異なる配列を、ＧｅｎＢａｎｋ配列データベースにおいて公開されたｒＲＮＡ配列およびＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍの場合には、研究室でさらに決定しそして確認したｒＲＮＡ配列の比較分析によって同定した。本明細書中に開示された目的のために使用または適用され得るコンピューターおよびコンピュータープログラムは、市販されている。本発明者らは、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｍｕｒｉｓ、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｂａｉｌｅｙｉ、およびＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｗｒａｉｒｉの間の十分な類似性を観察して、本発明のＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍプローブを設計した。本発明者らはまた、これらの同じ生物体の間の十分な変動を観察して、本発明のＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍプローブを設計した。
【００７７】
特有の潜在的な標的ヌクレオチド配列を単に推定的に同定することは、機能的に属特異的なハイブリダイゼーションアッセイプローブまたは種特異的なハイブリダイゼーションアッセイプローブを作製して、その配列を含むＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍまたはＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍのｒＲＮＡまたはｒＤＮＡにハイブリダイズし得ることを保証しない。種々の他の因子は、属特異的プローブまたは種特異的プローブに対する標的部位としての核酸遺伝子座の適合性を決定する。ハイブリダイゼーション反応（例えば、本明細書中に記載される反応）の程度および特異性は、多数の因子によって影響を受けるので、これらの因子の１つ以上の操作は、その標的に完全に相補的であるか否かにかかわらず、特定のオリゴヌクレオチドの正確な感度性および特異性を決定する。種々のアッセイ条件の重要性および有効性は、当業者に公知であり、Ｈｏｇａｎ、「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ／ｏｒ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｏｎ−Ｖｉｒａｌ Ｏｒｇａｎｉｓｍｓ」、米国特許第５，８４０，４８８号；Ｈｏｇａｎら、「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ ｔｏ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｏｒｄｏｎａｅ」、米国特許第５，２１６，１４３号；およびＫｏｈｎｅ、「Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ，Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｏｎ−Ｖｉｒａｌ Ｏｒｇａｎｉｓｍｓ」、米国特許第４，８５１，３３０号によって開示されている。
【００７８】
ハイブリダイゼーションの所望の温度およびハイブリダイゼーション溶液の組成（例えば、塩濃度、界面活性剤および他の溶質）もまた、二本鎖ハイブリッドの安定性に大きく影響を与え得る。プローブが標的にハイブリダイズするのを可能にするイオン強度および温度のような条件は、属特異的プローブまたは種特異的プローブを構築する際に考慮に入れなければならない。ハイブリッド核酸の熱安定性は、反応混合物のイオン強度に伴って、一般には増大する。他方で、水素結合を破壊する化学試薬（例えば、ホルムアミド、尿素、ジメチルスルホキシドおよびアルコール）は、このハイブリッドの熱安定性を大いに減少させ得る。
【００７９】
その標的に対するプローブの特異性を最大化するために、本発明の対象プローブを設計して、高ストリンジェンシーな条件下で、これらの標的にハイブリダイズさせる。このような条件下では、高い程度の相補性を有する単一の核酸鎖のみが、互いにハイブリダイズする。このような高い程度の相補性を有さない単一の核酸鎖は、ハイブリッドを形成しない。従って、アッセイ条件のストリンジェンシーは、ハイブリッドを形成するために２つの核酸鎖の間に存在しなければならない相補性の量を決定する。ストリンジェンシーは、プローブと標的核酸との間に形成されるハイブリッドと、プローブと試験サンプル中に存在する任意の非標的核酸との間に形成される潜在的なハイブリッドとの間の安定性の相違を最大化するように選択される。
【００８０】
非標的生物体の配列に対して完全な相補性を有するハイブリダイゼーションアッセイプローブの長さを最小にすることによって、非標的核酸に対するＧリッチ領域およびＣリッチ領域の相補性を回避することよって、および非標的配列に対する出来る限り多くの不安定化ミスマッチを含むようにプローブを構築することによって、適切な特異性が達成され得る。プローブが特定の型の生物体のみを検出するのに適切であるか否かは、プローブ：標的ハイブリッドとプローブ：非標的ハイブリッドとの間の熱安定性相違に大きく依存する。プローブを設計する際に、これらのＴｍ値における相違は、出来る限り大きくあるべきである（好ましくは、２〜５℃以上）。このＴｍ値の操作は、プローブの長さおよびプローブの組成（例えば、ＧＣ含有量 対 ＡＴ含有量）に対する変化によって達成され得る。
【００８１】
一般的に、オリゴヌクレオチドプローブについての最適なハイブリダイゼーション温度は、所定の二重鎖についての融解温度よりおよそ５℃低い。最適な温度より低い温度でのインキュベーションによって、ミスマッチの塩基配列がハイブリダイズするのを可能にし得、それによって特異性を減少させ得る。プローブが長いほど、塩基対間の水素結合が多くなり、一般にＴｍはより高くなる。ＧおよびＣの割合の増加もまた、Ｔｍを増加させる。なぜなら、Ｇ−Ｃ塩基対は、さらなる水素結合を示し、それによって、熱安定性がＡ−Ｔ塩基対よりも高くなるからである。このような考慮は、当業者に公知である（例えば、Ｊ．ＳＡＭＢＲＯＯＫら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，第１１章（第２版、１９８９）を参照のこと）。
【００８２】
Ｔｍを決定するための好ましい方法は、周知のＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ（ＨＰＡ）（Ａｅｎｏｌｄら、「Ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ」、米国特許第５，２８３，１７４号によって開示される）を用いて、ハイブリダイゼーションを測定する。このＴｍは、以下の様式においてＨＰＡを使用して測定され得る。プローブ分子を、アクリジニウムエステルを用いて標識し、コハク酸リチウム緩衝液（０．１Ｍ コハク酸リチウム緩衝液、ｐＨ４．７、２０ｍＭ ＥＤＴＡ、１５ｍＭ アルドリチオール（ａｌｄｒｉｔｈｉｏｌ）−２、１．２Ｍ ＬｉＣｌ、３％（ｖ／ｖ） 無水エタノール、２％（ｗ／ｖ）ラウリル硫酸リチウム）中で、過剰な量の標的を使用して、プローブ：標的ハイブリッドを形成するのを可能にする。次いで、プローブ：標的ハイブリッドを含有する溶液のアリコートを、コハク酸リチウム緩衝液に希釈し、種々の温度（予測されるＴｍ（代表的には、５５℃）よりも低い温度から開始して、２〜５℃増加させていく）にて、５分間インキュベートする。次いで、この溶液を、穏やかなホウ酸アルカリ緩衝液（６００ｍＭ ホウ酸、２４０ｍＭ ＮａＯＨ、１％（ｖ／ｖ） ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００、ｐＨ８．５）で希釈し、等しいかまたはより低い温度で（例えば、５０℃）にて、１０分間インキュベートする。
【００８３】
これらの条件下において、一本鎖プローブに結合されたアクリジニウムエステルは加水分解されるが、ハイブリダイズしたプローブに結合されたアクリジニウムエステルは、加水分解から比較的保護される。従って、加水分解処理した後に残存しているアクリジニウムエステルの量は、ハイブリッド分子の数に比例する。この残存しているアクリジニウムエステルは、過酸化水素およびアルカリをこの溶液に添加することによって残存するアクリジニウムエステルから生成される化学発光をモニタリングすることによって測定され得る。化学発光は、照度計（例えば、ＬＥＡＤＥＲ（登録商標） ４５０ｉ 照度計（Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ；カタログ番号３２００ｉ））で測定され得る。得られたデータを、最大シグナル（通常は、最も低い温度からの）％ 対 温度としてプロットする。このＴｍは、最大シグナルの５０％が残存している温度として定義される。上記方法に加えて、Ｔｍは、当業者に公知の同位体方法によって決定され得る（例えば、米国特許第５，８４０，４８８号を参照のこと）。
【００８４】
所定のハイブリッドに対するＴｍは、使用されるハイブリダイゼーション溶液の性質に依存して変化することに注意しなければならない。因子（例えば、塩濃度、界面活性剤、および他の溶質）は、熱変性の間にハイブリッド安定性に影響を及ぼし得る（例えば、ＳＡＭＢＲＯＯＫら、前出、第１１章を参照のこと）。プローブが標的にハイブリダイズするのを可能にする条件（例えば、イオン強度、および温度）は、プローブ構築物において考慮されるべきである。（ハイブリッド核酸の熱安定性は、反応混合物のイオン強度に伴って増加する。）他方で、水素結合を破壊させる化学試薬（例えば、ホルムアミド、尿素、ジメチルスルホキシド、およびアルコール）は、ハイブリッド熱安定性を大いに減少させ得る。
【００８５】
その標的に対するハイブリダイゼーションアッセイプローブの特異性を保証するために、高ストリンジェンシーの条件下で標的核酸にのみハイブリダイズするプローブを設計することが好ましい。高度に相補的な配列のみが、高ストリンジェンシーな条件下で、ハイブリッドを形成する。従って、アッセイ条件のストリンジェンシーは、安定なハイブリッドを形成するために２つの配列間で必要とされる相補性の量を決定する。ストリンジェンシーは、プローブ：標的ハイブリッドと潜在的なプローブ：非ハイブリッドとの間の安定性における相違を最大にするように選択されなければならない。
【００８６】
特定のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例は、下記の実施例の節に提供される。もちろん、代替的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、本開示に基づいて、当業者によって決定され得る（例えば、ＳＡＭＢＲＯＯＫら、前出、第１１章を参照のこと）。
【００８７】
標的核酸配列領域の長さ、従って、プローブ配列の長さもまた、重要であり得る。いくつかの場合において、位置および長さが異なる、特定の領域由来のいくつかの配列が存在し得、これらの配列は、所望のハイブリダイゼーション特性を有するプローブを設計するために使用され得る。他の場合において、あるプローブが、単に一塩基だけが異なる別のプローブよりも、特異性の点から、より有意なプローブであり得る。完全には相補的でない核酸がハイブリダイズすることは可能であるが、完全に相補的な塩基の最も長いストレッチ、および塩基組成が、一般に、ハイブリッド安定性を決定する。
【００８８】
ハイブリダイゼーションを阻害する強力な内部構造を形成することが公知のｒＲＮＡ領域は、特に、前記のヘルパープローブが使用されないアッセイにおいて、それほど好ましい標的領域ではない。同様に、広範な自己相補性を有するプローブは、一般には回避され、特定の例外は以下で議論される。鎖が分子内ハイブリッドまたは分子間ハイブリッドに、全体的にまたは部分的に関与する場合、その鎖は、反応条件を変更しないで、新規の分子間プローブ：標的ハイブリッドの形成にそれほど関与し得ない。リボソームＲＮＡ分子は、水素結合によって、非常に安定な分子内らせん構造および二次構造を形成することが知られている。ハイブリダイゼーション条件下で実質的に一本鎖のままである標的核酸の領域に対するプローブを設計することによって、プローブと標的との間のハイブリダイゼーションの速度および程度が、増加され得る。
【００８９】
ゲノムリボソーム核酸（ｒＤＮＡ）標的は、天然で二本鎖形態で存在し、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の生成物も問題である。。これらの二本鎖標的は、天然でプローブとのハイブリダイゼーションに阻害性であり、ハイブリダイゼーション前に変性を必要とする。適切な変性およびハイブリダイゼーション条件は、当業者に公知である（例えば、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｅ．Ｍ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，９８：５０３（１９７５）を参照のこと）。
【００９０】
それらの標的核酸に対して完全に一致したオリゴヌクレオチドについての融解温度の推定値を提供する、多数の式が利用可能である。このような式の１つは、以下である：
Ｔｍ＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋０．４１（Ｇ＋Ｃの割合）−（６００／Ｎ）
（ここで、Ｎは、ヌクレオチド数でのオリゴヌクレオチドの長さである。）この式は、１４ヌクレオチド長と６０〜７０ヌクレオチド長との間のオリゴヌクレオチドに対するＴｍの良好な推定値を与える。このような計算から、その後のＴｍの経験的検証または「微調整」が、当業者に周知のスクリーニング技術を使用してなされ得る。ハイブリダイゼーションおよびオリゴヌクレオチドプローブに関するさらなる情報については、ＳＡＮＢＲＯＯＫら、前出、第１１章を参照にし得る。とりわけ当業者に周知のこの参照はまた、ハイブリッドのＴｍに対するミスマッチの有効な推定を提供する。従って、２つ以上の生物体のリボソームＲＮＡ（またはｒＤＮＡ）の所定の領域の既知のヌクレオチド配列から、これらの生物体を互いに区別するオリゴヌクレオチドが設計され得る。
【００９１】
（Ｃ．核酸増幅）
好ましくは、本発明の増幅プライマーは、オリゴデオキシヌクレオチドであり、そして核酸ポリメラーゼによる伸長産物の合成のための基質として使用するのに、十分に長い。最適なプライマー長は、いくつかの因子を考慮しなければならず、これらの因子としては、反応温度、プライマーの構造および塩基組成、ならびにプローブの使用方法が挙げられる。例えば、最適な特異性のために、オリゴヌクレオチドプライマーは、一般に、標的核酸配列の複雑性に依存して、少なくとも１２塩基長であるべきである。このような特異性が必要でない場合、より短いプライマーが使用され得る。このような場合、より低い温度で反応を行って、テンプレート核酸との安定なハイブリッド複合体を形成することが望ましくあり得る。
【００９２】
所望の特徴を有する増幅プライマーおよびハイブリダイゼーションアッセイプローブを設計するための有用な指針は、表題「Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ」の節で、以下に記載される。増幅およびプローブ化のための最適な部位は、少なくとも２つ（好ましくは、３つ）のＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍまたはＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ核酸の保存領域を含む。これらの領域は、約１５〜３５０塩基長、好ましくは、約１５塩基長と１５０塩基長との間である。
【００９３】
一セットの増幅プライマー（プライマーおよび／またはプロモーター−プライマー）を用いて観察された増幅の程度は、いくつかの因子に依存しており、これらの因子としては、プライマーがそれらの特定の標的配列にハイブリズする能力、および酵素学的に伸長または複製されるそれらの能力が挙げられる。異なる長さおよび塩基組成の増幅プライマーが使用され得るが、本発明において好ましい増幅プライマーは、１８〜４０塩基の標的結合領域を有し、標的に対する推定Ｔｍは、約４２℃である。
【００９４】
プローブハイブリダイゼーションに影響を及ぼすパラメータ（例えば、標的配列のＴｍ、相補性、および二次元構造）はまた、増幅プライマーハイブリダイゼーション、従って増幅プライマーの性能に影響を及ぼす。非特異的伸長（プライマーの二量体、または非標的複製）の程度もまた増幅効率に影響を及ぼし得る。従って、増幅プライマーは、特に、それらの配列の３’末端で、低い自己相補性または交差相補性を有するように選択される。それにもかかわらず、本発明者らは、下記の「シグナルプライマー」が自己相補性領域を含むように改変され得、それによって、そのシグナルプライマーを「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｏｒｃｈ（分子トーチ）」または「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎ（分子ビーコン）」シグナルプライマーこれらの用語は以下で定義される）へ転換し得る。冗長なホモポリマーの連続および高いＧＣ含有量は、偽性のプライマー伸長を減少するために回避される。設計でのこれらの局面を補助するために、コンピュータープログラムが利用可能であり、これらとしては、Ｏｌｉｇｏ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．から入手可能なＯｌｉｇｏ Ｔｅｃｈ（登録商標）ソフトウェアが挙げられ、以下のＵＲＬでワールドワイドウェブにアクセスすることが出来る：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｏｌｉｇｏｓｅｔｃ．ｃｏｍ／ＯｌｉｇｏＴｅｃｈ．ｈｔｍｌ。
【００９５】
本発明の増幅プライマーと組み合わせて使用される核酸ポリメラーゼとは、リボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチドのいずれか、または両方を、核酸ポリマーまたは核酸鎖中に、テンプレートに依存的な様式で組み込む、化学薬剤、物理的薬剤または生物学的薬剤をいう。核酸ポリメラーゼの例としては、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、およびＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼが挙げられる。ＤＮＡポリメラーゼは、テンプレートに依存的な様式において、そして５’から３’の方向で、核酸合成を引き起こす。二本鎖核酸における２つの鎖の代表的な逆平行方向に起因して、この方向は、テンプレート上の３’領域からテンプレート上の５’領域である。ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼの例としては、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）由来の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、およびＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｂｓｔ）由来のＤＮＡポリメラーゼＩの大フラグメントが挙げられる。ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼの例としては、種々のレトロウイルス逆転写酵素（例えば、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）逆転写酵素または鳥類骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素）が挙げられる。
【００９６】
大部分の核酸増幅反応の間に、核酸ポリメラーゼは、標的核酸をテンプレートとして使用して、ヌクレオチド残基をプライマーの３’末端に付加し、それによってこの標的核酸の領域に部分的または完全に相補的なヌクレオチド配列を有する第二の核酸鎖を合成する。多数の核酸増幅反応において、生じた二本鎖構造を含む２つの鎖は、増幅反応が進行するのを可能にするように、化学的手段または物理的手段によって分離されなければならない。あるいは、新しく合成されたテンプレート鎖は、他の手段によって（例えば、鎖置換または元の標的鎖の一部または全てを消化する核酸分解（ｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃ）酵素のその使用によって）、第二のプライマーまたはプロモーター−プライマーとのハイブリダイゼーションに有効可能にされ得る。このようにして、このプロセスは、多数のサイクルを通して繰り返され得、標的ヌクレオチド配列を有する核酸分子の数を大いに増加させる。
【００９７】
第一増幅プライマーもしくは第二増幅プライマーのいずれか、またはそれらの両方は、プロモーター−プライマーであり得る。（いくらかの適用において、この増幅プライマーは、Ｋａｃｉａｎら、「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄ，Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ａｎｄ Ｋｉｔ」、米国特許第５，５５４，５１６号に開示されるように、センス鎖に相補的なプロモーター−プライマーのみからなり得る。）プロモーター−プライマーは、通常は、標的核酸分子またはプライマー伸長産物中に存在するヌクレオチド配列に相補的ではないオリゴヌクレオチドを含有する（このようなオリゴヌクレオチドの記載については、Ｋａｃｉａｎら、「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄ」、米国特許第５，３９９，４９１号を参照のこと）。これらの非相補的な配列は、増幅プライマー上の相補的な配列に対して５’側に位置し得、そして核酸ポリメラーゼの作用を介して二重鎖が作製される場合、ＲＮＡ合成の開始のための遺伝子座を提供し得る。このように、提供されるプロモーターは、標的核酸配列の複数のＲＮＡコピーのインビトロ転写を可能にし得る。本明細書中のプライマーに対して言及される場合、このような言及は、この言及の内容が明らかに他を示さない限り、プロモータ−プライマーのプライマーの局面を含むことが意図されることが明らかである。
【００９８】
いくつかの増幅系（例えば、Ｄａｔｔａｇｕｐｔａら、「Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ｓｔｒａｎｄ Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ」、米国特許第６，０８７，１３３号によって開示される増幅方法を参照のこと）において、増幅プライマーは、鎖置換を補助する５’非相補的ヌクレオチドを含み得る。さらに、５’エキソヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼと組み合わせて使用される場合、増幅プライマーは、酵素消化を防ぐために、それらの５’末端で改変を有し得る。あるいは、核酸ポリメラーゼは、５’エキソヌクレアーゼ活性を取り除くように、例えば、このようなヌクレアーゼ活性を有さない活性なポリメラーゼフラグメントを生成するプロテアーゼで処理することによって、改変され得る。このような場合、プライマーは、それらの５’末端で改変される必要はない。
【００９９】
（１．オリゴヌクレオチドの調製）
本発明のオリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブを、当該分野で公知の方法により容易に調製し得る。好ましくは、このオリゴヌクレオチドを、固相法により合成し得る。例えば、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓは、標準的なホスホロアミダイト固相化学を用いて、ホスホロジエステル結合によりヌクレオチドを結合することを記載する（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ、Ｍ．Ｈ．ら Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１５４：２８７（１９８７）を参照のこと）。シアノエチルホスホロアミダイト前駆物質を用いた自動化固相化学合成がＢａｒｏｎｅにより記載される（Ｂａｒｏｎｅ、Ａ．Ｄ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１２（１０）：４０５１（１９８４）を参照のこと）。同様に、Ｂａｔｔ、「Ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ Ｒｅａｇｅｎｔ ｆｏｒ Ｓｕｌｆｕｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｏｒｇａｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｏｕｓ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ」米国特許第５，４４９，７６９号は、ホスホロチオエート結合を含むオリゴヌクレオチドを合成する手順について開示する。さらにＲｉｌｅｙら、「Ｐｒｏｃｅｓｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｏｌｉｇｏｍｅｒｓ」米国特許第５，８１１，５３８号は、メチルホスホネート結合を含む異なる結合を有するオリゴヌクレオチドの合成を開示する。さらに、オリゴヌクレオチドの有機合成方法は、当業者に公知であり、例えば、ＳＡＭＢＲＯＯＫら（前出、第１０章）に記載される。
【０１００】
特定のオリゴヌクレオチドの合成および精製の後に、いくつかの異なる手順が使用されて、このオリゴヌクレオチドを精製し、その質を調整し得る。適切な手順は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動または高圧液体クロマトグラフィを含む。これら両方の手順は、当業者に周知である。
【０１０１】
本発明のオリゴヌクレオチド（ハイブリダイゼーションアッセイプローブ、増幅プライマーまたはヘルパープローブのいずれか）の全ては、化学基で修飾されて、これらの機能を増大し得るか、増幅産物の特性を亢進し得る。
【０１０２】
例えば、骨格修飾オリゴヌクレオチド、例えば、このオリゴヌクレオチドに、特定のポリメラーゼの核酸溶解活性もしくはヌクレアーゼ酵素に対する抵抗性を与える、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、２’−Ｏ−アルキルまたはペプチド基を有するものは、このような酵素を、増幅または他の増幅反応において使用することを可能にし得る。修飾の別の例は、プローブまたはプライマーの核酸鎖中のヌクレオチド間に取りこまれた非ヌクレオチドリンカー（Ａｒｎｏｌｄら、「Ｎｏｎ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｌｉｎｋｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｒｏｂｅｓ」米国特許第６，０３１，０９１号）の使用を含み、これは、プローブのハイブリダイゼーションまたはプライマーのハイブリダイゼーションおよび伸長を妨げない。本発明のオリゴヌクレオチドはまた、所望される修飾ヌクレオチドおよび天然ヌクレオチドの混合物を含み得る。
【０１０３】
増幅プライマーの３’末端を、改変またはブロックして、ＤＮＡ合成の開始を予防または阻害し得る（Ｋａｃｉａｎら、米国特許第５，５５４，５１６号に開示される）。プライマーの３’末端を、当該分野で公知の種々の方法により改変し得る。例えば、プライマーに対する適切な改変は、リボヌクレオチド、３’デオキシヌクレオチド残基（例えば、コルジセピン）、２’，３’−ジデオキシヌクレオチド残基、改変ヌクレオチド結合（例えば、ホスホロチオエート）および非ヌクレオチド結合（例えば、Ａｒｎｏｌｄら、米国特許第６，０３１，０９１号）、またはアルカンジオール改変（Ｗｉｌｋら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１８：２０６５（１９９０））の添加を含み得るが、この改変は単に、標的核酸配列に対して相補的でないプライミング配列の３’側の領域からなり得る。さらに、異なる３’ブロックプライマーの混合物または３’ブロックおよび非ブロックプライマーの混合物は、以下に記載のように核酸増幅の効率を増大し得る。
【０１０４】
上記のように、プライマーの５’末端ヌクレオチドを改変して、いくつかの核酸ポリメラーゼに存在する５’エキソヌクレアーゼ活性に対し抵抗性にし得る。このような改変を、Ａｒｎｏｌｄら、米国特許第６，０３１，０９１号に開示されるような技術を使用して、非ヌクレオチド基をプライマーの５’末端に添加することにより実施し得る。
【０１０５】
一旦合成されると、選択されたオリゴヌクレオチドを、いくつかの周知の方法により標識し得る（例えば、ＳＡＭＢＲＯＯＫ、前出、第１０章）を参照のこと）。有用な標識は、放射性同位元素および非放射活性レポート基を含む。同位体標識としては、３Ｈ、３５Ｓ、３２Ｐ、１２５Ｉ、５７Ｃｏおよび１４Ｃが挙げられる。同位体標識を、オリゴヌクレオチド中に、当該分野で公知の技術（例えば、ニックトランスレーション、末端標識、第２鎖合成、逆転写の使用、および化学的方法）により導入され得る。放射性標識プローブを使用する場合、ハイブリダイゼーションを、オートラジオグラフィー、シンチレーション計数またはγ線計数により検出し得る。選択される検出方法は、標識するために使用される特定の放射性同位体に依存する。
【０１０６】
非同位体物質もまた、標識に使用し得て、核酸配列中または核酸配列の末端に導入され得る。改変ヌクレオチドを、酵素的または化学的に導入し得る。プローブの化学的改変を、プローブの合成中または合成後に実施し得る（例えば、Ａｒｎｏｌｄら、米国特許第６，０３１，０９１号に開示されるような非ヌクレオチドリンカー基の使用を介する）。非同位体標識としては、蛍光分子（Ｔｙａｇｉら、「Ｄｅｔｅｃｔａｂｌｙ Ｌａｂｅｌｅｄ Ｄｕａｌ Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｒｏｂｅｓ， Ａｓｓａｙｓ ａｎｄ Ｋｉｔｓ」米国特許第５，９２５，５１７号に開示される蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）対のような個々の標識または標識の組み合わせ、化学発光分子、酵素、補因子、酵素基質、ハプテンまたは他のリガンド）が挙げられる。
【０１０７】
本発明のハイブリダイゼーションアッセイプローブを用いて、好ましくはプローブをアクリジニウムエステルを伴った非ヌクレオチドリンカーを用いて標識する。アクリジニウムエステル標識を、Ａｒｎｏｌｄら、「Ａｃｒｉｄｉｎｉｕｍ Ｅｓｔｅｒ Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｒｏｂｅｓ」米国特許第５，１８５，４３９号に開示されるように実施し得る。
【０１０８】
（２．Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍリボソーム核酸の増幅）
本発明の増幅プライマーは、ＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍまたはＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ生物体に由来する１８Ｓリボソーム核酸領域を指向する。これらの増幅プライマーは、ＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍまたはＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ生物体の存在を、核酸増幅アッセイにおいて検出するために使用されるハイブリダイゼーションアッセイプローブの少なくとも１つの標的核酸配列（またはその相補体）に隣接するか、重複するかまたは含まれ得る。上記のように、増幅プライマーはまた、非相補的塩基を、ＲＮＡポリメラーゼに結合し得るか、標的核酸をテンプレートとして用いてＲＮＡ転写を指示し得るプロモーター配列を含むこれらの５’末端に含み得る。Ｔ７プロモーター配列（例えば、配列番号６９）を使用し得る。
【０１０９】
本発明の増幅プライマーは、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ生物体由来の核酸中に存在する標的核酸配列を、増幅条件下で増幅し得る。これらの増幅プライマーは、以下の塩基配列を有するかまたは実質的に対応するオリゴヌクレオチドを含む：配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７または配列番号６８。
【０１１０】
あるいは、本発明の増幅プライマーは、増幅条件下で核酸ポリメラーゼと結合する場合に、以下の塩基配列を有する核酸領域を介して結合または伸長が生じるオリゴヌクレオチドを含む：配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７または配列番号６８。
【０１１１】
１つの好ましい実施形態において、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ核酸を増幅するための少なくとも２つの増幅プライマーのセットが提供され、以下を含む：（ｉ）配列番号４５、配列番号５１、配列番号５７、または配列番号６３の塩基配列を有するかまたは実質的に対応するオリゴヌクレオチドを含む第１の増幅プライマー；および（ｉｉ）配列番号４７、配列番号５３、配列番号５９、または配列番号６５の塩基配列を有するかまたは実質的に対応するオリゴヌクレオチドを含む第２の増幅プライマー。好ましくは、第１の増幅プライマーは、配列番号４５の塩基配列を有するかまたは実質的に対応するオリゴヌクレオチドを含み、第２の増幅プライマーは、配列番号５９の塩基配列を有するかまたは実質的に対応するオリゴヌクレオチドを含む。
【０１１２】
別の好ましい実施形態において、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ核酸を増幅するための少なくとも２つの増幅プライマーのセットが提供され、以下を含む：（ｉ）配列番号４５、配列番号５１、配列番号５７、または配列番号６３の塩基配列を有するかまたは実質的に対応するオリゴヌクレオチドを含む第１の増幅プライマー；および（ｉｉ）配列番号４８、配列番号５４、配列番号６０、または配列番号６６の塩基配列を有するかまたは実質的に対応するオリゴヌクレオチドを含む第２の増幅プライマー。好ましくは、第１の増幅プライマーは、配列番号４５の塩基配列を有するかまたは実質的に対応するオリゴヌクレオチドを含み、第２の増幅プライマーは、配列番号６０の塩基配列を有するかまたは実質的に対応するオリゴヌクレオチドを含む。
【０１１３】
なお別の実施形態において、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ核酸を増幅するための少なくとも２つの増幅プライマーのセットが提供され、以下を含む：（ｉ）配列番号４６、配列番号５２、配列番号５８、または配列番号６４の塩基配列を有するかまたは実質的に対応するオリゴヌクレオチドを含む第１の増幅プライマー；および（ｉｉ）配列番号４８、配列番号５４、配列番号６０、または配列番号６６の塩基配列を有するかまたは実質的に対応するオリゴヌクレオチドを含む第２の増幅プライマー。好ましくは、第１の増幅プライマーは、配列番号４６の塩基配列を有するかまたは実質的に対応するオリゴヌクレオチドを含み、第２の増幅プライマーは、配列番号６０の塩基配列を有するかまたは実質的に対応するオリゴヌクレオチドを含む。
【０１１４】
なお別の実施形態において、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ核酸を増幅するための少なくとも２つの増幅プライマーのセットが提供され、以下を含む：（ｉ）配列番号４６、配列番号５２、配列番号５８、または配列番号６４の塩基配列を有するかまたは実質的に対応するオリゴヌクレオチドを含む第１の増幅プライマー；および（ｉｉ）配列番号４７、配列番号５３、配列番号５９、または配列番号６５の塩基配列を有するかまたは実質的に対応するオリゴヌクレオチドを含む第２の増幅プライマー。好ましくは、第１の増幅プライマーは、配列番号４６の塩基配列を有するかまたは実質的に対応するオリゴヌクレオチドを含み、第２の増幅プライマーは、配列番号５９の塩基配列を有するかまたは実質的に対応するオリゴヌクレオチドを含む。
【０１１５】
さらに好ましい実施形態において、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ核酸を増幅するための少なくとも２つの増幅プライマーのセットが提供され、以下を含む：（ｉ）配列番号４９、配列番号５５、配列番号６１、または配列番号６７の塩基配列を有するかまたは実質的に対応するオリゴヌクレオチドを含む第１の増幅プライマー；および（ｉｉ）配列番号５０、配列番号５６、配列番号６２、または配列番号６８の塩基配列を有するかまたは実質的に対応するオリゴヌクレオチドを含む第２の増幅プライマー。好ましくは、第１の増幅プライマーは、配列番号４９の塩基配列を有するかまたは実質的に対応するオリゴヌクレオチドを含み、第２の増幅プライマーは、配列番号６２の塩基配列を有するかまたは実質的に対応するオリゴヌクレオチドを含む。
【０１１６】
本発明の増幅プライマーは、例えば、３’および／または５’末端がブロックされた改変（上記に議論されるように）、または配列の付加（ＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ７、Ｔ３またはＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ）によって認識される特異的ヌクレオチド配列、ＲＮＡポリメラーゼによってＲＮＡ転写の開始または伸長を増大する配列、または分子間の塩基対を提供し、核酸の２次構造もしくは３次構造の形成を支持し得る配列を含むが、これらに限定されない）を有し得る。
【０１１７】
増幅プライマーを、核酸増幅手順（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、転写媒介性増幅（ＴＭＡ）、核酸配列をベースにした増幅（ＮＡＳＢＡ）、自立した配列増幅（３ＳＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、鎖解離増幅（ＳＤＡ）、およびＬｏｏｐ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＬＡＭＰ）において使用し、これらのそれぞれは、当該分野で周知である（例えば、Ｍｕｌｌｉｓ、「Ｐｒｏｃｅｓｓ ｆｏｒ Ａｍｐｌｉｆｙｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」米国特許第４，６８３，２０２号；Ｅｒｌｉｃｈら、「Ｋｉｔｓ ｆｏｒ Ａｍｐｌｉｆｙｉｎｇ ａｎｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」米国特許第６，１９７，５６３号；Ｗａｌｋｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２０：１６９１−１６９６（１９９２）；Ｆａｈｙら、「Ｓｅｌｆ−ｓｕｓｔａｉｎｅｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ（３ＳＲ）：Ａｎ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−Ｂａｓｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｔｏ ＰＣＲ」ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、１：２５−３３（１９９１）；Ｋａｃｉａｎら、米国特許第５，３９９，４９１；Ｋａｃｉａｎら、「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ」米国特許第５，４８０，７８４号；Ｄａｖｅｙら、「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｐｒｏｃｅｓｓ」米国特許第５，５５４，５１７号；Ｂｉｒｋｅｎｍｅｙｅｒら、「Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔａｒｇｅｔ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｕｓｉｎｇ Ｇａｐ Ｆｉｌｌｉｎｇ Ｌｉｇａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ」米国特許第５，４２７，９３０号；Ｍａｒｓｈａｌｌら、「Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＲＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ Ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ Ｌｉｇａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ」米国特許第５，６８６，２７２号；Ｗａｌｋｅｒ、「Ｓｔｒａｎｄ Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ」米国特許第５，７１２，１２４号；Ｎｏｔｏｍｉら、「Ｐｒｏｃｅｓｓ ｆｏｒ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ」欧州特許出願番号１ ０２０ ５３４ Ａ１；Ｄａｔｔａｇｕｐｔａら、「Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ｓｔｒａｎｄ Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ」米国特許第６，２１４，５８７号；およびＨＥＬＥＮ Ｈ．ＬＥＥら、ＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤ ＡＭＰＬＩＦＩＣＡＴＩＯＮ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ：ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮ ＴＯ ＤＩＳＥＡＳＥ ＤＩＡＧＮＯＳＩＳ（１９９７）を参照こと）。前出の「核酸増幅」の定義を満たす他の任意の増幅手順はまた、本発明者らにより企図される。
【０１１８】
本発明の増幅プライマーは、好ましくは非標識であるが、１つ以上のレポーター基を含み、ハイブリダイゼーションアッセイプローブと組み合わせてか、またはハイブリダイゼーションアッセイプローブを含まずに、標的核酸の検出を容易にし得る。増幅された標的配列を検出するための広範な種々の方法が利用可能である。例えば、ヌクレオチド基質またはプライマーは、新たに合成されたＤＮＡ中に取りこまれた検出可能な標識を含み得る。次いで、得られた標識増幅産物を一般的に、未使用の標識ヌクレオチドまたはプライマーから分離し、分離した生成物画分において、検出する（例えば、Ｗｕ。「Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｕｓｉｎｇ Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ Ｃａｐｔｕｒｅ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｔｅｓｔ Ｋｉｔ」米国特許第５，３８７，５１０号を参照のこと）。
【０１１９】
しかし、プライマーが、例えば、ドナー／アクセプター色素対を形成する２つの色素に結合することにより修飾されている場合、分離する工程は、必要でない。プライマーが標的核酸にハイブリダイズせず、このことにより物理的に２つの色素を分離する限り、修飾プライマーを、１つの色素対メンバーの蛍光が、他の色素対メンバーによりクエンチされたままであるように設計し得る。さらに、プライマーを改変して、２つの色素の間に位置する制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含むようし得、改変プライマーと標的核酸との間でハイブリッドが形成される場合、制限エンドヌクレアーゼ認識部位は、２重鎖となり、適切な制限エンドヌクレアーゼによる切断またはニック形成に利用可能である。次いでハイブリッドの切断またはニック形成は、２つの色素を分離し、クエンチの減少に起因する蛍光の変化を生じる。この蛍光変化を、試験試料中の標的生物体の存在を示すものとして検出し得る。この型の改変プライマーは、「シグナルプライマー」として示され、Ｎａｄｅａｕら、「Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ｂｙ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ」米国特許第６，０５４，２７９号により開示される。
【０１２０】
有用に検出可能な標識を供し得る物質は、当該分野で周知であり、放射性同位元素、蛍光分子、化学発光分子、発色団およびリガンド（例えば、ビオチンおよびハプテン）（直接検出されないが、これらの特定的結合パートナー（例えば、それぞれアビジンおよび抗体）の標識形態と反応することにより容易に検出され得る。
【０１２１】
別のアプローチは、検出可能な標識オリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイゼーションし、任意の従来の様式において、得られたハイブリッドを測定することにより増幅産物を検出することである。特に、この生成物を、化学発光アクリジウムエステル標識オリゴヌクレオチドプローブを標的配列にハイブリダイズし、ハイブリダイズしなかったプローブ上に存在するアクリジウムエステルを選択的に加水分解し、そして残ったアクリジウムエステルから生ずる化学発光を照度計中で測定することによって評価し得る（例えば、米国特許第５，２８３，１７４号およびＮＯＲＭＡＮ Ｃ． ＮＥＬＳＯＮら、ＮＯＮＩＳＯＴＯＰＩＣ ＰＲＯＢＩＮＧ、ＢＬＯＴＴＩＮＧ，ＡＮＤ ＳＥＱＵＥＮＣＩＮＧ，第１７章（Ｌａｒｒｙ Ｊ．Ｋｒｉｃｋａ編、第２版 １９９５））。
【０１２２】
（Ｄ．Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍリボソーム核酸に対するハイブリダイゼーションアッセイプローブ）
本発明の実施形態は、新規なハイブリダイゼーションアッセイプローブに関する。ハイブリダイゼーションは、水素結合した二重鎖を形成する相補的な核酸の二本鎖の会合である。検出されるべき核酸配列（「標的配列」）にハイブリダイズし得る核酸配列は、標的配列のプローブとして働き得る。ハイブリダイゼーションは、ＤＮＡ／ＤＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡ、およびＲＮＡ／ＲＮＡを含む相補的な核酸鎖の間で生じ得る。ヌクレオチド（塩基であるアデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、チミジン（Ｔ）、グアニン（Ｇ）、ウラシル（Ｕ）、イノシン（Ｉ）、およびそのアナログを含む）から形成された、二本鎖のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、またはリボ核酸（ＲＮＡ）は、ハイブリダイズして二本鎖構造を形成し得る。この二本鎖構造でこの二本鎖は、相補的な塩基の対の間の水素結合によって一緒に保持される。一般に、Ａは、ＴまたはＵに対して水素結合し、一方Ｇは、Ｃに対して水素結合する。従って、ハイブリダイズした鎖にそった任意のポイントで、古典的な塩基対であるＡＴまたはＡＵ、ＴＡまたはＵＡ、ＧＣ、またはＣＧが見出され得る。従って、核酸の第一鎖が、第二鎖に対して相補的な十分連続する塩基を含み、そしてこの二本の鎖がそのハイブリダイゼーションを促進する条件下で一緒にされるとき、二本鎖の核酸が得られる。適切な条件下で、ＤＮＡ／ＤＮＡ、ＲＮＡ／ＤＮＡ、またはＲＮＡ／ＲＮＡハイブリッドが形成され得る。
【０１２３】
ハイブリダイゼーションの速度および程度は、多数の因子によって影響される。例えば、上記の二本の鎖の一方が全体としてまたは部分的にハイブリッドに関与している場合、これは新しいハイブリッドの形成に関与する能力が低いことが暗示される。目的の配列のかなりの部分が一本鎖であるようにプローブを設計することによって、ハイブリダイゼーションの速度および程度は一般に増大し得る。また、標的が、組み込まれたゲノム配列である場合、それはＰＣＲ産物の場合にそうであるように、天然に二本鎖形態で生じる。これらの二本鎖標的は、プローブとのハイブリダイゼーションを天然に阻害し、そしてハイブリダイゼーション工程の前に、変性を要する。さらに、十分な自己相補性が存在する場合は、分子内ハイブリッドおよび分子間ハイブリッドがプローブ内で形成され得る。ハイブリダイゼーションに対して阻害的な強力な内部構造を形成することが公知の核酸の領域は、好適度が低い。このような構造の例としては、ヘアピンループが挙げられる。同様に、広い自己相補性を有するプローブは一般に回避されるべきである。全てのこれらの所望されない構造は、注意深いプローブ設計を通じて回避され得、そして市販のコンピュータープログラム（例えば、Ｏｌｉｇｏ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．から入手可能なＯｌｉｇｏ Ｔｅｃｈ（登録商標）分析ソフトウェア）は、これらのタイプの相互作用についての検索のために利用可能である。
【０１２４】
いくつかの適用において、少なくともある程度の自己相補性を示すプローブは、検出の前にハイブリダイズしていないプローブをまず除去する必要なしに、試験サンプルにおいてプローブ：標的二重鎖の検出を促進することが所望され得る。例えば、「分子トーチ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｏｒｃｈ）」と呼ばれる構造は、自己相補性の明白な領域（鋳造された「標的結合ドメイン」および「標的閉鎖ドメイン」）を含むように設計され、この領域は、連結領域によって接続され、そして前に決定されたハイブリダイゼーションアッセイ条件下でお互いにハイブリダイズする。変性条件に対して曝露された場合、分子トーチの２つの相補性領域（完全にまたは部分的に相補的であり得る）は、融解し、事前に決定したハイブリダイゼーションアッセイ条件を回復するとき、標的配列に対するハイブリダイゼーションのために利用可能な標的結合ドメインを残す。標的結合ドメインが、標的閉鎖ドメインよりも標的配列に対するハイブリダイゼーションを支持するように分子トーチを設計する。分子トーチの標的結合ドメインおよび標的閉鎖ドメインは、この分子トーチが、標的核酸にハイブリダイズするときよりも自己ハイブリダイズされる場合、異なるシグナルが生じるように配置された相互作用する標識（例えば、発光体／クエンチャー）を含み、それによって分子トーチに会合した存在可能な標識を有するハイブリダイズしていないプローブの存在下で試験サンプル中のプローブ：標的二本鎖の検出を可能にする。（分子トーチは、Ｂｅｃｋｅｒら「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｏｒｃｈｅｓ」米国特許出願番号０９／３４６，５５１号および国際公開番号ＷＯ００／０１８５０（その両方ともこれとともに共有権を享受する）に開示される）。
【０１２５】
自己相補性を有するハイブリダイゼーションアッセイプローブの別の例は、「分子ビーコン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎ）」と一般に呼ばれる構造である。分子ビーコンは、標的相補配列を有する核酸分子、標的核酸配列の非存在下で閉鎖されたコンフォメーションにおいてプローブを保持するアフィニティー対（または核酸アーム）、および標識対（プローブが閉鎖されたコンフォメーションにある場合相互作用する）を含む。標的核酸および標的相補性配列のハイブリダイゼーションは、アフィニティー対のメンバーを分け、それによってこのプローブを開放（ｏｐｅｎ）コンフォメーションにシフトする。開放コンフォメーションへのシフトは、標識対（例えば、発蛍光団およびクエンチャー（例えば、ＤＡＢＣＹＬ、およびＥＤＡＮＳ））の相互作用の減少に起因して検出可能である。（分子ビーコン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎｓ）は、米国特許第５，９２５，５１７号においてＴｙａｇｉらによって開示されている。
【０１２６】
プローブがその標的にハイブリダイズする速度は、プローブ領域における標的二次構造の熱安定性の１つの尺度である。ハイブリダイゼーション速度の標準的な測定値は、Ｃｏｔ１／２であり、ヌクレオチドのモル／Ｌ×秒として測定される。従って、それは、プローブの濃度×その濃度で最大ハイブリダイゼーションの５０％が生じる時間である。この値は、固定した時間、一定量の標的に対して種々の量のプローブをハイブリダイズすることによって決定される。Ｃｏｔ１／２は、標準的な手順によって図示される。プローブ：標的ハイブリッド融点は、当業者に周知の同位体の方法で決定され得る。所定のハイブリッドに対する融点（Ｔｍ）は、用いられるハイブリダイゼーション溶液に依存して変化する。
【０１２７】
従って、第一の局面において、本発明は、プローブが、ストリンジェントなハイブリダイゼーションアッセイ条件下でＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ核酸に優先的にハイブリダイズする能力によって、非Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ核酸からＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ核酸を識別し得るハイブリダイゼーションアッセイプローブを特徴とする。詳細には、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍプローブは、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ生物体由来の核酸に存在する標的配列に実質的に相補的である塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含む。Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍプローブが、ストリンジェントなハイブリダイゼーションアッセイ条件下でＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ属に属する少なくとも２つの種の存在を検出し得るという条件では、本発明のＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍプローブは、試験サンプル中に存在し得、そしてなおＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍプローブとして特徴づけされるＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ属の全てのメンバーは検出できない。
【０１２８】
関連の局面において、本発明は、プローブが、ストリンジェントなハイブリダイゼーションアッセイ条件下でＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ核酸に優先的にハイブリダイズする能力によって、非Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ核酸からＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ核酸を識別し得るハイブリダイゼーションアッセイプローブを記載する。詳細には、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍプローブは、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ生物体由来の核酸に存在する標的配列に実質的に相補的である塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含む。Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍプローブが、ストリンジェントなハイブリダイゼーションアッセイ条件下でＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ種に属する少なくとも１つの株の存在を検出し得るという条件では、本発明のＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍプローブは、試験サンプル中に存在し得、そしてなおＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍプローブとして特徴づけされるＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ種の全てのメンバーは検出できない。
【０１２９】
ハイブリダイゼーションアッセイの場合、標的核酸配列の長さ、従ってプローブ配列の長さは、重要であり得る。ある場合には、いくつかの配列は、所望のハイブリダイゼーション特徴を有するプローブを生じる、位置および長さの異なる特定の領域に由来し得る。他の場合には、１つの配列は、単に１塩基だけ異なる別の配列よりも良好なハイブリダイゼーション特徴を有し得る。完全に相補的でない核酸がハイブリダイズすることは可能であるが、完全に相同な塩基配列の最長のストレッチが、正常にはハイブリッド安定性を主に決定する。異なる長さおよび塩基組成のプローブが用いられ得るが、本発明において好ましいプローブは、１００塩基長まで、より好ましくは１２〜５０塩基長、そしてなおより好ましくは１８〜３５塩基長のオリゴヌクレオチドを有する。
【０１３０】
ハイブリダイゼーションアッセイプローブは、１８ＳリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、またはそのコードＤＮＡ（ｒＤＮＡ）に実質的に相補的な塩基配列（ＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍまたはＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍの標的配列）を含む。従って、このプローブは、ストリンジェントなハイブリダイゼーションアッセイ条件下でＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍまたはＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ生物体由来の標的配列に安定にハイブリダイズし得る。このハイブリダイゼーションアッセイプローブはまた、標的された核酸領域の外側のさらなる塩基を有し得る。この塩基は、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ由来核酸またはＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ由来核酸に相補的であってもなくてもよいが、試験サンプル中に存在し得る非標的生物体由来の核酸には相補的でない。
【０１３１】
本発明のプローブ（およびプライマー）はまた、固体支持体に連結されている固定されたオリゴヌクレオチドに存在する実質的に相補的な塩基配列に対して、事前に決定したハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし得る塩基配列（標的配列に対してハイブリダイズするように意図された塩基配列とは異なる）から構成される捕獲テール（ｃａｐｔｕｒｅ ｔａｉｌ）を含むように設計され得る。この固定されたオリゴヌクレオチドは好ましくは、磁気的に荷電された粒子に連結され、この粒子は、標的核酸に対してプローブがハイブリダイズするのに十分な時間の経過後、精製工程の間に反応容器中で単離され得る。このような精製工程を実施するために用いられ得る装置の例は、Ａｃｏｓｔａら、「Ａｓｓａｙ Ｗｏｒｋ Ｓｔａｔｉｏｎ」米国特許第６，２５４，８２６号によって開示されている。このプローブは好ましくは、プローブ：標的ハイブリッドの融点がプローブ：固定オリゴヌクレオチドハイブリッドの融点よりも大きいように設計される。この方法では、ハイブリダイゼーションアッセイ条件の異なるセットを使用して、固定されたオリゴヌクレオチドへのプローブのハイブリダイゼーションの前に、標的核酸へのプローブのハイブリダイゼーションを容易にし得、これによって遊離のプローブの濃度を最大化し、そして好ましい液体相のハイブリダイゼーション動態を提供する。この「２工程（ｔｗｏ−ｓｔｅｐ）」標的捕獲方法は、Ｗｅｉｓｂｕｒｇら「Ｔｗｏ Ｓｔｅｐ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃａｐｔｕｒｅ ｏｆ ａ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ」、米国特許第６，１１０，６７８号によって開示されている。本発明に容易に適合可能である他の標的捕獲スキームは、当該分野で周知であり、そして例えば、Ｒａｎｋｉら「Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ｂｙ ａ Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ Ｓａｎｄｗｉｃｈ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｔｅｓｔ」、米国特許第４，４８６，５３９号、およびＳｔａｂｉｎｓｋｙ「Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｋｉｔｓ ｆｏｒ Ｐｅｒｆｏｒｍｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙｓ」米国特許第４，７５１，１７７号によって開示されたスキームを含む。
【０１３２】
Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍプローブについて、用語「標的核酸配列」、「標的ヌクレオチド配列」、「標的配列」、および「標的領域」とは、全てＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍのｒＲＮＡもしくはｒＤＮＡ、またはそれに相補的な配列に存在する核酸配列であって、非Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ種に密接に関連する核酸には存在しない核酸配列をいう。Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍプローブについて、用語「標的核酸配列」、「標的ヌクレオチド配列」、「標的配列」、および「標的領域」とは全て、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍのｒＲＮＡもしくはｒＤＮＡ、またはそれに相補的な配列に存在する核酸配列であって、非Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ種に密接に関連する核酸には存在しない核酸配列をいう。標的配列に相補的なヌクレオチド配列を有する核酸は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、または転写媒介増幅（ＴＭＡ）のような標的増幅技術によって生成され得る。（ＴＭＡは、例えば、Ｋａｃｉａｎら、米国特許第５，３９９，４９１号、およびＫａｃｉａｎら、「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ」、米国特許第５，４８０，７８４号によって開示されている）。
【０１３３】
Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ含有試験サンプルに存在することが期待され得る生物体としては、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒａ ｃａｙｅｔａｎｅｎｓｉｓ、Ｓａｒｃｏｃｙｓｔｉｓ ｈｏｍｉｎｉｓ、Ｅｎｔａｍｏｅｂａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ、およびＥｉｍｅｒｉａ ｐｒａｅｃｏｘが挙げられる。この生物体のリストは、本発明のＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍプローブを用いて識別され得る生物体の完全な代表であることを意図するものでは決してない。概して、本発明のＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍプローブを用いて、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でプローブと安定にハイブリダイズしない任意の非Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ核酸からＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ核酸を識別し得る。
【０１３４】
Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍに密接に関連した生物体としては、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｍｕｒｉｓ、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｂａｉｌｅｙｉ、およびＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｗｒａｉｒｉが挙げられるが、このリストは、本発明のＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍプローブを用いて識別され得る生物体の完全な代表であることを意図するものでは決してない。概して、本発明のＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍプローブを用いて、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でプローブと安定にハイブリダイズしない任意の非Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ核酸からＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ核酸を識別し得る。
【０１３５】
本発明のＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍプローブは、好ましくは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、または配列番号４の塩基配列を有するか、またはその塩基配列に実質的に相当するオリゴヌクレオチドを含む。配列番号１または配列番号２の塩基配列を有するか、またはその塩基配列に実質的に相当するオリゴヌクレオチドを含むＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍプローブは、好ましくは、配列番号１または配列番号２のヌクレオチド１１と１２（５’から３’側に読む）との間に配置された非ヌクレオチドリンカーによってプローブに連結されたアクリジニウムエステル標識を含む。そして配列番号３または配列番号４の塩基配列を有するか、またはその塩基配列に実質的に相当するオリゴヌクレオチドを含むＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍプローブは好ましくは、配列番号３または配列番号４のヌクレオチド１１と１２（５’から３’側に読む）との間に配置された非ヌクレオチドリンカーによってプローブに連結されたアクリジニウムエステル標識を含む。プローブに対するこのアクリジニウムエステル標識の連結は、米国特許第５，１８５，４３９号、および米国特許第６，０３１，０９１号におけるＡｒｎｏｌｄらの教示に従って実行され得る。
【０１３６】
本発明のＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍプローブは好ましくは、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、または配列番号２０の塩基配列を有するか、またはその塩基配列に実質的に相当するオリゴヌクレオチドを含む。好ましいＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍプローブの１グループは、配列番号５、配列番号９、配列番号１３、または配列番号１７の塩基配列を有するか、またはその塩基配列に実質的に相当するオリゴヌクレオチドを含み、そして好ましくは、配列番号５または配列番号９のヌクレオチド１８と１９（５’側から３’側に読む）との間、ならびに配列番号１３または配列番号１７のヌクレオチド９と１０（５’側から３’側に読む）との間に配置された非ヌクレオチドリンカーによってプローブに連結されたアクリジニウムエステル標識を含む。別のグループの好ましいＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍプローブは、配列番号６、配列番号１０、配列番号１４、または配列番号１８の塩基配列を有するか、またはその塩基配列に実質的に相当するオリゴヌクレオチドを含み、そして好ましくは、配列番号６または配列番号１０のヌクレオチド１１と１２（５’側から３’側に読む）との間、ならびに配列番号１４または配列番号１８のヌクレオチド９と１０（５’側から３’側に読む）との間に配置された非ヌクレオチドリンカーによってプローブに連結されたアクリジニウムエステル標識を含む。好ましいＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍプローブのさらなるグループは、配列番号７、配列番号１１、配列番号１５、または配列番号１９の塩基配列を有するか、またはその塩基配列に実質的に相当するオリゴヌクレオチドを含み、そして好ましくは、配列番号７または配列番号１１のヌクレオチド１３と１４（５’側から３’側に読む）との間、ならびに配列番号１５または配列番号１９のヌクレオチド１２と１３（５’側から３’側に読む）との間に配置された非ヌクレオチドリンカーによってプローブに連結されたアクリジニウムエステル標識を含む。好ましいＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍプローブの最後のグループは、配列番号８、配列番号１２、配列番号１６、または配列番号２０の塩基配列を有するか、またはその塩基配列に実質的に相当するオリゴヌクレオチドを含み、そして好ましくは、配列番号８または配列番号１２のヌクレオチド１６と１７（５’側から３’側に読む）との間、ならびに配列番号１６または配列番号２０のヌクレオチド９と１０（５’側から３’側に読む）との間に配置された非ヌクレオチドリンカーによってプローブに連結されたアクリジニウムエステル標識を含む。プローブに対するこのアクリジニウムエステル標識の連結は、米国特許第５，１８５，４３９号、および米国特許第６，０３１，０９１号におけるＡｒｎｏｌｄらの教示に従って実行され得る。
【０１３７】
従って、本発明の１つの局面において、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ生物体が試験サンプルに存在するか否かを決定するために有用であるＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍハイブリダイゼーションアッセイプローブが、提供される。このプローブは、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ生物体由来の標的核酸に存在する標的核酸配列に存在する少なくとも１０連続する塩基領域に少なくとも８０％相補的である、少なくとも１０連続する塩基領域を含む１００塩基長までのオリゴヌクレオチドを含む。この標的配列は好ましくは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、または配列番号４の塩基配列を有し、そしてこのプローブは、ストリンジェントな条件下で、試験サンプルに存在する非Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ生物体由来の核酸よりも標的核酸に対して、優先的にハイブリダイズする。
【０１３８】
あるいは、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍプローブは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、または配列番号４の塩基配列に存在する少なくとも１０連続する塩基領域に少なくとも８０％相同である少なくとも１０連続する塩基領域を含む１００塩基長までのオリゴヌクレオチドを含む。このプローブは、試験サンプルに存在する非Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ生物体由来の核酸よりも標的核酸に対してストリンジェントな条件下で優先的にハイブリダイズする。
【０１３９】
本発明の別の局面において、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ生物体が試験サンプルに存在するか否かを決定するために有用であるＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍハイブリダイゼーションアッセイプローブが、提供される。このプローブは、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ生物体由来の標的核酸に存在する標的核酸配列に存在する少なくとも１０連続する塩基領域に少なくとも８０％相補的である、少なくとも１０連続する塩基領域を含む１００塩基長までのオリゴヌクレオチドを含む。この標的配列は好ましくは、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、または配列番号２０の塩基配列を有し、そしてこのプローブは、ストリンジェントな条件下で、試験サンプルに存在する非Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ生物体由来の核酸よりも標的核酸に対して、優先的にハイブリダイズする。
【０１４０】
あるいは、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍプローブは、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、または配列番号２０の塩基配列に存在する少なくとも１０連続する塩基領域に少なくとも８０％相同である少なくとも１０連続する塩基領域を含む１００塩基長までのオリゴヌクレオチドを含む。このプローブは、ストリンジェントな条件下で、試験サンプルに存在する非Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ生物体由来の核酸よりも標的核酸に対して優先的にハイブリダイズする。
【０１４１】
一旦合成されれば、このプローブは、任意の周知の方法によって検出可能な標識またはレポーター基で標識され得る（例えば、ＳＡＭＢＲＯＯＫら、前出、第１０章を参照のこと）。このプローブは、標的配列の検出を容易にする検出可能部分（例えば、放射性同位体、抗原、または化学発光部分）で標識され得る。有用な標識としては、放射性同位体、および非放射性レポーター基が挙げられる。同位体標識としては、３Ｈ、３５Ｓ、３２Ｐ、１２５Ｉ、５７Ｃｏ、および１４Ｃ、が挙げられる。同位体標識は、ニックトランスレーション、エンドラベリング（末端標識化）、第二鎖合成、逆転写などの当該分野で公知の技術によって、および化学的方法によってオリゴヌクレオチドに導入され得る。放射線標識したプローブを用いる場合、ハイブリダイゼーションは、オートラジオグラフィー、シンチレーション計測、またはγ計測のような技術によって検出され得る。この検出方法の選択は、標識化のために用いられる特定の放射性同位体に依存する。
【０１４２】
非同位体物質はまた、標識化のために用いられ得、そしてヌクレオチドの間に、またはオリゴヌクレオチドの末端に内部導入され得る。改変されたヌクレオチドは、酵素的にまたは化学的に組み込まれ得る。オリゴヌクレオチドの化学的改変は、当該分野で公知の技術を用いてオリゴヌクレオチドの合成中にまたは合成後に実施され得る。例えば、米国特許第６，０３１，０９１号においてＡｒｎｏｌｄらによって開示された非ヌクレオチドリンカー基の使用による。非同位体の標識としては、蛍光分子、化学発光分子、蛍光化学発光分子、リン光分子、電気化学発光分子、発光団、酵素、酵素補因子、酵素基質、色素およびハプテンまたは他のリガンドが挙げられる。別の有用な標識技術は、ストリンジェントな条件下で標的核酸に安定にハイブリダイズ不能な塩基配列である。本発明のプローブは好ましくは、アクリジニウムエステルで標識される。（アクリジニウムエステル標識化は、米国特許第５，１８５，４３９号においてＡｒｎｏｌｄらによって開示されている）。
【０１４３】
選択されたハイブリダイゼーションアッセイプローブは、次いで、ＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍまたはＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ生物を含むと思われる試験サンプルと接触し得る。一般的に、試験サンプルは、公知でない生物も含む供給源由来である。プローブを試験サンプルと接触させた後、この試験サンプルは、試験サンプル中の他の生物由来の核酸の存在下で、この試験サンプル中に存在し得るＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍまたはｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ生物由来の標的核酸分子にプローブを、優先的にハイブリダイゼーションすることを可能にする条件下でインキュベートされ得る。
【０１４４】
このプローブはまた、１つ以上の標識されていないヘルパープローブと組み合わされて、ＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍまたはＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ生物由来の標的核酸への結合を容易にし得る。プローブが、試験サンプル中に存在する標的核酸にハイブリダイズした後、得られるハイブリッドは、当該分野で周知の種々の技術（例えば、ヒドロキシアパタイト吸着および放射性モニタリング）によって分離されそして検出され得る。他の技術としては、ハイブリダイズされていないプローブに関連するレベルを選択的に下げて、次いで、ハイブリダイズされたプローブに関連するレベルの残存する量を測定する技術とを含み、これは、米国特許第５、２８３、１７４号に開示される。本願発明者らは、特に、この後者の技術を好む。
【０１４５】
（Ｅ． Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍの検出において使用されるヘルパープローブ）
本発明の別の実施形態は、新規なヘルパープローブに関する。上述のように、ヘルパープローブが使用され、ハイブリダイゼーションアッセイプローブがそれらの意図した標的核酸にハイブリダイゼーションするのを容易にし得、その結果、ハイブリダイゼーションアッセイプローブは、ヘルパープローブが存在しない状態よりもさらに容易にプローブ：標的核酸二重鎖を形成する（ヘルパープローブは、Ｈｏｇａｎら、「Ｍｅａｎｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｅｎｈａｎｃｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」、米国特許第５、０３０、５５７号によって開示されている）。各々のヘルパープローブは、標的核酸配列に十分に相補的であり、ヘルパープローブ：標的核酸二重鎖をストリンジェントなハイブリダイゼーションアッセイ条件下で形成するオリゴヌクレオチドを含む。得られたヘルパープローブを使用するストリンジェントなハイブリダイゼーションアッセイ条件は、関連するハイブリダイゼーションアッセイプローブが標的核酸に優先的にハイブリダイズするために使用される条件によって決定される。
【０１４６】
一本鎖ＲＮＡおよびＤＮＡの領域は、ストリンジェントなハイブリダイゼーションアッセイ条件下でさえ、二次構造および三次構造に関与される。このような構造は、ハイブリダイゼーションアッセイプローブの標的核酸に対するハイブリダイゼーションを立体的に阻害し得るかブロックし得る。ヘルパープローブの標的核酸に対するハイブリダイゼーションは、標的核酸の二次構造および三次構造を変化させ、それによって標的領域がハイブリダイゼーションアッセイプローブによってより接近可能になるようにさせる。その結果、ハイブリダイゼーションアッセイプローブ：標的核酸二重鎖の動態および／または融点が高められる。ヘルパープローブは、一般的に、ハイブリダイゼーションアッセイプローブの標的領域付近に配置される核酸配列に対してハイブリダイズするように選択される。
【０１４７】
本発明のＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍハイブリダイゼーションアッセイプローブで使用され得るヘルパープローブは、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ由来の核酸内の核酸配列に対して標的化される。同様に、本発明のＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍハイブリダイゼーションアッセイプローブで使用され得るヘルパープローブは、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ由来の核酸内の核酸配列に対して標的化される。各々のヘルパープローブは、標的核酸中に存在する塩基領域を標的するオリゴヌクレオチドを含む。好ましくは、ヘルパープローブは、適切な場合、ＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍまたはＣｆｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ生物由来の標的核酸中に存在する標的核酸配列中に存在する少なくとも１０連続する塩基領域と少なくとも８０％相補性を有する少なくとも１０連続する塩基領域を含む。ヘルパープローブおよびそれらの関連するハイブリダイゼーションアッセイプローブは、同じ標的核酸内に含まれる異なる標的核酸配列を有する。本発明のヘルパープローブは、好ましくは、１００塩基長まで、さらに好ましくは、１２〜５０塩基長、なおさらに好ましくは、１８〜３５塩基長のオリゴヌクレオチドである。あるいは、ヘルパープローブは、それらの標的領域と少なくとも９０％相補性であるか、または完全に相補性でさえあり得る。
【０１４８】
本発明において有用であり得るＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍヘルパープローブの例は、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７または配列番号２８の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはそれらの塩基配列に実質的に対応するオリゴヌクレオチドを含むプローブである。
【０１４９】
本発明において有用であり得るＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍヘルパープローブの例は、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３または配列番号４４の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはそれらの塩基配列に実質的に対応するオリゴヌクレオチドを含むプローブである。１００ｐｍｏｌのプローブおよび０．１ｆｍｏｌ〜１００ｆｍｏｌの量の範囲の標的核酸を含む２００μｌのサンプル溶液が提供される場合、本願発明者らは、配列番号３８（２０ｐｍｏｌ）および配列番号３９（２０ｐｍｏｌ）のヌクレオチド塩基配列からなるヘルパープローブを発見したが、プローブの標的に対するハイブリダイゼーションを容易にするとは考えられず、これらのヘルパープローブの濃度の最適化は、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ １８Ｓ ｒＲＮＡ標的核酸中に含まれる相補性配列に対する配列番号１３または配列番号１７のヌクレオチド塩基配列からなるハイブリダイゼーションアッセイプローブの改良されたハイブリダイゼーションを生じ得るとなお考えられる。
【０１５０】
ヘルパープローブが、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍハイブリダイゼーションアッセイプローブと組み合わせて使用される場合、好ましいハイブリダイゼーションアッセイプローブは、配列番号１、配列番号２、配列番号３または配列番号４の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはそれらの塩基配列に実質的に対応するオリゴヌクレオチドを含み、そして好ましいヘルパープローブは、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７または配列番号２８の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはそれらの塩基配列に実質的に対応するオリゴヌクレオチドを含む。
【０１５１】
この組み合わせの１つの好ましい実施形態において、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍハイブリダイゼーションアッセイプローブは、配列番号１、配列番号２、配列番号３または配列番号４の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはそれらの塩基配列に実質的に対応するオリゴヌクレオチドを含み、そしてヘルパープローブは、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５または配列番号２７の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはそれらの塩基配列に実質的に対応するオリゴヌクレオチドを含む。
【０１５２】
この組み合わせのさらに好ましい実施形態において、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍハイブリダイゼーションアッセイプローブは、配列番号１、配列番号２、配列番号３または配列番号４の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはそれらの塩基配列に実質的に対応するオリゴヌクレオチドを含み、そしてヘルパープローブは、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６または配列番号２８の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはそれらの塩基配列に実質的に対応するオリゴヌクレオチドを含む。
【０１５３】
別の好ましい組み合わせは、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍハイブリダイゼーションアッセイプローブが、配列番号１、配列番号２、配列番号３または配列番号４の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはそれらの塩基配列に実質的に対応するオリゴヌクレオチドを含む場合、少なくとも２つのヘルパープローブを含む。この組み合わせにおいて、第１のヘルパープローブは好ましくは、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５または配列番号２７の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはそれらの塩基配列に実質的に対応するオリゴヌクレオチドを含み、そして第２のヘルパープローブは、好ましくは、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６または配列番号２８の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはそれらの塩基配列に実質的に対応するオリゴヌクレオチドを含む。
【０１５４】
ヘルパープローブが、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍハイブリダイゼーションアッセイプローブと組み合わせて使用される場合、以下の組み合わせが好ましい。ハイブリダイゼーションアッセイプローブが、配列番号５、配列番号６、配列番号９、配列番号１０、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１７または配列番号１８の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはそれらの塩基配列に実質的に対応するオリゴヌクレオチドを含む場合、ヘルパープローブは、好ましくは、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３または配列番号４４の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはそれらの塩基配列に実質的に対応するオリゴヌクレオチドを含む。
【０１５５】
この組み合わせの１つの実施形態において、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍハイブリダイゼーションアッセイプローブは、配列番号５、配列番号６、配列番号９、配列番号１０、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１７または配列番号１８の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはそれらの塩基配列に実質的に対応するオリゴヌクレオチドを含み、そしてヘルパープローブは、配列番号２９、配列番号３３、配列番号３７または配列番号４１の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはそれらの塩基配列に実質的に対応するオリゴヌクレオチドを含む。
【０１５６】
この組み合わせのさらなる実施形態において、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍハイブリダイゼーションアッセイプローブは、配列番号５、配列番号６、配列番号９、配列番号１０、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１７または配列番号１８の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはそれらの塩基配列に実質的に対応するオリゴヌクレオチドを含み、そしてヘルパープローブは、配列番号３０、配列番号３４、配列番号３８または配列番号４２の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはそれらの塩基配列に実質的に対応するオリゴヌクレオチドを含む。
【０１５７】
この組み合わせの別の実施形態において、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍハイブリダイゼーションアッセイプローブは、配列番号５、配列番号６、配列番号９、配列番号１０、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１７または配列番号１８の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはそれらの塩基配列に実質的に対応するオリゴヌクレオチドを含み、そしてヘルパープローブは、配列番号３１、配列番号３５、配列番号３９または配列番号４３の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはそれらの塩基配列に実質的に対応するオリゴヌクレオチドを含む。
【０１５８】
この組み合わせのなおさらなる実施形態において、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍハイブリダイゼーションアッセイプローブは、配列番号５、配列番号６、配列番号９、配列番号１０、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１７または配列番号１８の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはそれらの塩基配列に実質的に対応するオリゴヌクレオチドを含み、そしてヘルパープローブは、配列番号３２、配列番号３６、配列番号４０または配列番号４４の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはそれらの塩基配列に実質的に対応するオリゴヌクレオチドを含む。
【０１５９】
別の好ましい組み合わせは、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍハイブリダイゼーションアッセイプローブが、配列番号５、配列番号６、配列番号９、配列番号１０、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１７または配列番号１８の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはそれらの塩基配列に実質的に対応するオリゴヌクレオチドを含む場合、少なくとも２つのヘルパープローブを含む。この組み合わせにおいて、第１のヘルパープローブは、好ましくは、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３７、配列番号３８、配列番号４１または配列番号４２の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはそれらの塩基配列に実質的に対応する塩基配列を含み、そして第２のヘルパープローブは、好ましくは、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４３または配列番号４４の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはそれらの塩基配列に実質的に対応するオリゴヌクレオチドを含む。
【０１６０】
この組み合わせの１つの実施形態において、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍハイブリダイゼーションアッセイプローブは、配列番号５、配列番号６、配列番号９、配列番号１０、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１７または配列番号１８の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはそれらの塩基配列に実質的に対応するオリゴヌクレオチドを含む。第１のヘルパープローブは、配列番号２９、配列番号３３、配列番号３７または配列番号４１の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはそれらの塩基配列に実質的に対応するオリゴヌクレオチドを含み、そして第２のヘルパープローブは、配列番号３１、配列番号３５、配列番号３９または配列番号４３の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはそれらの塩基配列に実質的に対応するオリゴヌクレオチドを含む。
【０１６１】
この組み合わせのさらなる実施形態において、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍハイブリダイゼーションアッセイプローブは、配列番号５、配列番号６、配列番号９、配列番号１０、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１７または配列番号１８の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはそれらの塩基配列に実質的に対応するオリゴヌクレオチドを含む。第１のヘルパープローブは、配列番号２９、配列番号３３、配列番号３７または配列番号４１の塩基配列を有するかまたはそれらの塩基配列に実質的に対応するオリゴヌクレオチドを含み、そして第２のヘルパープローブは、配列番号３２、配列番号３６、配列番号４０または配列番号４４の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはそれらの塩基配列に対応するオリゴヌクレオチドを含む。
【０１６２】
この組み合わせの別の実施形態において、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍハイブリダイゼーションアッセイプローブは、配列番号５、配列番号６、配列番号９、配列番号１０、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１７または配列番号１８の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはそれらの塩基配列に実質的に対応するオリゴヌクレオチドを含む。第１のヘルパープローブは、配列番号３０、配列番号３４、配列番号３８または配列番号４２の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはそれらの塩基配列に実質的に対応するオリゴヌクレオチドを含み、そして第２のヘルパープローブは、配列番号３１、配列番号３５、配列番号３９または配列番号４３の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはそれらの塩基配列に実質的に対応するオリゴヌクレオチドを含む。
【０１６３】
この組み合わせのなおさらなる実施形態において、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍハイブリダイゼーションアッセイプローブは、配列番号５、配列番号６、配列番号９、配列番号１０、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１７または配列番号１８の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはそれらの塩基配列に実質的に対応するオリゴヌクレオチドを含む。第１のヘルパープローブは、配列番号３０、配列番号３４、配列番号３８または配列番号４２の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはそれらの塩基配列に実質的に対応するオリゴヌクレオチドを含み、そして第２のヘルパープローブは、配列番号３２、配列番号３６、配列番号４０または配列番号４４の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはそれらの塩基配列に実質的に対応するオリゴヌクレオチドを含む。
【０１６４】
なお別の好ましい組み合わせにおいて、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍハイブリダイゼーションアッセイプローブは、配列番号７、配列番号１１、配列番号１５または配列番号１９の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはそれらの塩基配列に実質的に対応するオリゴヌクレオチドを含み、そして上記のヘルパープローブは、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３７、配列番号３８、配列番号４１または配列番号４２の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはそれらの塩基配列に実質的に対応するオリゴヌクレオチドを含む。
【０１６５】
この組み合わせの１つの実施形態において、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍハイブリダイゼーションアッセイプローブは、配列番号７、配列番号１１、配列番号１５または配列番号１９の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはそれらの塩基配列に実質的に対応するオリゴヌクレオチドを含み、そしてヘルパープローブは、配列番号２９、配列番号３３、配列番号３７または配列番号４１の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはそれらの塩基配列に実質的に対応するオリゴヌクレオチドを含む。
【０１６６】
この組み合わせのさらなる実施形態において、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍハイブリダイゼーションアッセイプローブは、配列番号７、配列番号１１、配列番号１５または配列番号１９の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはそれらの塩基配列に実質的に対応するオリゴヌクレオチドを含み、そしてヘルパープローブは、配列番号３０、配列番号３４、配列番号３８または配列番号４２の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはそれらの塩基配列に実質的に対応するオリゴヌクレオチドを含む。
【０１６７】
（Ｆ． 核酸組成物）
別の関連する局面において、本発明は、ストリンジェントなハイブリダイゼーションアッセイ条件下で、ハイブリダイゼーションアッセイプローブと標的核酸との間に形成される核酸ハイブリッド（「プローブ：標的」）を含む組成物を特徴とする。プローブと標的核酸との間に形成されるハイブリッドの用途の１つは、試験サンプル中の標的生物の存在もしくは量、または生物のグループの指標を提供することである。例えば、核酸ハイブリッド中に存在するアクリジニウムエステル（ＡＥ）は、アルカリ溶液中の加水分解に耐性であり、一方、一本鎖核酸中に存在するＡＥは、アルカリ溶液中で加水分解を受ける（米国特許第５、２３８、１７４号を参照のこと）。従って、結合していないＡＥ標識されたプローブの加水分解の後に、核酸ハイブリッドに関連して残存するアクリジニウムエステルの化学発光を測定することによって、標的核酸の存在が検出され得る。
【０１６８】
本発明はまた、ストリンジェントなハイブリダイゼーションアッセイ条件下で、ヘルパープローブと標的核酸との間に形成される核酸ハイブリッド（「ヘルパープローブ：標的」）を含む組成物を意図する。ヘルパープローブと標的核酸との間に形成されるハイブリッドの１つの用途は、ハイブリダイゼーションのための特定の核酸配列を利用可能にすることである。例えば、ヘルパープローブと標的核酸との間に形成されるハイブリッドは、ハイブリダイゼーションアッセイプローブを用いるハイブリダイゼーションのために利用可能な核酸配列を付与し得る。ヘルパープローブの使用の完全な記述は、Ｈｏｇａｎら、米国特許第５，０３０，５５７号中に提供される。
【０１６９】
本発明はまた、増幅条件下、増幅プライマーと標的核酸との間に形成される核酸（「プライマー：標的」）を含む組成物を特徴とする。プライマーと標的核酸との間に形成されるハイブリッドの用途の１つは、増幅プライマーの３’末端で核酸ポリメラーゼのための開始部位を提供することである。例えば、ハイブリッドは、逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、ＴａｑポリメラーゼまたはＴ４ ＤＮＡポリメラーゼ）、およびＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ７ポリメラーゼ、ＳＰ６ポリメラーゼ、Ｔ３ポリメラーゼ）などのための開始部位を形成し得る。
【０１７０】
本発明の組成物は、試験サンプル中のＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍまたはＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ生物の存在または量を決定するための組成物を含み、この組成物は、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ生物由来の標的核酸と、以下のオリゴヌクレオチドとの間に形成される核酸ハイブリッドを含む：配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１；配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７または配列番号６８の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはそれらの塩基配列に実質的に対応するオリゴヌクレオチド。
【０１７１】
本発明はまた、試験サンプル中のＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ生物の存在または量を決定するための組成物を意図し、この組成物は、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ生物由来の標的核酸と、以下のオリゴヌクレオチドを含むハイブリダイゼーションアッセイプローブとの間に形成される核酸ハイブリッドを含む：配列番号１、配列番号２、配列番号３または配列番号４の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはそれらの塩基配列に実質的に対応するオリゴヌクレオチド。別の実施形態において、これらのプローブ：標的組成物は、さらに、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ由来の標的核酸にハイブリダイズするヘルパープローブを含み得、ここで、ヘルパープローブは、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７または配列番号２８の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドかまたはそれらの塩基配列に実質的に対応するオリゴヌクレオチドを含む。核酸ハイブリッド組成物のこの後者のグループを形成するための好ましいハイブリダイゼーションアッセイプローブおよびヘルパープローブの組み合わせは、「Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍの検出において使用されるヘルバープローブ」の表題のもとに上記されたプローブの混合の組み合わせである。
【０１７２】
本発明は、試験サンプル中のＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ生物の存在または量を決定するための組成物を意図し、この組成物は、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ生物由来の標的核酸と、以下のオリゴヌクレオチドを含むハイブリダイゼーションアッセイプローブとの間に形成される核酸ハイブリッドを含む：配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、または配列番号２０の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはそれらの塩基配列に実質的に対応するオリゴヌクレオチド。別の実施形態において、これらのプローブ：標的組成物は、さらに、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ由来の標的核酸に対してハイブリダイズするヘルパープローブを含み、ここで、ヘルパープローブは、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３または配列番号４４の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはそれらの塩基配列に実質的に対応するオリゴヌクレオチドを含む。核酸ハイブリッド組成物のこの後者のグループを形成するために好ましいハイブリダイゼーションアッセイプローブおよびヘルパープローブの組み合わせは、「Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍの検出において使用されるヘルバープローブ」の表題のもとに上記されたプローブの混合の組み合わせである。
【０１７３】
本発明はまた、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ生物に由来する標的核酸中に存在する標的配列を増幅するための組成物を意図し、この組成物は、その標的核酸と、オリゴヌクレオチドを含む増幅プライマーとの間に形成される、核酸ハイブリッドを含み、このオリゴヌクレオチドは、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、または配列番号６８の塩基配列を有するかもしくはその塩基配列に実質的に対応する。これらの核酸ハイブリッド組成物を形成するための好ましい増幅プライマーの組み合わせは、見出し「Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍリボソーム核酸の増幅」のもとで、上記された組み合わせである。
【０１７４】
（Ｇ．アッセイ方法）
本発明は、試験サンプルにおける、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ生物またはＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ生物に由来する核酸の存在または量についてアッセイするための種々の方法を意図する。使用される厳密なアッセイ条件、プローブ、および／またはプライマーが、使用される特定のアッセイ形式およびそのサンプルの供給源に依存して変化することを、当業者は理解する。
【０１７５】
本発明の１つの局面は、試験サンプルにおけるＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ生物の存在または量を決定するための方法に関し、この方法は、その試験サンプルを、ストリンジェントなハイブリダイゼーションアッセイ条件下でその試験サンプル中に存在する非Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ生物由来の核酸よりもＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ由来標的核酸に優先的にハイブリダイズすることができるハイブリダイゼーションアッセイプローブと、ストリンジェントなハイブリダイゼーションアッセイ条件下で接触させることによる。この方法において、その標的核酸は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、または配列番号４の塩基配列を有するかもしくはその塩基配列に実質的に対応する、塩基配列を含む。（その供給源に依存して、その試験サンプルは、この方法のプローブが区別し得る未知の生物を含み得る。）この方法における使用のために好ましいプローブは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、または配列番号４を有するかもしくはその塩基配列に実質的に対応する、オリゴヌクレオチドを含む。
【０１７６】
好ましい実施形態において、試験サンプルにおける、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ生物の存在または量を決定するための方法はまた、その試験サンプルを、そのプローブがその標的核酸にハイブリダイズすることを促進するための１つ以上のヘルパープローブと接触させる工程をも、包含し得る。このヘルパープローブは、そのハイブリダイゼーションアッセイプローブの添加の前または後に、そのサンプルに添加され得るが、そのヘルパープローブとハイブリダイゼーションアッセイプローブとは、好ましくはその試験サンプルに同時に提供される。この方法における使用のために好ましいヘルパープローブは、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、または配列番号２８の塩基配列を有するかもしくはその塩基配列に実質的に対応する、オリゴヌクレオチドを含む。この方法において使用され得るハイブリダイゼーションアッセイプローブとヘルパープローブとの特定の組み合わせは、見出し「Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍの検出において使用されるヘルパープローブ」のもとで、上記に示される。
【０１７７】
本発明の別の局面は、試験サンプルにおける、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ生物の存在または量を決定するための方法に関し、この方法は、その試験サンプルを、ストリンジェントなハイブリダイゼーションアッセイ条件下でその試験サンプル中に存在する非Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ生物由来の核酸よりもＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ由来標的核酸に優先的にハイブリダイズすることができるハイブリダイゼーションアッセイプローブと、ストリンジェントなハイブリダイゼーションアッセイ条件下で接触させることによる。この方法において、その標的核酸は、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、または配列番号２０の塩基配列を有するかもしくはその塩基配列に実質的に対応する、塩基配列を含む。（その供給源に依存して、その試験サンプルは、この方法のプローブが区別し得る未知の生物を含み得る。）この方法における使用のために好ましいプローブは、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、または配列番号２０の塩基配列を有するかもしくはその塩基配列に実質的に対応する、オリゴヌクレオチドを含む。
【０１７８】
好ましい実施形態において、試験サンプルにおける、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ生物の存在または量を決定するための方法はまた、その試験サンプルを、そのプローブがその標的核酸にハイブリダイズすることを促進するための１つ以上のヘルパープローブと接触させる工程をも、包含し得る。このヘルパープローブは、そのハイブリダイゼーションアッセイプローブの添加の前または後に、そのサンプルに添加され得るが、そのヘルパープローブとハイブリダイゼーションアッセイプローブとは、好ましくはその試験サンプルに同時に提供される。この方法における使用のために好ましいヘルパープローブは、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、または配列番号４４の塩基配列を有するかもしくはその塩基配列に実質的に対応する、オリゴヌクレオチドを含む。この方法において使用され得るハイブリダイゼーションアッセイプローブとヘルパープローブとの特定の組み合わせは、見出し「Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍの検出において使用されるヘルパープローブ」のもとで、上記に示される。
【０１７９】
本発明のなお別の局面は、試験サンプルにおけるＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ由来核酸を増幅するための方法に関し、この方法は、その試験サンプルを、１つ以上の増幅プライマーと増幅条件下で接触させる工程により、この１つ以上の増幅プライマーは、核酸ポリメラーゼと接触された場合、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、または配列番号６８の塩基配列を有する核酸領域に結合するかまたはこの核酸領域を介して伸長を生じる。この方法における使用のために好ましい増幅プライマーは、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、または配列番号６８の塩基配列を有するかもしくはその塩基配列に実質的に対応する、オリゴヌクレオチドを含み、この増幅プライマーは、ＲＮＡポリメラーゼにより認識される核酸配列、またはＲＮＡポリメラーゼによる開始もしくは伸長を増強する核酸配列を、必要に応じて含む。この方法において使用され得る増幅プライマーの特定の組み合わせは、見出し「Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍリボソーム核酸の増幅」のもとで、上記されている。
【０１８０】
好ましい実施形態において、試験サンプルにおけるＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ由来核酸を増幅するための方法は、その試験サンプルを、ストリンジェントなハイブリダイゼーションアッセイ条件下でその試験サンプル中に存在する非Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ生物由来の核酸よりも増幅したＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ標的核酸に優先的にハイブリダイズすることができるハイブリダイゼーションアッセイプローブと、ストリンジェントなハイブリダイゼーションアッセイ条件下で接触させる工程をさらに包含する。この試験サンプルは、一般的には増幅に十分な時間が過ぎた後で、そのハイブリダイゼーションアッセイプローブと接触されるが、この増幅プライマーとハイブリダイゼーションアッセイプローブとは、任意の順番でこのサンプルに添加され得、特に、このハイブリダイゼーションアッセイプローブが自己ハイブリダイズプローブ（例えば、上記で考察されたＭｏｌｌｅｃｕｌａｒ ＴｏｒｃｈまたはＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎ）である場合に、そのようにされ得る。試験サンプルをハイブリダイゼーションアッセイプローブと接触させるこの工程は、その試験サンプルにおけるＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ生物の存在または量が決定され得るように、実施される。この方法における使用のために好ましいプローブは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、または配列番号４の塩基配列を有するかもしくはその塩基配列に実質的に対応する、オリゴヌクレオチドを含む。このプローブは、その試験サンプルにおける検出を容易にする標識をさらに含み得る。
【０１８１】
１つの好ましい実施形態において、この方法は、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ由来核酸を増幅するための少なくとも２つの増幅プライマーの組を用いて実行され、その組は、配列番号４５、配列番号５１、配列番号５７、または配列番号６３の塩基配列を有するかもしくはその塩基配列に実質的に対応する、オリゴヌクレオチドを含む、第１の増幅プライマーと、配列番号４８、配列番号５４、配列番号６０、または配列番号６６の塩基配列を有するかもしくはその塩基配列に実質的に対応する、オリゴヌクレオチドを含む、第２の増幅プライマーと、を含む。その試験サンプルにおいて増幅したＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ核酸を特異的に検出するために使用されるハイブリゼーションアッセイプローブは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、または配列番号４の塩基配列を有するかもしくはその塩基配列に実質的に対応する、オリゴヌクレオチドを含む。
【０１８２】
別の好ましい実施形態において、この方法は、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ由来核酸を増幅するための少なくとも２つの増幅プライマーの組を用いて実行され、その組は、配列番号４６、配列番号５２、配列番号５８、または配列番号６４の塩基配列を有するかもしくはその塩基配列に実質的に対応する、オリゴヌクレオチドを含む、第１の増幅プライマーと、配列番号４８、配列番号５４、配列番号６０、または配列番号６６の塩基配列を有するかもしくはその塩基配列に実質的に対応する、オリゴヌクレオチドを含む、第２の増幅プライマーと、を含む。その試験サンプルにおいて増幅したＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ核酸を特異的に検出するために使用されるハイブリゼーションアッセイプローブは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、または配列番号４の塩基配列を有するかもしくはその塩基配列に実質的に対応する、オリゴヌクレオチドを含む。
【０１８３】
好ましい実施形態において、試験サンプルにおけるＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ由来核酸を増幅するための方法は、その試験サンプルを、ストリンジェントなハイブリダイゼーションアッセイ条件下でその試験サンプル中に存在する非Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ生物由来の核酸よりも増幅したＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ標的核酸に優先的にハイブリダイズすることができるハイブリダイゼーションアッセイプローブと、ストリンジェントなハイブリダイゼーションアッセイ条件下で接触させる工程をさらに包含する。この試験サンプルは、一般的には増幅に十分な時間が過ぎた後で、そのハイブリダイゼーションアッセイプローブと接触されるが、この増幅プライマーとハイブリダイゼーションアッセイプローブとは、任意の順番でこのサンプルに添加され得、特に、このハイブリダイゼーションアッセイプローブが自己ハイブリダイズプローブ（例えば、上記で考察されたＭｏｌｌｅｃｕｌａｒ ＴｏｒｃｈまたはＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎ）である場合に、そのようにされ得る。試験サンプルをハイブリダイゼーションアッセイプローブと接触させるこの工程は、その試験サンプルにおけるＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ生物の存在または量が決定され得るように、実施される。この方法における使用のために好ましいプローブは、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、または配列番号２０の塩基配列を有するかもしくはその塩基配列に実質的に対応する、オリゴヌクレオチドを含む。このプローブは、その試験サンプルにおける検出を容易にする標識をさらに含み得る。
【０１８４】
１つの好ましい実施形態において、この方法は、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ由来核酸を増幅するための少なくとも２つの増幅プライマーの組を用いて実行され、その組は、配列番号４５、配列番号５１、配列番号５７、または配列番号６３の塩基配列を有するかもしくはその塩基配列に実質的に対応する、オリゴヌクレオチドを含む、第１の増幅プライマーと、配列番号４７、配列番号５３、配列番号５９、または配列番号６５の塩基配列を有するかもしくはその塩基配列に実質的に対応する、オリゴヌクレオチドを含む、第２の増幅プライマーと、を含む。その試験サンプルにおいて増幅したＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ核酸を特異的に検出するために使用されるハイブリゼーションアッセイプローブは、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、または配列番号１９の塩基配列を有するかもしくはその塩基配列に実質的に対応する、オリゴヌクレオチドを含む。
【０１８５】
別の好ましい実施形態において、この方法は、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ由来核酸を増幅するための少なくとも２つの増幅プライマーの組を用いて実行され、その組は、配列番号４５、配列番号５１、配列番号５７、または配列番号６３の塩基配列を有するかもしくはその塩基配列に実質的に対応する、オリゴヌクレオチドを含む、第１の増幅プライマーと、配列番号４８、配列番号５４、配列番号６０、または配列番号６６の塩基配列を有するかもしくはその塩基配列に実質的に対応する、オリゴヌクレオチドを含む、第２の増幅プライマーと、を含む。その試験サンプルにおいて増幅したＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ核酸を特異的に検出するために使用されるハイブリゼーションアッセイプローブは、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、または配列番号１９の塩基配列を有するかもしくはその塩基配列に実質的に対応する、オリゴヌクレオチドを含む。
【０１８６】
なお別の好ましい実施形態において、この方法は、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ由来核酸を増幅するための少なくとも２つの増幅プライマーの組を用いて実行され、その組は、配列番号４６、配列番号５２、配列番号５８、または配列番号６４の塩基配列を有するかもしくはその塩基配列に実質的に対応する、オリゴヌクレオチドを含む、第１の増幅プライマーと、配列番号４７、配列番号５３、配列番号５９、または配列番号６５の塩基配列を有するかもしくはその塩基配列に実質的に対応する、オリゴヌクレオチドを含む、第２の増幅プライマーと、を含む。その試験サンプルにおいて増幅したＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ核酸を特異的に検出するために使用されるハイブリゼーションアッセイプローブは、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、または配列番号１９の塩基配列を有するかもしくはその塩基配列に実質的に対応する、オリゴヌクレオチドを含む。
【０１８７】
さらに別の好ましい実施形態において、この方法は、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ由来核酸を増幅するための少なくとも２つの増幅プライマーの組を用いて実行され、その組は、配列番号４６、配列番号５２、配列番号５８、または配列番号６４の塩基配列を有するかもしくはその塩基配列に実質的に対応する、オリゴヌクレオチドを含む、第１の増幅プライマーと、配列番号４８、配列番号５４、配列番号６０、または配列番号６６の塩基配列を有するかもしくはその塩基配列に実質的に対応する、オリゴヌクレオチドを含む、第２の増幅プライマーと、を含む。その試験サンプルにおいて増幅したＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ核酸を特異的に検出するために使用されるハイブリゼーションアッセイプローブは、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、または配列番号１９の塩基配列を有するかもしくはその塩基配列に実質的に対応する、オリゴヌクレオチドを含む。
【０１８８】
さらに好ましい実施形態において、この方法は、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ由来核酸を増幅するための少なくとも２つの増幅プライマーの組を用いて実行され、その組は、配列番号４９、配列番号５５、配列番号６１、または配列番号６７の塩基配列を有するかもしくはその塩基配列に実質的に対応する、オリゴヌクレオチドを含む、第１の増幅プライマーと、配列番号５０、配列番号５６、配列番号６２、または配列番号６８の塩基配列を有するかもしくはその塩基配列に実質的に対応する、オリゴヌクレオチドを含む、第２の増幅プライマーと、を含む。その試験サンプルにおいて増幅したＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ核酸を特異的に検出するために使用されるハイブリゼーションアッセイプローブは、配列番号８、配列番号１２、配列番号１６、または配列番号２０の塩基配列を有するかもしくはその塩基配列に実質的に対応する、オリゴヌクレオチドを含む。
【０１８９】
（Ｈ．診断系）
本発明はまた、キット形態の診断系を企図する。本発明の診断系は、キットを包含し得、このキットは、少なくとも１回のアッセイのために十分な量で、本発明の任意のハイブリダイゼーションアッセイプローブ、ヘルパープローブ、および／または増幅プライマーを、包装材料中に含む。代表的には、このキットはまた、試験サンプルにおけるＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ生物またはＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ生物の存在または量を決定するための増幅および／または検出アッセイにおいて、その包装されたプローブおよび／またはプライマーを使用するための指示を含み、この指示は、具体的な形態で記録されている（例えば、紙または電子媒体に含まれている）。
【０１９０】
この診断系の種々の成分は、種々の形態で提供され得る。例えば、必要な酵素、ヌクレオチド三リン酸、プローブ、および／またはプライマーが、凍結乾燥試薬として提供され得る。これらの凍結乾燥試薬は、再構成された場合に、それらが完全な混合物を形成し、そのアッセイにおいて使用できる状態であるその成分の各々が適切な比になるように、凍結乾燥前に前もって混合され得る。さらに、本発明の診断系は、このキットの凍結乾燥試薬を再構成するための再構成試薬を含み得る。Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ生物に由来する標的核酸を増幅するための好ましいキットにおいて、その酵素、ヌクレオチド三リン酸、およびその酵素に必要な補因子は、再構成された場合に、本増幅方法における使用のために適切な試薬を形成する単一凍結乾燥試薬として、提供される。これらのキットにおいて、凍結乾燥プライマー試薬もまた、提供され得る。他の好ましいキットにおいて、凍結乾燥プローブ試薬が、提供される。
【０１９１】
代表的包装試薬としては、本発明のハイブリダイゼーションアッセイプローブ、ヘルパープローブ、および／または増幅プライマーを、固定限界内に保つことができる、固体マトリックス（例えば、ガラス、プラスチック、紙、箔、微粒子など）が挙げられる。従って、例えば、この包装材料としては、ミリグラム未満（例えば、ピコグラムまたはナノグラム）量の意図されるプローブもしくはプライマーを含むために使用される、ガラスバイアルが挙げられ得るか、またはこの包装材料は、本発明のプローブもしくはプライマーが作動可能に固定されている（すなわち、本発明の増幅および／または検出方法に関与できるように連結されている）、マイクロタイタープレートウェルであり得る。
【０１９２】
その指示は、代表的には、試薬および／または試薬濃度、ならびに少なくとも１つのアッセイ方法パラメータ（例えば、サンプル量あたりの使用する試薬の相対量であり得る）を示す。さらに、維持、時間、温度および緩衝液の条件のような詳細もまた、含まれ得る。
【０１９３】
本発明の診断系は、試験サンプルにおけるＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ生物またはＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ生物の存在または量を増幅および／または決定することにおいて使用するためのキットを意図し、このキットは、本明細書中に記載される任意のハイブリダイゼーションアッセイプローブ、ヘルパープローブおよび／または増幅プライマーを有し、これらの成分は、それらが個々に提供されるか、または上記の好ましい組み合わせのうちの１つの状態で提供されるかに関わらない。
【０１９４】
（１．実施例）
実施例が、本発明の異なる局面および実施形態を例示するために、以下に提供される。これらの実施例が、本明細書中に記載される特定の実施形態に本発明を限定することは意図されないことを、当業者は認識する。
【０１９５】
（Ａ．Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ核酸の単離および精製）
ＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍリボゾームＲＮＡを得るために、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ微小遠心機（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．；Ｃａｔ．Ｎｏ．２２ ６２ １２０−３）を使用して、サンプルを、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ １．５ｍｌマイクロ試験チューブ（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．、Ｗｅｓｔｂｕｒｙ、ＮＹ；Ｃａｔ．Ｎｏ．２２ ６０ ００２ ８）にて７，０００ｒｐｍで５分間遠心分離することによって、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍオーシストをそのサンプルからまず単離する。その後、その上清を吸引除去し、そして残りのペレットを、Ａｍｉｂｉｏｎ’ｓ ＲＮＡａｑｕｅｏｕｓＴＭキット（Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．，Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ；Ｃａｔ．Ｎｏ．ＡＭ−１９１２）に備わる溶解／結合緩衝液２００μｌ中に再懸濁する。
【０１９６】
約１．０ｍｍのジルコニア／シリカビーズ（ＢｉｏＳｐｅｃ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｂａｒｔｌｅｓｖｉｌｅ，ＯＫ；Ｃａｔ．Ｎｏ．１１０７９１１０Ｚ）を、２．０ｍｌ遠心分離バイアル（ＢｉｏＳｐｅｃ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ．；Ｃａｔ．Ｎｏ．１０８３２）に添加し、このバイアルを約４分の３（１．５ｍｌ）満たす。その後、５００μｌのジエチルピロカルボネート（ＤＥＰＣ）処理水（Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．；Ｃａｔ．Ｎｏ．９９２２）をこのバイアルに添加し、そしてこのバイアルを密封し、そして手で数回反転させ、その後、そのバイアルからＤＥＰＣ処理水を吸引する。
【０１９７】
再懸濁したペレットをそのマイクロ試験チューブから取り出し、そしてビーズ含有バイアルに添加する。さらなる溶解／結合緩衝液を、そのバイアルを完全に満たすように添加し、その後、そのバイアルを再度密封し、そしてＢｅａｄＢｅａｔｅｒＴＭ（ＢｉｏＳｐｅｃ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ．；Ｃａｔ．Ｎｏ．３１１０ＢＸ）中に配置し、このＢｅａｄＢｅａｔｅｒＴＭを５，０００ｒｐｍにて２分間作動させる。このバイアルをこのＢｅａｄＢｅａｔｅｒＴＭから取り出し、そして氷上に４分間配置し、その後、このＢｅａｄＢｅａｔｅｒＴＭ中で、５，０００ｒｐｍにて２分間の２回目の作動に供す。このバイアルを、再び氷上に４分間配置する。
【０１９８】
その上清をこのバイアルからピペットで取り出し、それによって上清をビーズから分離させ、そしてその上清を新たな２ｍｌ遠心分離バイアル（ＢｉｏＳｐｅｃ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ．；Ｃａｔ．Ｎｏ．１０８３２）に添加する。また、このバイアルに、上記ＲＮＡａｑｕｅｏｕｓＴＭキットに備わるエタノール（６４％）をその上清と等量添加し、その後、このバイアルを密封し、そして手で数回反転させて、その上清とエタノールとの完全な混合を確実にする。その後、この混合物を、上記ＲＮＡａｑｕｅｏｕｓＴＭキットに備わる収集チューブのフィルターカートリッジに６００μｌアリコートで添加する。その後、その収集チューブを、上記Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ遠心機中で１３，０００ｒｐｍにて３０秒間遠心分離し、溶出物を吸引除去し、そして上記ＲＮＡａｑｕｅｏｕｓＴＭキットからＷａｓｈ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｉを７００μｌ、各フィルターカートリッジに添加する。その収集チューブを、１３，０００ｒｐｍにて３０秒間もう１度遠心分離し、その溶出物を除去し、そして上記ＲＮＡａｑｕｅｏｕｓＴＭキットからＷａｓｈ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ ２／３を５００μｌ、そのフィルターカートリッジに添加する。この最後の遠心分離とＷａｓｈ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ ２／３での処理とを反復して、エタノールの除去を確実にする。その後、その収集チューブを１３，０００ｒｐｍにて３０秒間遠心分離し、そしてその溶出物を除去し、その後、その収集チューブを１３，０００ｒｐｍにて２分間遠心分離する。
【０１９９】
その後、そのフィルターカートリッジを、上記ＲＮＡａｑｕｅｏｕｓＴＭキットに備わる別の収集チューブの組に配置し、上記ＲＮＡａｑｕｅｏｕｓＴＭキットに備わる溶出溶液（９５℃に予め加熱した）を５０μｌ、これらの新たな収集チューブに添加する。この収集チューブを、上記遠心機中で１３，０００ｒｐｍにて１分間遠心分離し、その後、別の上記予め加熱した溶出溶液５０μｌを、この収集チューブに添加する。１３，０００ｒｐｍにて１分間、最後の遠心分離を実施する。そしてこれらの最後の２つの遠心分離からの溶出物は、精製ＲＮＡを含む。
【０２００】
（Ｂ．ハイブリダイゼーションアッセイプローブ）
ＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍまたはＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ由来の核酸に特異的なハイブリダイゼーションアッセイプローブを、上記に示した公開された配列およびＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍについて決定された１８Ｓ ｒＲＮＡ配列から同定した。Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍに特異的なプローブを、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｍｕｒｉｓ、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｂａｉｌｅｙｉおよびＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｗｒａｉｒｉの１８Ｓ ｒＲＮＡ配列と、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒａ ｃａｙｅｔａｎｅｎｓｉｓ、Ｓａｒｃｏｃｙｓｔｉｓ ｈｏｍｉｎｉｓ、Ｅｎｔａｍｏｅｂａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａおよびＥｉｍｅｒｉａ ｐｒａｅｃｏｘの１８Ｓ ｒＲＮＡ配列を比較することによって同定した。そして、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍに特異的なプローブを同定するために、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍの１８Ｓ ｒＲＮＡ配列を、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｍｕｒｉｓ、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｂａｉｌｅｙｉおよびＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｗｒａｉｒｉの１８Ｓ ｒＲＮＡ配列と比較した。可変性の領域を同定し、これらを試験して、特異性を確認し得た。
【０２０１】
配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１６および配列番号１８の塩基配列を有するハイブリダイゼーションアッセイプローブを、以下に記載の実施例で扱う。これらのプローブを、米国特許第６，０３１，０９１号においてＡｒｎｏｌｄらによって開示されるように、非ヌクレオチドリンカーを用いて合成し、そして米国特許第５，１８５，４３９号においてＡｒｎｏｌｄらによって開示されるように、化学発光剤アクリジニウムエステル（ＡＥ）を用いて標識した。ＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍおよびＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ核酸に対するプローブの反応性および特異性は、米国特許第５，２８３，１７７４号においてＡｒｎｏｌｄらによって開示される、相同保護アッセイ（Ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ）（ＨＰＡ）を使用して実証される。結果を、相対光単位（ＲＬＵ）で示し、これは、ルミノメーターによって検出される光子の尺度である。
【０２０２】
（Ｃ．試薬）
種々の試薬を以下の実施例に示す。これらには、ハイブリダイゼーション試薬、選択試薬、増幅試薬、再構成緩衝液、酵素試薬、酵素希釈緩衝液およびオイル試薬が挙げられる。これらの試薬の処方およびｐＨ値（関連する場合）は、以下のとおりである。
【０２０３】
ハイブリダイゼーション試薬：以下の実施例の「ハイブリダイゼーション試薬」は、５０ｍＭ コハク酸、１％（ｗ／ｖ）ラウリル硫酸リチウム（ＬＬＳ）、７．５ｍＭ アルドリチオール−２、０．６Ｍ ＬｉＣｌ、１１５ｍＭ ＬｉＯＨ、１０ｍＭ エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、１０ｍＭ エチレングリコールＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＥＧＴＡ）および１．５％（ｖ／ｖ） エチルアルコール（無水）から作製される（ｐＨ４．７）。
【０２０４】
選択試薬：以下の実施例の「選択試薬」は、６００ｍＭ ホウ酸、２４０ｍＭ ＮａＯＨおよび１％（ｖ／ｖ） ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００から作製される（ｐＨ８．５）。
【０２０５】
増幅試薬：以下の実施例の「増幅試薬」は、各４ｍＭのＡＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰおよびＣＴＰ、各１ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰおよびｄＣＴＰ、４０ｍＭ トリゾーマ塩基（ｐＨ７．５）、２５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１７．５ｍＭ ＫＣｌおよび５％（ｗ／ｖ） ポリビニルピロリドンから作製される。この増幅試薬は、１．５ｍｌの滅菌脱イオン水で再構成される。
【０２０６】
酵素試薬：以下の実施例の「酵素試薬」は、１２５ｍＭ Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン（ＮＡＬＣ）、０．２％（ｖ／ｖ） ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１０２、２０ｍＭ Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）（ｐＨ７．５）、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１ｍＭ 酢酸亜鉛、０．２Ｍ トレハロース、２０００ユニット モロニーマウス白血病ウイルス（「ＭＭＬＶ」）逆転写酵素および２０００ユニット Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼから作製される（１「ユニット」の活性は、ＭＭＬＶ逆転写酵素については、３７℃にて１５分間での５．７５ｆｍｏｌのｃＤＮＡの合成および放出として定義され、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼについては、１「ユニット」の活性は、３７℃にて２０分間での５．０ｆｍｏｌのＲＮＡ転写物の生成として定義される）。この酵素試薬は、１．５ｍＬの酵素希釈緩衝液で再構成される。
【０２０７】
酵素希釈緩衝液：以下の実施例の「酵素希釈緩衝液」は、１４０ｍＭ トリゾーマ試薬（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０％（ｖ／ｖ） ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１０２、７０ｍＭ ＫＣｌおよび２０％（ｖ／ｖ） グリセロールから作製される。
【０２０８】
検出試薬：以下の実施例の「検出試薬」は、検出試薬Ｉ（０．１％（ｖ／ｖ） 過酸化水素および１ｍＭ 硝酸を含む）および検出試薬ＩＩ（１Ｎ 水酸化ナトリウムおよび界面活性剤成分）を含む。
【０２０９】
オイル試薬：以下の実施例の「オイル試薬」は、鉱油である。
【０２１０】
（実施例１）
（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ核酸の特異的検出）
本実施例は、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｒＲＮＡに標的化されるアクリジニウムエステル標識ハイブリダイゼーションアッセイプローブを含むプローブミックスが、非Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ生物の存在下でＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ種を選択的に検出する能力を示す。配列番号３の塩基配列を有するハイブリダイゼーションアッセイプローブを、上記のように、ヌクレオチド１１と１２（５’から３’に読んで）との間に配置される非ヌクレオチドリンカーを含むように合成した。さらに、配列番号２７および配列番号２８の塩基配列を有する非標識ヘルパープローブを、このプローブミックスに含めて、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ核酸へのハイブリダイゼーションアッセイプローブのハイブリダイゼーションを促進させる。最初のヌクレオチド（５’から３’に読んで）（これは、対応するデオキシヌクレオチドと置換されている）を除いて、ヘルパープローブの各ヌクレオチドは、そのリボフラノシル部分に対して２’−Ｏ−メチル置換を含むように改変されたリボヌクレオチドである。
【０２１１】
Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ核酸に対するハイブリダイゼーションアッセイプローブの特異性を、２連のサンプルセットのパネルを使用して決定する。各セットは、以下からなる群より選択された単離株由来の１００ｎｇの精製ｒＲＮＡ（１サンプル当たり５０ｎｇ）を含む：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒａ ｃａｙｅｔａｎｅｎｉｓ、Ｓａｒｃｏｃｙｓｔｉｓ ｈｏｍｉｎｉｓ、Ｅｎｔａｍｏｅｂａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ、Ｅｉｍｅｒｉａ ｐｒａｅｃｏｘ、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ、およびＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｍｕｒｉｓ、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｂａｉｌｅｙｉおよびＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｗｒａｉｒｉの少なくとも１つ。Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍおよびＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｍｕｒｉｓの単離株は、Ｗａｔｅｒｂｏｒｎｅ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ ｏｆ Ｎｅｗ Ｏｒｌｅａｎｓ，ＬＡから得られ得る（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍについてはパート番号Ｐ１０２およびＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｍｕｒｉｓについてはパート番号Ｐ１０４）。ネガティブコントロールサンプルのセットを含めて、バックグラウンドレベルを決定する。
【０２１２】
各サンプルを、１２×７５ｍｍのポリプロピレンチューブ（Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ；カタログ番号２４４０）に提供する。さらに、各チューブに、０．１ｐｍｏｌのハイブリダイゼーションアッセイプローブ、５．０ｐｍｏｌの各ヘルパープローブ、および１００μｌの１×ハイブリダイゼーション試薬を提供する。ハイブリダイゼーションをさせるために、チューブを、循環水浴（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗｉｎｃｈｅｓｔｅｒ、ＶＡ；Ｍｏｄｅｌ ２６０；カタログ番号５１２２１０３５）中で３０分間、６０℃にてインキュベートする。ハイブリダイゼーション後、３００μｌの選択試薬を各チューブに添加し、そして各チューブを循環水浴中で１０分間、６０℃にてインキュベートして、ハイブリダイズされていないプローブに結合しているアクリジニウムエステル標識を加水分解する。サンプルを１分間氷上で冷却し、その後、検出試薬の自動注入を備えるＬＥＡＤＥＲ（登録商標）４５０ｉルミノメーターにおいて分析する。１０，０００ＲＬＵよりも高い正味のＲＬＵ値を、陽性の結果とみなし、そして１０，０００ＲＬＵ未満の正味のＲＬＵ値を、陰性の結果とみなす。正味のＲＬＵ値は、各サンプルセットの平均ＲＬＵ値−ネガティブコントロールセットの平均ＲＬＵ値（すなわち、バックグラウンドシグナル）に基づく。
【０２１３】
（実施例２）
（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ核酸の増幅および検出）
本実施例は、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ由来核酸に特異的なハイブリダイゼーションアッセイプローブを使用する、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｒＲＮＡの標的配列の増幅およびその増幅されたｒＲＮＡの検出を示す。詳細には、配列番号１の塩基配列を有するＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍハイブリダイゼーションアッセイプローブを、上記のように、ヌクレオチド１１と１２（５’から３’に読んで）との間に配置される非ヌクレオチドリンカーを含むように合成した。このハイブリダイゼーションアッセイプローブは、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ標的ｒＲＮＡと同センスであり、そしてこのプローブを使用して、転写媒介増幅の生成物を検出する。転写媒介増幅を行うための手順は、先に記載され、そして米国特許第５，３９９，４９１号および同第５，４８０，７８４号においてＫａｃｉａｎらによって記載される。さらに、このハイブリダイゼーションアッセイプローブは、実施例１のハイブリダイゼーションアッセイプローブと反対のセンスであり、これは、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ生物由来の核酸に特異的であると考えられる。従って、本実施例のハイブリダイゼーションアッセイプローブは、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ生物由来の核酸に特異的であることが予測される。
【０２１４】
Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍおよびＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｍｕｒｉｓ由来のリボソームＲＮＡを、以下のプロモーター−プライマー／プライマーの組み合わせの１つを使用して、別々に増幅する：（ｉ）配列番号６９の５’末端プロモーター塩基配列および配列番号６０の３’末端センステンプレート特異的塩基配列を有するプロモーター−プライマー、ならびに配列番号４５のアンチセンステンプレート特異的塩基配列を有するプライマー；および（ｉｉ）配列番号６９の５’末端プロモーター塩基配列および配列番号６０の３’末端センステンプレート特異的塩基配列を有するプロモーター−プライマー、ならびに配列番号４６のアンチセンステンプレート特異的塩基配列を有するプライマー。Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍおよびＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｍｕｒｉｓ単離株は、Ｗａｔｅｒｂｏｒｎｅ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ ｏｆ Ｎｅｗ Ｏｒｌｅａｎｓ，ＬＡから得られ得る（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍについてはパート番号Ｐ１０２およびＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｍｕｒｉｓについてはパート番号Ｐ１０４）。
【０２１５】
増幅を、１２×７５ｍｍのポリプロピレンチューブ（Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ；カタログ番号２４４０）で行う。各チューブは、２連のセットで０ａｍｏｌ、０．２ａｍｏｌまたは２．０ａｍｏｌのＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ ｒＲＮＡまたはＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｍｕｒｉｓ ｒＲＮＡ、１５ｐｍｏｌ プロモーター−プライマー、１５ｐｍｏｌ プライマー、２５μｌ 増幅試薬、および滅菌脱イオン水を含み、各チューブの総量を７５μｌにする。各サンプルに２００μｌのオイル試薬を加え、そして乾燥加熱浴（Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ；カタログ番号４００６）中で１０分間、９５℃にてインキュベートする。次いで、サンプルを、循環水浴（Ｌａｕｄａ Ｄｒ．Ｒ．Ｗｏｂｓｅｒ ＧｍｂＨ ＆ Ｃｏ．ＫＧ、Ｌａｕｄａ−Ｋｏｅｎｉｇｓｈｏｆｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ；Ｍｏｄｅｌ Ｎｏ．Ｍ２０−Ｓ）に移し、そして５分間、４２℃にてインキュベートし、その後、各チューブに２５μｌの再構成した酵素試薬を加える。循環水浴中４２℃での６０分間のインキュベーション後、１００ｆｍｏｌのハイブリダイゼーションアッセイプローブを含む１００μｌ １×ハイブリダイゼーション試薬を、各チューブに加え、サンプルを、循環水浴中６０℃で３０分間インキュベートし、そしてアニールされたハイブリダイゼーションアッセイプローブ由来のシグナルを、実施例１に記載された様式で検出する。ネガティブコントロール（０ａｍｏｌの標的ｒＲＮＡ）の平均ＲＬＵ値の１０倍を超える平均ＲＬＵ値を有するサンプルセットは、標的ｒＲＮＡの増幅を示し、そしてネガティブコントロールの平均ＲＬＵ値の１０倍未満の平均ＲＬＵ値を有するサンプルセットは、標的ｒＲＮＡの増幅がないことを示す。
【０２１６】
（実施例３）
（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ核酸の特異的検出）
本実施例は、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ ｒＲＮＡに標的化されるアクリジニウムエステル標識ハイブリダイゼーションアッセイプローブを含むプローブミックスが、非Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ生物の存在下でＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ生物を選択的に検出する能力を示す。上記のように、以下の塩基配列の１つを有するハイブリダイゼーションアッセイプローブを合成する：（ｉ）配列番号１３（ヌクレオチド９と１０（５’から３’に読んで）との間に非ヌクレオチドリンカーが配置される）；（ｉｉ）配列番号１５（ヌクレオチド１２と１３（５’から３’に読んで）との間に非ヌクレオチドリンカーが配置される）；（ｉｉｉ）配列番号１６（ヌクレオチド９と１０（５’から３’に読んで）との間に非ヌクレオチドリンカーが配置される）；および（ｉｖ）配列番号１８（ヌクレオチド９と１０（５’から３’に読んで）との間に非ヌクレオチドリンカーが配置される）。最初のヌクレオチド（５’から３’に読んで）（これは、対応するデオキシヌクレオチドと置換されている）を除いて、配列番号１８の塩基配列を有するハイブリダイゼーションアッセイプローブの各ヌクレオチドは、そのリボフラノシル部分に対して２’−Ｏ−メチル置換を含むように改変されたリボヌクレオチドである。
【０２１７】
さらに、以下の塩基配列を有する非標識ヘルパープローブを、このプローブミックスに含めて、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ核酸へのハイブリダイゼーションアッセイプローブのハイブリダイゼーションを促進させる：（ｉ）配列番号１５の塩基配列を有するハイブリダイゼーションアッセイプローブと共に使用するための、配列番号４１または配列番号４２；および（ｉｉ）配列番号１３または配列番号１８（示されるように改変された）の塩基配列を有するハイブリダイゼーションアッセイプローブと共に使用するための、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３および配列番号４４のいずれか１つまたはそれらの組み合わせ。最初のヌクレオチド（５’から３’に読んで）（これは、対応するデオキシヌクレオチドと置換されている）を除いて、これらのヘルパープローブの各ヌクレオチドは、そのリボフラノシル部分に対して２’−Ｏ−メチル置換を含むように改変されたリボヌクレオチドである。
【０２１８】
Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ核酸に対するハイブリダイゼーションアッセイプローブの特異性を、２連のサンプルセットのパネルを使用して決定する。各セットは、以下からなる群より選択された単離株由来の１００ｎｇの精製ｒＲＮＡ（１サンプル当たり５０ｎｇ）を含む：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒａ ｃａｙｅｔａｎｅｎｓｉｓ、Ｓａｒｃｏｃｙｓｔｉｓ ｈｏｍｉｎｉｓ、Ｅｉｍｅｒｉａ ｐｒａｅｃｏｘ、Ｅｎｔａｍｏｅｂａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ、およびＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｍｕｒｉｓ、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｂａｉｌｅｙｉ、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｓｅｒｐｅｎｔｉｓおよびＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｗｒａｉｒｉの少なくとも１つ。Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍおよびＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｍｕｒｉｓの単離株は、Ｗａｔｅｒｂｏｒｎｅ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄから入手可能である（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍについてはパート番号Ｐ１０２およびＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｍｕｒｉｓについてはパート番号Ｐ１０４）。ネガティブコントロールサンプルのセットを含めて、バックグラウンドレベルを決定する。
【０２１９】
各サンプルを、１２×７５ｍｍのポリプロピレンチューブ（Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ；カタログ番号２４４０）に提供する。さらに、各チューブに、０．１ｐｍｏｌのハイブリダイゼーションアッセイプローブ、５．０ｐｍｏｌの各ヘルパープローブ、および１００μｌの１×ハイブリダイゼーション試薬を提供する。ハイブリダイゼーションをさせるために、チューブを、循環水浴（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；Ｍｏｄｅｌ ２６０；カタログ番号５１２２１０３５）中で３０分間、６０℃にてインキュベートする。ハイブリダイゼーション後、３００μｌの選択試薬を各チューブに添加し、そして各チューブを循環水浴中で１０分間、６０℃にてインキュベートして、ハイブリダイズされていないプローブに結合しているアクリジニウムエステル標識を加水分解する。サンプルを１分間氷上で冷却し、その後、検出試薬の自動注入を備えるＬＥＡＤＥＲ（登録商標）４５０ｉルミノメーターにおいて分析する。１０，０００ＲＬＵよりも高い正味のＲＬＵ値を、陽性の結果とみなし、そして１０，０００ＲＬＵ未満の正味のＲＬＵ値を、陰性の結果とみなす。正味のＲＬＵ値は、各サンプルセットの平均ＲＬＵ値−ネガティブコントロールセットの平均ＲＬＵ値（すなわち、バックグラウンドシグナル）に基づく。
【０２２０】
（実施例４）
（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍハイブリダイゼーションアッセイプローブの感度）
本実施例は、標的を含むｒＲＮＡ転写物を有するコントロールおよび種々の量のＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍオーシストを含む水サンプルを使用し、サンプル中のＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ核酸の検出についてのアクリジニウムエステル標識ハイブリダイゼーションアッセイプローブの感度を実証した。ハイブリダイゼーションアッセイプローブを、上記のように、配列番号１３の塩基配列を有しかつヌクレオチド９と１０（５’から３’に読んで）との間に配置される非ヌクレオチドリンカーを含むように合成した。ヘルパープローブは、本実施例では使用しなかった。
【０２２１】
このＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍハイブリダイゼーションアッセイプローブの感度を、２連のコントロールおよびサンプル（１つの例外を含む）のパネルを使用して決定した。コントロールサンプルは、以下を含んだ：（ｉ）各チューブに９５μｌ溶解試薬を含みそして転写物を含まない、第１のセット（「ネガティブコントロール」）；（ｉｉ）各チューブに８５μｌ溶解試薬および０．０１ｆｍｏｌ／μｌの濃度の１０μｌの転写物を含む、第２のセット（「第１のポジティブコントロール」）；（ｉｉｉ）各チューブに８５μｌ溶解試薬および０．１ｆｍｏｌ／μｌの濃度の１０μｌの転写物を含む、第３のセット（「第２のポジティブコントロール」）；および（ｉｖ）各チューブに８５μｌ溶解試薬および１．０ｆｍｏｌ／μｌの濃度の１０μｌの転写物を含む、第４のセット（「第３のポジティブコントロール」）。溶解試薬は、１．９２５ｍｌの溶解緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ ＣａＣｌ２および１％（ｗ／ｖ）ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ））および２０ｍｇ／ｍｌの濃度の１０５μｌ プロテイナーゼＫから作製された。
【０２２２】
５種の２連のサンプルを試験した。各セットのメンバーは、１ｍｌ溶解試薬中に、それぞれ、２×１０３、１×１０４、１×１０５、１×１０６および５×１０６の量のオーシストを含んだ。上記で詳述した単離および精製方法とは異なり、本実施例のＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ ｒＲＮＡを、エッペンドルフ微量遠心分離機（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．；カタログ番号２２ ６２ １２０−３）を使用して５分間、９，０００ｒｐｍにて、エッペンドルフ１．５ｍｌマイクロテストチューブ（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．；カタログ番号２２ ６０ ００２ ８）中で各サンプルを高速遠心分離することによって、サンプルから単離した。約１００μｌの上清を各チューブから取り出し、そしてサンプルを、微量遠心分離機で２分間、９，０００ｒｐｍで再度遠心分離した。ペレットを乱さないように上清を除去し、ペレットを１００μｌの溶解試薬中に再懸濁した。
【０２２３】
サンプルおよびコントロール全てに、１００μｌのオイル試薬を提供し、そして循環水浴（Ｌａｕｄａ Ｄｒ．Ｒ．Ｗｏｂｓｅｒ ＧｍｂＨ ＆ Ｃｏ．ＫＧ；Ｍｏｄｅｌ Ｎｏ．Ｍ２０−Ｓ）中で６０分間、４２℃にてインキュベートした。次いで、サンプルを、乾燥加熱浴（Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ；カタログ番号４００６）に移し、９５℃にて９０分間インキュベートした。その後、各チューブに１００μｌのプローブミックスを加えた。このプローブミックスは、２．２ｍｌの１×ハイブリダイゼーション試薬および１００ｆｍｏｌ／μｌの濃度の２２μｌのハイブリダイゼーションアッセイプローブを合わせて調製した。チューブの内容物を手短にボルテックスし、再度、循環水浴中で３０分間６０℃にてインキュベートし、標的ｒＲＮＡへプローブをハイブリダイズさせた。
【０２２４】
ハイブリダイゼーション後、３００μｌの選択試薬を各チューブに添加し、そしてチューブを手短にボルテックスし、その後、循環水浴中で８分間６０℃にてさらにインキュベートして、ハイブリダイズされなかったプローブに結合するアクリジニウムエステル標識を加水分解した。次いで、チューブの内容物を室温で５分間冷却し、その後、検出試薬の自動注入器を備えるＬＥＡＤＥＲ（登録商標）４５０ｈｃルミノメーター（Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）において分析した。この実験のＲＬＵ値および変動係数（ＣＶ）％値を、以下の表１に示す。ここで、「正味のＲＬＵ」は、ネガティブコントロール、ポジティブコントロールまたはサンプルコントロールの平均ＲＬＵからネガティブコントロールの平均ＲＬＵを引いたものである。
【０２２５】
（表１：ポジティブコントロール中に存在する種々の濃度の標的核酸および種々の量のＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍオーシストから単離された種々の量の標的核酸に対するプローブのハイブリダイゼーション）
【０２２６】
【表１】
この実験の結果は、１個のオーシスト当たり約６，０００のｒＲＮＡコピー数を示唆するが、この値は、上記の新規でより効果的な単離および精製方法後よりも高かったかもしれない。このコピー数は、アルゴリズムｙ＝ｍｘ＋ｂを使用する直線外挿によって計算した。ここで、「ｙ」は、相対光単位数であり、「ｍ」は、傾きであり、「ｘ」は、オーシスト数であり、そして「ｂ」は、ｙ切片であり、１ｆｍｏｌのポジティブコントロールは、約６．０２×１０８の転写物コピーを含む。図１は、「平均正味ＲＬＵ」 対 血球計数によって測定した「オーシスト」をプロットする、オーシスト力価グラフであり、これは、試験サンプル中のＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍの存在を検出するために必要とされるオーシスト負荷の指標を提供する。これらの結果は、水サンプル中のＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ生物の存在が、十分な標的配列を生成するための予備増幅工程を行う必要なく、直接検出され得ることを示す。
【０２２７】
（実施例５）
（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ核酸の増幅および検出）
この実施例は、核酸増幅産物の検出のための、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍハイブリダイゼーションアッセイプローブの使用を説明する。特に、配列番号５、配列番号７、配列番号８または配列番号１０の塩基配列を有するＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍハイブリダイゼーションアッセイプローブは、上記のように合成され、以下に位置する非ヌクレオチドリンカーを含む：（ｉ）配列番号５の塩基配列のヌクレオチド１８と１９との間（５’から３’に読んで）；（ｉｉ）配列番号７の塩基配列のヌクレオチド１３と１４との間（５’から３’に読んで）；（ｉｉｉ）配列番号８の塩基配列のヌクレオチド１６と１７との間（５’から３’に読んで）；および（ｉｖ）配列番号１０の塩基配列のヌクレオチド１１と１２との間（５’から３’に読んで）。対応するデオキシヌクレオチドで置換される最初のヌクレオチド（５’から３’に読んで）を除いて、配列番号１０の塩基配列を有するハイブリダイゼーションアッセイプローブの各ヌクレオチドは、リボフラノシル部分に対する２’−Ｏ−メチル置換を含むように改変されたリボヌクレオチドである。
【０２２８】
これらのハイブリダイゼーションアッセイプローブは、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ標的ｒＲＮＡと同じセンスであり、そして転写物媒介増幅産物を検出するために使用される。転写媒介増幅を実行するための手順は、前出ならびにＫａｃｉａｎら、米国特許第５，３９９，４９１号および同第５，４８０，７８４号によって記載される。さらに、これらのハイブリダイゼーションアッセイプローブは、それぞれ、実施例３の配列番号１３、配列番号１５、配列番号１６および配列番号１８の塩基配列を有するハイブリダイゼーションアッセイプローブの反対のセンスであり、これらは、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ生物由来の核酸に特異的であると考えられる。従って、この実施例のハイブリダイゼーションアッセイプローブは、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ生物由来の核酸に特異的であると予想される。
【０２２９】
Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ由来のリボソームＲＮＡは、ハイブリダイゼーションアッセイプローブが、配列番号５、配列番号７または配列番号１０の塩基配列を有する場合、以下のプロモーター−プライマー／プライマーの組み合わせの１つを使用して、増幅される：（ｉ）配列番号６９の５’末端プロモーター塩基配列および配列番号５９の３’末端センステンプレート特異的塩基配列を有するプロモーター−プライマー、ならびに配列番号４５のアンチセンステンプレート特異的な塩基配列を有するプライマー；（ｉｉ）配列番号６９の５’末端プロモーター塩基配列および配列番号５９の３’末端センステンプレート特異的塩基配列を有するプロモーター−プライマー、ならびに配列番号４６のアンチセンステンプレート特異的な塩基配列を有するプライマー；（ｉｉｉ）配列番号６９の５’末端プロモーター塩基配列および配列番号６０の３’末端センステンプレート特異的塩基配列を有するプロモーター−プライマー、ならびに配列番号４５のアンチセンステンプレート特異的な塩基配列を有するプライマー；そして（ｉｖ）配列番号６９の５’末端プロモーター塩基配列および配列番号６０の３’末端センステンプレート特異的塩基配列を有するプロモーター−プライマー、ならびに配列番号４６のアンチセンステンプレート特異的な塩基配列を有するプライマー。そして、ハイブリダイゼーションアッセイプローブが配列番号８の塩基配列を有する場合、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ由来のｒＲＮＡは、配列番号６９の５’末端プロモーター塩基配列および配列番号６２の３’末端センステンプレート特異的塩基配列を有するプロモーター−プライマー、ならびに配列番号４９のアンチセンステンプレート特異的な塩基配列を有するプライマーを使用して増幅される。Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ単離株は、Ｐａｒｔ．Ｎｏ．Ｐ１０２としてＷａｔｅｒｂｏｒｎ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄから入手可能である。
【０２３０】
増幅は、１２×７５ｍｍのポリプロピレンチューブ（Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ；カタログ番号２４４０）中で実行され、各々のチューブは、０ａｍｏｌ、０．２ａｍｏｌ、または２．０ａｍｏｌのＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ ｒＲＮＡを二連のセット、１５ｐｍｏｌのプロモーター−プライマー、１５ｐｍｏｌのプライマー、２５μｌのＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔおよび各チューブ内の総容積を７５μｌにする滅菌脱イオン水を含む。各サンプルは、２００μｌのＯｉｌ Ｒｅａｇｅｎｔを受け、そして乾熱浴（Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ；カタログ番号４００６）中で９５℃で１０分間インキュベートされる。次いで、このサンプルを、循環水浴（Ｌａｕｄａ Ｄｒ．Ｒ．Ｗｏｂｓｅｒ ＧｍｂＨ＆Ｃｏ．ＫＧ；モデル番号Ｍ２０−Ｓ）に移し、そして４２℃で５分間インキュベートした後、再構成したＥｎｚｙｍｅ Ｒｅａｇｅｎｔ２５μｌを、各チューブに添加する。循環水浴中での４２℃で６０分間のインキュベーション後、ハイブリダイゼーションアッセイプローブ１００ｆｍｏｌ含有の１×Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔの１００μｌを、各サンプルに添加し、このサンプルを循環水浴中で６０℃で３０分間インキュベートし、アニールしたハイブリダイゼーションアッセイプローブからのシグナルを、実施例３に記載の様式で検出する。ネガティブコントロール（０ａｍｏｌの標的ｒＲＮＡ）についての平均ＲＬＵの１０倍を上回る平均ＲＬＵを有するサンプルセットは、標的ｒＲＮＡの増幅を示し、そしてネガティブコントロールについての平均ＲＬＵの１０倍未満の平均ＲＬＵを有するサンプルセットは、標的ｒＲＮＡの増幅がないことを示す。
【０２３１】
（実施例６）
（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ標的転写物の増幅）
この実施例は、種々の濃度でのＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ ｒＲＮＡ転写物配列の増幅および検出を説明する。特に、配列番号５の塩基配列を有するＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍハイブリダイゼーションアッセイプローブを、ヌクレオチド１８と１９との間（５’から３’に読んで）に位置する非ヌクレオチドリンカーを含むように、上記のように合成した。このハイブリダイゼーションアッセイプローブは、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ標的ｒＲＮＡと同じセンスであり、そして転写媒介増幅産物の検出のために使用された。転写媒介増幅を実行するための手順は、前出ならびにＫａｃｉａｎら、米国特許第５，３９９，４９１号および同第５，４８０，７８４号によって記載される。さらに、これらのハイブリダイゼーションアッセイプローブは、実施例３の配列番号１３の塩基配列を有するハイブリダイゼーションアッセイプローブの反対のセンスであり、これは、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ生物由来の核酸に特異的であると考えられる。従って、この実施例のハイブリダイゼーションアッセイプローブは、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ生物由来の核酸に特異的であると予想された。
【０２３２】
この実施例について、２つの異なるプロモーター−プライマー／プライマーの組み合わせを使用した。第一のプロモーター−プライマー／プライマーの組み合わせは、配列番号６９の５’末端プロモーター塩基配列および配列番号５９の３’末端センステンプレート特異的塩基配列を有するプロモーター−プライマー、ならびに配列番号４６のアンチセンステンプレート特異的な塩基配列を有するプライマーを含んだ（「プライマーセット１」）。これらのプロモーター−プライマー／プライマーの組み合わせの第二の組み合わせは、配列番号６９の５’末端プロモーター塩基配列および配列番号５９の３’末端センステンプレート特異的塩基配列を有するプロモーター−プライマー、ならびに配列番号４５のアンチセンステンプレート特異的な塩基配列を有するプライマーを含んだ（「プライマーセット２」）。各プライマーセットについての作業ストックは、各々１５ｐｍｏｌ／μｌの濃度でプライマーおよびプロモーター−プライマーを含有する、２００μｌの滅菌脱イオン水であった。
【０２３３】
次いで、各プライマーセットについての作業ストックを使用して、２つの増幅溶液を調製した。これらの溶液の第一の溶液を、３７５μｌのＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ、１５μｌのプライマーセット１の作業ストックおよび５８５μｌの滅菌脱イオン水を合わせることによって調製した（「第一増幅溶液」）。これらの溶液の第二の溶液を、３７５μｌのＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ、１５μｌのプライマーセット２の作業ストックおよび５８５μｌの滅菌脱イオン水を合わせることによって調製した（「第二増幅溶液」）。
【０２３４】
プローブストックを、約２００μｌの１×Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ中１００ｆｍｏｌ／μｌの濃度で、ハイブリダイゼーションアッセイプローブから作製した。このストックから、プローブミックスを、３０μｌのプローブストックおよび３ｍｌの２×Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔを合わせることによって、調製した。プローブストックのこの容積は、３０サンプルまでに十分であった。
【０２３５】
転写物の希釈を行って、滅菌脱イオン水中１０ａｍｏｌ／μｌ、１ａｍｏｌ／μｌ、０．１ａｍｏｌ／μｌ、０．０１ａｍｏｌ／μｌおよび０．００１ａｍｏｌ／μｌの濃度を有する転写物ストックを調製した（転写物ストックの各ａｍｏｌは、約６００，０００コピーの転写物を含んだ）。これらのストック濃度の各々から、４個のＥｐｐｅｎｄｏｒｆ １．５ｍｌのマイクロ試験チューブ（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ，Ｉｎｃ．；カタログ番号２２ ６０ ００２ ８）のセットを調製し、これらの各々は、１０μｌの転写物ストック溶液を含んだ。各チューブセット由来の、各２個のチューブの内容物を、６５μｌの第一増幅溶液と合わせ、一方、各チューブセット由来の他の２個のチューブの内容物を、６５μｌの第二増幅溶液と合わせた。４個のネガティブコントロールチューブ（０ａｍｏｌの標的）もまた含まれ、これらの各々は、１０μｌの滅菌脱イオン水を含んだ。これらのネガティブコントロールの２個は、６５μｌの第一増幅溶液を受け、一方、他の２個のネガティブコントロールは、６５μｌの第二増幅溶液を受けた。
【０２３６】
各チューブは、２００μｌのＯｉｌ Ｒｅａｇｅｎｔ（サンプルおよびコントロールの両方とも）を受け、そしてこれらのチューブを、乾熱浴（Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ；カタログ番号４００６）中で５分間９５℃でインキュベートした。次いで、これらのチューブを循環水浴（Ｌａｕｄａ Ｄｒ．Ｒ．Ｗｏｂｓｅｒ ＧｍｂＨ＆Ｃｏ．ＫＧ；モデル番号Ｍ２０−Ｓ）に移し、そして４２℃で５分間インキュベートした後、再構成したＥｎｚｙｍｅ Ｒｅａｇｅｎｔ２５μｌを、各チューブに添加した。次いで、これらのチューブを穏やかに混合し、そして循環水浴中で４２℃でさらに６０分間インキュベートした。この３回目のインキュベーション後、１００μｌのプローブミックスをチューブに添加し、チューブをボルテックスし、そして循環水浴中での６０℃で３０分間の、４回目のインキュベーションに供した。次いで、各チューブに、３００μｌのＳｅｌｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔを提供し、ボルテックスし、循環水浴中で６０℃で１０分間インキュベートし、そして氷水上で１分間冷却した。アニールしたハイブリダイゼーションアッセイプローブからのシグナルを、（ＬＥＡＤＥＲ（登録商標）４５０ｈｃ照度計を、ＬＥＡＤＥＲ（登録商標）４５０ｉ照度計の代わりに使用した点を除いて）実施例３に記載の様式で検出し、結果を以下の表２に示す。ネガティブコントロール（０ａｍｏｌの標的ｒＲＮＡ）についての平均ＲＬＵの１０倍を上回る平均ＲＬＵを有するサンプルセットは、標的ｒＲＮＡの増幅を示し、そしてネガティブコントロールについての平均ＲＬＵの１０倍未満の平均ＲＬＵを有するサンプルセットは、標的ｒＲＮＡの増幅がないことを示した。
【０２３７】
【表２】
この実験の結果は、プライマーセット１が、標的核酸を増幅するためのこれらの条件下で有用であり、そして少なくとも最低６，０００のコピー数（これは、オーシスト中に存在するｒＲＮＡの画分を示すと考えられる）を有するサンプル中に存在する、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ由来の標的ｒＲＮＡの存在を検出するために使用され得ることを実証する。図２は、「平均正味ＲＬＵ」対「標的」をプロットする増幅グラフであり、これは、転写媒介増幅後に試験サンプル中のＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ生物の存在を検出するために必要な開始ｒＲＮＡコピー数を示す。この実施例から、サンプルｒＲＮＡが転写媒介増幅の実行によって増幅される場合、１，０００コピーのｒＲＮＡ（一個のＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍオーシスト中に存在すると予測される量未満）が、試験サンプル中のＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ生物の存在を検出するために十分であるようである。従来の実験によって、この実施例に示される条件および濃度は最適化され得、プライマーセット２は、標的配列を同様に増幅（定義のように）し得ると考えられる。
【０２３８】
（実施例７）
（非標的生物由来のｒＲＮＡの存在下でのＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ標的転写物の増幅）
この実施例は、各々種々の濃度でのＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｍｕｒｉｓ ｒＲＮＡの存在下でのＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ ｒＲＮＡ標的配列の増幅および検出を説明する。特に、配列番号５の塩基配列を有するＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍハイブリダイゼーションアッセイプローブを、上記のように、ヌクレオチド１８と１９との間（５’から３’に読んで）に位置する非ヌクレオチドリンカーを含むように合成した。このハイブリダイゼーションアッセイプローブは、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ標的ｒＲＮＡと同じセンスであり、そして転写媒介増幅産物の検出のために使用された。転写媒介増幅を実行するための手順は、前出ならびにＫａｃｉａｎら、米国特許第５，３９９，４９１号および同第５，４８０，７８４号によって記載される。さらに、これらのハイブリダイゼーションアッセイプローブは、実施例３の配列番号１３の塩基配列を有するハイブリダイゼーションアッセイプローブの反対のセンスであり、これは、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ生物由来の核酸に特異的であると考えられる。従って、この実施例のハイブリダイゼーションアッセイプローブは、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ生物由来の核酸に特異的であると予想された。
【０２３９】
この実施例において、合計２０個の１２×７５ｍｍポリプロピレンチューブ（Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ；カタログ番号２４４０）を、以下の表３に示されたＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ転写物ｒＲＮＡおよびＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｍｕｒｉｓ ｒＲＮＡの量を含むように、マトリックス形式で設定した。この実施例の転写物を生成するために使用されたＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍオーシストは、Ｐａｒｔ．Ｎｏ．Ｐ１０２としてＷａｔｅｒｂｏｒｎ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄから得た。Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｍｕｒｉｓオーシストは、個人的な供給源から得たが、このＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｍｕｒｉｓ単離株は、Ｐａｒｔ．Ｎｏ．Ｐ１０４としてＷａｔｅｒｂｏｒｎ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄから入手可能である。Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｍｕｒｉｓについて、二連のセットのチューブに、０ａｍｏｌ、０．２ａｍｏｌ、または２．０ａｍｏｌ、２０ａｍｏｌ、２００ａｍｏｌのＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｍｕｒｉｓサンプルｒＲＮＡを提供した。次いで、これらのセットのチューブの各メンバーを、０ａｍｏｌまたは２ａｍｏｌのいずれかのＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ転写物ｒＲＮＡを有する２個のＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍチューブのうちの１個と一致させた。各チューブに提供されるプロモーター−プライマー／プライマーの組み合わせは、配列番号６９の５’末端プロモーター塩基配列および配列番号５９の３’末端センステンプレート特異的塩基配列を有するプロモーター−プライマー、ならびに配列番号４６のアンチセンステンプレート特異的な塩基配列を有するプライマーを含んだ。このプライマーセットを使用して、７５０μｌのＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔおよび３０μｌのプライマー作業ストック（滅菌脱イオン水中に１５ｐｍｏｌ／μｌの各プロモーター−プライマーおよびプライマーを含む）からなる増幅溶液を調製した。
【０２４０】
各チューブに、２５μｌの増幅溶液を提供し、そして非コントロールチューブに、適切に希釈したサンプルｒＲＮＡの１０μｌを提供した。全てのチューブの総容積を、滅菌脱イオン水を用いて７５μｌにした。このチューブに、２００μｌのＯｉｌ Ｒｅａｇｅｎｔを別々に提供し、次いで乾熱浴中（Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ；カタログ番号４００６）中で１０分間９５℃でインキュベートし、その後、これらのチューブを循環水浴（Ｌａｕｄａ Ｄｒ．Ｒ．Ｗｏｂｓｅｒ ＧｍｂＨ＆Ｃｏ．ＫＧ；モデル番号Ｍ２０−Ｓ）に移し、そして４２℃で５分間インキュベートした。再構成したＥｎｚｙｍｅ Ｒｅａｇｅｎｔ２５μｌを各チューブに添加した後、これらのチューブを穏やかに混合し、そして循環水浴中で４２℃でさらに６０分間インキュベートした。この３回目のインキュベーション後、１００μｌのプローブミックスを各チューブに添加し、このプローブミックスは、１×Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ中、１ｐｍｏｌ／ｍｌのハイブリダイゼーションアッセイプローブからなった。次いで、チューブをボルテックスし、そして循環水浴中での６０℃で３０分間の、４回目のインキュベーションに供した。次いで、各チューブに、３００μｌのＳｅｌｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔを提供し、ボルテックスし、循環水浴中で６０℃で１０分間インキュベートし、そして氷水上で１分間冷却した。アニールしたハイブリダイゼーションアッセイプローブからのシグナルを、（ＬＥＡＤＥＲ（登録商標）４５０ｈｃ照度計を、ＬＥＡＤＥＲ（登録商標）４５０ｉ照度計の代わりに使用した点を除いて）実施例３に記載の様式で検出し、結果を以下の表３に示す。ネガティブコントロール（０ａｍｏｌの標的ｒＲＮＡおよび０ａｍｏｌの非標的ｒＲＮＡ）についてのＲＬＵの１０倍を上回るＲＬＵ値を有するサンプルは、標的ｒＲＮＡまたは非標的ｒＲＮＡの増幅を示し、そしてネガティブコントロールについてのＲＬＵの１０倍未満のＲＬＵ値を有するサンプルは、標的ｒＲＮＡまたは非標的ｒＲＮＡの増幅がないことを示した。
【０２４１】
【表３】
この実験の結果は、このプライマーセットが、近縁の非標的生物由来の潜在的妨害核酸の存在下で、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ由来の核酸に存在する標的配列を増幅するために有用であることを実証する。さらに、このデータは、このハイブリダイゼーションアッセイプローブが、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ核酸由来のアンプリコンに特異的にハイブリダイズすることを実証する。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、血球計算板計測により決定した「平均の正味ＲＬＵ」対「オーシスト」をプロットしたオーシストの力価グラフである。この図は、オーシストの負荷が、試験サンプル中のＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍの存在を直接的に検出するために必要なことを示す。
【図２】
図２は、「平均の正味ＲＬＵ」対「標的」をプロットした増幅のグラフである。この図は、転写が媒介する増幅手順の後で、試験サンプル中のＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ生物の存在を検出するのに必要な初期のｒＲＮＡコピー数の指標を提供する。
本出願は、米国仮出願６０／２３２，０２８（２０００年９月１２日出願）の権利を主張し、この米国仮出願６０／２３２，０２８の内容は、本明細書中に参考として本明細書によって援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、水、糞、食物または他のサンプル媒体の試験サンプル中の、一般にＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ生物、特にＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ生物の存在を決定するのに有用な、ハイブリダイゼーションアッセイプローブ、ヘルパープローブ、増幅プライマー、核酸組成物、プローブミックス、方法およびキットに関する。
【０００３】
本発明は、さらに、生存しているオーシスト（ｏｏｃｙｓｔ）（例えば、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ生物）から精製されたリボ核酸を得るための方法に関する。次いで、この精製されたリボ核酸は、１つ以上の増幅オリゴヌクレオチドおよび／もしくはハイブリダイゼーションアッセイプローブを用いた増幅ならびに／または検出に、利用可能になり得る。
【０００４】
（参考文献の援用）
本明細書中に言及される全ての参考文献は、参考としてその全体が本明細書によって援用される。これらの参考文献の援用は、独立したものであり、これら全ての参考文献の内容の任意の部分または任意の特定の参考文献が、特許出願についての任意の国または地域の制定上の開示要件を満たすために必須の材料であるべきとみなされることを、本発明者らが断言または承認しているとして解釈されるべきではない。それにもかかわらず、本発明者らは、適切である場合、審査の権威者または裁判所によって本願発明に必須であると判断された材料を提供するためにこのような参考文献のうちのいずれかに依存するという権利を保有する。本明細書中に言及されない参考文献は、本願発明に対して先行分野であるとことを認める。
【０００５】
（発明の背景）
Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍは、種々の動物（ヒトを含む）を感染し得る胞子虫綱寄生虫である。１つの特定の種（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ）が、免疫適合性の成体または乳児において胃腸炎を引き起こすことによって、そして場合によっては、免疫不全の個体（例えば、乳児、高齢者およびＡＩＤＳ患者）において生命を脅かす下痢を時おり引き起こすことによって、ヒトに対して特定の脅威を引き起こす、コクシジウム寄生虫である。Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍに感染したＡＩＤＳ患者における死亡率は、５０％と高い死亡率である。Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍの伝染は、糞便−口腔経路または水源の汚染、水泳プール、および未処理の地表水による直接的なものである。３０個ほどの少ない微視的なオーシストが感染し得、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍは、発展途上国における持続性の下痢の主要な原因であると考えられ、そして米国の水供給に対する重大な脅威である。
【０００６】
Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍは、環境因子に対して非常に耐性である厚い壁のオーシストとして天然に存在し、低温かつ湿潤の設定に維持された場合、その環境に数ヶ月の間生存する能力を示す。オーシストは、飲料水の従来の塩素処理に対して非常に耐性であり、そしてオーシストの大きさは、地方自治体の水道局によって代表的に使用される水濾過システムに対して問題を提示している。実際、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍのオーシストは、非常に強靭であるので、完全な強度の漂白に対する２４時間の曝露後も、その完全性および生存性を維持し得る。環境手段および化学手段による崩壊に対するこれらの耐性は、生水の全供給のほぼ９０パーセントが、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍオーシストで感染しているので、特に警戒が必要である。
【０００７】
米国において、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍを検出するための環境保護団体によって最近承認された方法は、「Ｍｅｔｈｏｄ １６２２」と称される抗体染色方法である。この方法は、いくつかの欠点（これには、アッセイの主観性、高い抗体バックグラウンドが容認できない多数の偽陽性を生じること、およびその実験室に集中する局面、顕微鏡分析に数時間も必要とすることが挙げられる）有する。Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍを検出するための現在利用可能な他の方法（ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるゲノムＤＮＡの検出、酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）のような免疫学的アッセイを含む）は、有意な感度の問題および特異性の問題を有する。従って、試験サンプル中のＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ生物（そして、特に、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ）の存在を決定するために使用され得る、感度が高くかつ特異的なアッセイ、ならびに厚い壁のオーシストの内容物を放出させるための方法に対する必要性が存在する。
【０００８】
（発明の要旨）
本発明は、水、糞、食物または他のサンプル媒体のような試験サンプル中にＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ属またはＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ種に属する生物が存在するか否かを決定するのに有用な、オリゴヌクレオチドを特徴とする。この特徴であるオリゴヌクレオチドは、増幅するかならびに／またはＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ属もしくはＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ種に属する生物が試験サンプル中に存在するか否かを決定するのに有用な、増幅プライマー、ハイブリダイゼーションアッセイプローブおよび／またはヘルパープローブ中に含まれ得る。
【０００９】
例えば、このハイブリダイゼーションアッセイプローブは、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ生物由来の核酸中に存在する標的領域に優先的にハイブリダイズし得、検出可能なプローブ：標的ハイブリッドを形成する。この検出可能なプローブ：標的ハイブリッドが、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ属に属する生物（これには、例えば、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ａｇｎｉ種、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｂａｉｌｅｙｉ種、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｂｏｖｉｓ種、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｃｒｏｔａｌｉ種、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｍｅｌｅａｇｒｉｄｉｓ種、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｍｕｒｉｓ種、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｎａｓｏｒｕｍ種、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ種、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｓｅｒｐｅｎｔｉｓ種および／またはＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｗｒａｉｒｉ種、ならびにＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ属に属する他の生物が挙げられ得る）の存在を示す。１つの実施形態において、本発明は、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ生物が試験サンプル中に存在するか否かを決定するためのハイブリダイゼーションアッセイプローブを提供し、このプローブは、好ましくは、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ生物由来の標的核酸中に存在する標的核酸配列中に存在する少なくとも１０個連続する塩基領域に対して、少なくとも８０％相補的（好ましくは、少なくとも９０％相補的、そしてより好ましくは１００％相補的）である少なくとも１０個連続する塩基領域を含み、この標的核酸配列は、以下（５’から３’に読む）：
【００１０】
【化１】
【００１１】
別の実施形態において、本発明は、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ種の生物が試験サンプル中に存在するか否かを決定するためのハイブリダイゼーションアッセイプローブを提供し、このプローブは、好ましくは、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ生物由来の標的核酸中に存在する標的核酸配列中に存在する少なくとも１０個連続する塩基領域に対して、少なくとも少なくとも８０％相補的（好ましくは、少なくとも９０％相補的、そしてより好ましくは１００％相補的）である少なくとも１０個連続する塩基領域を含み、この標的核酸配列は、以下（５’から３’に読む）：
【００１２】
【化２】
【００１３】
好ましくは、本発明のＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍプローブおよびＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍプローブは、１００塩基長まで（好ましくは、１２〜５０塩基長、より好ましくは１８〜３５塩基長）のオリゴヌクレオチドを含み、かつ標的核酸配列に実質的に相補的である（好ましくは、第１の標的核酸配列に完全に相補的である）。オリゴヌクレオチドは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、ＤＮＡおよびＲＮＡの組合わせからなり得るか、あるいは、このオリゴヌクレオチドは、核酸アナログ（例えば、ペプチド核酸）であり得るか、または１つ以上の改変ヌクレオシド（例えば、リボフラノシル部分に対する２’−Ｏ−メチル置換を有する、リボヌクレオシド）を含み得る。
【００１４】
プローブは、好ましくは、検出可能な標識を含む。標識は、任意の適切な標識物質（放射性同位体、酵素、酵素補因子、酵素基質、色素、ハプテン、化学発光分子、蛍光分子、燐光性分子、電気化学発光分子、発色団、明確に規定された条件下で標的核酸に安定にハイブリダイズし得ない塩基配列領域、およびこれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない）であり得る。１つの特に好ましい実施形態において、標識は、アクリジニウムエステルである。
【００１５】
別の実施形態において、本発明は、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ生物（または、特に、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ生物）が試験サンプル中に存在するか否かを決定するのに有用な、プローブミックスを意図する。例えば、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ属由来の生物の存在を決定するために、プローブミックスは、上記のＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍプローブのうちの１つおよび１つのヘルパープローブを含み得る。好ましくは、ヘルパープローブは、１００塩基長まで、より好ましくは、１２〜５０塩基長、さらにより好ましくは１８〜３５塩基長のオリゴヌクレオチドである。好ましくは、ヘルパープローブは、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ生物由来の標的核酸中に存在する標的核酸配列中に存在する少なくとも１０個連続する塩基領域に対して、少なくとも８０％相補的（好ましくは、少なくとも９０％相補的、そしてより好ましくは１００％相補的）である少なくとも１０個連続する塩基領域を含み、この標的配列配列は、以下（５’から３’に読む）：
【００１６】
【化３】
【００１７】
試験サンプル中のＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ生物の存在を決定するために、プローブミックスは、上記のＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍプローブのうちの１つおよび１つのヘルパープローブを含み得る。好ましくは、ヘルパープローブは、１００塩基長まで、より好ましくは、１２〜５０塩基長、さらにより好ましくは１８〜３５塩基長のオリゴヌクレオチドである。好ましくは、ヘルパープローブは、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ生物由来の標的核酸中に存在する標的核酸配列中に存在する少なくとも１０個連続する塩基領域に対して、少なくとも８０％相補的（好ましくは、少なくとも９０％相補的、そしてより好ましくは１００％相補的）である少なくとも１０個連続する塩基領域を含み、この標的配列配列は、以下（５’から３’に読む）：
【００１８】
【化４】
【００１９】
Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍプローブミックスについての好ましい実施形態において、ハイブリダイゼーションアッセイプローブは、配列番号５、配列番号６、配列番号９、配列番号１０、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１７および配列番号１８からなる群より選択される配列中に存在する少なくとも１０個連続する塩基領域に対して、少なくとも８０％相同性である少なくとも１０個連続する塩基領域を有するオリゴヌクレオチドを含み；そしてヘルパープローブは、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、および配列番号４４からなる群より選択される配列中に存在する少なくとも１０個連続する塩基領域に対して、少なくとも８０％相同性である少なくとも１０個連続する塩基領域を有するオリゴヌクレオチドを含む。
【００２０】
Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍプローブミックスについての別の好ましい実施形態において、ハイブリダイゼーションアッセイプローブは、配列番号５、配列番号６、配列番号９、配列番号１０、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１７および配列番号１８からなる群より選択される配列中に存在する少なくとも１０個連続する塩基領域に対して、少なくとも８０％相同性である少なくとも１０個連続する塩基領域を有するオリゴヌクレオチドを含み；そしてプローブミックスは、第１のヘルパープローブおよび第２のヘルパープローブを含む。ここで、第１のヘルパープローブは、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３７、配列番号３８、配列番号４１、および配列番号４２からなる群より選択される配列中に存在する少なくとも１０個連続する塩基領域に対して、少なくとも８０％相同性である少なくとも１０個連続する塩基領域を有するオリゴヌクレオチドを含み、ここで、第２のヘルパープローブは、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４３、および配列番号４４からなる群より選択される配列中に存在する少なくとも１０個連続する塩基領域に対して、少なくとも８０％相同性である少なくとも１０個連続する塩基領域を有するオリゴヌクレオチドを含む。
【００２１】
Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍプローブミックスについての別の好ましい実施形態において、ハイブリダイゼーションアッセイプローブは、配列番号７、配列番号１１、配列番号１５および配列番号１９からなる群より選択される配列中に存在する少なくとも１０個連続する塩基領域に対して、少なくとも８０％相同性である少なくとも１０個連続する塩基領域を有するオリゴヌクレオチドを含み；そしてヘルパープローブは、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３７、配列番号３８、配列番号４１、および配列番号４２からなる群より選択される配列中に存在する少なくとも１０個連続する塩基領域に対して、少なくとも８０％相同性である少なくとも１０個連続する塩基領域を有するオリゴヌクレオチドを含む。
【００２２】
本発明はまた、ストリンジェントなハイブリダイゼーションアッセイ条件下で、上記のハイブリダイゼーションアッセイプローブおよび／またはヘルパープローブとそのプローブに対する標的核酸との間に形成される安定な核酸二重鎖を含む組成物を意図する。
【００２３】
本発明はまた、増幅アッセイにおけるＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ生物の存在を検出するために有用な増幅プライマーを特徴とする。１つの好ましい実施形態において、本発明は、試験サンプル中に存在するＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ生物由来の核酸を増幅するための少なくとも１つの増幅プライマーを提供し、この増幅プライマーは、好ましくは、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ生物由来の標的核酸中に存在する標的核酸配列中に存在する少なくとも１０個連続する塩基領域に対して、少なくとも８０％相補的（好ましくは、少なくとも９０％相補的、より好ましくは１００％相補的）である少なくとも１０個連続する塩基領域を含む。この標的核酸配列は、以下（５’から３’に読む）：
【００２４】
【化５】
【００２５】
本発明はさらに、増幅条件下で核酸ポリメラーゼと接触させた場合に、以下：配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７および配列番号６８からなる群より選択される塩基配列を有する核酸領域を介して結合し、そして伸長をもたらす増幅プライマーを意図する。この実施形態の増幅プライマーはまた、必要に応じて、ＲＮＡポリメラーゼによって認識されるか、またはＲＮＡポリメラーゼによる開始もしくは伸長を増強する、５’配列を含む。配列番号６９のＴ７プライマーが、好ましい。
【００２６】
本発明の増幅プライマーは、好ましくは少なくとも２つの増幅プライマーのセットで使用される。好ましいセットは、少なくとも１０個連続した塩基の領域を含む第一の増幅プライマーを含み、この塩基の領域は、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５８、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６４および配列番号６７からなる群から選択される配列に存在する、少なくとも１０個連続した塩基の領域に対して少なくとも８０％相補性である。これらの好ましいセットの第二の増幅プライマーは、少なくとも１０個連続した塩基の領域を含み、この塩基の領域は、配列番号４７、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６５、配列番号６６および配列番号６８からなる群から選択される配列に存在する、少なくとも１０個連続した塩基の領域に対して少なくとも８０％相補性である。
【００２７】
本発明はさらに、増幅条件下で、上記の増幅プライマーとこのプライマーに対する標的核酸との間に形成される安定な核酸二重鎖を含む組成物を意図する。
【００２８】
本発明は、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ生物またはＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ生物が試験サンプル中に存在するか否かを決定するための方法をさらに特徴とする。一つの実施形態において、本発明は、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ生物が試験サンプル中に存在するか否かを決定する方法を提供し、この方法は、以下の工程：（ａ）プローブがＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ生物に由来する標的核酸に優先的にハイブリダイズすることを可能にする条件下で、それによって、試験サンプルを、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ生物を検出するための上記ハイブリダイゼーションアッセイプローブの一つと接触させ、検出に安定なプローブ：標的ハイブリッドを形成する、工程；および（ｂ）試験サンプル中のＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ生物の存在または非存在の指標としてこのハイブリッドが、試験サンプル中に存在するか否かを決定する工程を包含する。この方法は、試験サンプル中に存在するＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ生物の量を見積もるための手段として、試験サンプル中に存在するハイブリッドの量を定量する工程をさらに包含し得る。
【００２９】
別の実施形態において、本発明は、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ生物が試験サンプル中に存在するか否かを決定する方法を提供し、この方法は、以下の工程：（ａ）プローブが、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ生物に由来する標的核酸に優先的にハイブリダイズすることが可能な条件下で、試験サンプルをＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ生物を検出するための上記ハイブリダイゼーションアッセイプローブの一つと接触させ、それによって検出に安定なプローブ：標的ハイブリッドを形成する、工程；および（ｂ）試験サンプル中のＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ生物の存在または非存在の指標として、このハイブリッドが、試験サンプルに存在するか否かを決定する工程を包含する。この方法は、試験サンプル中に存在するＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ生物の量を見積もるための手段として、試験サンプル中に存在するハイブリッドの量を定量する工程をさらに包含し得る。
【００３０】
Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ生物またはＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ生物が試験サンプル中に存在するか否かを決定する方法、または試験サンプル中に存在するこれらの生物の量を決定する方法は、試験サンプルとＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍまたはＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍにとって適切な上記のヘルパープローブの少なくとも１つを、所望どおりに接触させる工程をさらに包含し得る。（好ましいハイブリダイゼーションアッセイプローブおよびヘルパープローブの組み合わせは、プローブミックスとして上に記載される。）ヘルパープローブに加えて、あるいは代替的に、この方法は、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ生物またはＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ生物由来の核酸に存在する標的核酸配列を増幅するのに適切な、上記の増幅プライマーの少なくとも１つを、試験サンプルと所望どおりに接触させる工程をさらに包含し得る。
【００３１】
本発明はまた、試験サンプル中に存在するＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ生物由来の核酸に存在する標的核酸配列を増幅するための方法を意図し、この方法は、以下の工程：（ａ）増幅条件下で、試験サンプルと上記の増幅プライマーの少なくとも１つを接触させる工程；および（ｂ）標的核酸配列を増幅する工程を包含する。この増幅された標的核酸配列は、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ生物、特にＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ生物由来の核酸に存在し得る。好ましい増幅方法は、上記の増幅プライマーの少なくとも２つのセットを含む。
【００３２】
一つの実施形態において、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ生物由来の核酸配列に存在する標的核酸配列を増幅するための方法は、さらに、以下の工程：（ａ）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、試験サンプルを標的核酸またはそれらの相補体に優先的にハイブリダイズするハイブリダイゼーションアッセイプローブと接触させ、それによって検出に安定なプローブ：標的ハイブリッドを形成する、工程；および（ｂ）試験サンプル中のＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ生物またはＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ生物の存在または非存在の指標として、ハイブリッドが、試験サンプルに存在するか否かを決定する工程を包含する。上記のハイブリダイゼーションアッセイプローブは、この方法にとって特に好ましい。
【００３３】
本発明はまた、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ生物が試験サンプル中に存在するか否かを決定するためのキットを意図する。これらのキットは、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ由来の核酸に対して特異的な上記のハイブリダイゼーションプローブの少なくとも１つを含み、そして必要に応じて、試験サンプル中のＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ生物の存在またはその量を決定するための指示書を含む。別の実施形態において、このキットは、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ由来の核酸に適切な上記のヘルパープローブの少なくとも１つをさらに含む。さらなる実施形態において、このキットまたは、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ生物由来の核酸に存在する標的核酸配列を増幅するために適切な上記の増幅プライマーの少なくとも１つを含む。なお別の実施形態において、このキットは、上記のヘルパープローブの少なくとも１つおよび上記の増幅プライマーの少なくとも１つをさらに含む。
【００３４】
同様に、本発明は、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ生物が試験サンプル中に存在するか否かを決定するためのキットを意図する。これらのキットは、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ由来の核酸に対して特異的な上記のハイブリダイゼーションプローブアッセイの少なくとも１つを含み、そして必要に応じて、試験サンプル中のＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ生物の存在またはその量を決定するための指示書を含む。別の実施形態において、このキットは、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ生物由来の核酸に適切な上記のヘルパープローブの少なくとも１つをさらに含む。さらなる実施形態において、このキットまたは、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ生物由来の核酸に存在する標的核酸配列を増幅するために適切な上記の増幅プライマーの少なくとも１つを含む。別の実施形態において、このキットは、上記のヘルパープローブの少なくとも１つおよび上記の増幅プライマーの少なくとも１つを含む
本発明はまた、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ生物またはＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ生物由来の核酸に存在する標的核酸配列を増幅するためのキットを意図する。このキットは、上記増幅プライマーの少なくとも１つ、および、必要に応じて、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ生物またはＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ生物由来の核酸を適切な場合に増幅するための指示書を含む。
【００３５】
本発明のハイブリダイゼーションアッセイプローブが、必要とされ得る特異性の程度に依存して、増幅プライマーまたは捕獲プローブとして使用され得ること、本発明の増幅プライマーが、ハイブリダイゼーションアッセイプローブまたは捕獲プローブとして使用され得ること、そして本発明のヘルパープローブが、増幅プライマーまたは捕獲プローブとして使用され得ることは、当業者に理解される。
【００３６】
本発明は、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ生物のような生オーシストから精製されたＲＮＡを得るための方法をさらに特徴とする。次いで、オーシストから単離されたリボ核酸は、上記の増幅プライマーおよび／またはハイブリダイゼーションアッセイプローブの少なくとも１つを用いて、増幅および／または検出のために利用可能となり得る。
【００３７】
好ましい実施形態において、生オーシストから精製されたＲＮＡを得るための方法は、以下の工程：（ｉ）オーシストを含むと疑われる流体サンプルを、この流体サンプルの入った容器内でオーシストを濃縮するのに十分なスピードおよび時間で遠心分離する工程；（ｉｉ）遠心分離の工程の間に形成される上清を容器から除去する工程；（ｉｉｉ）存在するならば、緩衝化溶液中に濃縮されたオーシストを再懸濁する工程；（ｉｖ）オーシストおよびそこから放出するＲＮＡを溶解するのに十分な速度および時間で、多数の粒子が存在する上記緩衝化溶液を、振動させる工程、または別の攪拌する工程（例えば、ボルテックス）；（ｖ）ＲＮＡに結合するフィルター（例えば、シリカベースのマトリックス）上に放出されたＲＮＡを固定化する工程；（ｖｉ）放出ＲＮＡ以外のオーシスト成分（例えば、タンパク質、ＤＮＡおよび他の混入物）を取り除くために、緩衝化溶液で一回以上フィルターを洗浄することによって、放出したＲＮＡを精製する工程；ならびに（ｖｉｉ）そのフィルターから精製したＲＮＡを取り出す工程、を包含する。本方法の工程（ｉｉｉ）において使用される緩衝化溶液は、好ましくは、グアニジニウム（ｇｕａｎｉｄｉｎｉｕｍ）チオシアナートのようなカオトロピック剤を含む。これは、オーシストから放出される内因性リボヌクレアーゼを不活性化する。オーシストを溶解するために使用される粒子は、例えば、ガラス、ジルコニアガラス、ジルコニア、ステンレス鋼、クロム鋼またはタングステンカーバイドであり得るが、約３．７ｇ／ｃｃの密度を有するジルコニアガラス粒子が好ましい。好ましくは、この粒子は一般的に球状を有し、そして好ましくは、約０．１〜約２．５ｍｍの範囲、より好ましくは、約０．５〜約１．０ｍｍの範囲の平均直径を有し、そして最も好ましくは約１．０ｍｍの平均直径を有する。
【００３８】
本発明の他の特徴および利点は、以下に記載の本発明の好ましい実施形態の説明および特許請求の範囲から明らかである。
【００３９】
（好ましい実施形態の説明）
本発明は、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ生物体由来の核酸に標的化したオリゴヌクレオチドを記載し、このオリゴヌクレオチドは、試験サンプルにおける、一般にはＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ生物体、特にＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ生物体の存在または非存在を決定するために特に有用である。このオリゴヌクレオチドは、異なる方法におけるＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ生物体の検出を補助（例えば、ハイブリダイゼーションアッセイプローブ、ヘルパープローブおよび／または増幅プライマーとして機能することによる）し得る。本発明のハイブリダイゼーションアッセイプローブは、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ生物体由来の標的核酸中に存在する標的核酸配列に、ストリンジェントなハイブリダイゼーションアッセイ条件下で優先的にハイブリダイズし得、試験サンプル中のＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ生物体、またはより具体的にはＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ生物体の存在を示す検出可能な二重鎖を形成する。これらのプローブのいくつかは、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍとその既知の最も近い系統発生的隣接物（ｃｌｏｓｅｓｔ ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｎｅｉｇｈｂｏｒ）との間を識別し得ると考えられる。これらのプローブの他のものは、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍとその既知の最も近い系統発生的隣接物との間を識別し得ると考えられる。本発明のヘルパープローブは、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ生物体由来の核酸中に存在する標的核酸配列に、ストリンジェントなハイブリダイゼーションアッセイ条件下でハイブリダイズし得、そしてハイブリダイゼーションアッセイプローブ：標的核酸二重鎖の形成を増強するために使用され得る。本発明の増幅プライマーは、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ生物体由来の核酸配列中に存在する標的核酸配列に、増幅条件下でハイブリダイズし得、そして核酸由来のＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ、より具体的にはＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍを生成するための増幅反応におけるプライマーとして使用され得る。このプローブおよび増幅プライマーは、試験サンプルにおけるＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍまたはＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ生物体を検出および／または定量するためのアッセイにおいて使用され得る。
【００４０】
本発明はさらに、生存可能なオーシスト（例えば、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ生物体）から精製されたＲＮＡを得るための方法を記載する。この精製されたＲＮＡは、１つ以上の増幅プライマーを用いる増幅に対して利用可能になり得、そして／またはハイブリダイゼーションアッセイプローブを用いる検出に対して利用可能になり得る。
【００４１】
（Ａ．定義）
以下の用語は、異なる意味を有するように明確に示されない限り、本明細書中でこの示される意味を有する。
【００４２】
「標的核酸」または「標的」は、標的核酸配列を含む核酸を意味する。
【００４３】
「標的核酸配列」、「標的ヌクレオチド配列」、「標的配列」、または「標的領域」は、一本鎖核酸分子のヌクレオチド配列の全てまたは一部を含む、特定のデオキシリボヌクレオチド配列またはリボヌクレオチド配列を意味する。
【００４４】
「オリゴヌクレオチド」または「オリゴマー」は、互いに結合した２つ以上のヌクレオシドサブユニットまたは核酸塩基サブユニットから作製されるポリマーを意味する。このオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ、ならびにそれらのアナログであり得る。このヌクレオシドサブユニットの糖グループは、リボース、デオキシリボース、およびそれらのアナログ（例えば、リボフラノシル部分に対して２’−Ｏ−メチル置換を有するリボヌクレオシドが挙げられる）であり得る。（２’置換を有するヌクレオシドサブユニットを含み、そしてハイブリダイゼーションアッセイプローブ、ヘルパープローブ、および／または増幅プライマーとして有用なオリゴヌクレオチドは、Ｂｅｃｋｅｒら、「Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ａｍｐｌｉｆｙｉｎｇ Ｔａｒｇｅｔ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｕｓｉｎｇ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｒｉｍｅｒｓ」米国特許第６，１３０，０３８号に開示される。） ヌクレオシドサブユニットは、連結（例えば、リン酸ジエステル連結）、改変された連結、またはその相補的標的核酸配列へのヌクレオチドのハイブリダイゼーションを阻止しない非ヌクレオチド部分によって、結合され得る。改変された連結としては、標準的なリン酸ジエステル連結が、異なる連結（例えば、ホスホロチオエート連結またはメチルホスホネート連結）で置換された連結が挙げられる。核酸塩基サブユニットは、例えば、ＤＮＡの天然のリン酸デオキシリボース骨格を偽（ｐｓｅｕｏｄｏ）ペプチド骨格（例えば、カルボキシメチルリンカーによって核酸塩基サブユニットを中心の二級アミンに結合する、２−アミノエチルグリシン骨格）で置き換えることによって、結合され得る。（偽ペプチド骨格を有するＤＮＡアナログは、一般に「ペプチド核酸」または「ＰＮＡ」といわれ、そしてＮｉｅｌｓｅｎら、「Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ」、米国特許第５，５３９，０８２号に開示される）。本発明によって意図されるオリゴヌクレオチドまたはオリゴマーの他の非限定的な例としては、「ロックされた（ｌｏｃｋｅｄ）核酸」、「ロックされたヌクレオシドアナログ」または「ＬＮＡ」といわれる二環式および三環式のヌクレオシドアナログおよびヌクレオチドアナログを含む核酸アナログが挙げられる。（ロックされた核酸は、Ｗａｎｇ、「Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌｌｙ Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ａｎｄ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ」、米国特許第６，０８３，４８２号；Ｉｍａｎｉｓｈｉら、「Ｎｏｖｅｌ Ｂｉｃｙｃｌｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ａｎｄ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ」、国際公開番号ＷＯ９８／３９３５２；およびＷｅｎｇｅｌら、「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ」、国際公開番号ＷＯ９９／１４２２６に開示される。） 任意の核酸アナログ（ただし、改変されたオリゴヌクレオチドは、ストリンジェントなアッセイ条件またはストリンジェントな増幅条件下で標的核酸にハイブリダイズし得る）が、本発明によって意図される。ハイブリダイゼーションアッセイプローブの場合、この改変されたオリゴヌクレオチドはまた、ストリンジェントなハイブリダイゼーションアッセイ条件下で標的核酸に優先的にハイブリダイズし得なければならない。
【００４５】
規定された配列のオリゴヌクレオチドは、当業者に公知の技術によって（例えば、化学合成または生化学合成によって、および組換え核酸分子（例えば、細菌性ベクターまたはレトロウイルスベクター）からのインビトロまたはインビボでの発現によって）生成され得る。本開示によって意図される場合、オリゴヌクレオチドは、野生型染色体のＤＮＡまたはそのインビボ転写産物からならない。オリゴヌクレオチドの１つの用途は、ハイブリダイゼーションアッセイプローブとしての用途である。オリゴヌクレオチドはまた、インビボまたはインビトロでの治療的増幅プライマーとして、あるいは罹患した細胞、感染した細胞、または病原性細胞への遺伝子の転写または翻訳をブロックまたは阻害するためのアンチセンス因子として、使用され得る。
【００４６】
「ハイブリダイゼーションアッセイプローブ」または「プローブ」は、検出に安定なプローブ：標的ハイブリッドをストリンジェントなハイブリダイゼーションアッセイ条件下で形成するために、その標的核酸配列に対して十分に相補的な塩基配列を有する、オリゴヌクレオチドを意味する。当業者に理解されるように、プローブは、ヒトの介入なしでは天然に見出されない形態（例えば、外来核酸で組換えられた形態、単離された形態、またはある程度精製された形態）で単離された、核酸分子またはそのアナログである。本発明のプローブは、標的領域の外側にさらなるヌクレオシドまたは核酸塩基（このようなヌクレオシドまたは核酸塩基が、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でのハイブリダイゼーションを妨げず、そしてハイブリダイゼーションアッセイプローブの場合には、標的核酸への優先的なハイブリダイゼーションを妨げない限り）を有し得る。非相補的な配列（例えば、標的捕獲配列（一般的には、ホモポリマー区域（例えば、ポリＡテール、ポリＴテールまたはポリＵテール））、プロモーター配列、ＲＮＡの転写のための結合部位、制限エンドヌクレアーゼ認識部位、または所望の二次構造もしくは三次構造を与える配列（例えば、触媒的活性部位またはヘアピン構造））もまた含まれ得、これらは、検出および／または増幅を容易にするために使用され得る。規定された配列のプローブは、当業者に公知の技術によって（例えば、化学合成によって、および組換え核酸分子からのインビトロまたはインビボ発現によって）生成され得る。
【００４７】
「安定な」または「検出について安定な」は、反応混合物の温度が、核酸二重鎖の融解温度よりも少なくとも２℃低いことを意味する。この反応混合物の温度は、この核酸二重鎖の溶融温度よりも、好ましくは少なくとも５℃低く、そしてさらにより好ましくは、この反応混合物の溶融温度よりも少なくとも１０℃低い。
【００４８】
「実質的に相同」「実質的に対応する（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ）」または「実質的に対応する（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｓ）」は、本発明のオリゴヌクレオチドが、参照塩基配列（ＲＮＡおよびＤＮＡ等価物を除く）中に存在する少なくとも１０個連続した塩基領域に対して、少なくとも８０％相同、好ましくは少なくとも９０％相同、および最も好ましくは１００％相同である、少なくとも１０個連続した塩基領域を含む塩基配列を有することを意味する。（当業者は、容認できないレベルの非特異的ハイブリダイゼーションを妨げながら、標的配列へのこのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを可能にするために、種々の相同性のパーセンテージでハイブリダイゼーションアッセイ条件に対してなされ得る改変を容易に理解する。） 類似性の程度は、２つの配列を構成する核酸塩基の順序を比較し、そしてこの２つの配列の間に存在し得る他の構造的差異（ただし、この構造的差異は、相補的な塩基との水素結合を妨げない）は考慮しないことによって、決定される。２つの配列間の相同性の程度はまた、比較した少なくとも１０個連続した塩基の各セットにおいて存在する塩基ミスマッチの数の観点から表され得、これは、０〜２塩基の差異の範囲であり得る。
【００４９】
「実質的に相補的」は、本発明のオリゴヌクレオチドが、標的核酸配列（ＲＮＡおよびＤＮＡの等価物を除く）中に存在する少なくとも１０個連続した塩基領域に対して、少なくとも８０％相補的、好ましくは少なくとも９０％相補的、および最も好ましくは１００％相補的な、少なくとも１０個連続した塩基領域を含む塩基配列を有することを意味する。（当業者は、容認できないレベルの非特異的ハイブリダイゼーションを妨げながら、標的配列へのこのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを可能にするために、種々の相補性のパーセンテージでハイブリダイゼーションアッセイ条件に対してなされ得る改変を容易に理解する。） 相補性の程度は、２つの配列を構成する核酸塩基の順序を比較し、そしてこの２つの配列の間に存在し得る他の構造的差異（ただし、この構造的差異は、相補的な塩基との水素結合を妨げない）は考慮しないことによって、決定される。２つの配列間の相補性の程度はまた、比較した少なくとも１０個連続した塩基の各セットにおいて存在する塩基ミスマッチの数の観点から表され得、これは、０〜２塩基の差異の範囲であり得る。
【００５０】
「ＲＮＡおよびＤＮＡの等価物」は、同じ相補性の塩基対ハイブリダイゼーション特性を有するＲＮＡ分子およびＤＮＡ分子を意味する。ＲＮＡおよびＤＮＡの等価物は、異なる糖部分（すなわち、リボース 対 デオキシリボース）を有し、そしてＲＮＡにおけるウラシルおよびＤＮＡにおけるチミジンの存在によって異なり得る。ＲＮＡの等価物とＤＮＡの等価物との間の差異は、相同性における差異には寄与しない。なぜなら、これらの等価物は、特定の配列に対して同じ程度の相補性を有するからである。
【００５１】
「ハイブリダイゼーション」は、平行、または好ましくは、逆平行の配向で、特定のハイブリダイゼーションアッセイ条件下で一緒になって（ｃｏｍｅ ｔｏｇｅｔｈｅｒ）二本鎖領域を有する安定な構造を形成する、２つの完全または部分的に相補的な核酸鎖の能力をいう。この二本鎖構造（ときどき、ハイブリッドと呼ばれる）の２つの構成鎖は、水素結合によって結合される。これらの水素結合は、最も一般的には、単一の核酸鎖上に、塩基のアデニンおよびチミンもしくはウラシル（ＡおよびＴもしくはＵ）またはシトシンおよびグアニン（ＣおよびＧ）を含むヌクレオチド間で形成するが、塩基対形成は、これらの「正準の」対のメンバーではない塩基間でも形成し得る。正準でない塩基対形成は、当該分野で周知である。（例えば、Ｒｏｇｅｒ Ｌ．Ｐ．Ａｄａｍｓら、Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ（第１１版、１９９２）を参照のこと。）
「優先的にハイブリダイズする」は、ストリンジェントなハイブリダイゼーションアッセイ条件下で、ハイブリダイゼーションアッセイプローブが、それらの標的核酸にハイブリダイズして少なくとも１つの目的の生物の存在を示す安定なプローブ：標的ハイブリッドを形成し得、そして非標的生物（特に、系統的に密接に関連した生物）の存在を示す、十分に多数の安定なプローブ：非標的ハイブリッドが形成されないことを意味する。従って、このプローブは、当業者が、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍまたは適切な場合、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ由来の核酸の存在（または非存在）を正確に検出することを可能にするように、非標的核酸よりも標的核酸に十分に大きな程度にハイブリダイズし、そして試験サンプル中の系統学的に密接に関連した生物の存在からその存在を区別する。一般的に、オリゴヌクレオチド配列とその標的配列との間の相補性の程度の減少は、その標的領域へのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションの程度または速度を減少させる。しかし、１つ以上の相補的でないヌクレオシドまたは核酸塩基の包含は、非標的生物を区別するオリゴヌクレオチドの能力を促進し得る。
【００５２】
好ましいハイブリダイゼーションは、以下に提供される実施例におけるように、当該分野で公知の技術および本明細書中に記載される技術を使用して測定され得る。好ましくは、試験サンプル中において標的ハイブリダイゼーションシグナルと非標的ハイブリダイゼーションシグナルとの間には、少なくとも１０倍の差異、より好ましくは、少なくとも約１００倍の差異、および最も好ましくは１，０００倍の差異が存在する。好ましくは、試験サンプル中の非標的ハイブリダイゼーションシグナルは、バックグラウンドシグナルレベルでしかない。
【００５３】
「ストリンジェントなハイブリダイゼーションアッセイ条件」、「ハイブリダイゼーションアッセイ条件」、「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」または「ストリンジェントな条件」は、ハイブリダイゼーションアッセイプローブが、標的核酸（好ましくは、ＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍまたはＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ生物由来のｒＲＮＡまたはｒＤＮＡ）に優先的にハイブリダイズし、そして密接に関連した非標的微生物に由来する核酸に優先的にハイブリダイズしないようにする条件を意味する。ストリンジェントなハイブリダイゼーションアッセイ条件は、プローブのＧＣ含量および長さ、プローブ配列と試験サンプル中に存在し得る非標的配列の配列との間の類似性の程度、および標的配列を含む要因に依存して変化し得る。ハイブリダイゼーション条件は、ハイブリダイゼーション試薬または溶液の温度および組成を含む。以下の実施例の節は、本発明のプローブを使用してＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍまたはＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ生物由来の標的核酸を検出するための好ましいハイブリダイゼーションアッセイ条件を提供するが、他の受容可能なストリンジェントな条件は、当業者によって容易に確かめられ得る。
【００５４】
本明細書中でオリゴヌクレオチドに関して使用される場合、「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」または「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」は、特定の塩基配列に実質的に相同な塩基配列を有し、そして４つまでのさらなる塩基を有し得、そして／またはそこから２つの塩基が欠失され得るオリゴヌクレオチドを意味する。従って、これらの成句は、配列の長さの制限および配列の改変の制限の両方を含む。任意の付加または欠失は、オリゴヌクレオチドがその要求される特性（例えば、非標的核酸よりもその標的核酸に対して、ストリンジェントなハイブリダイゼーションアッセイ条件下で優先的にハイブリダイゼーションし得る能力）を有することを妨げない特定の塩基配列の非物質的バリエーションである。このオリゴヌクレオチドは、任意の付加または欠失なしで特定の核酸配列に実質的に類似した塩基配列を含み得る。しかし、特定の塩基配列から本質的になるオリゴヌクレオチドを含むプローブまたはプライマーは、標的核酸へのプローブのハイブリダイゼーションに関与せず、そしてこのようなハイブリダイゼーションに影響しない他の核酸分子を含み得る。
【００５５】
「核酸二重鎖」、「二重鎖」、「核酸ハイブリッド」または「ハイブリッド」は、二本鎖の水素結合領域を含む安定な核酸構造を意味する。このようなハイブリッドとしては、ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＲＮＡ：ＤＮＡおよびＤＮＡ：ＤＮＡの二重鎖分子およびそれらのアナログが挙げられる。この構造は、任意の公知の手段（プローブに結合した標識を必要としない手段を含む）によって検出可能であるように十分に安定である。例えば、検出方法は、光学活性であり、かつその表面での質量における変化に感受性であるプローブコーティング基板を含み得る。質量変化は、光に応答する光学活性基板の異なる反射特性および透過特性を生じ、そして固定された標的核酸の存在および量を示すように機能する。（光学検出のこの例示的な形態は、Ｎｙｇｒｅｎら、「Ｄｅｖｉｃｅｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」米国特許第６，０６０，２３７号によって開示される。）
「増幅プライマー」または「プライマー」は、標的核酸にハイブリダイズし得、かつ核酸合成の開始のためのプライマーおよび／またはプロモーターの鋳型（例えば、相補鎖の合成のための、それにより、機能的なプロモーター配列を形成する）として作用し得るオリゴヌクレオチドを意味する。増幅プライマーがＲＮＡ構成を開始するように設計される場合、プライマーは、標的配列に相補的でないが、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼまたはＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼのようなＲＮＡポリメラーゼによって認識される塩基配列を含み得る。増幅プライマーは、プライマー伸長の速度または量を妨げるかまたは減少させるように改変された３’末端を含み得る。（ＭｃＤｏｎｏｕｇｈら、「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ａｍｐｌｉｆｙｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｕｓｉｎｇ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ−Ｐｒｉｍｅｒ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ」米国特許第５，７６６，８４９号は、改変されたかまたはブロックされた３’末端を有するプライマーおよびプロモーター−プライマーを開示する）。本発明の増幅プライマーは、化学的に合成され得るか、またはベクターから誘導され得、これらは、天然に存在する核酸分子ではない。
【００５６】
「核酸増幅」または「標的増幅」は、少なくとも１つの標的核酸配列を有する核酸分子の数を増加させることを意味する。本発明に従う標的増幅は、直線的または指数関数的のいずれかであり得るが、指数関数的増幅が好ましい。
【００５７】
「増幅条件」は、核酸増幅を可能にする条件を意味する。以下の実施例の節は、転写ベースの増幅方法で本発明のプライマーを使用して、ＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍまたはＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｕｖｕｍ生物由来の標的核酸配列を増幅するための好ましい増幅条件を提供するが、他の受容可能な増幅条件もまた、使用される特定の増幅方法に依存して当業者によって容易に確かめられ得る。
【００５８】
「アンチセンス」、「反対のセンス」または「ネガティブなセンス」は、参照、すなわち、センスの核酸分子に完全に相補的な核酸分子を意味する。
【００５９】
「センス」、「同じセンス」または「ポジティブなセンス」は、参照核酸分子に完全に相同な核酸分子を意味する。
【００６０】
「アンプリコン」は、核酸増幅反応で生成され、そして標的核酸から誘導される核酸分子を意味する。アンプリコンは、標的核酸として同じまたは反対のセンスであり得る標的核酸配列を含む。
【００６１】
「誘導された」は、生物から直接得られたか、または核酸増幅の産物である核酸に対する参照を意味する。従って、生物から「誘導された」核酸は、例えば、生物中に天然に存在しないアンチセンスＲＮＡ分子であり得る。
【００６２】
「捕獲プローブ」は、ハイブリダイゼーションアッセイプローブによって標的化される領域以外の領域で標的核酸に、そして固定されたプローブにハイブリダイズし得、それにより、試験サンプル中の標的核酸を固定しそして単離するための手段を提供する、共に結合した１つ以上のオリゴヌクレオチドを意味する。捕獲プローブは、標的核酸にハイブリダイズする標的結合領域、および固定プローブにハイブリダイズする固定プローブ結合領域の両方を含む。捕獲プローブは、標的核酸および固定プローブの両方にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得、捕獲プローブの標的結合領域および固定プローブ結合領域は、異なるハイブリダイゼーション下でこれらの標的配列に結合するように設計され得る。この様式で、捕獲プローブは、固定プローブ結合領域の固定プローブへのハイブリダイゼーションを可能にする条件を調整する前に、溶液動力学においてより好ましい条件下で標的核酸に捕獲プローブが最初にハイブリダイズするように設計され得る。標的結合領域および固定プローブ結合領域は、お互いに直接隣接するか、または１つ以上の必要に応じて改変されたヌクレオチドによって分離されて、同じオリゴヌクレオチド内に含まれ得るか、あるいはこれらの領域は、非ヌクレオチドリンカーによってお互いに結合され得る。
【００６３】
「固定プローブ」は、固定された支持体に捕獲プローブを結合させるためのオリゴヌクレオチドを意味する。固定プローブは、条件が同じか異なるかに関わらず捕獲プローブが標的核酸および固定プローブにハイブリダイズするように使用された条件下で安定したままである結合または相互作用によって、固体支持体に直接的または間接的のいずれかで結合される。固定プローブは、サンプル中の非結合物質からの、結合した標的核酸の分離を容易にする。
【００６４】
「分離する（こと）」、「精製する（こと）」、または「精製された」は、サンプル維持容器に含まれるサンプルの１つ以上の成分が、溶液中に存在する１つ以上の他のサンプル成分から物理的に取り出されるかもしくは取り出されたか、またはそれらの存在下で希釈されるかもしくは希釈されたことを意味する。分離工程または精製工程の間に取り出されるかまたは希釈され得るサンプル成分としては、タンパク質、炭水化物、脂質、インヒビター、非標的核酸および非結合プローブが挙げられる。標的捕獲手順を使用して、固定捕獲プローブに結合された標的核酸は、好ましくは、分離工程または精製工程の間、サンプル中に維持される。
【００６５】
「ヘルパープローブ」または「ヘルパーオリゴヌクレオチド」は、ハイブリダイゼーションアッセイプローブの位置と異なる位置の標的核酸にハイブリダイズするように設計され、それにより、標的核酸へのプローブのハイブリダイゼーション速度を増加させるか、プローブ：標的ハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）を上昇させるかのいずれかを行なうか、またはその両方を行なうオリゴヌクレオチドを意味する。
【００６６】
「系統学的に密接に関連した」は、生物が進化的な意味でお互いに密接に関連しており、従ってより遠く関連した生物よりも高い総核酸相同性を有することを意味する。系統樹上で隣接し、そして隣接位置の次の生物は、密接に関連している。系統樹上の隣接位置または隣接位置の次から遠く離れた位置の生物は、これらが有意な総核酸配列相同性を有する場合には、なお密接に関連している。
【００６７】
「属特異的」は、プローブに関して、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ属の少なくとも２種に属する生物から誘導された核酸中に存在する標的核酸配列に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で優先的にハイブリダイズし得ることを意味する。
【００６８】
「種特異的」は、プローブに関して、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ種に属する生物から誘導された核酸中に存在する標的核酸配列に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で優先的にハイブリダイズし得ることを意味する。
【００６９】
（Ｂ．ハイブリダイゼーション条件およびプローブ／プライマー設計）
ハイブリダイゼーション反応条件（最も重要には、ハイブリダイゼーションの温度およびハイブリダイゼーション溶液における塩濃度）は、本発明のハイブリダイゼーションアッセイプローブまたは増幅プライマーが、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ標的核酸配列を有する核酸に優先的にハイブリダイズし、試験サンプル中に存在することが疑われている他の非標的核酸にはハイブリダイズしないことを可能にするように選択され得る。減少した塩濃度および／または増加した温度（増加したストリンジェンシー条件）で、核酸ハイブリダイゼーションの程度は、二本鎖ハイブリッド分子中の対になったヌクレオチド塩基の間の水素結合が破壊される場合、減少する。このプロセスは、「融解」として公知である。
【００７０】
一般的に言うと、最も安定なハイブリッドは、最も大きい数の連続した完全に一致した（すなわち、水素結合した）ヌクレオチド塩基対を有するハイブリッドである。このようなハイブリッドは、通常、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーが増加する場合に、最後に融解すると予想される。しかし、１つ以上のミスマッチの「非正準の」塩基対または不完全な塩基対（核酸のヌクレオチド配列における位置においてより弱い塩基対形成または既存でない塩基対形成を生じる）を含む二本鎖核酸領域は、核酸ハイブリッドが、試験サンプル中に存在し得る他の選択されていない核酸と交差反応することなく、ハイブリダイゼーションアッセイ中で形成および検出されることを可能にする比較的高いストリンジェンシーの条件下でなお十分に安定であり得る。
【００７１】
従って、標的核酸のヌクレオチド配列と他方の系統学的に別であるが密接に関連した生物に属する非標的核酸のヌクレオチド配列の間の類似性の程度、および特定のハイブリダイゼーションアッセイプローブまたは増幅プライマーのヌクレオチド配列と、他方の標的核酸および非標的核酸のヌクレオチド配列の間の相補性の程度に依存して、１つ以上のミスマッチは、標的核酸にハイブリダイズしかつ非標的核酸にハイブリダイズしないプローブまたはプライマーに含まれるオリゴヌクレオチドの能力を必ずしも無効にしない。
【００７２】
本発明のハイブリダイゼーションアッセイプローブは、プローブ：標的ハイブリッドの融解温度（Ｔｍ、潜在的に二本鎖の分子の半分が、所定の反応混合物中で一本鎖の変性状態である温度として定義される）と、試験サンプル中に存在すると予想されるが、プローブと検出されることを求められていない系統学的に最も密接に関連した生物のｒＲＮＡまたはｒＤＮＡとの間で形成されたミスマッチのハイブリッドのＴｍとの間の差異を最大化するように、選択（ｃｈｏｓｅｎ）、選択（ｓｅｌｅｃｔｅｄ）、および／または設計された。非標識の増幅プライマーおよびヘルパープローブは、本発明において有用であるハイブリダイゼーションアッセイプローブとして極端に高度な特異性を有することは必要でないが、これらは、特定の増幅またはハイブリダイゼーションアッセイ条件下で他の核酸より多くの１つ以上の標的核酸に優先的にハイブリダイズする同様の様式で設計される。
【００７３】
プローブの設計において使用される核酸配列の同定を容易にするために、異なる生物由来のヌクレオチド配列を、相同性を最大化するために最初に整列した。この比較のためのヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋデータベースから得られ、そして以下の登録番号を有した：Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ（登録番号Ｌ１６９９６、Ｌ１６９９７、Ｌ２５６４２、ＡＦ０４０７２５およびＡＦ０１５７７２）、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｍｕｒｉｓ（登録番号Ｌ１９０６９）、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｂａｉｌｅｙｉ（登録番号Ｌ１９０６８）、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｗｒａｉｒｉ（登録番号Ｕ１１４４０）、Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（登録番号Ｚ８３２０４）、Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒａ ｃａｙｅｔａｎｅｎｓｉｓ（登録番号ＡＦ１１１１８３）、Ｓａｒｃｏｃｙｓｔｉｓ ｈｏｍｉｎｉｓ（登録番号ＡＦ００６４７０）、Ｅｎｔａｍｏｅｂａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ（登録番号Ｘ６４１４２）およびＥｉｍｅｒｉａ ｐｒａｅｃｏｘ（登録番号Ｕ６７１２０）。
【００７４】
ｒＲＮＡ分子内に、二次構造（分子内水素結合によって部分的に引き起こされる）と機能との間の密接な関係が存在する。この事実は、維持される二次構造を生じる一次ヌクレオチド配列における進化的変化に対して制限を課す。例えば、塩基が、二重らせんの一本の「鎖」において変化する場合（分子内水素結合に起因して、両方の「鎖」は、同じｒＲＮＡ分子の１部である）、相補性（これは、共分散と呼ばれる）、すなわち、必要な二次構造を保持するために、他の「鎖」の一次配列において、相殺的置換が通常生じる。これは、２つの非常に異なるｒＲＮＡ配列が、保存された一次配列および保存された二次構造エレメントの両方に基づいて整列されることを可能にする。本明細書中に記載されたハイブリダイゼーションアッセイプローブについての潜在的な標的配列は、整列された配列の相同性におけるバリエーションに注目することによって同定された。
【００７５】
各々の可変領域における配列の進化は、大部分が分岐している。この分岐に起因して、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍの系統学的により遠緑種の対応するｒＲＮＡ可変領域は、系統学的により近緑種のｒＲＮＡが示すよりも、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｒＲＮＡとより大きな相違を示す。同様に、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍの系統学的により遠緑種の対応するｒＲＮＡ可変領域は、系統学的により近緑種のｒＲＮＡが示すよりも、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ ｒＲＮＡとより大きな相違を示す。Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ（すなわち、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｍｕｒｉｓ、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｂａｉｌｅｙｉ、およびＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｗｒａｉｒｉ）とＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒａ ｃａｙｅｔａｎｅｎｓｉｓ、Ｓａｒｃｏｃｙｓｔｉｓ ｈｏｍｉｎｉｓ、Ｅｎｔａｍｏｅｂａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａおよびＥｉｍｅｒｉａ ｐｒａｅｃｏｘとの間の十分な変動を観察して、好ましい標的部位を同定し、そして非Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ生物体とＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ生物体とを区別するために有用なハイブリダイゼーションアッセイプローブを設計した。同様に、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍとＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｍｕｒｉｓ、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｂａｉｌｅｙｉおよびＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｗｒａｉｒｉとの間の十分な変動を観察して、好ましい標的部位を同定し、そして非Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ生物体（特に、その示されたＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ種）とＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ生物体とを区別するために有用なハイブリダイゼーションアッセイプローブを設計した。
【００７６】
本発明者らは、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍと他のＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ種との間で異なる配列、およびＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ属のメンバーと他の生物体との間で異なる配列を、ＧｅｎＢａｎｋ配列データベースにおいて公開されたｒＲＮＡ配列およびＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍの場合には、研究室でさらに決定しそして確認したｒＲＮＡ配列の比較分析によって同定した。本明細書中に開示された目的のために使用または適用され得るコンピューターおよびコンピュータープログラムは、市販されている。本発明者らは、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｍｕｒｉｓ、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｂａｉｌｅｙｉ、およびＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｗｒａｉｒｉの間の十分な類似性を観察して、本発明のＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍプローブを設計した。本発明者らはまた、これらの同じ生物体の間の十分な変動を観察して、本発明のＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍプローブを設計した。
【００７７】
特有の潜在的な標的ヌクレオチド配列を単に推定的に同定することは、機能的に属特異的なハイブリダイゼーションアッセイプローブまたは種特異的なハイブリダイゼーションアッセイプローブを作製して、その配列を含むＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍまたはＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍのｒＲＮＡまたはｒＤＮＡにハイブリダイズし得ることを保証しない。種々の他の因子は、属特異的プローブまたは種特異的プローブに対する標的部位としての核酸遺伝子座の適合性を決定する。ハイブリダイゼーション反応（例えば、本明細書中に記載される反応）の程度および特異性は、多数の因子によって影響を受けるので、これらの因子の１つ以上の操作は、その標的に完全に相補的であるか否かにかかわらず、特定のオリゴヌクレオチドの正確な感度性および特異性を決定する。種々のアッセイ条件の重要性および有効性は、当業者に公知であり、Ｈｏｇａｎ、「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ／ｏｒ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｏｎ−Ｖｉｒａｌ Ｏｒｇａｎｉｓｍｓ」、米国特許第５，８４０，４８８号；Ｈｏｇａｎら、「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ ｔｏ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｏｒｄｏｎａｅ」、米国特許第５，２１６，１４３号；およびＫｏｈｎｅ、「Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ，Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｏｎ−Ｖｉｒａｌ Ｏｒｇａｎｉｓｍｓ」、米国特許第４，８５１，３３０号によって開示されている。
【００７８】
ハイブリダイゼーションの所望の温度およびハイブリダイゼーション溶液の組成（例えば、塩濃度、界面活性剤および他の溶質）もまた、二本鎖ハイブリッドの安定性に大きく影響を与え得る。プローブが標的にハイブリダイズするのを可能にするイオン強度および温度のような条件は、属特異的プローブまたは種特異的プローブを構築する際に考慮に入れなければならない。ハイブリッド核酸の熱安定性は、反応混合物のイオン強度に伴って、一般には増大する。他方で、水素結合を破壊する化学試薬（例えば、ホルムアミド、尿素、ジメチルスルホキシドおよびアルコール）は、このハイブリッドの熱安定性を大いに減少させ得る。
【００７９】
その標的に対するプローブの特異性を最大化するために、本発明の対象プローブを設計して、高ストリンジェンシーな条件下で、これらの標的にハイブリダイズさせる。このような条件下では、高い程度の相補性を有する単一の核酸鎖のみが、互いにハイブリダイズする。このような高い程度の相補性を有さない単一の核酸鎖は、ハイブリッドを形成しない。従って、アッセイ条件のストリンジェンシーは、ハイブリッドを形成するために２つの核酸鎖の間に存在しなければならない相補性の量を決定する。ストリンジェンシーは、プローブと標的核酸との間に形成されるハイブリッドと、プローブと試験サンプル中に存在する任意の非標的核酸との間に形成される潜在的なハイブリッドとの間の安定性の相違を最大化するように選択される。
【００８０】
非標的生物体の配列に対して完全な相補性を有するハイブリダイゼーションアッセイプローブの長さを最小にすることによって、非標的核酸に対するＧリッチ領域およびＣリッチ領域の相補性を回避することよって、および非標的配列に対する出来る限り多くの不安定化ミスマッチを含むようにプローブを構築することによって、適切な特異性が達成され得る。プローブが特定の型の生物体のみを検出するのに適切であるか否かは、プローブ：標的ハイブリッドとプローブ：非標的ハイブリッドとの間の熱安定性相違に大きく依存する。プローブを設計する際に、これらのＴｍ値における相違は、出来る限り大きくあるべきである（好ましくは、２〜５℃以上）。このＴｍ値の操作は、プローブの長さおよびプローブの組成（例えば、ＧＣ含有量 対 ＡＴ含有量）に対する変化によって達成され得る。
【００８１】
一般的に、オリゴヌクレオチドプローブについての最適なハイブリダイゼーション温度は、所定の二重鎖についての融解温度よりおよそ５℃低い。最適な温度より低い温度でのインキュベーションによって、ミスマッチの塩基配列がハイブリダイズするのを可能にし得、それによって特異性を減少させ得る。プローブが長いほど、塩基対間の水素結合が多くなり、一般にＴｍはより高くなる。ＧおよびＣの割合の増加もまた、Ｔｍを増加させる。なぜなら、Ｇ−Ｃ塩基対は、さらなる水素結合を示し、それによって、熱安定性がＡ−Ｔ塩基対よりも高くなるからである。このような考慮は、当業者に公知である（例えば、Ｊ．ＳＡＭＢＲＯＯＫら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，第１１章（第２版、１９８９）を参照のこと）。
【００８２】
Ｔｍを決定するための好ましい方法は、周知のＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ（ＨＰＡ）（Ａｅｎｏｌｄら、「Ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ」、米国特許第５，２８３，１７４号によって開示される）を用いて、ハイブリダイゼーションを測定する。このＴｍは、以下の様式においてＨＰＡを使用して測定され得る。プローブ分子を、アクリジニウムエステルを用いて標識し、コハク酸リチウム緩衝液（０．１Ｍ コハク酸リチウム緩衝液、ｐＨ４．７、２０ｍＭ ＥＤＴＡ、１５ｍＭ アルドリチオール（ａｌｄｒｉｔｈｉｏｌ）−２、１．２Ｍ ＬｉＣｌ、３％（ｖ／ｖ） 無水エタノール、２％（ｗ／ｖ）ラウリル硫酸リチウム）中で、過剰な量の標的を使用して、プローブ：標的ハイブリッドを形成するのを可能にする。次いで、プローブ：標的ハイブリッドを含有する溶液のアリコートを、コハク酸リチウム緩衝液に希釈し、種々の温度（予測されるＴｍ（代表的には、５５℃）よりも低い温度から開始して、２〜５℃増加させていく）にて、５分間インキュベートする。次いで、この溶液を、穏やかなホウ酸アルカリ緩衝液（６００ｍＭ ホウ酸、２４０ｍＭ ＮａＯＨ、１％（ｖ／ｖ） ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００、ｐＨ８．５）で希釈し、等しいかまたはより低い温度で（例えば、５０℃）にて、１０分間インキュベートする。
【００８３】
これらの条件下において、一本鎖プローブに結合されたアクリジニウムエステルは加水分解されるが、ハイブリダイズしたプローブに結合されたアクリジニウムエステルは、加水分解から比較的保護される。従って、加水分解処理した後に残存しているアクリジニウムエステルの量は、ハイブリッド分子の数に比例する。この残存しているアクリジニウムエステルは、過酸化水素およびアルカリをこの溶液に添加することによって残存するアクリジニウムエステルから生成される化学発光をモニタリングすることによって測定され得る。化学発光は、照度計（例えば、ＬＥＡＤＥＲ（登録商標） ４５０ｉ 照度計（Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ；カタログ番号３２００ｉ））で測定され得る。得られたデータを、最大シグナル（通常は、最も低い温度からの）％ 対 温度としてプロットする。このＴｍは、最大シグナルの５０％が残存している温度として定義される。上記方法に加えて、Ｔｍは、当業者に公知の同位体方法によって決定され得る（例えば、米国特許第５，８４０，４８８号を参照のこと）。
【００８４】
所定のハイブリッドに対するＴｍは、使用されるハイブリダイゼーション溶液の性質に依存して変化することに注意しなければならない。因子（例えば、塩濃度、界面活性剤、および他の溶質）は、熱変性の間にハイブリッド安定性に影響を及ぼし得る（例えば、ＳＡＭＢＲＯＯＫら、前出、第１１章を参照のこと）。プローブが標的にハイブリダイズするのを可能にする条件（例えば、イオン強度、および温度）は、プローブ構築物において考慮されるべきである。（ハイブリッド核酸の熱安定性は、反応混合物のイオン強度に伴って増加する。）他方で、水素結合を破壊させる化学試薬（例えば、ホルムアミド、尿素、ジメチルスルホキシド、およびアルコール）は、ハイブリッド熱安定性を大いに減少させ得る。
【００８５】
その標的に対するハイブリダイゼーションアッセイプローブの特異性を保証するために、高ストリンジェンシーの条件下で標的核酸にのみハイブリダイズするプローブを設計することが好ましい。高度に相補的な配列のみが、高ストリンジェンシーな条件下で、ハイブリッドを形成する。従って、アッセイ条件のストリンジェンシーは、安定なハイブリッドを形成するために２つの配列間で必要とされる相補性の量を決定する。ストリンジェンシーは、プローブ：標的ハイブリッドと潜在的なプローブ：非ハイブリッドとの間の安定性における相違を最大にするように選択されなければならない。
【００８６】
特定のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例は、下記の実施例の節に提供される。もちろん、代替的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、本開示に基づいて、当業者によって決定され得る（例えば、ＳＡＭＢＲＯＯＫら、前出、第１１章を参照のこと）。
【００８７】
標的核酸配列領域の長さ、従って、プローブ配列の長さもまた、重要であり得る。いくつかの場合において、位置および長さが異なる、特定の領域由来のいくつかの配列が存在し得、これらの配列は、所望のハイブリダイゼーション特性を有するプローブを設計するために使用され得る。他の場合において、あるプローブが、単に一塩基だけが異なる別のプローブよりも、特異性の点から、より有意なプローブであり得る。完全には相補的でない核酸がハイブリダイズすることは可能であるが、完全に相補的な塩基の最も長いストレッチ、および塩基組成が、一般に、ハイブリッド安定性を決定する。
【００８８】
ハイブリダイゼーションを阻害する強力な内部構造を形成することが公知のｒＲＮＡ領域は、特に、前記のヘルパープローブが使用されないアッセイにおいて、それほど好ましい標的領域ではない。同様に、広範な自己相補性を有するプローブは、一般には回避され、特定の例外は以下で議論される。鎖が分子内ハイブリッドまたは分子間ハイブリッドに、全体的にまたは部分的に関与する場合、その鎖は、反応条件を変更しないで、新規の分子間プローブ：標的ハイブリッドの形成にそれほど関与し得ない。リボソームＲＮＡ分子は、水素結合によって、非常に安定な分子内らせん構造および二次構造を形成することが知られている。ハイブリダイゼーション条件下で実質的に一本鎖のままである標的核酸の領域に対するプローブを設計することによって、プローブと標的との間のハイブリダイゼーションの速度および程度が、増加され得る。
【００８９】
ゲノムリボソーム核酸（ｒＤＮＡ）標的は、天然で二本鎖形態で存在し、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の生成物も問題である。。これらの二本鎖標的は、天然でプローブとのハイブリダイゼーションに阻害性であり、ハイブリダイゼーション前に変性を必要とする。適切な変性およびハイブリダイゼーション条件は、当業者に公知である（例えば、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｅ．Ｍ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，９８：５０３（１９７５）を参照のこと）。
【００９０】
それらの標的核酸に対して完全に一致したオリゴヌクレオチドについての融解温度の推定値を提供する、多数の式が利用可能である。このような式の１つは、以下である：
Ｔｍ＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋０．４１（Ｇ＋Ｃの割合）−（６００／Ｎ）
（ここで、Ｎは、ヌクレオチド数でのオリゴヌクレオチドの長さである。）この式は、１４ヌクレオチド長と６０〜７０ヌクレオチド長との間のオリゴヌクレオチドに対するＴｍの良好な推定値を与える。このような計算から、その後のＴｍの経験的検証または「微調整」が、当業者に周知のスクリーニング技術を使用してなされ得る。ハイブリダイゼーションおよびオリゴヌクレオチドプローブに関するさらなる情報については、ＳＡＮＢＲＯＯＫら、前出、第１１章を参照にし得る。とりわけ当業者に周知のこの参照はまた、ハイブリッドのＴｍに対するミスマッチの有効な推定を提供する。従って、２つ以上の生物体のリボソームＲＮＡ（またはｒＤＮＡ）の所定の領域の既知のヌクレオチド配列から、これらの生物体を互いに区別するオリゴヌクレオチドが設計され得る。
【００９１】
（Ｃ．核酸増幅）
好ましくは、本発明の増幅プライマーは、オリゴデオキシヌクレオチドであり、そして核酸ポリメラーゼによる伸長産物の合成のための基質として使用するのに、十分に長い。最適なプライマー長は、いくつかの因子を考慮しなければならず、これらの因子としては、反応温度、プライマーの構造および塩基組成、ならびにプローブの使用方法が挙げられる。例えば、最適な特異性のために、オリゴヌクレオチドプライマーは、一般に、標的核酸配列の複雑性に依存して、少なくとも１２塩基長であるべきである。このような特異性が必要でない場合、より短いプライマーが使用され得る。このような場合、より低い温度で反応を行って、テンプレート核酸との安定なハイブリッド複合体を形成することが望ましくあり得る。
【００９２】
所望の特徴を有する増幅プライマーおよびハイブリダイゼーションアッセイプローブを設計するための有用な指針は、表題「Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ」の節で、以下に記載される。増幅およびプローブ化のための最適な部位は、少なくとも２つ（好ましくは、３つ）のＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍまたはＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ核酸の保存領域を含む。これらの領域は、約１５〜３５０塩基長、好ましくは、約１５塩基長と１５０塩基長との間である。
【００９３】
一セットの増幅プライマー（プライマーおよび／またはプロモーター−プライマー）を用いて観察された増幅の程度は、いくつかの因子に依存しており、これらの因子としては、プライマーがそれらの特定の標的配列にハイブリズする能力、および酵素学的に伸長または複製されるそれらの能力が挙げられる。異なる長さおよび塩基組成の増幅プライマーが使用され得るが、本発明において好ましい増幅プライマーは、１８〜４０塩基の標的結合領域を有し、標的に対する推定Ｔｍは、約４２℃である。
【００９４】
プローブハイブリダイゼーションに影響を及ぼすパラメータ（例えば、標的配列のＴｍ、相補性、および二次元構造）はまた、増幅プライマーハイブリダイゼーション、従って増幅プライマーの性能に影響を及ぼす。非特異的伸長（プライマーの二量体、または非標的複製）の程度もまた増幅効率に影響を及ぼし得る。従って、増幅プライマーは、特に、それらの配列の３’末端で、低い自己相補性または交差相補性を有するように選択される。それにもかかわらず、本発明者らは、下記の「シグナルプライマー」が自己相補性領域を含むように改変され得、それによって、そのシグナルプライマーを「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｏｒｃｈ（分子トーチ）」または「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎ（分子ビーコン）」シグナルプライマーこれらの用語は以下で定義される）へ転換し得る。冗長なホモポリマーの連続および高いＧＣ含有量は、偽性のプライマー伸長を減少するために回避される。設計でのこれらの局面を補助するために、コンピュータープログラムが利用可能であり、これらとしては、Ｏｌｉｇｏ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．から入手可能なＯｌｉｇｏ Ｔｅｃｈ（登録商標）ソフトウェアが挙げられ、以下のＵＲＬでワールドワイドウェブにアクセスすることが出来る：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｏｌｉｇｏｓｅｔｃ．ｃｏｍ／ＯｌｉｇｏＴｅｃｈ．ｈｔｍｌ。
【００９５】
本発明の増幅プライマーと組み合わせて使用される核酸ポリメラーゼとは、リボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチドのいずれか、または両方を、核酸ポリマーまたは核酸鎖中に、テンプレートに依存的な様式で組み込む、化学薬剤、物理的薬剤または生物学的薬剤をいう。核酸ポリメラーゼの例としては、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、およびＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼが挙げられる。ＤＮＡポリメラーゼは、テンプレートに依存的な様式において、そして５’から３’の方向で、核酸合成を引き起こす。二本鎖核酸における２つの鎖の代表的な逆平行方向に起因して、この方向は、テンプレート上の３’領域からテンプレート上の５’領域である。ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼの例としては、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）由来の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、およびＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｂｓｔ）由来のＤＮＡポリメラーゼＩの大フラグメントが挙げられる。ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼの例としては、種々のレトロウイルス逆転写酵素（例えば、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）逆転写酵素または鳥類骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素）が挙げられる。
【００９６】
大部分の核酸増幅反応の間に、核酸ポリメラーゼは、標的核酸をテンプレートとして使用して、ヌクレオチド残基をプライマーの３’末端に付加し、それによってこの標的核酸の領域に部分的または完全に相補的なヌクレオチド配列を有する第二の核酸鎖を合成する。多数の核酸増幅反応において、生じた二本鎖構造を含む２つの鎖は、増幅反応が進行するのを可能にするように、化学的手段または物理的手段によって分離されなければならない。あるいは、新しく合成されたテンプレート鎖は、他の手段によって（例えば、鎖置換または元の標的鎖の一部または全てを消化する核酸分解（ｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃ）酵素のその使用によって）、第二のプライマーまたはプロモーター−プライマーとのハイブリダイゼーションに有効可能にされ得る。このようにして、このプロセスは、多数のサイクルを通して繰り返され得、標的ヌクレオチド配列を有する核酸分子の数を大いに増加させる。
【００９７】
第一増幅プライマーもしくは第二増幅プライマーのいずれか、またはそれらの両方は、プロモーター−プライマーであり得る。（いくらかの適用において、この増幅プライマーは、Ｋａｃｉａｎら、「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄ，Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ａｎｄ Ｋｉｔ」、米国特許第５，５５４，５１６号に開示されるように、センス鎖に相補的なプロモーター−プライマーのみからなり得る。）プロモーター−プライマーは、通常は、標的核酸分子またはプライマー伸長産物中に存在するヌクレオチド配列に相補的ではないオリゴヌクレオチドを含有する（このようなオリゴヌクレオチドの記載については、Ｋａｃｉａｎら、「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄ」、米国特許第５，３９９，４９１号を参照のこと）。これらの非相補的な配列は、増幅プライマー上の相補的な配列に対して５’側に位置し得、そして核酸ポリメラーゼの作用を介して二重鎖が作製される場合、ＲＮＡ合成の開始のための遺伝子座を提供し得る。このように、提供されるプロモーターは、標的核酸配列の複数のＲＮＡコピーのインビトロ転写を可能にし得る。本明細書中のプライマーに対して言及される場合、このような言及は、この言及の内容が明らかに他を示さない限り、プロモータ−プライマーのプライマーの局面を含むことが意図されることが明らかである。
【００９８】
いくつかの増幅系（例えば、Ｄａｔｔａｇｕｐｔａら、「Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ｓｔｒａｎｄ Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ」、米国特許第６，０８７，１３３号によって開示される増幅方法を参照のこと）において、増幅プライマーは、鎖置換を補助する５’非相補的ヌクレオチドを含み得る。さらに、５’エキソヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼと組み合わせて使用される場合、増幅プライマーは、酵素消化を防ぐために、それらの５’末端で改変を有し得る。あるいは、核酸ポリメラーゼは、５’エキソヌクレアーゼ活性を取り除くように、例えば、このようなヌクレアーゼ活性を有さない活性なポリメラーゼフラグメントを生成するプロテアーゼで処理することによって、改変され得る。このような場合、プライマーは、それらの５’末端で改変される必要はない。
【００９９】
（１．オリゴヌクレオチドの調製）
本発明のオリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブを、当該分野で公知の方法により容易に調製し得る。好ましくは、このオリゴヌクレオチドを、固相法により合成し得る。例えば、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓは、標準的なホスホロアミダイト固相化学を用いて、ホスホロジエステル結合によりヌクレオチドを結合することを記載する（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ、Ｍ．Ｈ．ら Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１５４：２８７（１９８７）を参照のこと）。シアノエチルホスホロアミダイト前駆物質を用いた自動化固相化学合成がＢａｒｏｎｅにより記載される（Ｂａｒｏｎｅ、Ａ．Ｄ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１２（１０）：４０５１（１９８４）を参照のこと）。同様に、Ｂａｔｔ、「Ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ Ｒｅａｇｅｎｔ ｆｏｒ Ｓｕｌｆｕｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｏｒｇａｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｏｕｓ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ」米国特許第５，４４９，７６９号は、ホスホロチオエート結合を含むオリゴヌクレオチドを合成する手順について開示する。さらにＲｉｌｅｙら、「Ｐｒｏｃｅｓｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｏｌｉｇｏｍｅｒｓ」米国特許第５，８１１，５３８号は、メチルホスホネート結合を含む異なる結合を有するオリゴヌクレオチドの合成を開示する。さらに、オリゴヌクレオチドの有機合成方法は、当業者に公知であり、例えば、ＳＡＭＢＲＯＯＫら（前出、第１０章）に記載される。
【０１００】
特定のオリゴヌクレオチドの合成および精製の後に、いくつかの異なる手順が使用されて、このオリゴヌクレオチドを精製し、その質を調整し得る。適切な手順は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動または高圧液体クロマトグラフィを含む。これら両方の手順は、当業者に周知である。
【０１０１】
本発明のオリゴヌクレオチド（ハイブリダイゼーションアッセイプローブ、増幅プライマーまたはヘルパープローブのいずれか）の全ては、化学基で修飾されて、これらの機能を増大し得るか、増幅産物の特性を亢進し得る。
【０１０２】
例えば、骨格修飾オリゴヌクレオチド、例えば、このオリゴヌクレオチドに、特定のポリメラーゼの核酸溶解活性もしくはヌクレアーゼ酵素に対する抵抗性を与える、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、２’−Ｏ−アルキルまたはペプチド基を有するものは、このような酵素を、増幅または他の増幅反応において使用することを可能にし得る。修飾の別の例は、プローブまたはプライマーの核酸鎖中のヌクレオチド間に取りこまれた非ヌクレオチドリンカー（Ａｒｎｏｌｄら、「Ｎｏｎ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｌｉｎｋｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｒｏｂｅｓ」米国特許第６，０３１，０９１号）の使用を含み、これは、プローブのハイブリダイゼーションまたはプライマーのハイブリダイゼーションおよび伸長を妨げない。本発明のオリゴヌクレオチドはまた、所望される修飾ヌクレオチドおよび天然ヌクレオチドの混合物を含み得る。
【０１０３】
増幅プライマーの３’末端を、改変またはブロックして、ＤＮＡ合成の開始を予防または阻害し得る（Ｋａｃｉａｎら、米国特許第５，５５４，５１６号に開示される）。プライマーの３’末端を、当該分野で公知の種々の方法により改変し得る。例えば、プライマーに対する適切な改変は、リボヌクレオチド、３’デオキシヌクレオチド残基（例えば、コルジセピン）、２’，３’−ジデオキシヌクレオチド残基、改変ヌクレオチド結合（例えば、ホスホロチオエート）および非ヌクレオチド結合（例えば、Ａｒｎｏｌｄら、米国特許第６，０３１，０９１号）、またはアルカンジオール改変（Ｗｉｌｋら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１８：２０６５（１９９０））の添加を含み得るが、この改変は単に、標的核酸配列に対して相補的でないプライミング配列の３’側の領域からなり得る。さらに、異なる３’ブロックプライマーの混合物または３’ブロックおよび非ブロックプライマーの混合物は、以下に記載のように核酸増幅の効率を増大し得る。
【０１０４】
上記のように、プライマーの５’末端ヌクレオチドを改変して、いくつかの核酸ポリメラーゼに存在する５’エキソヌクレアーゼ活性に対し抵抗性にし得る。このような改変を、Ａｒｎｏｌｄら、米国特許第６，０３１，０９１号に開示されるような技術を使用して、非ヌクレオチド基をプライマーの５’末端に添加することにより実施し得る。
【０１０５】
一旦合成されると、選択されたオリゴヌクレオチドを、いくつかの周知の方法により標識し得る（例えば、ＳＡＭＢＲＯＯＫ、前出、第１０章）を参照のこと）。有用な標識は、放射性同位元素および非放射活性レポート基を含む。同位体標識としては、３Ｈ、３５Ｓ、３２Ｐ、１２５Ｉ、５７Ｃｏおよび１４Ｃが挙げられる。同位体標識を、オリゴヌクレオチド中に、当該分野で公知の技術（例えば、ニックトランスレーション、末端標識、第２鎖合成、逆転写の使用、および化学的方法）により導入され得る。放射性標識プローブを使用する場合、ハイブリダイゼーションを、オートラジオグラフィー、シンチレーション計数またはγ線計数により検出し得る。選択される検出方法は、標識するために使用される特定の放射性同位体に依存する。
【０１０６】
非同位体物質もまた、標識に使用し得て、核酸配列中または核酸配列の末端に導入され得る。改変ヌクレオチドを、酵素的または化学的に導入し得る。プローブの化学的改変を、プローブの合成中または合成後に実施し得る（例えば、Ａｒｎｏｌｄら、米国特許第６，０３１，０９１号に開示されるような非ヌクレオチドリンカー基の使用を介する）。非同位体標識としては、蛍光分子（Ｔｙａｇｉら、「Ｄｅｔｅｃｔａｂｌｙ Ｌａｂｅｌｅｄ Ｄｕａｌ Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｒｏｂｅｓ， Ａｓｓａｙｓ ａｎｄ Ｋｉｔｓ」米国特許第５，９２５，５１７号に開示される蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）対のような個々の標識または標識の組み合わせ、化学発光分子、酵素、補因子、酵素基質、ハプテンまたは他のリガンド）が挙げられる。
【０１０７】
本発明のハイブリダイゼーションアッセイプローブを用いて、好ましくはプローブをアクリジニウムエステルを伴った非ヌクレオチドリンカーを用いて標識する。アクリジニウムエステル標識を、Ａｒｎｏｌｄら、「Ａｃｒｉｄｉｎｉｕｍ Ｅｓｔｅｒ Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｒｏｂｅｓ」米国特許第５，１８５，４３９号に開示されるように実施し得る。
【０１０８】
（２．Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍリボソーム核酸の増幅）
本発明の増幅プライマーは、ＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍまたはＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ生物体に由来する１８Ｓリボソーム核酸領域を指向する。これらの増幅プライマーは、ＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍまたはＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ生物体の存在を、核酸増幅アッセイにおいて検出するために使用されるハイブリダイゼーションアッセイプローブの少なくとも１つの標的核酸配列（またはその相補体）に隣接するか、重複するかまたは含まれ得る。上記のように、増幅プライマーはまた、非相補的塩基を、ＲＮＡポリメラーゼに結合し得るか、標的核酸をテンプレートとして用いてＲＮＡ転写を指示し得るプロモーター配列を含むこれらの５’末端に含み得る。Ｔ７プロモーター配列（例えば、配列番号６９）を使用し得る。
【０１０９】
本発明の増幅プライマーは、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ生物体由来の核酸中に存在する標的核酸配列を、増幅条件下で増幅し得る。これらの増幅プライマーは、以下の塩基配列を有するかまたは実質的に対応するオリゴヌクレオチドを含む：配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７または配列番号６８。
【０１１０】
あるいは、本発明の増幅プライマーは、増幅条件下で核酸ポリメラーゼと結合する場合に、以下の塩基配列を有する核酸領域を介して結合または伸長が生じるオリゴヌクレオチドを含む：配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７または配列番号６８。
【０１１１】
１つの好ましい実施形態において、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ核酸を増幅するための少なくとも２つの増幅プライマーのセットが提供され、以下を含む：（ｉ）配列番号４５、配列番号５１、配列番号５７、または配列番号６３の塩基配列を有するかまたは実質的に対応するオリゴヌクレオチドを含む第１の増幅プライマー；および（ｉｉ）配列番号４７、配列番号５３、配列番号５９、または配列番号６５の塩基配列を有するかまたは実質的に対応するオリゴヌクレオチドを含む第２の増幅プライマー。好ましくは、第１の増幅プライマーは、配列番号４５の塩基配列を有するかまたは実質的に対応するオリゴヌクレオチドを含み、第２の増幅プライマーは、配列番号５９の塩基配列を有するかまたは実質的に対応するオリゴヌクレオチドを含む。
【０１１２】
別の好ましい実施形態において、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ核酸を増幅するための少なくとも２つの増幅プライマーのセットが提供され、以下を含む：（ｉ）配列番号４５、配列番号５１、配列番号５７、または配列番号６３の塩基配列を有するかまたは実質的に対応するオリゴヌクレオチドを含む第１の増幅プライマー；および（ｉｉ）配列番号４８、配列番号５４、配列番号６０、または配列番号６６の塩基配列を有するかまたは実質的に対応するオリゴヌクレオチドを含む第２の増幅プライマー。好ましくは、第１の増幅プライマーは、配列番号４５の塩基配列を有するかまたは実質的に対応するオリゴヌクレオチドを含み、第２の増幅プライマーは、配列番号６０の塩基配列を有するかまたは実質的に対応するオリゴヌクレオチドを含む。
【０１１３】
なお別の実施形態において、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ核酸を増幅するための少なくとも２つの増幅プライマーのセットが提供され、以下を含む：（ｉ）配列番号４６、配列番号５２、配列番号５８、または配列番号６４の塩基配列を有するかまたは実質的に対応するオリゴヌクレオチドを含む第１の増幅プライマー；および（ｉｉ）配列番号４８、配列番号５４、配列番号６０、または配列番号６６の塩基配列を有するかまたは実質的に対応するオリゴヌクレオチドを含む第２の増幅プライマー。好ましくは、第１の増幅プライマーは、配列番号４６の塩基配列を有するかまたは実質的に対応するオリゴヌクレオチドを含み、第２の増幅プライマーは、配列番号６０の塩基配列を有するかまたは実質的に対応するオリゴヌクレオチドを含む。
【０１１４】
なお別の実施形態において、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ核酸を増幅するための少なくとも２つの増幅プライマーのセットが提供され、以下を含む：（ｉ）配列番号４６、配列番号５２、配列番号５８、または配列番号６４の塩基配列を有するかまたは実質的に対応するオリゴヌクレオチドを含む第１の増幅プライマー；および（ｉｉ）配列番号４７、配列番号５３、配列番号５９、または配列番号６５の塩基配列を有するかまたは実質的に対応するオリゴヌクレオチドを含む第２の増幅プライマー。好ましくは、第１の増幅プライマーは、配列番号４６の塩基配列を有するかまたは実質的に対応するオリゴヌクレオチドを含み、第２の増幅プライマーは、配列番号５９の塩基配列を有するかまたは実質的に対応するオリゴヌクレオチドを含む。
【０１１５】
さらに好ましい実施形態において、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ核酸を増幅するための少なくとも２つの増幅プライマーのセットが提供され、以下を含む：（ｉ）配列番号４９、配列番号５５、配列番号６１、または配列番号６７の塩基配列を有するかまたは実質的に対応するオリゴヌクレオチドを含む第１の増幅プライマー；および（ｉｉ）配列番号５０、配列番号５６、配列番号６２、または配列番号６８の塩基配列を有するかまたは実質的に対応するオリゴヌクレオチドを含む第２の増幅プライマー。好ましくは、第１の増幅プライマーは、配列番号４９の塩基配列を有するかまたは実質的に対応するオリゴヌクレオチドを含み、第２の増幅プライマーは、配列番号６２の塩基配列を有するかまたは実質的に対応するオリゴヌクレオチドを含む。
【０１１６】
本発明の増幅プライマーは、例えば、３’および／または５’末端がブロックされた改変（上記に議論されるように）、または配列の付加（ＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ７、Ｔ３またはＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ）によって認識される特異的ヌクレオチド配列、ＲＮＡポリメラーゼによってＲＮＡ転写の開始または伸長を増大する配列、または分子間の塩基対を提供し、核酸の２次構造もしくは３次構造の形成を支持し得る配列を含むが、これらに限定されない）を有し得る。
【０１１７】
増幅プライマーを、核酸増幅手順（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、転写媒介性増幅（ＴＭＡ）、核酸配列をベースにした増幅（ＮＡＳＢＡ）、自立した配列増幅（３ＳＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、鎖解離増幅（ＳＤＡ）、およびＬｏｏｐ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＬＡＭＰ）において使用し、これらのそれぞれは、当該分野で周知である（例えば、Ｍｕｌｌｉｓ、「Ｐｒｏｃｅｓｓ ｆｏｒ Ａｍｐｌｉｆｙｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」米国特許第４，６８３，２０２号；Ｅｒｌｉｃｈら、「Ｋｉｔｓ ｆｏｒ Ａｍｐｌｉｆｙｉｎｇ ａｎｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」米国特許第６，１９７，５６３号；Ｗａｌｋｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２０：１６９１−１６９６（１９９２）；Ｆａｈｙら、「Ｓｅｌｆ−ｓｕｓｔａｉｎｅｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ（３ＳＲ）：Ａｎ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−Ｂａｓｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｔｏ ＰＣＲ」ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、１：２５−３３（１９９１）；Ｋａｃｉａｎら、米国特許第５，３９９，４９１；Ｋａｃｉａｎら、「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ」米国特許第５，４８０，７８４号；Ｄａｖｅｙら、「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｐｒｏｃｅｓｓ」米国特許第５，５５４，５１７号；Ｂｉｒｋｅｎｍｅｙｅｒら、「Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔａｒｇｅｔ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｕｓｉｎｇ Ｇａｐ Ｆｉｌｌｉｎｇ Ｌｉｇａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ」米国特許第５，４２７，９３０号；Ｍａｒｓｈａｌｌら、「Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＲＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ Ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ Ｌｉｇａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ」米国特許第５，６８６，２７２号；Ｗａｌｋｅｒ、「Ｓｔｒａｎｄ Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ」米国特許第５，７１２，１２４号；Ｎｏｔｏｍｉら、「Ｐｒｏｃｅｓｓ ｆｏｒ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ」欧州特許出願番号１ ０２０ ５３４ Ａ１；Ｄａｔｔａｇｕｐｔａら、「Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ｓｔｒａｎｄ Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ」米国特許第６，２１４，５８７号；およびＨＥＬＥＮ Ｈ．ＬＥＥら、ＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤ ＡＭＰＬＩＦＩＣＡＴＩＯＮ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ：ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮ ＴＯ ＤＩＳＥＡＳＥ ＤＩＡＧＮＯＳＩＳ（１９９７）を参照こと）。前出の「核酸増幅」の定義を満たす他の任意の増幅手順はまた、本発明者らにより企図される。
【０１１８】
本発明の増幅プライマーは、好ましくは非標識であるが、１つ以上のレポーター基を含み、ハイブリダイゼーションアッセイプローブと組み合わせてか、またはハイブリダイゼーションアッセイプローブを含まずに、標的核酸の検出を容易にし得る。増幅された標的配列を検出するための広範な種々の方法が利用可能である。例えば、ヌクレオチド基質またはプライマーは、新たに合成されたＤＮＡ中に取りこまれた検出可能な標識を含み得る。次いで、得られた標識増幅産物を一般的に、未使用の標識ヌクレオチドまたはプライマーから分離し、分離した生成物画分において、検出する（例えば、Ｗｕ。「Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｕｓｉｎｇ Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ Ｃａｐｔｕｒｅ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｔｅｓｔ Ｋｉｔ」米国特許第５，３８７，５１０号を参照のこと）。
【０１１９】
しかし、プライマーが、例えば、ドナー／アクセプター色素対を形成する２つの色素に結合することにより修飾されている場合、分離する工程は、必要でない。プライマーが標的核酸にハイブリダイズせず、このことにより物理的に２つの色素を分離する限り、修飾プライマーを、１つの色素対メンバーの蛍光が、他の色素対メンバーによりクエンチされたままであるように設計し得る。さらに、プライマーを改変して、２つの色素の間に位置する制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含むようし得、改変プライマーと標的核酸との間でハイブリッドが形成される場合、制限エンドヌクレアーゼ認識部位は、２重鎖となり、適切な制限エンドヌクレアーゼによる切断またはニック形成に利用可能である。次いでハイブリッドの切断またはニック形成は、２つの色素を分離し、クエンチの減少に起因する蛍光の変化を生じる。この蛍光変化を、試験試料中の標的生物体の存在を示すものとして検出し得る。この型の改変プライマーは、「シグナルプライマー」として示され、Ｎａｄｅａｕら、「Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ｂｙ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ」米国特許第６，０５４，２７９号により開示される。
【０１２０】
有用に検出可能な標識を供し得る物質は、当該分野で周知であり、放射性同位元素、蛍光分子、化学発光分子、発色団およびリガンド（例えば、ビオチンおよびハプテン）（直接検出されないが、これらの特定的結合パートナー（例えば、それぞれアビジンおよび抗体）の標識形態と反応することにより容易に検出され得る。
【０１２１】
別のアプローチは、検出可能な標識オリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイゼーションし、任意の従来の様式において、得られたハイブリッドを測定することにより増幅産物を検出することである。特に、この生成物を、化学発光アクリジウムエステル標識オリゴヌクレオチドプローブを標的配列にハイブリダイズし、ハイブリダイズしなかったプローブ上に存在するアクリジウムエステルを選択的に加水分解し、そして残ったアクリジウムエステルから生ずる化学発光を照度計中で測定することによって評価し得る（例えば、米国特許第５，２８３，１７４号およびＮＯＲＭＡＮ Ｃ． ＮＥＬＳＯＮら、ＮＯＮＩＳＯＴＯＰＩＣ ＰＲＯＢＩＮＧ、ＢＬＯＴＴＩＮＧ，ＡＮＤ ＳＥＱＵＥＮＣＩＮＧ，第１７章（Ｌａｒｒｙ Ｊ．Ｋｒｉｃｋａ編、第２版 １９９５））。
【０１２２】
（Ｄ．Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍリボソーム核酸に対するハイブリダイゼーションアッセイプローブ）
本発明の実施形態は、新規なハイブリダイゼーションアッセイプローブに関する。ハイブリダイゼーションは、水素結合した二重鎖を形成する相補的な核酸の二本鎖の会合である。検出されるべき核酸配列（「標的配列」）にハイブリダイズし得る核酸配列は、標的配列のプローブとして働き得る。ハイブリダイゼーションは、ＤＮＡ／ＤＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡ、およびＲＮＡ／ＲＮＡを含む相補的な核酸鎖の間で生じ得る。ヌクレオチド（塩基であるアデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、チミジン（Ｔ）、グアニン（Ｇ）、ウラシル（Ｕ）、イノシン（Ｉ）、およびそのアナログを含む）から形成された、二本鎖のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、またはリボ核酸（ＲＮＡ）は、ハイブリダイズして二本鎖構造を形成し得る。この二本鎖構造でこの二本鎖は、相補的な塩基の対の間の水素結合によって一緒に保持される。一般に、Ａは、ＴまたはＵに対して水素結合し、一方Ｇは、Ｃに対して水素結合する。従って、ハイブリダイズした鎖にそった任意のポイントで、古典的な塩基対であるＡＴまたはＡＵ、ＴＡまたはＵＡ、ＧＣ、またはＣＧが見出され得る。従って、核酸の第一鎖が、第二鎖に対して相補的な十分連続する塩基を含み、そしてこの二本の鎖がそのハイブリダイゼーションを促進する条件下で一緒にされるとき、二本鎖の核酸が得られる。適切な条件下で、ＤＮＡ／ＤＮＡ、ＲＮＡ／ＤＮＡ、またはＲＮＡ／ＲＮＡハイブリッドが形成され得る。
【０１２３】
ハイブリダイゼーションの速度および程度は、多数の因子によって影響される。例えば、上記の二本の鎖の一方が全体としてまたは部分的にハイブリッドに関与している場合、これは新しいハイブリッドの形成に関与する能力が低いことが暗示される。目的の配列のかなりの部分が一本鎖であるようにプローブを設計することによって、ハイブリダイゼーションの速度および程度は一般に増大し得る。また、標的が、組み込まれたゲノム配列である場合、それはＰＣＲ産物の場合にそうであるように、天然に二本鎖形態で生じる。これらの二本鎖標的は、プローブとのハイブリダイゼーションを天然に阻害し、そしてハイブリダイゼーション工程の前に、変性を要する。さらに、十分な自己相補性が存在する場合は、分子内ハイブリッドおよび分子間ハイブリッドがプローブ内で形成され得る。ハイブリダイゼーションに対して阻害的な強力な内部構造を形成することが公知の核酸の領域は、好適度が低い。このような構造の例としては、ヘアピンループが挙げられる。同様に、広い自己相補性を有するプローブは一般に回避されるべきである。全てのこれらの所望されない構造は、注意深いプローブ設計を通じて回避され得、そして市販のコンピュータープログラム（例えば、Ｏｌｉｇｏ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．から入手可能なＯｌｉｇｏ Ｔｅｃｈ（登録商標）分析ソフトウェア）は、これらのタイプの相互作用についての検索のために利用可能である。
【０１２４】
いくつかの適用において、少なくともある程度の自己相補性を示すプローブは、検出の前にハイブリダイズしていないプローブをまず除去する必要なしに、試験サンプルにおいてプローブ：標的二重鎖の検出を促進することが所望され得る。例えば、「分子トーチ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｏｒｃｈ）」と呼ばれる構造は、自己相補性の明白な領域（鋳造された「標的結合ドメイン」および「標的閉鎖ドメイン」）を含むように設計され、この領域は、連結領域によって接続され、そして前に決定されたハイブリダイゼーションアッセイ条件下でお互いにハイブリダイズする。変性条件に対して曝露された場合、分子トーチの２つの相補性領域（完全にまたは部分的に相補的であり得る）は、融解し、事前に決定したハイブリダイゼーションアッセイ条件を回復するとき、標的配列に対するハイブリダイゼーションのために利用可能な標的結合ドメインを残す。標的結合ドメインが、標的閉鎖ドメインよりも標的配列に対するハイブリダイゼーションを支持するように分子トーチを設計する。分子トーチの標的結合ドメインおよび標的閉鎖ドメインは、この分子トーチが、標的核酸にハイブリダイズするときよりも自己ハイブリダイズされる場合、異なるシグナルが生じるように配置された相互作用する標識（例えば、発光体／クエンチャー）を含み、それによって分子トーチに会合した存在可能な標識を有するハイブリダイズしていないプローブの存在下で試験サンプル中のプローブ：標的二本鎖の検出を可能にする。（分子トーチは、Ｂｅｃｋｅｒら「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｏｒｃｈｅｓ」米国特許出願番号０９／３４６，５５１号および国際公開番号ＷＯ００／０１８５０（その両方ともこれとともに共有権を享受する）に開示される）。
【０１２５】
自己相補性を有するハイブリダイゼーションアッセイプローブの別の例は、「分子ビーコン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎ）」と一般に呼ばれる構造である。分子ビーコンは、標的相補配列を有する核酸分子、標的核酸配列の非存在下で閉鎖されたコンフォメーションにおいてプローブを保持するアフィニティー対（または核酸アーム）、および標識対（プローブが閉鎖されたコンフォメーションにある場合相互作用する）を含む。標的核酸および標的相補性配列のハイブリダイゼーションは、アフィニティー対のメンバーを分け、それによってこのプローブを開放（ｏｐｅｎ）コンフォメーションにシフトする。開放コンフォメーションへのシフトは、標識対（例えば、発蛍光団およびクエンチャー（例えば、ＤＡＢＣＹＬ、およびＥＤＡＮＳ））の相互作用の減少に起因して検出可能である。（分子ビーコン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎｓ）は、米国特許第５，９２５，５１７号においてＴｙａｇｉらによって開示されている。
【０１２６】
プローブがその標的にハイブリダイズする速度は、プローブ領域における標的二次構造の熱安定性の１つの尺度である。ハイブリダイゼーション速度の標準的な測定値は、Ｃｏｔ１／２であり、ヌクレオチドのモル／Ｌ×秒として測定される。従って、それは、プローブの濃度×その濃度で最大ハイブリダイゼーションの５０％が生じる時間である。この値は、固定した時間、一定量の標的に対して種々の量のプローブをハイブリダイズすることによって決定される。Ｃｏｔ１／２は、標準的な手順によって図示される。プローブ：標的ハイブリッド融点は、当業者に周知の同位体の方法で決定され得る。所定のハイブリッドに対する融点（Ｔｍ）は、用いられるハイブリダイゼーション溶液に依存して変化する。
【０１２７】
従って、第一の局面において、本発明は、プローブが、ストリンジェントなハイブリダイゼーションアッセイ条件下でＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ核酸に優先的にハイブリダイズする能力によって、非Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ核酸からＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ核酸を識別し得るハイブリダイゼーションアッセイプローブを特徴とする。詳細には、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍプローブは、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ生物体由来の核酸に存在する標的配列に実質的に相補的である塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含む。Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍプローブが、ストリンジェントなハイブリダイゼーションアッセイ条件下でＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ属に属する少なくとも２つの種の存在を検出し得るという条件では、本発明のＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍプローブは、試験サンプル中に存在し得、そしてなおＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍプローブとして特徴づけされるＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ属の全てのメンバーは検出できない。
【０１２８】
関連の局面において、本発明は、プローブが、ストリンジェントなハイブリダイゼーションアッセイ条件下でＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ核酸に優先的にハイブリダイズする能力によって、非Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ核酸からＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ核酸を識別し得るハイブリダイゼーションアッセイプローブを記載する。詳細には、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍプローブは、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ生物体由来の核酸に存在する標的配列に実質的に相補的である塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含む。Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍプローブが、ストリンジェントなハイブリダイゼーションアッセイ条件下でＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ種に属する少なくとも１つの株の存在を検出し得るという条件では、本発明のＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍプローブは、試験サンプル中に存在し得、そしてなおＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍプローブとして特徴づけされるＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ種の全てのメンバーは検出できない。
【０１２９】
ハイブリダイゼーションアッセイの場合、標的核酸配列の長さ、従ってプローブ配列の長さは、重要であり得る。ある場合には、いくつかの配列は、所望のハイブリダイゼーション特徴を有するプローブを生じる、位置および長さの異なる特定の領域に由来し得る。他の場合には、１つの配列は、単に１塩基だけ異なる別の配列よりも良好なハイブリダイゼーション特徴を有し得る。完全に相補的でない核酸がハイブリダイズすることは可能であるが、完全に相同な塩基配列の最長のストレッチが、正常にはハイブリッド安定性を主に決定する。異なる長さおよび塩基組成のプローブが用いられ得るが、本発明において好ましいプローブは、１００塩基長まで、より好ましくは１２〜５０塩基長、そしてなおより好ましくは１８〜３５塩基長のオリゴヌクレオチドを有する。
【０１３０】
ハイブリダイゼーションアッセイプローブは、１８ＳリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、またはそのコードＤＮＡ（ｒＤＮＡ）に実質的に相補的な塩基配列（ＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍまたはＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍの標的配列）を含む。従って、このプローブは、ストリンジェントなハイブリダイゼーションアッセイ条件下でＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍまたはＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ生物体由来の標的配列に安定にハイブリダイズし得る。このハイブリダイゼーションアッセイプローブはまた、標的された核酸領域の外側のさらなる塩基を有し得る。この塩基は、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ由来核酸またはＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ由来核酸に相補的であってもなくてもよいが、試験サンプル中に存在し得る非標的生物体由来の核酸には相補的でない。
【０１３１】
本発明のプローブ（およびプライマー）はまた、固体支持体に連結されている固定されたオリゴヌクレオチドに存在する実質的に相補的な塩基配列に対して、事前に決定したハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし得る塩基配列（標的配列に対してハイブリダイズするように意図された塩基配列とは異なる）から構成される捕獲テール（ｃａｐｔｕｒｅ ｔａｉｌ）を含むように設計され得る。この固定されたオリゴヌクレオチドは好ましくは、磁気的に荷電された粒子に連結され、この粒子は、標的核酸に対してプローブがハイブリダイズするのに十分な時間の経過後、精製工程の間に反応容器中で単離され得る。このような精製工程を実施するために用いられ得る装置の例は、Ａｃｏｓｔａら、「Ａｓｓａｙ Ｗｏｒｋ Ｓｔａｔｉｏｎ」米国特許第６，２５４，８２６号によって開示されている。このプローブは好ましくは、プローブ：標的ハイブリッドの融点がプローブ：固定オリゴヌクレオチドハイブリッドの融点よりも大きいように設計される。この方法では、ハイブリダイゼーションアッセイ条件の異なるセットを使用して、固定されたオリゴヌクレオチドへのプローブのハイブリダイゼーションの前に、標的核酸へのプローブのハイブリダイゼーションを容易にし得、これによって遊離のプローブの濃度を最大化し、そして好ましい液体相のハイブリダイゼーション動態を提供する。この「２工程（ｔｗｏ−ｓｔｅｐ）」標的捕獲方法は、Ｗｅｉｓｂｕｒｇら「Ｔｗｏ Ｓｔｅｐ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃａｐｔｕｒｅ ｏｆ ａ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ」、米国特許第６，１１０，６７８号によって開示されている。本発明に容易に適合可能である他の標的捕獲スキームは、当該分野で周知であり、そして例えば、Ｒａｎｋｉら「Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ｂｙ ａ Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ Ｓａｎｄｗｉｃｈ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｔｅｓｔ」、米国特許第４，４８６，５３９号、およびＳｔａｂｉｎｓｋｙ「Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｋｉｔｓ ｆｏｒ Ｐｅｒｆｏｒｍｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙｓ」米国特許第４，７５１，１７７号によって開示されたスキームを含む。
【０１３２】
Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍプローブについて、用語「標的核酸配列」、「標的ヌクレオチド配列」、「標的配列」、および「標的領域」とは、全てＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍのｒＲＮＡもしくはｒＤＮＡ、またはそれに相補的な配列に存在する核酸配列であって、非Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ種に密接に関連する核酸には存在しない核酸配列をいう。Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍプローブについて、用語「標的核酸配列」、「標的ヌクレオチド配列」、「標的配列」、および「標的領域」とは全て、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍのｒＲＮＡもしくはｒＤＮＡ、またはそれに相補的な配列に存在する核酸配列であって、非Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ種に密接に関連する核酸には存在しない核酸配列をいう。標的配列に相補的なヌクレオチド配列を有する核酸は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、または転写媒介増幅（ＴＭＡ）のような標的増幅技術によって生成され得る。（ＴＭＡは、例えば、Ｋａｃｉａｎら、米国特許第５，３９９，４９１号、およびＫａｃｉａｎら、「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ」、米国特許第５，４８０，７８４号によって開示されている）。
【０１３３】
Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ含有試験サンプルに存在することが期待され得る生物体としては、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒａ ｃａｙｅｔａｎｅｎｓｉｓ、Ｓａｒｃｏｃｙｓｔｉｓ ｈｏｍｉｎｉｓ、Ｅｎｔａｍｏｅｂａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ、およびＥｉｍｅｒｉａ ｐｒａｅｃｏｘが挙げられる。この生物体のリストは、本発明のＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍプローブを用いて識別され得る生物体の完全な代表であることを意図するものでは決してない。概して、本発明のＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍプローブを用いて、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でプローブと安定にハイブリダイズしない任意の非Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ核酸からＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ核酸を識別し得る。
【０１３４】
Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍに密接に関連した生物体としては、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｍｕｒｉｓ、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｂａｉｌｅｙｉ、およびＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｗｒａｉｒｉが挙げられるが、このリストは、本発明のＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍプローブを用いて識別され得る生物体の完全な代表であることを意図するものでは決してない。概して、本発明のＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍプローブを用いて、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でプローブと安定にハイブリダイズしない任意の非Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ核酸からＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ核酸を識別し得る。
【０１３５】
本発明のＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍプローブは、好ましくは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、または配列番号４の塩基配列を有するか、またはその塩基配列に実質的に相当するオリゴヌクレオチドを含む。配列番号１または配列番号２の塩基配列を有するか、またはその塩基配列に実質的に相当するオリゴヌクレオチドを含むＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍプローブは、好ましくは、配列番号１または配列番号２のヌクレオチド１１と１２（５’から３’側に読む）との間に配置された非ヌクレオチドリンカーによってプローブに連結されたアクリジニウムエステル標識を含む。そして配列番号３または配列番号４の塩基配列を有するか、またはその塩基配列に実質的に相当するオリゴヌクレオチドを含むＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍプローブは好ましくは、配列番号３または配列番号４のヌクレオチド１１と１２（５’から３’側に読む）との間に配置された非ヌクレオチドリンカーによってプローブに連結されたアクリジニウムエステル標識を含む。プローブに対するこのアクリジニウムエステル標識の連結は、米国特許第５，１８５，４３９号、および米国特許第６，０３１，０９１号におけるＡｒｎｏｌｄらの教示に従って実行され得る。
【０１３６】
本発明のＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍプローブは好ましくは、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、または配列番号２０の塩基配列を有するか、またはその塩基配列に実質的に相当するオリゴヌクレオチドを含む。好ましいＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍプローブの１グループは、配列番号５、配列番号９、配列番号１３、または配列番号１７の塩基配列を有するか、またはその塩基配列に実質的に相当するオリゴヌクレオチドを含み、そして好ましくは、配列番号５または配列番号９のヌクレオチド１８と１９（５’側から３’側に読む）との間、ならびに配列番号１３または配列番号１７のヌクレオチド９と１０（５’側から３’側に読む）との間に配置された非ヌクレオチドリンカーによってプローブに連結されたアクリジニウムエステル標識を含む。別のグループの好ましいＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍプローブは、配列番号６、配列番号１０、配列番号１４、または配列番号１８の塩基配列を有するか、またはその塩基配列に実質的に相当するオリゴヌクレオチドを含み、そして好ましくは、配列番号６または配列番号１０のヌクレオチド１１と１２（５’側から３’側に読む）との間、ならびに配列番号１４または配列番号１８のヌクレオチド９と１０（５’側から３’側に読む）との間に配置された非ヌクレオチドリンカーによってプローブに連結されたアクリジニウムエステル標識を含む。好ましいＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍプローブのさらなるグループは、配列番号７、配列番号１１、配列番号１５、または配列番号１９の塩基配列を有するか、またはその塩基配列に実質的に相当するオリゴヌクレオチドを含み、そして好ましくは、配列番号７または配列番号１１のヌクレオチド１３と１４（５’側から３’側に読む）との間、ならびに配列番号１５または配列番号１９のヌクレオチド１２と１３（５’側から３’側に読む）との間に配置された非ヌクレオチドリンカーによってプローブに連結されたアクリジニウムエステル標識を含む。好ましいＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍプローブの最後のグループは、配列番号８、配列番号１２、配列番号１６、または配列番号２０の塩基配列を有するか、またはその塩基配列に実質的に相当するオリゴヌクレオチドを含み、そして好ましくは、配列番号８または配列番号１２のヌクレオチド１６と１７（５’側から３’側に読む）との間、ならびに配列番号１６または配列番号２０のヌクレオチド９と１０（５’側から３’側に読む）との間に配置された非ヌクレオチドリンカーによってプローブに連結されたアクリジニウムエステル標識を含む。プローブに対するこのアクリジニウムエステル標識の連結は、米国特許第５，１８５，４３９号、および米国特許第６，０３１，０９１号におけるＡｒｎｏｌｄらの教示に従って実行され得る。
【０１３７】
従って、本発明の１つの局面において、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ生物体が試験サンプルに存在するか否かを決定するために有用であるＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍハイブリダイゼーションアッセイプローブが、提供される。このプローブは、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ生物体由来の標的核酸に存在する標的核酸配列に存在する少なくとも１０連続する塩基領域に少なくとも８０％相補的である、少なくとも１０連続する塩基領域を含む１００塩基長までのオリゴヌクレオチドを含む。この標的配列は好ましくは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、または配列番号４の塩基配列を有し、そしてこのプローブは、ストリンジェントな条件下で、試験サンプルに存在する非Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ生物体由来の核酸よりも標的核酸に対して、優先的にハイブリダイズする。
【０１３８】
あるいは、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍプローブは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、または配列番号４の塩基配列に存在する少なくとも１０連続する塩基領域に少なくとも８０％相同である少なくとも１０連続する塩基領域を含む１００塩基長までのオリゴヌクレオチドを含む。このプローブは、試験サンプルに存在する非Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ生物体由来の核酸よりも標的核酸に対してストリンジェントな条件下で優先的にハイブリダイズする。
【０１３９】
本発明の別の局面において、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ生物体が試験サンプルに存在するか否かを決定するために有用であるＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍハイブリダイゼーションアッセイプローブが、提供される。このプローブは、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ生物体由来の標的核酸に存在する標的核酸配列に存在する少なくとも１０連続する塩基領域に少なくとも８０％相補的である、少なくとも１０連続する塩基領域を含む１００塩基長までのオリゴヌクレオチドを含む。この標的配列は好ましくは、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、または配列番号２０の塩基配列を有し、そしてこのプローブは、ストリンジェントな条件下で、試験サンプルに存在する非Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ生物体由来の核酸よりも標的核酸に対して、優先的にハイブリダイズする。
【０１４０】
あるいは、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍプローブは、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、または配列番号２０の塩基配列に存在する少なくとも１０連続する塩基領域に少なくとも８０％相同である少なくとも１０連続する塩基領域を含む１００塩基長までのオリゴヌクレオチドを含む。このプローブは、ストリンジェントな条件下で、試験サンプルに存在する非Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ生物体由来の核酸よりも標的核酸に対して優先的にハイブリダイズする。
【０１４１】
一旦合成されれば、このプローブは、任意の周知の方法によって検出可能な標識またはレポーター基で標識され得る（例えば、ＳＡＭＢＲＯＯＫら、前出、第１０章を参照のこと）。このプローブは、標的配列の検出を容易にする検出可能部分（例えば、放射性同位体、抗原、または化学発光部分）で標識され得る。有用な標識としては、放射性同位体、および非放射性レポーター基が挙げられる。同位体標識としては、３Ｈ、３５Ｓ、３２Ｐ、１２５Ｉ、５７Ｃｏ、および１４Ｃ、が挙げられる。同位体標識は、ニックトランスレーション、エンドラベリング（末端標識化）、第二鎖合成、逆転写などの当該分野で公知の技術によって、および化学的方法によってオリゴヌクレオチドに導入され得る。放射線標識したプローブを用いる場合、ハイブリダイゼーションは、オートラジオグラフィー、シンチレーション計測、またはγ計測のような技術によって検出され得る。この検出方法の選択は、標識化のために用いられる特定の放射性同位体に依存する。
【０１４２】
非同位体物質はまた、標識化のために用いられ得、そしてヌクレオチドの間に、またはオリゴヌクレオチドの末端に内部導入され得る。改変されたヌクレオチドは、酵素的にまたは化学的に組み込まれ得る。オリゴヌクレオチドの化学的改変は、当該分野で公知の技術を用いてオリゴヌクレオチドの合成中にまたは合成後に実施され得る。例えば、米国特許第６，０３１，０９１号においてＡｒｎｏｌｄらによって開示された非ヌクレオチドリンカー基の使用による。非同位体の標識としては、蛍光分子、化学発光分子、蛍光化学発光分子、リン光分子、電気化学発光分子、発光団、酵素、酵素補因子、酵素基質、色素およびハプテンまたは他のリガンドが挙げられる。別の有用な標識技術は、ストリンジェントな条件下で標的核酸に安定にハイブリダイズ不能な塩基配列である。本発明のプローブは好ましくは、アクリジニウムエステルで標識される。（アクリジニウムエステル標識化は、米国特許第５，１８５，４３９号においてＡｒｎｏｌｄらによって開示されている）。
【０１４３】
選択されたハイブリダイゼーションアッセイプローブは、次いで、ＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍまたはＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ生物を含むと思われる試験サンプルと接触し得る。一般的に、試験サンプルは、公知でない生物も含む供給源由来である。プローブを試験サンプルと接触させた後、この試験サンプルは、試験サンプル中の他の生物由来の核酸の存在下で、この試験サンプル中に存在し得るＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍまたはｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ生物由来の標的核酸分子にプローブを、優先的にハイブリダイゼーションすることを可能にする条件下でインキュベートされ得る。
【０１４４】
このプローブはまた、１つ以上の標識されていないヘルパープローブと組み合わされて、ＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍまたはＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ生物由来の標的核酸への結合を容易にし得る。プローブが、試験サンプル中に存在する標的核酸にハイブリダイズした後、得られるハイブリッドは、当該分野で周知の種々の技術（例えば、ヒドロキシアパタイト吸着および放射性モニタリング）によって分離されそして検出され得る。他の技術としては、ハイブリダイズされていないプローブに関連するレベルを選択的に下げて、次いで、ハイブリダイズされたプローブに関連するレベルの残存する量を測定する技術とを含み、これは、米国特許第５、２８３、１７４号に開示される。本願発明者らは、特に、この後者の技術を好む。
【０１４５】
（Ｅ． Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍの検出において使用されるヘルパープローブ）
本発明の別の実施形態は、新規なヘルパープローブに関する。上述のように、ヘルパープローブが使用され、ハイブリダイゼーションアッセイプローブがそれらの意図した標的核酸にハイブリダイゼーションするのを容易にし得、その結果、ハイブリダイゼーションアッセイプローブは、ヘルパープローブが存在しない状態よりもさらに容易にプローブ：標的核酸二重鎖を形成する（ヘルパープローブは、Ｈｏｇａｎら、「Ｍｅａｎｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｅｎｈａｎｃｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」、米国特許第５、０３０、５５７号によって開示されている）。各々のヘルパープローブは、標的核酸配列に十分に相補的であり、ヘルパープローブ：標的核酸二重鎖をストリンジェントなハイブリダイゼーションアッセイ条件下で形成するオリゴヌクレオチドを含む。得られたヘルパープローブを使用するストリンジェントなハイブリダイゼーションアッセイ条件は、関連するハイブリダイゼーションアッセイプローブが標的核酸に優先的にハイブリダイズするために使用される条件によって決定される。
【０１４６】
一本鎖ＲＮＡおよびＤＮＡの領域は、ストリンジェントなハイブリダイゼーションアッセイ条件下でさえ、二次構造および三次構造に関与される。このような構造は、ハイブリダイゼーションアッセイプローブの標的核酸に対するハイブリダイゼーションを立体的に阻害し得るかブロックし得る。ヘルパープローブの標的核酸に対するハイブリダイゼーションは、標的核酸の二次構造および三次構造を変化させ、それによって標的領域がハイブリダイゼーションアッセイプローブによってより接近可能になるようにさせる。その結果、ハイブリダイゼーションアッセイプローブ：標的核酸二重鎖の動態および／または融点が高められる。ヘルパープローブは、一般的に、ハイブリダイゼーションアッセイプローブの標的領域付近に配置される核酸配列に対してハイブリダイズするように選択される。
【０１４７】
本発明のＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍハイブリダイゼーションアッセイプローブで使用され得るヘルパープローブは、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ由来の核酸内の核酸配列に対して標的化される。同様に、本発明のＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍハイブリダイゼーションアッセイプローブで使用され得るヘルパープローブは、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ由来の核酸内の核酸配列に対して標的化される。各々のヘルパープローブは、標的核酸中に存在する塩基領域を標的するオリゴヌクレオチドを含む。好ましくは、ヘルパープローブは、適切な場合、ＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍまたはＣｆｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ生物由来の標的核酸中に存在する標的核酸配列中に存在する少なくとも１０連続する塩基領域と少なくとも８０％相補性を有する少なくとも１０連続する塩基領域を含む。ヘルパープローブおよびそれらの関連するハイブリダイゼーションアッセイプローブは、同じ標的核酸内に含まれる異なる標的核酸配列を有する。本発明のヘルパープローブは、好ましくは、１００塩基長まで、さらに好ましくは、１２〜５０塩基長、なおさらに好ましくは、１８〜３５塩基長のオリゴヌクレオチドである。あるいは、ヘルパープローブは、それらの標的領域と少なくとも９０％相補性であるか、または完全に相補性でさえあり得る。
【０１４８】
本発明において有用であり得るＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍヘルパープローブの例は、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７または配列番号２８の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはそれらの塩基配列に実質的に対応するオリゴヌクレオチドを含むプローブである。
【０１４９】
本発明において有用であり得るＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍヘルパープローブの例は、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３または配列番号４４の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはそれらの塩基配列に実質的に対応するオリゴヌクレオチドを含むプローブである。１００ｐｍｏｌのプローブおよび０．１ｆｍｏｌ〜１００ｆｍｏｌの量の範囲の標的核酸を含む２００μｌのサンプル溶液が提供される場合、本願発明者らは、配列番号３８（２０ｐｍｏｌ）および配列番号３９（２０ｐｍｏｌ）のヌクレオチド塩基配列からなるヘルパープローブを発見したが、プローブの標的に対するハイブリダイゼーションを容易にするとは考えられず、これらのヘルパープローブの濃度の最適化は、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ １８Ｓ ｒＲＮＡ標的核酸中に含まれる相補性配列に対する配列番号１３または配列番号１７のヌクレオチド塩基配列からなるハイブリダイゼーションアッセイプローブの改良されたハイブリダイゼーションを生じ得るとなお考えられる。
【０１５０】
ヘルパープローブが、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍハイブリダイゼーションアッセイプローブと組み合わせて使用される場合、好ましいハイブリダイゼーションアッセイプローブは、配列番号１、配列番号２、配列番号３または配列番号４の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはそれらの塩基配列に実質的に対応するオリゴヌクレオチドを含み、そして好ましいヘルパープローブは、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７または配列番号２８の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはそれらの塩基配列に実質的に対応するオリゴヌクレオチドを含む。
【０１５１】
この組み合わせの１つの好ましい実施形態において、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍハイブリダイゼーションアッセイプローブは、配列番号１、配列番号２、配列番号３または配列番号４の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはそれらの塩基配列に実質的に対応するオリゴヌクレオチドを含み、そしてヘルパープローブは、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５または配列番号２７の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはそれらの塩基配列に実質的に対応するオリゴヌクレオチドを含む。
【０１５２】
この組み合わせのさらに好ましい実施形態において、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍハイブリダイゼーションアッセイプローブは、配列番号１、配列番号２、配列番号３または配列番号４の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはそれらの塩基配列に実質的に対応するオリゴヌクレオチドを含み、そしてヘルパープローブは、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６または配列番号２８の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはそれらの塩基配列に実質的に対応するオリゴヌクレオチドを含む。
【０１５３】
別の好ましい組み合わせは、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍハイブリダイゼーションアッセイプローブが、配列番号１、配列番号２、配列番号３または配列番号４の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはそれらの塩基配列に実質的に対応するオリゴヌクレオチドを含む場合、少なくとも２つのヘルパープローブを含む。この組み合わせにおいて、第１のヘルパープローブは好ましくは、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５または配列番号２７の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはそれらの塩基配列に実質的に対応するオリゴヌクレオチドを含み、そして第２のヘルパープローブは、好ましくは、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６または配列番号２８の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはそれらの塩基配列に実質的に対応するオリゴヌクレオチドを含む。
【０１５４】
ヘルパープローブが、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍハイブリダイゼーションアッセイプローブと組み合わせて使用される場合、以下の組み合わせが好ましい。ハイブリダイゼーションアッセイプローブが、配列番号５、配列番号６、配列番号９、配列番号１０、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１７または配列番号１８の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはそれらの塩基配列に実質的に対応するオリゴヌクレオチドを含む場合、ヘルパープローブは、好ましくは、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３または配列番号４４の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはそれらの塩基配列に実質的に対応するオリゴヌクレオチドを含む。
【０１５５】
この組み合わせの１つの実施形態において、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍハイブリダイゼーションアッセイプローブは、配列番号５、配列番号６、配列番号９、配列番号１０、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１７または配列番号１８の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはそれらの塩基配列に実質的に対応するオリゴヌクレオチドを含み、そしてヘルパープローブは、配列番号２９、配列番号３３、配列番号３７または配列番号４１の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはそれらの塩基配列に実質的に対応するオリゴヌクレオチドを含む。
【０１５６】
この組み合わせのさらなる実施形態において、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍハイブリダイゼーションアッセイプローブは、配列番号５、配列番号６、配列番号９、配列番号１０、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１７または配列番号１８の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはそれらの塩基配列に実質的に対応するオリゴヌクレオチドを含み、そしてヘルパープローブは、配列番号３０、配列番号３４、配列番号３８または配列番号４２の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはそれらの塩基配列に実質的に対応するオリゴヌクレオチドを含む。
【０１５７】
この組み合わせの別の実施形態において、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍハイブリダイゼーションアッセイプローブは、配列番号５、配列番号６、配列番号９、配列番号１０、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１７または配列番号１８の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはそれらの塩基配列に実質的に対応するオリゴヌクレオチドを含み、そしてヘルパープローブは、配列番号３１、配列番号３５、配列番号３９または配列番号４３の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはそれらの塩基配列に実質的に対応するオリゴヌクレオチドを含む。
【０１５８】
この組み合わせのなおさらなる実施形態において、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍハイブリダイゼーションアッセイプローブは、配列番号５、配列番号６、配列番号９、配列番号１０、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１７または配列番号１８の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはそれらの塩基配列に実質的に対応するオリゴヌクレオチドを含み、そしてヘルパープローブは、配列番号３２、配列番号３６、配列番号４０または配列番号４４の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはそれらの塩基配列に実質的に対応するオリゴヌクレオチドを含む。
【０１５９】
別の好ましい組み合わせは、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍハイブリダイゼーションアッセイプローブが、配列番号５、配列番号６、配列番号９、配列番号１０、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１７または配列番号１８の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはそれらの塩基配列に実質的に対応するオリゴヌクレオチドを含む場合、少なくとも２つのヘルパープローブを含む。この組み合わせにおいて、第１のヘルパープローブは、好ましくは、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３７、配列番号３８、配列番号４１または配列番号４２の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはそれらの塩基配列に実質的に対応する塩基配列を含み、そして第２のヘルパープローブは、好ましくは、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４３または配列番号４４の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはそれらの塩基配列に実質的に対応するオリゴヌクレオチドを含む。
【０１６０】
この組み合わせの１つの実施形態において、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍハイブリダイゼーションアッセイプローブは、配列番号５、配列番号６、配列番号９、配列番号１０、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１７または配列番号１８の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはそれらの塩基配列に実質的に対応するオリゴヌクレオチドを含む。第１のヘルパープローブは、配列番号２９、配列番号３３、配列番号３７または配列番号４１の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはそれらの塩基配列に実質的に対応するオリゴヌクレオチドを含み、そして第２のヘルパープローブは、配列番号３１、配列番号３５、配列番号３９または配列番号４３の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはそれらの塩基配列に実質的に対応するオリゴヌクレオチドを含む。
【０１６１】
この組み合わせのさらなる実施形態において、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍハイブリダイゼーションアッセイプローブは、配列番号５、配列番号６、配列番号９、配列番号１０、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１７または配列番号１８の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはそれらの塩基配列に実質的に対応するオリゴヌクレオチドを含む。第１のヘルパープローブは、配列番号２９、配列番号３３、配列番号３７または配列番号４１の塩基配列を有するかまたはそれらの塩基配列に実質的に対応するオリゴヌクレオチドを含み、そして第２のヘルパープローブは、配列番号３２、配列番号３６、配列番号４０または配列番号４４の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはそれらの塩基配列に対応するオリゴヌクレオチドを含む。
【０１６２】
この組み合わせの別の実施形態において、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍハイブリダイゼーションアッセイプローブは、配列番号５、配列番号６、配列番号９、配列番号１０、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１７または配列番号１８の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはそれらの塩基配列に実質的に対応するオリゴヌクレオチドを含む。第１のヘルパープローブは、配列番号３０、配列番号３４、配列番号３８または配列番号４２の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはそれらの塩基配列に実質的に対応するオリゴヌクレオチドを含み、そして第２のヘルパープローブは、配列番号３１、配列番号３５、配列番号３９または配列番号４３の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはそれらの塩基配列に実質的に対応するオリゴヌクレオチドを含む。
【０１６３】
この組み合わせのなおさらなる実施形態において、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍハイブリダイゼーションアッセイプローブは、配列番号５、配列番号６、配列番号９、配列番号１０、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１７または配列番号１８の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはそれらの塩基配列に実質的に対応するオリゴヌクレオチドを含む。第１のヘルパープローブは、配列番号３０、配列番号３４、配列番号３８または配列番号４２の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはそれらの塩基配列に実質的に対応するオリゴヌクレオチドを含み、そして第２のヘルパープローブは、配列番号３２、配列番号３６、配列番号４０または配列番号４４の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはそれらの塩基配列に実質的に対応するオリゴヌクレオチドを含む。
【０１６４】
なお別の好ましい組み合わせにおいて、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍハイブリダイゼーションアッセイプローブは、配列番号７、配列番号１１、配列番号１５または配列番号１９の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはそれらの塩基配列に実質的に対応するオリゴヌクレオチドを含み、そして上記のヘルパープローブは、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３７、配列番号３８、配列番号４１または配列番号４２の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはそれらの塩基配列に実質的に対応するオリゴヌクレオチドを含む。
【０１６５】
この組み合わせの１つの実施形態において、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍハイブリダイゼーションアッセイプローブは、配列番号７、配列番号１１、配列番号１５または配列番号１９の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはそれらの塩基配列に実質的に対応するオリゴヌクレオチドを含み、そしてヘルパープローブは、配列番号２９、配列番号３３、配列番号３７または配列番号４１の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはそれらの塩基配列に実質的に対応するオリゴヌクレオチドを含む。
【０１６６】
この組み合わせのさらなる実施形態において、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍハイブリダイゼーションアッセイプローブは、配列番号７、配列番号１１、配列番号１５または配列番号１９の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはそれらの塩基配列に実質的に対応するオリゴヌクレオチドを含み、そしてヘルパープローブは、配列番号３０、配列番号３４、配列番号３８または配列番号４２の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはそれらの塩基配列に実質的に対応するオリゴヌクレオチドを含む。
【０１６７】
（Ｆ． 核酸組成物）
別の関連する局面において、本発明は、ストリンジェントなハイブリダイゼーションアッセイ条件下で、ハイブリダイゼーションアッセイプローブと標的核酸との間に形成される核酸ハイブリッド（「プローブ：標的」）を含む組成物を特徴とする。プローブと標的核酸との間に形成されるハイブリッドの用途の１つは、試験サンプル中の標的生物の存在もしくは量、または生物のグループの指標を提供することである。例えば、核酸ハイブリッド中に存在するアクリジニウムエステル（ＡＥ）は、アルカリ溶液中の加水分解に耐性であり、一方、一本鎖核酸中に存在するＡＥは、アルカリ溶液中で加水分解を受ける（米国特許第５、２３８、１７４号を参照のこと）。従って、結合していないＡＥ標識されたプローブの加水分解の後に、核酸ハイブリッドに関連して残存するアクリジニウムエステルの化学発光を測定することによって、標的核酸の存在が検出され得る。
【０１６８】
本発明はまた、ストリンジェントなハイブリダイゼーションアッセイ条件下で、ヘルパープローブと標的核酸との間に形成される核酸ハイブリッド（「ヘルパープローブ：標的」）を含む組成物を意図する。ヘルパープローブと標的核酸との間に形成されるハイブリッドの１つの用途は、ハイブリダイゼーションのための特定の核酸配列を利用可能にすることである。例えば、ヘルパープローブと標的核酸との間に形成されるハイブリッドは、ハイブリダイゼーションアッセイプローブを用いるハイブリダイゼーションのために利用可能な核酸配列を付与し得る。ヘルパープローブの使用の完全な記述は、Ｈｏｇａｎら、米国特許第５，０３０，５５７号中に提供される。
【０１６９】
本発明はまた、増幅条件下、増幅プライマーと標的核酸との間に形成される核酸（「プライマー：標的」）を含む組成物を特徴とする。プライマーと標的核酸との間に形成されるハイブリッドの用途の１つは、増幅プライマーの３’末端で核酸ポリメラーゼのための開始部位を提供することである。例えば、ハイブリッドは、逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、ＴａｑポリメラーゼまたはＴ４ ＤＮＡポリメラーゼ）、およびＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ７ポリメラーゼ、ＳＰ６ポリメラーゼ、Ｔ３ポリメラーゼ）などのための開始部位を形成し得る。
【０１７０】
本発明の組成物は、試験サンプル中のＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍまたはＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ生物の存在または量を決定するための組成物を含み、この組成物は、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ生物由来の標的核酸と、以下のオリゴヌクレオチドとの間に形成される核酸ハイブリッドを含む：配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１；配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７または配列番号６８の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはそれらの塩基配列に実質的に対応するオリゴヌクレオチド。
【０１７１】
本発明はまた、試験サンプル中のＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ生物の存在または量を決定するための組成物を意図し、この組成物は、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ生物由来の標的核酸と、以下のオリゴヌクレオチドを含むハイブリダイゼーションアッセイプローブとの間に形成される核酸ハイブリッドを含む：配列番号１、配列番号２、配列番号３または配列番号４の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはそれらの塩基配列に実質的に対応するオリゴヌクレオチド。別の実施形態において、これらのプローブ：標的組成物は、さらに、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ由来の標的核酸にハイブリダイズするヘルパープローブを含み得、ここで、ヘルパープローブは、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７または配列番号２８の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドかまたはそれらの塩基配列に実質的に対応するオリゴヌクレオチドを含む。核酸ハイブリッド組成物のこの後者のグループを形成するための好ましいハイブリダイゼーションアッセイプローブおよびヘルパープローブの組み合わせは、「Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍの検出において使用されるヘルバープローブ」の表題のもとに上記されたプローブの混合の組み合わせである。
【０１７２】
本発明は、試験サンプル中のＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ生物の存在または量を決定するための組成物を意図し、この組成物は、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ生物由来の標的核酸と、以下のオリゴヌクレオチドを含むハイブリダイゼーションアッセイプローブとの間に形成される核酸ハイブリッドを含む：配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、または配列番号２０の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはそれらの塩基配列に実質的に対応するオリゴヌクレオチド。別の実施形態において、これらのプローブ：標的組成物は、さらに、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ由来の標的核酸に対してハイブリダイズするヘルパープローブを含み、ここで、ヘルパープローブは、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３または配列番号４４の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはそれらの塩基配列に実質的に対応するオリゴヌクレオチドを含む。核酸ハイブリッド組成物のこの後者のグループを形成するために好ましいハイブリダイゼーションアッセイプローブおよびヘルパープローブの組み合わせは、「Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍの検出において使用されるヘルバープローブ」の表題のもとに上記されたプローブの混合の組み合わせである。
【０１７３】
本発明はまた、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ生物に由来する標的核酸中に存在する標的配列を増幅するための組成物を意図し、この組成物は、その標的核酸と、オリゴヌクレオチドを含む増幅プライマーとの間に形成される、核酸ハイブリッドを含み、このオリゴヌクレオチドは、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、または配列番号６８の塩基配列を有するかもしくはその塩基配列に実質的に対応する。これらの核酸ハイブリッド組成物を形成するための好ましい増幅プライマーの組み合わせは、見出し「Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍリボソーム核酸の増幅」のもとで、上記された組み合わせである。
【０１７４】
（Ｇ．アッセイ方法）
本発明は、試験サンプルにおける、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ生物またはＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ生物に由来する核酸の存在または量についてアッセイするための種々の方法を意図する。使用される厳密なアッセイ条件、プローブ、および／またはプライマーが、使用される特定のアッセイ形式およびそのサンプルの供給源に依存して変化することを、当業者は理解する。
【０１７５】
本発明の１つの局面は、試験サンプルにおけるＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ生物の存在または量を決定するための方法に関し、この方法は、その試験サンプルを、ストリンジェントなハイブリダイゼーションアッセイ条件下でその試験サンプル中に存在する非Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ生物由来の核酸よりもＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ由来標的核酸に優先的にハイブリダイズすることができるハイブリダイゼーションアッセイプローブと、ストリンジェントなハイブリダイゼーションアッセイ条件下で接触させることによる。この方法において、その標的核酸は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、または配列番号４の塩基配列を有するかもしくはその塩基配列に実質的に対応する、塩基配列を含む。（その供給源に依存して、その試験サンプルは、この方法のプローブが区別し得る未知の生物を含み得る。）この方法における使用のために好ましいプローブは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、または配列番号４を有するかもしくはその塩基配列に実質的に対応する、オリゴヌクレオチドを含む。
【０１７６】
好ましい実施形態において、試験サンプルにおける、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ生物の存在または量を決定するための方法はまた、その試験サンプルを、そのプローブがその標的核酸にハイブリダイズすることを促進するための１つ以上のヘルパープローブと接触させる工程をも、包含し得る。このヘルパープローブは、そのハイブリダイゼーションアッセイプローブの添加の前または後に、そのサンプルに添加され得るが、そのヘルパープローブとハイブリダイゼーションアッセイプローブとは、好ましくはその試験サンプルに同時に提供される。この方法における使用のために好ましいヘルパープローブは、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、または配列番号２８の塩基配列を有するかもしくはその塩基配列に実質的に対応する、オリゴヌクレオチドを含む。この方法において使用され得るハイブリダイゼーションアッセイプローブとヘルパープローブとの特定の組み合わせは、見出し「Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍの検出において使用されるヘルパープローブ」のもとで、上記に示される。
【０１７７】
本発明の別の局面は、試験サンプルにおける、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ生物の存在または量を決定するための方法に関し、この方法は、その試験サンプルを、ストリンジェントなハイブリダイゼーションアッセイ条件下でその試験サンプル中に存在する非Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ生物由来の核酸よりもＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ由来標的核酸に優先的にハイブリダイズすることができるハイブリダイゼーションアッセイプローブと、ストリンジェントなハイブリダイゼーションアッセイ条件下で接触させることによる。この方法において、その標的核酸は、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、または配列番号２０の塩基配列を有するかもしくはその塩基配列に実質的に対応する、塩基配列を含む。（その供給源に依存して、その試験サンプルは、この方法のプローブが区別し得る未知の生物を含み得る。）この方法における使用のために好ましいプローブは、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、または配列番号２０の塩基配列を有するかもしくはその塩基配列に実質的に対応する、オリゴヌクレオチドを含む。
【０１７８】
好ましい実施形態において、試験サンプルにおける、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ生物の存在または量を決定するための方法はまた、その試験サンプルを、そのプローブがその標的核酸にハイブリダイズすることを促進するための１つ以上のヘルパープローブと接触させる工程をも、包含し得る。このヘルパープローブは、そのハイブリダイゼーションアッセイプローブの添加の前または後に、そのサンプルに添加され得るが、そのヘルパープローブとハイブリダイゼーションアッセイプローブとは、好ましくはその試験サンプルに同時に提供される。この方法における使用のために好ましいヘルパープローブは、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、または配列番号４４の塩基配列を有するかもしくはその塩基配列に実質的に対応する、オリゴヌクレオチドを含む。この方法において使用され得るハイブリダイゼーションアッセイプローブとヘルパープローブとの特定の組み合わせは、見出し「Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍの検出において使用されるヘルパープローブ」のもとで、上記に示される。
【０１７９】
本発明のなお別の局面は、試験サンプルにおけるＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ由来核酸を増幅するための方法に関し、この方法は、その試験サンプルを、１つ以上の増幅プライマーと増幅条件下で接触させる工程により、この１つ以上の増幅プライマーは、核酸ポリメラーゼと接触された場合、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、または配列番号６８の塩基配列を有する核酸領域に結合するかまたはこの核酸領域を介して伸長を生じる。この方法における使用のために好ましい増幅プライマーは、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、または配列番号６８の塩基配列を有するかもしくはその塩基配列に実質的に対応する、オリゴヌクレオチドを含み、この増幅プライマーは、ＲＮＡポリメラーゼにより認識される核酸配列、またはＲＮＡポリメラーゼによる開始もしくは伸長を増強する核酸配列を、必要に応じて含む。この方法において使用され得る増幅プライマーの特定の組み合わせは、見出し「Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍリボソーム核酸の増幅」のもとで、上記されている。
【０１８０】
好ましい実施形態において、試験サンプルにおけるＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ由来核酸を増幅するための方法は、その試験サンプルを、ストリンジェントなハイブリダイゼーションアッセイ条件下でその試験サンプル中に存在する非Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ生物由来の核酸よりも増幅したＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ標的核酸に優先的にハイブリダイズすることができるハイブリダイゼーションアッセイプローブと、ストリンジェントなハイブリダイゼーションアッセイ条件下で接触させる工程をさらに包含する。この試験サンプルは、一般的には増幅に十分な時間が過ぎた後で、そのハイブリダイゼーションアッセイプローブと接触されるが、この増幅プライマーとハイブリダイゼーションアッセイプローブとは、任意の順番でこのサンプルに添加され得、特に、このハイブリダイゼーションアッセイプローブが自己ハイブリダイズプローブ（例えば、上記で考察されたＭｏｌｌｅｃｕｌａｒ ＴｏｒｃｈまたはＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎ）である場合に、そのようにされ得る。試験サンプルをハイブリダイゼーションアッセイプローブと接触させるこの工程は、その試験サンプルにおけるＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ生物の存在または量が決定され得るように、実施される。この方法における使用のために好ましいプローブは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、または配列番号４の塩基配列を有するかもしくはその塩基配列に実質的に対応する、オリゴヌクレオチドを含む。このプローブは、その試験サンプルにおける検出を容易にする標識をさらに含み得る。
【０１８１】
１つの好ましい実施形態において、この方法は、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ由来核酸を増幅するための少なくとも２つの増幅プライマーの組を用いて実行され、その組は、配列番号４５、配列番号５１、配列番号５７、または配列番号６３の塩基配列を有するかもしくはその塩基配列に実質的に対応する、オリゴヌクレオチドを含む、第１の増幅プライマーと、配列番号４８、配列番号５４、配列番号６０、または配列番号６６の塩基配列を有するかもしくはその塩基配列に実質的に対応する、オリゴヌクレオチドを含む、第２の増幅プライマーと、を含む。その試験サンプルにおいて増幅したＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ核酸を特異的に検出するために使用されるハイブリゼーションアッセイプローブは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、または配列番号４の塩基配列を有するかもしくはその塩基配列に実質的に対応する、オリゴヌクレオチドを含む。
【０１８２】
別の好ましい実施形態において、この方法は、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ由来核酸を増幅するための少なくとも２つの増幅プライマーの組を用いて実行され、その組は、配列番号４６、配列番号５２、配列番号５８、または配列番号６４の塩基配列を有するかもしくはその塩基配列に実質的に対応する、オリゴヌクレオチドを含む、第１の増幅プライマーと、配列番号４８、配列番号５４、配列番号６０、または配列番号６６の塩基配列を有するかもしくはその塩基配列に実質的に対応する、オリゴヌクレオチドを含む、第２の増幅プライマーと、を含む。その試験サンプルにおいて増幅したＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ核酸を特異的に検出するために使用されるハイブリゼーションアッセイプローブは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、または配列番号４の塩基配列を有するかもしくはその塩基配列に実質的に対応する、オリゴヌクレオチドを含む。
【０１８３】
好ましい実施形態において、試験サンプルにおけるＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ由来核酸を増幅するための方法は、その試験サンプルを、ストリンジェントなハイブリダイゼーションアッセイ条件下でその試験サンプル中に存在する非Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ生物由来の核酸よりも増幅したＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ標的核酸に優先的にハイブリダイズすることができるハイブリダイゼーションアッセイプローブと、ストリンジェントなハイブリダイゼーションアッセイ条件下で接触させる工程をさらに包含する。この試験サンプルは、一般的には増幅に十分な時間が過ぎた後で、そのハイブリダイゼーションアッセイプローブと接触されるが、この増幅プライマーとハイブリダイゼーションアッセイプローブとは、任意の順番でこのサンプルに添加され得、特に、このハイブリダイゼーションアッセイプローブが自己ハイブリダイズプローブ（例えば、上記で考察されたＭｏｌｌｅｃｕｌａｒ ＴｏｒｃｈまたはＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎ）である場合に、そのようにされ得る。試験サンプルをハイブリダイゼーションアッセイプローブと接触させるこの工程は、その試験サンプルにおけるＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ生物の存在または量が決定され得るように、実施される。この方法における使用のために好ましいプローブは、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、または配列番号２０の塩基配列を有するかもしくはその塩基配列に実質的に対応する、オリゴヌクレオチドを含む。このプローブは、その試験サンプルにおける検出を容易にする標識をさらに含み得る。
【０１８４】
１つの好ましい実施形態において、この方法は、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ由来核酸を増幅するための少なくとも２つの増幅プライマーの組を用いて実行され、その組は、配列番号４５、配列番号５１、配列番号５７、または配列番号６３の塩基配列を有するかもしくはその塩基配列に実質的に対応する、オリゴヌクレオチドを含む、第１の増幅プライマーと、配列番号４７、配列番号５３、配列番号５９、または配列番号６５の塩基配列を有するかもしくはその塩基配列に実質的に対応する、オリゴヌクレオチドを含む、第２の増幅プライマーと、を含む。その試験サンプルにおいて増幅したＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ核酸を特異的に検出するために使用されるハイブリゼーションアッセイプローブは、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、または配列番号１９の塩基配列を有するかもしくはその塩基配列に実質的に対応する、オリゴヌクレオチドを含む。
【０１８５】
別の好ましい実施形態において、この方法は、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ由来核酸を増幅するための少なくとも２つの増幅プライマーの組を用いて実行され、その組は、配列番号４５、配列番号５１、配列番号５７、または配列番号６３の塩基配列を有するかもしくはその塩基配列に実質的に対応する、オリゴヌクレオチドを含む、第１の増幅プライマーと、配列番号４８、配列番号５４、配列番号６０、または配列番号６６の塩基配列を有するかもしくはその塩基配列に実質的に対応する、オリゴヌクレオチドを含む、第２の増幅プライマーと、を含む。その試験サンプルにおいて増幅したＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ核酸を特異的に検出するために使用されるハイブリゼーションアッセイプローブは、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、または配列番号１９の塩基配列を有するかもしくはその塩基配列に実質的に対応する、オリゴヌクレオチドを含む。
【０１８６】
なお別の好ましい実施形態において、この方法は、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ由来核酸を増幅するための少なくとも２つの増幅プライマーの組を用いて実行され、その組は、配列番号４６、配列番号５２、配列番号５８、または配列番号６４の塩基配列を有するかもしくはその塩基配列に実質的に対応する、オリゴヌクレオチドを含む、第１の増幅プライマーと、配列番号４７、配列番号５３、配列番号５９、または配列番号６５の塩基配列を有するかもしくはその塩基配列に実質的に対応する、オリゴヌクレオチドを含む、第２の増幅プライマーと、を含む。その試験サンプルにおいて増幅したＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ核酸を特異的に検出するために使用されるハイブリゼーションアッセイプローブは、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、または配列番号１９の塩基配列を有するかもしくはその塩基配列に実質的に対応する、オリゴヌクレオチドを含む。
【０１８７】
さらに別の好ましい実施形態において、この方法は、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ由来核酸を増幅するための少なくとも２つの増幅プライマーの組を用いて実行され、その組は、配列番号４６、配列番号５２、配列番号５８、または配列番号６４の塩基配列を有するかもしくはその塩基配列に実質的に対応する、オリゴヌクレオチドを含む、第１の増幅プライマーと、配列番号４８、配列番号５４、配列番号６０、または配列番号６６の塩基配列を有するかもしくはその塩基配列に実質的に対応する、オリゴヌクレオチドを含む、第２の増幅プライマーと、を含む。その試験サンプルにおいて増幅したＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ核酸を特異的に検出するために使用されるハイブリゼーションアッセイプローブは、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、または配列番号１９の塩基配列を有するかもしくはその塩基配列に実質的に対応する、オリゴヌクレオチドを含む。
【０１８８】
さらに好ましい実施形態において、この方法は、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ由来核酸を増幅するための少なくとも２つの増幅プライマーの組を用いて実行され、その組は、配列番号４９、配列番号５５、配列番号６１、または配列番号６７の塩基配列を有するかもしくはその塩基配列に実質的に対応する、オリゴヌクレオチドを含む、第１の増幅プライマーと、配列番号５０、配列番号５６、配列番号６２、または配列番号６８の塩基配列を有するかもしくはその塩基配列に実質的に対応する、オリゴヌクレオチドを含む、第２の増幅プライマーと、を含む。その試験サンプルにおいて増幅したＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ核酸を特異的に検出するために使用されるハイブリゼーションアッセイプローブは、配列番号８、配列番号１２、配列番号１６、または配列番号２０の塩基配列を有するかもしくはその塩基配列に実質的に対応する、オリゴヌクレオチドを含む。
【０１８９】
（Ｈ．診断系）
本発明はまた、キット形態の診断系を企図する。本発明の診断系は、キットを包含し得、このキットは、少なくとも１回のアッセイのために十分な量で、本発明の任意のハイブリダイゼーションアッセイプローブ、ヘルパープローブ、および／または増幅プライマーを、包装材料中に含む。代表的には、このキットはまた、試験サンプルにおけるＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ生物またはＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ生物の存在または量を決定するための増幅および／または検出アッセイにおいて、その包装されたプローブおよび／またはプライマーを使用するための指示を含み、この指示は、具体的な形態で記録されている（例えば、紙または電子媒体に含まれている）。
【０１９０】
この診断系の種々の成分は、種々の形態で提供され得る。例えば、必要な酵素、ヌクレオチド三リン酸、プローブ、および／またはプライマーが、凍結乾燥試薬として提供され得る。これらの凍結乾燥試薬は、再構成された場合に、それらが完全な混合物を形成し、そのアッセイにおいて使用できる状態であるその成分の各々が適切な比になるように、凍結乾燥前に前もって混合され得る。さらに、本発明の診断系は、このキットの凍結乾燥試薬を再構成するための再構成試薬を含み得る。Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ生物に由来する標的核酸を増幅するための好ましいキットにおいて、その酵素、ヌクレオチド三リン酸、およびその酵素に必要な補因子は、再構成された場合に、本増幅方法における使用のために適切な試薬を形成する単一凍結乾燥試薬として、提供される。これらのキットにおいて、凍結乾燥プライマー試薬もまた、提供され得る。他の好ましいキットにおいて、凍結乾燥プローブ試薬が、提供される。
【０１９１】
代表的包装試薬としては、本発明のハイブリダイゼーションアッセイプローブ、ヘルパープローブ、および／または増幅プライマーを、固定限界内に保つことができる、固体マトリックス（例えば、ガラス、プラスチック、紙、箔、微粒子など）が挙げられる。従って、例えば、この包装材料としては、ミリグラム未満（例えば、ピコグラムまたはナノグラム）量の意図されるプローブもしくはプライマーを含むために使用される、ガラスバイアルが挙げられ得るか、またはこの包装材料は、本発明のプローブもしくはプライマーが作動可能に固定されている（すなわち、本発明の増幅および／または検出方法に関与できるように連結されている）、マイクロタイタープレートウェルであり得る。
【０１９２】
その指示は、代表的には、試薬および／または試薬濃度、ならびに少なくとも１つのアッセイ方法パラメータ（例えば、サンプル量あたりの使用する試薬の相対量であり得る）を示す。さらに、維持、時間、温度および緩衝液の条件のような詳細もまた、含まれ得る。
【０１９３】
本発明の診断系は、試験サンプルにおけるＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ生物またはＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ生物の存在または量を増幅および／または決定することにおいて使用するためのキットを意図し、このキットは、本明細書中に記載される任意のハイブリダイゼーションアッセイプローブ、ヘルパープローブおよび／または増幅プライマーを有し、これらの成分は、それらが個々に提供されるか、または上記の好ましい組み合わせのうちの１つの状態で提供されるかに関わらない。
【０１９４】
（１．実施例）
実施例が、本発明の異なる局面および実施形態を例示するために、以下に提供される。これらの実施例が、本明細書中に記載される特定の実施形態に本発明を限定することは意図されないことを、当業者は認識する。
【０１９５】
（Ａ．Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ核酸の単離および精製）
ＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍリボゾームＲＮＡを得るために、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ微小遠心機（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．；Ｃａｔ．Ｎｏ．２２ ６２ １２０−３）を使用して、サンプルを、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ １．５ｍｌマイクロ試験チューブ（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．、Ｗｅｓｔｂｕｒｙ、ＮＹ；Ｃａｔ．Ｎｏ．２２ ６０ ００２ ８）にて７，０００ｒｐｍで５分間遠心分離することによって、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍオーシストをそのサンプルからまず単離する。その後、その上清を吸引除去し、そして残りのペレットを、Ａｍｉｂｉｏｎ’ｓ ＲＮＡａｑｕｅｏｕｓＴＭキット（Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．，Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ；Ｃａｔ．Ｎｏ．ＡＭ−１９１２）に備わる溶解／結合緩衝液２００μｌ中に再懸濁する。
【０１９６】
約１．０ｍｍのジルコニア／シリカビーズ（ＢｉｏＳｐｅｃ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｂａｒｔｌｅｓｖｉｌｅ，ＯＫ；Ｃａｔ．Ｎｏ．１１０７９１１０Ｚ）を、２．０ｍｌ遠心分離バイアル（ＢｉｏＳｐｅｃ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ．；Ｃａｔ．Ｎｏ．１０８３２）に添加し、このバイアルを約４分の３（１．５ｍｌ）満たす。その後、５００μｌのジエチルピロカルボネート（ＤＥＰＣ）処理水（Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．；Ｃａｔ．Ｎｏ．９９２２）をこのバイアルに添加し、そしてこのバイアルを密封し、そして手で数回反転させ、その後、そのバイアルからＤＥＰＣ処理水を吸引する。
【０１９７】
再懸濁したペレットをそのマイクロ試験チューブから取り出し、そしてビーズ含有バイアルに添加する。さらなる溶解／結合緩衝液を、そのバイアルを完全に満たすように添加し、その後、そのバイアルを再度密封し、そしてＢｅａｄＢｅａｔｅｒＴＭ（ＢｉｏＳｐｅｃ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ．；Ｃａｔ．Ｎｏ．３１１０ＢＸ）中に配置し、このＢｅａｄＢｅａｔｅｒＴＭを５，０００ｒｐｍにて２分間作動させる。このバイアルをこのＢｅａｄＢｅａｔｅｒＴＭから取り出し、そして氷上に４分間配置し、その後、このＢｅａｄＢｅａｔｅｒＴＭ中で、５，０００ｒｐｍにて２分間の２回目の作動に供す。このバイアルを、再び氷上に４分間配置する。
【０１９８】
その上清をこのバイアルからピペットで取り出し、それによって上清をビーズから分離させ、そしてその上清を新たな２ｍｌ遠心分離バイアル（ＢｉｏＳｐｅｃ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ．；Ｃａｔ．Ｎｏ．１０８３２）に添加する。また、このバイアルに、上記ＲＮＡａｑｕｅｏｕｓＴＭキットに備わるエタノール（６４％）をその上清と等量添加し、その後、このバイアルを密封し、そして手で数回反転させて、その上清とエタノールとの完全な混合を確実にする。その後、この混合物を、上記ＲＮＡａｑｕｅｏｕｓＴＭキットに備わる収集チューブのフィルターカートリッジに６００μｌアリコートで添加する。その後、その収集チューブを、上記Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ遠心機中で１３，０００ｒｐｍにて３０秒間遠心分離し、溶出物を吸引除去し、そして上記ＲＮＡａｑｕｅｏｕｓＴＭキットからＷａｓｈ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｉを７００μｌ、各フィルターカートリッジに添加する。その収集チューブを、１３，０００ｒｐｍにて３０秒間もう１度遠心分離し、その溶出物を除去し、そして上記ＲＮＡａｑｕｅｏｕｓＴＭキットからＷａｓｈ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ ２／３を５００μｌ、そのフィルターカートリッジに添加する。この最後の遠心分離とＷａｓｈ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ ２／３での処理とを反復して、エタノールの除去を確実にする。その後、その収集チューブを１３，０００ｒｐｍにて３０秒間遠心分離し、そしてその溶出物を除去し、その後、その収集チューブを１３，０００ｒｐｍにて２分間遠心分離する。
【０１９９】
その後、そのフィルターカートリッジを、上記ＲＮＡａｑｕｅｏｕｓＴＭキットに備わる別の収集チューブの組に配置し、上記ＲＮＡａｑｕｅｏｕｓＴＭキットに備わる溶出溶液（９５℃に予め加熱した）を５０μｌ、これらの新たな収集チューブに添加する。この収集チューブを、上記遠心機中で１３，０００ｒｐｍにて１分間遠心分離し、その後、別の上記予め加熱した溶出溶液５０μｌを、この収集チューブに添加する。１３，０００ｒｐｍにて１分間、最後の遠心分離を実施する。そしてこれらの最後の２つの遠心分離からの溶出物は、精製ＲＮＡを含む。
【０２００】
（Ｂ．ハイブリダイゼーションアッセイプローブ）
ＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍまたはＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ由来の核酸に特異的なハイブリダイゼーションアッセイプローブを、上記に示した公開された配列およびＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍについて決定された１８Ｓ ｒＲＮＡ配列から同定した。Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍに特異的なプローブを、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｍｕｒｉｓ、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｂａｉｌｅｙｉおよびＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｗｒａｉｒｉの１８Ｓ ｒＲＮＡ配列と、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒａ ｃａｙｅｔａｎｅｎｓｉｓ、Ｓａｒｃｏｃｙｓｔｉｓ ｈｏｍｉｎｉｓ、Ｅｎｔａｍｏｅｂａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａおよびＥｉｍｅｒｉａ ｐｒａｅｃｏｘの１８Ｓ ｒＲＮＡ配列を比較することによって同定した。そして、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍに特異的なプローブを同定するために、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍの１８Ｓ ｒＲＮＡ配列を、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｍｕｒｉｓ、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｂａｉｌｅｙｉおよびＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｗｒａｉｒｉの１８Ｓ ｒＲＮＡ配列と比較した。可変性の領域を同定し、これらを試験して、特異性を確認し得た。
【０２０１】
配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１６および配列番号１８の塩基配列を有するハイブリダイゼーションアッセイプローブを、以下に記載の実施例で扱う。これらのプローブを、米国特許第６，０３１，０９１号においてＡｒｎｏｌｄらによって開示されるように、非ヌクレオチドリンカーを用いて合成し、そして米国特許第５，１８５，４３９号においてＡｒｎｏｌｄらによって開示されるように、化学発光剤アクリジニウムエステル（ＡＥ）を用いて標識した。ＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍおよびＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ核酸に対するプローブの反応性および特異性は、米国特許第５，２８３，１７７４号においてＡｒｎｏｌｄらによって開示される、相同保護アッセイ（Ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ）（ＨＰＡ）を使用して実証される。結果を、相対光単位（ＲＬＵ）で示し、これは、ルミノメーターによって検出される光子の尺度である。
【０２０２】
（Ｃ．試薬）
種々の試薬を以下の実施例に示す。これらには、ハイブリダイゼーション試薬、選択試薬、増幅試薬、再構成緩衝液、酵素試薬、酵素希釈緩衝液およびオイル試薬が挙げられる。これらの試薬の処方およびｐＨ値（関連する場合）は、以下のとおりである。
【０２０３】
ハイブリダイゼーション試薬：以下の実施例の「ハイブリダイゼーション試薬」は、５０ｍＭ コハク酸、１％（ｗ／ｖ）ラウリル硫酸リチウム（ＬＬＳ）、７．５ｍＭ アルドリチオール−２、０．６Ｍ ＬｉＣｌ、１１５ｍＭ ＬｉＯＨ、１０ｍＭ エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、１０ｍＭ エチレングリコールＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＥＧＴＡ）および１．５％（ｖ／ｖ） エチルアルコール（無水）から作製される（ｐＨ４．７）。
【０２０４】
選択試薬：以下の実施例の「選択試薬」は、６００ｍＭ ホウ酸、２４０ｍＭ ＮａＯＨおよび１％（ｖ／ｖ） ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００から作製される（ｐＨ８．５）。
【０２０５】
増幅試薬：以下の実施例の「増幅試薬」は、各４ｍＭのＡＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰおよびＣＴＰ、各１ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰおよびｄＣＴＰ、４０ｍＭ トリゾーマ塩基（ｐＨ７．５）、２５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１７．５ｍＭ ＫＣｌおよび５％（ｗ／ｖ） ポリビニルピロリドンから作製される。この増幅試薬は、１．５ｍｌの滅菌脱イオン水で再構成される。
【０２０６】
酵素試薬：以下の実施例の「酵素試薬」は、１２５ｍＭ Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン（ＮＡＬＣ）、０．２％（ｖ／ｖ） ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１０２、２０ｍＭ Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）（ｐＨ７．５）、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１ｍＭ 酢酸亜鉛、０．２Ｍ トレハロース、２０００ユニット モロニーマウス白血病ウイルス（「ＭＭＬＶ」）逆転写酵素および２０００ユニット Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼから作製される（１「ユニット」の活性は、ＭＭＬＶ逆転写酵素については、３７℃にて１５分間での５．７５ｆｍｏｌのｃＤＮＡの合成および放出として定義され、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼについては、１「ユニット」の活性は、３７℃にて２０分間での５．０ｆｍｏｌのＲＮＡ転写物の生成として定義される）。この酵素試薬は、１．５ｍＬの酵素希釈緩衝液で再構成される。
【０２０７】
酵素希釈緩衝液：以下の実施例の「酵素希釈緩衝液」は、１４０ｍＭ トリゾーマ試薬（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０％（ｖ／ｖ） ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１０２、７０ｍＭ ＫＣｌおよび２０％（ｖ／ｖ） グリセロールから作製される。
【０２０８】
検出試薬：以下の実施例の「検出試薬」は、検出試薬Ｉ（０．１％（ｖ／ｖ） 過酸化水素および１ｍＭ 硝酸を含む）および検出試薬ＩＩ（１Ｎ 水酸化ナトリウムおよび界面活性剤成分）を含む。
【０２０９】
オイル試薬：以下の実施例の「オイル試薬」は、鉱油である。
【０２１０】
（実施例１）
（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ核酸の特異的検出）
本実施例は、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｒＲＮＡに標的化されるアクリジニウムエステル標識ハイブリダイゼーションアッセイプローブを含むプローブミックスが、非Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ生物の存在下でＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ種を選択的に検出する能力を示す。配列番号３の塩基配列を有するハイブリダイゼーションアッセイプローブを、上記のように、ヌクレオチド１１と１２（５’から３’に読んで）との間に配置される非ヌクレオチドリンカーを含むように合成した。さらに、配列番号２７および配列番号２８の塩基配列を有する非標識ヘルパープローブを、このプローブミックスに含めて、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ核酸へのハイブリダイゼーションアッセイプローブのハイブリダイゼーションを促進させる。最初のヌクレオチド（５’から３’に読んで）（これは、対応するデオキシヌクレオチドと置換されている）を除いて、ヘルパープローブの各ヌクレオチドは、そのリボフラノシル部分に対して２’−Ｏ−メチル置換を含むように改変されたリボヌクレオチドである。
【０２１１】
Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ核酸に対するハイブリダイゼーションアッセイプローブの特異性を、２連のサンプルセットのパネルを使用して決定する。各セットは、以下からなる群より選択された単離株由来の１００ｎｇの精製ｒＲＮＡ（１サンプル当たり５０ｎｇ）を含む：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒａ ｃａｙｅｔａｎｅｎｉｓ、Ｓａｒｃｏｃｙｓｔｉｓ ｈｏｍｉｎｉｓ、Ｅｎｔａｍｏｅｂａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ、Ｅｉｍｅｒｉａ ｐｒａｅｃｏｘ、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ、およびＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｍｕｒｉｓ、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｂａｉｌｅｙｉおよびＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｗｒａｉｒｉの少なくとも１つ。Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍおよびＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｍｕｒｉｓの単離株は、Ｗａｔｅｒｂｏｒｎｅ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ ｏｆ Ｎｅｗ Ｏｒｌｅａｎｓ，ＬＡから得られ得る（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍについてはパート番号Ｐ１０２およびＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｍｕｒｉｓについてはパート番号Ｐ１０４）。ネガティブコントロールサンプルのセットを含めて、バックグラウンドレベルを決定する。
【０２１２】
各サンプルを、１２×７５ｍｍのポリプロピレンチューブ（Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ；カタログ番号２４４０）に提供する。さらに、各チューブに、０．１ｐｍｏｌのハイブリダイゼーションアッセイプローブ、５．０ｐｍｏｌの各ヘルパープローブ、および１００μｌの１×ハイブリダイゼーション試薬を提供する。ハイブリダイゼーションをさせるために、チューブを、循環水浴（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗｉｎｃｈｅｓｔｅｒ、ＶＡ；Ｍｏｄｅｌ ２６０；カタログ番号５１２２１０３５）中で３０分間、６０℃にてインキュベートする。ハイブリダイゼーション後、３００μｌの選択試薬を各チューブに添加し、そして各チューブを循環水浴中で１０分間、６０℃にてインキュベートして、ハイブリダイズされていないプローブに結合しているアクリジニウムエステル標識を加水分解する。サンプルを１分間氷上で冷却し、その後、検出試薬の自動注入を備えるＬＥＡＤＥＲ（登録商標）４５０ｉルミノメーターにおいて分析する。１０，０００ＲＬＵよりも高い正味のＲＬＵ値を、陽性の結果とみなし、そして１０，０００ＲＬＵ未満の正味のＲＬＵ値を、陰性の結果とみなす。正味のＲＬＵ値は、各サンプルセットの平均ＲＬＵ値−ネガティブコントロールセットの平均ＲＬＵ値（すなわち、バックグラウンドシグナル）に基づく。
【０２１３】
（実施例２）
（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ核酸の増幅および検出）
本実施例は、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ由来核酸に特異的なハイブリダイゼーションアッセイプローブを使用する、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｒＲＮＡの標的配列の増幅およびその増幅されたｒＲＮＡの検出を示す。詳細には、配列番号１の塩基配列を有するＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍハイブリダイゼーションアッセイプローブを、上記のように、ヌクレオチド１１と１２（５’から３’に読んで）との間に配置される非ヌクレオチドリンカーを含むように合成した。このハイブリダイゼーションアッセイプローブは、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ標的ｒＲＮＡと同センスであり、そしてこのプローブを使用して、転写媒介増幅の生成物を検出する。転写媒介増幅を行うための手順は、先に記載され、そして米国特許第５，３９９，４９１号および同第５，４８０，７８４号においてＫａｃｉａｎらによって記載される。さらに、このハイブリダイゼーションアッセイプローブは、実施例１のハイブリダイゼーションアッセイプローブと反対のセンスであり、これは、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ生物由来の核酸に特異的であると考えられる。従って、本実施例のハイブリダイゼーションアッセイプローブは、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ生物由来の核酸に特異的であることが予測される。
【０２１４】
Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍおよびＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｍｕｒｉｓ由来のリボソームＲＮＡを、以下のプロモーター−プライマー／プライマーの組み合わせの１つを使用して、別々に増幅する：（ｉ）配列番号６９の５’末端プロモーター塩基配列および配列番号６０の３’末端センステンプレート特異的塩基配列を有するプロモーター−プライマー、ならびに配列番号４５のアンチセンステンプレート特異的塩基配列を有するプライマー；および（ｉｉ）配列番号６９の５’末端プロモーター塩基配列および配列番号６０の３’末端センステンプレート特異的塩基配列を有するプロモーター−プライマー、ならびに配列番号４６のアンチセンステンプレート特異的塩基配列を有するプライマー。Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍおよびＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｍｕｒｉｓ単離株は、Ｗａｔｅｒｂｏｒｎｅ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ ｏｆ Ｎｅｗ Ｏｒｌｅａｎｓ，ＬＡから得られ得る（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍについてはパート番号Ｐ１０２およびＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｍｕｒｉｓについてはパート番号Ｐ１０４）。
【０２１５】
増幅を、１２×７５ｍｍのポリプロピレンチューブ（Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ；カタログ番号２４４０）で行う。各チューブは、２連のセットで０ａｍｏｌ、０．２ａｍｏｌまたは２．０ａｍｏｌのＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ ｒＲＮＡまたはＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｍｕｒｉｓ ｒＲＮＡ、１５ｐｍｏｌ プロモーター−プライマー、１５ｐｍｏｌ プライマー、２５μｌ 増幅試薬、および滅菌脱イオン水を含み、各チューブの総量を７５μｌにする。各サンプルに２００μｌのオイル試薬を加え、そして乾燥加熱浴（Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ；カタログ番号４００６）中で１０分間、９５℃にてインキュベートする。次いで、サンプルを、循環水浴（Ｌａｕｄａ Ｄｒ．Ｒ．Ｗｏｂｓｅｒ ＧｍｂＨ ＆ Ｃｏ．ＫＧ、Ｌａｕｄａ−Ｋｏｅｎｉｇｓｈｏｆｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ；Ｍｏｄｅｌ Ｎｏ．Ｍ２０−Ｓ）に移し、そして５分間、４２℃にてインキュベートし、その後、各チューブに２５μｌの再構成した酵素試薬を加える。循環水浴中４２℃での６０分間のインキュベーション後、１００ｆｍｏｌのハイブリダイゼーションアッセイプローブを含む１００μｌ １×ハイブリダイゼーション試薬を、各チューブに加え、サンプルを、循環水浴中６０℃で３０分間インキュベートし、そしてアニールされたハイブリダイゼーションアッセイプローブ由来のシグナルを、実施例１に記載された様式で検出する。ネガティブコントロール（０ａｍｏｌの標的ｒＲＮＡ）の平均ＲＬＵ値の１０倍を超える平均ＲＬＵ値を有するサンプルセットは、標的ｒＲＮＡの増幅を示し、そしてネガティブコントロールの平均ＲＬＵ値の１０倍未満の平均ＲＬＵ値を有するサンプルセットは、標的ｒＲＮＡの増幅がないことを示す。
【０２１６】
（実施例３）
（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ核酸の特異的検出）
本実施例は、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ ｒＲＮＡに標的化されるアクリジニウムエステル標識ハイブリダイゼーションアッセイプローブを含むプローブミックスが、非Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ生物の存在下でＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ生物を選択的に検出する能力を示す。上記のように、以下の塩基配列の１つを有するハイブリダイゼーションアッセイプローブを合成する：（ｉ）配列番号１３（ヌクレオチド９と１０（５’から３’に読んで）との間に非ヌクレオチドリンカーが配置される）；（ｉｉ）配列番号１５（ヌクレオチド１２と１３（５’から３’に読んで）との間に非ヌクレオチドリンカーが配置される）；（ｉｉｉ）配列番号１６（ヌクレオチド９と１０（５’から３’に読んで）との間に非ヌクレオチドリンカーが配置される）；および（ｉｖ）配列番号１８（ヌクレオチド９と１０（５’から３’に読んで）との間に非ヌクレオチドリンカーが配置される）。最初のヌクレオチド（５’から３’に読んで）（これは、対応するデオキシヌクレオチドと置換されている）を除いて、配列番号１８の塩基配列を有するハイブリダイゼーションアッセイプローブの各ヌクレオチドは、そのリボフラノシル部分に対して２’−Ｏ−メチル置換を含むように改変されたリボヌクレオチドである。
【０２１７】
さらに、以下の塩基配列を有する非標識ヘルパープローブを、このプローブミックスに含めて、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ核酸へのハイブリダイゼーションアッセイプローブのハイブリダイゼーションを促進させる：（ｉ）配列番号１５の塩基配列を有するハイブリダイゼーションアッセイプローブと共に使用するための、配列番号４１または配列番号４２；および（ｉｉ）配列番号１３または配列番号１８（示されるように改変された）の塩基配列を有するハイブリダイゼーションアッセイプローブと共に使用するための、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３および配列番号４４のいずれか１つまたはそれらの組み合わせ。最初のヌクレオチド（５’から３’に読んで）（これは、対応するデオキシヌクレオチドと置換されている）を除いて、これらのヘルパープローブの各ヌクレオチドは、そのリボフラノシル部分に対して２’−Ｏ−メチル置換を含むように改変されたリボヌクレオチドである。
【０２１８】
Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ核酸に対するハイブリダイゼーションアッセイプローブの特異性を、２連のサンプルセットのパネルを使用して決定する。各セットは、以下からなる群より選択された単離株由来の１００ｎｇの精製ｒＲＮＡ（１サンプル当たり５０ｎｇ）を含む：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒａ ｃａｙｅｔａｎｅｎｓｉｓ、Ｓａｒｃｏｃｙｓｔｉｓ ｈｏｍｉｎｉｓ、Ｅｉｍｅｒｉａ ｐｒａｅｃｏｘ、Ｅｎｔａｍｏｅｂａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ、およびＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｍｕｒｉｓ、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｂａｉｌｅｙｉ、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｓｅｒｐｅｎｔｉｓおよびＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｗｒａｉｒｉの少なくとも１つ。Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍおよびＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｍｕｒｉｓの単離株は、Ｗａｔｅｒｂｏｒｎｅ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄから入手可能である（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍについてはパート番号Ｐ１０２およびＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｍｕｒｉｓについてはパート番号Ｐ１０４）。ネガティブコントロールサンプルのセットを含めて、バックグラウンドレベルを決定する。
【０２１９】
各サンプルを、１２×７５ｍｍのポリプロピレンチューブ（Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ；カタログ番号２４４０）に提供する。さらに、各チューブに、０．１ｐｍｏｌのハイブリダイゼーションアッセイプローブ、５．０ｐｍｏｌの各ヘルパープローブ、および１００μｌの１×ハイブリダイゼーション試薬を提供する。ハイブリダイゼーションをさせるために、チューブを、循環水浴（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；Ｍｏｄｅｌ ２６０；カタログ番号５１２２１０３５）中で３０分間、６０℃にてインキュベートする。ハイブリダイゼーション後、３００μｌの選択試薬を各チューブに添加し、そして各チューブを循環水浴中で１０分間、６０℃にてインキュベートして、ハイブリダイズされていないプローブに結合しているアクリジニウムエステル標識を加水分解する。サンプルを１分間氷上で冷却し、その後、検出試薬の自動注入を備えるＬＥＡＤＥＲ（登録商標）４５０ｉルミノメーターにおいて分析する。１０，０００ＲＬＵよりも高い正味のＲＬＵ値を、陽性の結果とみなし、そして１０，０００ＲＬＵ未満の正味のＲＬＵ値を、陰性の結果とみなす。正味のＲＬＵ値は、各サンプルセットの平均ＲＬＵ値−ネガティブコントロールセットの平均ＲＬＵ値（すなわち、バックグラウンドシグナル）に基づく。
【０２２０】
（実施例４）
（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍハイブリダイゼーションアッセイプローブの感度）
本実施例は、標的を含むｒＲＮＡ転写物を有するコントロールおよび種々の量のＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍオーシストを含む水サンプルを使用し、サンプル中のＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ核酸の検出についてのアクリジニウムエステル標識ハイブリダイゼーションアッセイプローブの感度を実証した。ハイブリダイゼーションアッセイプローブを、上記のように、配列番号１３の塩基配列を有しかつヌクレオチド９と１０（５’から３’に読んで）との間に配置される非ヌクレオチドリンカーを含むように合成した。ヘルパープローブは、本実施例では使用しなかった。
【０２２１】
このＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍハイブリダイゼーションアッセイプローブの感度を、２連のコントロールおよびサンプル（１つの例外を含む）のパネルを使用して決定した。コントロールサンプルは、以下を含んだ：（ｉ）各チューブに９５μｌ溶解試薬を含みそして転写物を含まない、第１のセット（「ネガティブコントロール」）；（ｉｉ）各チューブに８５μｌ溶解試薬および０．０１ｆｍｏｌ／μｌの濃度の１０μｌの転写物を含む、第２のセット（「第１のポジティブコントロール」）；（ｉｉｉ）各チューブに８５μｌ溶解試薬および０．１ｆｍｏｌ／μｌの濃度の１０μｌの転写物を含む、第３のセット（「第２のポジティブコントロール」）；および（ｉｖ）各チューブに８５μｌ溶解試薬および１．０ｆｍｏｌ／μｌの濃度の１０μｌの転写物を含む、第４のセット（「第３のポジティブコントロール」）。溶解試薬は、１．９２５ｍｌの溶解緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ ＣａＣｌ２および１％（ｗ／ｖ）ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ））および２０ｍｇ／ｍｌの濃度の１０５μｌ プロテイナーゼＫから作製された。
【０２２２】
５種の２連のサンプルを試験した。各セットのメンバーは、１ｍｌ溶解試薬中に、それぞれ、２×１０３、１×１０４、１×１０５、１×１０６および５×１０６の量のオーシストを含んだ。上記で詳述した単離および精製方法とは異なり、本実施例のＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ ｒＲＮＡを、エッペンドルフ微量遠心分離機（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．；カタログ番号２２ ６２ １２０−３）を使用して５分間、９，０００ｒｐｍにて、エッペンドルフ１．５ｍｌマイクロテストチューブ（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．；カタログ番号２２ ６０ ００２ ８）中で各サンプルを高速遠心分離することによって、サンプルから単離した。約１００μｌの上清を各チューブから取り出し、そしてサンプルを、微量遠心分離機で２分間、９，０００ｒｐｍで再度遠心分離した。ペレットを乱さないように上清を除去し、ペレットを１００μｌの溶解試薬中に再懸濁した。
【０２２３】
サンプルおよびコントロール全てに、１００μｌのオイル試薬を提供し、そして循環水浴（Ｌａｕｄａ Ｄｒ．Ｒ．Ｗｏｂｓｅｒ ＧｍｂＨ ＆ Ｃｏ．ＫＧ；Ｍｏｄｅｌ Ｎｏ．Ｍ２０−Ｓ）中で６０分間、４２℃にてインキュベートした。次いで、サンプルを、乾燥加熱浴（Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ；カタログ番号４００６）に移し、９５℃にて９０分間インキュベートした。その後、各チューブに１００μｌのプローブミックスを加えた。このプローブミックスは、２．２ｍｌの１×ハイブリダイゼーション試薬および１００ｆｍｏｌ／μｌの濃度の２２μｌのハイブリダイゼーションアッセイプローブを合わせて調製した。チューブの内容物を手短にボルテックスし、再度、循環水浴中で３０分間６０℃にてインキュベートし、標的ｒＲＮＡへプローブをハイブリダイズさせた。
【０２２４】
ハイブリダイゼーション後、３００μｌの選択試薬を各チューブに添加し、そしてチューブを手短にボルテックスし、その後、循環水浴中で８分間６０℃にてさらにインキュベートして、ハイブリダイズされなかったプローブに結合するアクリジニウムエステル標識を加水分解した。次いで、チューブの内容物を室温で５分間冷却し、その後、検出試薬の自動注入器を備えるＬＥＡＤＥＲ（登録商標）４５０ｈｃルミノメーター（Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）において分析した。この実験のＲＬＵ値および変動係数（ＣＶ）％値を、以下の表１に示す。ここで、「正味のＲＬＵ」は、ネガティブコントロール、ポジティブコントロールまたはサンプルコントロールの平均ＲＬＵからネガティブコントロールの平均ＲＬＵを引いたものである。
【０２２５】
（表１：ポジティブコントロール中に存在する種々の濃度の標的核酸および種々の量のＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍオーシストから単離された種々の量の標的核酸に対するプローブのハイブリダイゼーション）
【０２２６】
【表１】
【０２２７】
（実施例５）
（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ核酸の増幅および検出）
この実施例は、核酸増幅産物の検出のための、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍハイブリダイゼーションアッセイプローブの使用を説明する。特に、配列番号５、配列番号７、配列番号８または配列番号１０の塩基配列を有するＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍハイブリダイゼーションアッセイプローブは、上記のように合成され、以下に位置する非ヌクレオチドリンカーを含む：（ｉ）配列番号５の塩基配列のヌクレオチド１８と１９との間（５’から３’に読んで）；（ｉｉ）配列番号７の塩基配列のヌクレオチド１３と１４との間（５’から３’に読んで）；（ｉｉｉ）配列番号８の塩基配列のヌクレオチド１６と１７との間（５’から３’に読んで）；および（ｉｖ）配列番号１０の塩基配列のヌクレオチド１１と１２との間（５’から３’に読んで）。対応するデオキシヌクレオチドで置換される最初のヌクレオチド（５’から３’に読んで）を除いて、配列番号１０の塩基配列を有するハイブリダイゼーションアッセイプローブの各ヌクレオチドは、リボフラノシル部分に対する２’−Ｏ−メチル置換を含むように改変されたリボヌクレオチドである。
【０２２８】
これらのハイブリダイゼーションアッセイプローブは、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ標的ｒＲＮＡと同じセンスであり、そして転写物媒介増幅産物を検出するために使用される。転写媒介増幅を実行するための手順は、前出ならびにＫａｃｉａｎら、米国特許第５，３９９，４９１号および同第５，４８０，７８４号によって記載される。さらに、これらのハイブリダイゼーションアッセイプローブは、それぞれ、実施例３の配列番号１３、配列番号１５、配列番号１６および配列番号１８の塩基配列を有するハイブリダイゼーションアッセイプローブの反対のセンスであり、これらは、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ生物由来の核酸に特異的であると考えられる。従って、この実施例のハイブリダイゼーションアッセイプローブは、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ生物由来の核酸に特異的であると予想される。
【０２２９】
Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ由来のリボソームＲＮＡは、ハイブリダイゼーションアッセイプローブが、配列番号５、配列番号７または配列番号１０の塩基配列を有する場合、以下のプロモーター−プライマー／プライマーの組み合わせの１つを使用して、増幅される：（ｉ）配列番号６９の５’末端プロモーター塩基配列および配列番号５９の３’末端センステンプレート特異的塩基配列を有するプロモーター−プライマー、ならびに配列番号４５のアンチセンステンプレート特異的な塩基配列を有するプライマー；（ｉｉ）配列番号６９の５’末端プロモーター塩基配列および配列番号５９の３’末端センステンプレート特異的塩基配列を有するプロモーター−プライマー、ならびに配列番号４６のアンチセンステンプレート特異的な塩基配列を有するプライマー；（ｉｉｉ）配列番号６９の５’末端プロモーター塩基配列および配列番号６０の３’末端センステンプレート特異的塩基配列を有するプロモーター−プライマー、ならびに配列番号４５のアンチセンステンプレート特異的な塩基配列を有するプライマー；そして（ｉｖ）配列番号６９の５’末端プロモーター塩基配列および配列番号６０の３’末端センステンプレート特異的塩基配列を有するプロモーター−プライマー、ならびに配列番号４６のアンチセンステンプレート特異的な塩基配列を有するプライマー。そして、ハイブリダイゼーションアッセイプローブが配列番号８の塩基配列を有する場合、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ由来のｒＲＮＡは、配列番号６９の５’末端プロモーター塩基配列および配列番号６２の３’末端センステンプレート特異的塩基配列を有するプロモーター−プライマー、ならびに配列番号４９のアンチセンステンプレート特異的な塩基配列を有するプライマーを使用して増幅される。Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ単離株は、Ｐａｒｔ．Ｎｏ．Ｐ１０２としてＷａｔｅｒｂｏｒｎ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄから入手可能である。
【０２３０】
増幅は、１２×７５ｍｍのポリプロピレンチューブ（Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ；カタログ番号２４４０）中で実行され、各々のチューブは、０ａｍｏｌ、０．２ａｍｏｌ、または２．０ａｍｏｌのＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ ｒＲＮＡを二連のセット、１５ｐｍｏｌのプロモーター−プライマー、１５ｐｍｏｌのプライマー、２５μｌのＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔおよび各チューブ内の総容積を７５μｌにする滅菌脱イオン水を含む。各サンプルは、２００μｌのＯｉｌ Ｒｅａｇｅｎｔを受け、そして乾熱浴（Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ；カタログ番号４００６）中で９５℃で１０分間インキュベートされる。次いで、このサンプルを、循環水浴（Ｌａｕｄａ Ｄｒ．Ｒ．Ｗｏｂｓｅｒ ＧｍｂＨ＆Ｃｏ．ＫＧ；モデル番号Ｍ２０−Ｓ）に移し、そして４２℃で５分間インキュベートした後、再構成したＥｎｚｙｍｅ Ｒｅａｇｅｎｔ２５μｌを、各チューブに添加する。循環水浴中での４２℃で６０分間のインキュベーション後、ハイブリダイゼーションアッセイプローブ１００ｆｍｏｌ含有の１×Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔの１００μｌを、各サンプルに添加し、このサンプルを循環水浴中で６０℃で３０分間インキュベートし、アニールしたハイブリダイゼーションアッセイプローブからのシグナルを、実施例３に記載の様式で検出する。ネガティブコントロール（０ａｍｏｌの標的ｒＲＮＡ）についての平均ＲＬＵの１０倍を上回る平均ＲＬＵを有するサンプルセットは、標的ｒＲＮＡの増幅を示し、そしてネガティブコントロールについての平均ＲＬＵの１０倍未満の平均ＲＬＵを有するサンプルセットは、標的ｒＲＮＡの増幅がないことを示す。
【０２３１】
（実施例６）
（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ標的転写物の増幅）
この実施例は、種々の濃度でのＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ ｒＲＮＡ転写物配列の増幅および検出を説明する。特に、配列番号５の塩基配列を有するＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍハイブリダイゼーションアッセイプローブを、ヌクレオチド１８と１９との間（５’から３’に読んで）に位置する非ヌクレオチドリンカーを含むように、上記のように合成した。このハイブリダイゼーションアッセイプローブは、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ標的ｒＲＮＡと同じセンスであり、そして転写媒介増幅産物の検出のために使用された。転写媒介増幅を実行するための手順は、前出ならびにＫａｃｉａｎら、米国特許第５，３９９，４９１号および同第５，４８０，７８４号によって記載される。さらに、これらのハイブリダイゼーションアッセイプローブは、実施例３の配列番号１３の塩基配列を有するハイブリダイゼーションアッセイプローブの反対のセンスであり、これは、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ生物由来の核酸に特異的であると考えられる。従って、この実施例のハイブリダイゼーションアッセイプローブは、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ生物由来の核酸に特異的であると予想された。
【０２３２】
この実施例について、２つの異なるプロモーター−プライマー／プライマーの組み合わせを使用した。第一のプロモーター−プライマー／プライマーの組み合わせは、配列番号６９の５’末端プロモーター塩基配列および配列番号５９の３’末端センステンプレート特異的塩基配列を有するプロモーター−プライマー、ならびに配列番号４６のアンチセンステンプレート特異的な塩基配列を有するプライマーを含んだ（「プライマーセット１」）。これらのプロモーター−プライマー／プライマーの組み合わせの第二の組み合わせは、配列番号６９の５’末端プロモーター塩基配列および配列番号５９の３’末端センステンプレート特異的塩基配列を有するプロモーター−プライマー、ならびに配列番号４５のアンチセンステンプレート特異的な塩基配列を有するプライマーを含んだ（「プライマーセット２」）。各プライマーセットについての作業ストックは、各々１５ｐｍｏｌ／μｌの濃度でプライマーおよびプロモーター−プライマーを含有する、２００μｌの滅菌脱イオン水であった。
【０２３３】
次いで、各プライマーセットについての作業ストックを使用して、２つの増幅溶液を調製した。これらの溶液の第一の溶液を、３７５μｌのＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ、１５μｌのプライマーセット１の作業ストックおよび５８５μｌの滅菌脱イオン水を合わせることによって調製した（「第一増幅溶液」）。これらの溶液の第二の溶液を、３７５μｌのＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ、１５μｌのプライマーセット２の作業ストックおよび５８５μｌの滅菌脱イオン水を合わせることによって調製した（「第二増幅溶液」）。
【０２３４】
プローブストックを、約２００μｌの１×Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ中１００ｆｍｏｌ／μｌの濃度で、ハイブリダイゼーションアッセイプローブから作製した。このストックから、プローブミックスを、３０μｌのプローブストックおよび３ｍｌの２×Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔを合わせることによって、調製した。プローブストックのこの容積は、３０サンプルまでに十分であった。
【０２３５】
転写物の希釈を行って、滅菌脱イオン水中１０ａｍｏｌ／μｌ、１ａｍｏｌ／μｌ、０．１ａｍｏｌ／μｌ、０．０１ａｍｏｌ／μｌおよび０．００１ａｍｏｌ／μｌの濃度を有する転写物ストックを調製した（転写物ストックの各ａｍｏｌは、約６００，０００コピーの転写物を含んだ）。これらのストック濃度の各々から、４個のＥｐｐｅｎｄｏｒｆ １．５ｍｌのマイクロ試験チューブ（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ，Ｉｎｃ．；カタログ番号２２ ６０ ００２ ８）のセットを調製し、これらの各々は、１０μｌの転写物ストック溶液を含んだ。各チューブセット由来の、各２個のチューブの内容物を、６５μｌの第一増幅溶液と合わせ、一方、各チューブセット由来の他の２個のチューブの内容物を、６５μｌの第二増幅溶液と合わせた。４個のネガティブコントロールチューブ（０ａｍｏｌの標的）もまた含まれ、これらの各々は、１０μｌの滅菌脱イオン水を含んだ。これらのネガティブコントロールの２個は、６５μｌの第一増幅溶液を受け、一方、他の２個のネガティブコントロールは、６５μｌの第二増幅溶液を受けた。
【０２３６】
各チューブは、２００μｌのＯｉｌ Ｒｅａｇｅｎｔ（サンプルおよびコントロールの両方とも）を受け、そしてこれらのチューブを、乾熱浴（Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ；カタログ番号４００６）中で５分間９５℃でインキュベートした。次いで、これらのチューブを循環水浴（Ｌａｕｄａ Ｄｒ．Ｒ．Ｗｏｂｓｅｒ ＧｍｂＨ＆Ｃｏ．ＫＧ；モデル番号Ｍ２０−Ｓ）に移し、そして４２℃で５分間インキュベートした後、再構成したＥｎｚｙｍｅ Ｒｅａｇｅｎｔ２５μｌを、各チューブに添加した。次いで、これらのチューブを穏やかに混合し、そして循環水浴中で４２℃でさらに６０分間インキュベートした。この３回目のインキュベーション後、１００μｌのプローブミックスをチューブに添加し、チューブをボルテックスし、そして循環水浴中での６０℃で３０分間の、４回目のインキュベーションに供した。次いで、各チューブに、３００μｌのＳｅｌｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔを提供し、ボルテックスし、循環水浴中で６０℃で１０分間インキュベートし、そして氷水上で１分間冷却した。アニールしたハイブリダイゼーションアッセイプローブからのシグナルを、（ＬＥＡＤＥＲ（登録商標）４５０ｈｃ照度計を、ＬＥＡＤＥＲ（登録商標）４５０ｉ照度計の代わりに使用した点を除いて）実施例３に記載の様式で検出し、結果を以下の表２に示す。ネガティブコントロール（０ａｍｏｌの標的ｒＲＮＡ）についての平均ＲＬＵの１０倍を上回る平均ＲＬＵを有するサンプルセットは、標的ｒＲＮＡの増幅を示し、そしてネガティブコントロールについての平均ＲＬＵの１０倍未満の平均ＲＬＵを有するサンプルセットは、標的ｒＲＮＡの増幅がないことを示した。
【０２３７】
【表２】
【０２３８】
（実施例７）
（非標的生物由来のｒＲＮＡの存在下でのＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ標的転写物の増幅）
この実施例は、各々種々の濃度でのＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｍｕｒｉｓ ｒＲＮＡの存在下でのＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ ｒＲＮＡ標的配列の増幅および検出を説明する。特に、配列番号５の塩基配列を有するＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍハイブリダイゼーションアッセイプローブを、上記のように、ヌクレオチド１８と１９との間（５’から３’に読んで）に位置する非ヌクレオチドリンカーを含むように合成した。このハイブリダイゼーションアッセイプローブは、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ標的ｒＲＮＡと同じセンスであり、そして転写媒介増幅産物の検出のために使用された。転写媒介増幅を実行するための手順は、前出ならびにＫａｃｉａｎら、米国特許第５，３９９，４９１号および同第５，４８０，７８４号によって記載される。さらに、これらのハイブリダイゼーションアッセイプローブは、実施例３の配列番号１３の塩基配列を有するハイブリダイゼーションアッセイプローブの反対のセンスであり、これは、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ生物由来の核酸に特異的であると考えられる。従って、この実施例のハイブリダイゼーションアッセイプローブは、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ生物由来の核酸に特異的であると予想された。
【０２３９】
この実施例において、合計２０個の１２×７５ｍｍポリプロピレンチューブ（Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ；カタログ番号２４４０）を、以下の表３に示されたＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ転写物ｒＲＮＡおよびＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｍｕｒｉｓ ｒＲＮＡの量を含むように、マトリックス形式で設定した。この実施例の転写物を生成するために使用されたＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍオーシストは、Ｐａｒｔ．Ｎｏ．Ｐ１０２としてＷａｔｅｒｂｏｒｎ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄから得た。Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｍｕｒｉｓオーシストは、個人的な供給源から得たが、このＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｍｕｒｉｓ単離株は、Ｐａｒｔ．Ｎｏ．Ｐ１０４としてＷａｔｅｒｂｏｒｎ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄから入手可能である。Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｍｕｒｉｓについて、二連のセットのチューブに、０ａｍｏｌ、０．２ａｍｏｌ、または２．０ａｍｏｌ、２０ａｍｏｌ、２００ａｍｏｌのＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｍｕｒｉｓサンプルｒＲＮＡを提供した。次いで、これらのセットのチューブの各メンバーを、０ａｍｏｌまたは２ａｍｏｌのいずれかのＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ転写物ｒＲＮＡを有する２個のＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍチューブのうちの１個と一致させた。各チューブに提供されるプロモーター−プライマー／プライマーの組み合わせは、配列番号６９の５’末端プロモーター塩基配列および配列番号５９の３’末端センステンプレート特異的塩基配列を有するプロモーター−プライマー、ならびに配列番号４６のアンチセンステンプレート特異的な塩基配列を有するプライマーを含んだ。このプライマーセットを使用して、７５０μｌのＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔおよび３０μｌのプライマー作業ストック（滅菌脱イオン水中に１５ｐｍｏｌ／μｌの各プロモーター−プライマーおよびプライマーを含む）からなる増幅溶液を調製した。
【０２４０】
各チューブに、２５μｌの増幅溶液を提供し、そして非コントロールチューブに、適切に希釈したサンプルｒＲＮＡの１０μｌを提供した。全てのチューブの総容積を、滅菌脱イオン水を用いて７５μｌにした。このチューブに、２００μｌのＯｉｌ Ｒｅａｇｅｎｔを別々に提供し、次いで乾熱浴中（Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ；カタログ番号４００６）中で１０分間９５℃でインキュベートし、その後、これらのチューブを循環水浴（Ｌａｕｄａ Ｄｒ．Ｒ．Ｗｏｂｓｅｒ ＧｍｂＨ＆Ｃｏ．ＫＧ；モデル番号Ｍ２０−Ｓ）に移し、そして４２℃で５分間インキュベートした。再構成したＥｎｚｙｍｅ Ｒｅａｇｅｎｔ２５μｌを各チューブに添加した後、これらのチューブを穏やかに混合し、そして循環水浴中で４２℃でさらに６０分間インキュベートした。この３回目のインキュベーション後、１００μｌのプローブミックスを各チューブに添加し、このプローブミックスは、１×Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ中、１ｐｍｏｌ／ｍｌのハイブリダイゼーションアッセイプローブからなった。次いで、チューブをボルテックスし、そして循環水浴中での６０℃で３０分間の、４回目のインキュベーションに供した。次いで、各チューブに、３００μｌのＳｅｌｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔを提供し、ボルテックスし、循環水浴中で６０℃で１０分間インキュベートし、そして氷水上で１分間冷却した。アニールしたハイブリダイゼーションアッセイプローブからのシグナルを、（ＬＥＡＤＥＲ（登録商標）４５０ｈｃ照度計を、ＬＥＡＤＥＲ（登録商標）４５０ｉ照度計の代わりに使用した点を除いて）実施例３に記載の様式で検出し、結果を以下の表３に示す。ネガティブコントロール（０ａｍｏｌの標的ｒＲＮＡおよび０ａｍｏｌの非標的ｒＲＮＡ）についてのＲＬＵの１０倍を上回るＲＬＵ値を有するサンプルは、標的ｒＲＮＡまたは非標的ｒＲＮＡの増幅を示し、そしてネガティブコントロールについてのＲＬＵの１０倍未満のＲＬＵ値を有するサンプルは、標的ｒＲＮＡまたは非標的ｒＲＮＡの増幅がないことを示した。
【０２４１】
【表３】
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、血球計算板計測により決定した「平均の正味ＲＬＵ」対「オーシスト」をプロットしたオーシストの力価グラフである。この図は、オーシストの負荷が、試験サンプル中のＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍの存在を直接的に検出するために必要なことを示す。
【図２】
図２は、「平均の正味ＲＬＵ」対「標的」をプロットした増幅のグラフである。この図は、転写が媒介する増幅手順の後で、試験サンプル中のＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ生物の存在を検出するのに必要な初期のｒＲＮＡコピー数の指標を提供する。
Claims (165)
- オリゴヌクレオチドを含むハイブリダイゼーションアッセイプローブであって、該プローブは、ストリンジェントな条件下で、試験サンプル中のＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ生物由来の核酸に存在する標的配列にハイブリダイズして、検出において安定であるプローブ：標的ハイブリッドを形成し、該オリゴヌクレオチドは、標的配列中に存在する少なくとも１０個の連続した塩基領域に対して、少なくとも８０％相補的である少なくとも１０個の連続した塩基領域を有し、ここで、該標的配列は配列番号１、配列番号２、配列番号３および配列番号４からなる群より選択され、そして該プローブは、ストリンジェントな条件下で、試験サンプル中の非Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ生物由来の核酸にハイブリダイズせず、検出において安定であるプローブ：非標的ハイブリッドを形成しない、プローブ。
- 請求項１に記載のプローブであって、ここで、前記オリゴヌクレオチドは少なくとも１０個の連続した塩基領域を有し、該塩基領域は標的配列に存在する少なくとも１０個の連続した塩基領域に対して少なくとも９０％相補的である、プローブ。
- 請求項１に記載のプローブであって、ここで、前記オリゴヌクレオチドは少なくとも１０個の連続した塩基領域を有し、該塩基領域は標的配列に存在する少なくとも１０個の連続した塩基領域に対して１００％相補的である、プローブ。
- 請求項１に記載のプローブであって、ここで、前記オリゴヌクレオチドの塩基配列は前記標的配列の塩基配列に対して少なくとも８０％相補的である、プローブ。
- 請求項１に記載のプローブであって、ここで、該プローブの塩基配列は、前記標的配列の塩基配列に対して少なくとも８０％相補的である、プローブ。
- 請求項１に記載のプローブであって，ここで、該プローブの塩基配列は標的配列の塩基配列に対して完全に相補的である、プローブ。
- 請求項１〜４のいずれか１項に記載のプローブであって、ここで、該プローブが１００塩基までの長さである、プローブ。
- 請求項１〜４のいずれか１項に記載のプローブであって、ここで、該プローブは１２〜５０塩基長である、プローブ。
- 請求項１〜４のいずれか１項に記載のプローブであって、ここで、該プローブが１８〜３５の塩基長である、プローブ。
- 請求項１〜４または７〜９のいずれか１項に記載のプローブであって、ここで、該プローブは、ストリンジェントな条件下で前記標的配列にハイブリダズしない場合に、互いにハイブリダイズする塩基配列を含む、プローブ。
- 請求項１〜４または７〜９のいずれか１項に記載のプローブであって、ここで、該プローブは、ストリンジェントな条件下で、試験サンプ中に存在する、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ生物由来の核酸にも非標的生物由来の核酸にも適切にハイブリダイズしない１以上の塩基配列を含む、プローブ。
- 請求項１１に記載のプローブであって、ここで、該プローブは前記１以上の塩基配列のうちの２つを含み、ここで、該２つの塩基配列は、該プローブが、ストリンジェントな条件下で前記標的配列にハイブリダイズしない場合に、互いにハイブリダイズする、プローブ。
- 請求項１〜１２のいずれか１項に記載のプローブであって、検出可能な標識をさらに含む、プローブ。
- 請求項１０〜１２のいずれか１項に記載のプローブであって、相互作用する標識の群をさらに含む、プローブ。
- 請求項１４に記載のプローブであって、前記相互作用する標識は発光標識および消光標識を含む、プローブ。
- 請求項１〜１５のいずれか１項に記載のプローブであって、ここで、前記オリゴヌクレオチドは、リボフラノシル部分に２’−Ｏ−メチル置換を含むように改変された少なくとも１つのリボヌクレオチドを含む、プローブ。
- 請求項１〜１５のいずれか１項に記載のプローブであって、ここで、偽ペプチド骨格が前記オリゴヌクレオチドの塩基の少なくとも一部分を結合する、プローブ。
- 請求項１〜１７のいずれか１項に記載のプローブであって、ここで、前記ストリンジェントな条件は、５０ｍＭのコハク酸、１％（ｗ／ｖ）ＬＬＳ、７．５ｍＭ アルドリチオール−２、０．６Ｍ ＬｉＣｌ、１１５ｍＭ ＬｉＯＨ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ ＥＧＴＡ、１．５％（ｖ／ｖ）エチルアルコール（無水）、ｐＨ４．７、および約６０℃の試験サンプル温度で構成され、プローブ。
- 請求項１〜１８のいずれか１項に記載のプローブおよび１以上のヘルパーオリゴヌクレオチドを含むプローブミックスであって、該ヘルパーオリゴヌクレオチドは、標的配列中に存在する少なくとも１０個の連続した塩基領域に対して、少なくとも８０％相補的である少なくとも１０個の連続した塩基領域を有し、ここで、該標的配列は、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７および配列番号２８からなる群より選択される、プローブミックス。
- 請求項１９に記載のプローブミックスであって、ここで、前記ヘルパーオリゴヌクレオチドのうちの１つの標的配列が、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５および配列番号２７からなる群より選択される、プローブミックス。
- 請求項１９に記載のプローブミックスであって、ここで、前記ヘルパーオリゴヌクレオチドのうちの１つの標的配列が、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、および配列番号２８からなる群より選択される、プローブミックス。
- 請求項１９に記載のプローブミックスであって、ここで、前記１以上のヘルパーオリゴヌクレオチドは第１のヘルパーオリゴヌクレオチドおよび第２のヘルパーオリゴヌクレオチドを含み、ここで、該第１のヘルパーオリゴヌクレオチドの標的配列が、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５および配列番号２７からなる群より選択され、そして、ここで、該第２のヘルパーオリゴヌクレオチドの標的配列が、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、および配列番号２８からなる群より選択される、プローブミックス。
- 増幅条件下でＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ生物に由来する核酸に存在する核酸配列を増幅する用途のための増幅プライマーであって、
該プライマーは、少なくとも１０個の連続した塩基領域を有するオリゴヌクレオチドを含み、該少なくとも１０個の連続した塩基領域は、標的配列中に存在する少なくとも１０個の連続した塩基領域と少なくとも８０％相補的であり、
該標的配列は、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７および配列番号６８からなる群より選択され、ここで、該プライマーは、ＲＮＡポリメラーゼにより認識されるかまたはＲＮＡポリメラーゼによる開始もしくは伸長を増強する５’配列を必要に応じて含む、プライマー。 - 請求項２３に記載のプライマーであって、ここで、前記標的配列が配列番号４５、配列番号５１、配列番号５７および配列番号６３からなる群より選択される、プライマー。
- 請求項２３に記載のプライマーであって、ここで、前記標的配列が配列番号４６、配列番号５２、配列番号５８および配列番号６４からなる群より選択される、プライマー。
- 請求項２３に記載のプライマーであって、ここで、前記標的配列が、配列番号４７、配列番号５３、配列番号５９および配列番号６５からなる群より選択される、プライマー。
- 請求項２３に記載のプライマーであって、ここで、前記標的配列が配列番号４８、配列番号５４、配列番号６０および配列番号６６からなる群より選択される、プライマー。
- 請求項２３に記載のプライマーであって、ここで、前記標的配列が配列番号４９、配列番号５５、配列番号６１および配列番号６７からなる群より選択される、プライマー。
- 請求項２３に記載のプライマーであって、ここで、前記標的配列が配列番号５０、配列番号５６、配列番号６２および配列番号６８からなる群より選択される、プライマー。
- 請求項２３〜２９のいずれか１項に記載のプライマーであって、ここで、前記オリゴヌクレオチドは少なくとも１０個の連続した塩基領域を有し、該少なくとも１０個の連続した塩基領域は、標的配列中に存在する少なくとも１０個の連続した塩基領域に対して、少なくとも９０％相補的である、プライマー。
- 請求項２３〜２９のいずれか１項に記載のプライマーであって、ここで、前記オリゴヌクレオチドは少なくとも１０個の連続した塩基領域を有し、該少なくとも１０個の連続した塩基領域は、標的配列中に存在する少なくとも１０個の連続した塩基領域に対して、１００％相補的である、プライマー。
- 請求項２３〜２９のいずれか１項に記載のプライマーであって、ここで、前記オリゴヌクレオチドの塩基配列は前記標的配列の塩基配列に対して少なくとも８０％相補的である、プライマー。
- 請求項２３〜２９のいずれか１項に記載のプライマーであって、ここで、該プライマーの塩基配列は前記標的配列の塩基配列に対して少なくとも８０％相補的である、プライマー。
- 請求項２３〜２９のいずれか１項に記載のプライマーであって、ここで、該プライマーの塩基配列は、前記標的配列の塩基配列と完全に相補的である、プライマー。
- 請求項２３〜３２のいずれか１項に記載のプライマーであって、ここで、該プライマーは１８〜４０塩基長であり、そして必要に応じて５’配列を含み、該５’配列はＲＮＡポリメラーゼにより認識されるかまたはＲＮＡポリメラーゼによる開始もしくは伸長を増強する、プライマー。
- 請求項２３〜３５のいずれか１項に記載のプライマーであって、ここで、該プライマーは５’配列を含み、該５’配列はＲＮＡポリメラーゼにより認識されるかまたはＲＮＡポリメラーゼによる開始もしくは伸長を増強する、プライマー。
- 請求項３６に記載のプライマーであって、ここで、ＲＮＡポリメラーゼにより認識されるかまたはＲＮＡポリメラーゼによる開始もしくは伸長を増強する前記５’配列は、配列番号６９の塩基配列を有するＴ７プロモーターである、プライマー。
- 請求項２３〜３２のいずれか１項に記載のプライマーであって、ここで、該プライマーは、増幅条件下で前記標的配列にハイブリダイズしない場合に、互いにハイブリダイズする塩基配列を含む、プライマー。
- 請求項３８に記載のプライマーであって、相互作用する標識の群をさらに含む、プライマー。
- 請求項３９に記載のプライマーであって、ここで、前記相互作用する標識が発光標識および消光標識を含む、プライマー。
- 増幅条件下で、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ生物由来の核酸に存在する核酸配列を増幅する用途のための１セットの増幅プライマーであって、ここで、該１セットのプライマーのうち少なくとも２つのプライマーが、標的配列中に存在する少なくとも１０個の連続した塩基領域に対して、少なくとも８０％相補的である少なくとも１０個の連続した塩基領域を有するオリゴヌクレオチドを含み、該標的配列は、以下：配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７および配列番号６８からなる群より選択され、ここで、該１セットのプライマーのうちの１以上のプライマーは、ＲＮＡポリメラーゼにより認識されるかまたはＲＮＡポリメラーゼによる開始もしくは伸長を増強する５’配列を必要に応じて含む、プライマーのセット。
- 請求項４１に記載のプライマーであって、前記１セットのプライマーが以下：第１のプライマーおよび第２のプライマーを含み、ここで、該第１のプライマーの標的配列は、配列番号４５、配列番号５１、配列番号５７、および配列番号６３からなる群より選択され；ここで、該第２のプライマーの標的配列は、配列番号４７、配列番号５３、配列番号５９および配列番号６５からなる群より選択される、プライマー。
- 請求項４１に記載のプライマーであって、ここで前記１セットのプライマーは以下：第１のプライマーおよび第２のプライマーを含み、ここで、該第１のプライマーの標的配列は、配列番号４５、配列番号５１、配列番号５７、配列番号６３からなる群より選択され；ここで、該第２のプライマーの標的配列は、配列番号４８、配列番号５４、配列番号６０および配列番号６６からなる群より選択される、プライマー。
- 請求項４１に記載のプライマーであって、ここで前記１セットのプライマーは以下：第１のプライマーおよび第２のプライマーを含み、ここで、該第１のプライマーの標的配列は、配列番号４６、配列番号５２、配列番号５８、配列番号６４からなる群より選択され；ここで、該第２のプライマーの標的配列は、配列番号４７、配列番号５３、配列番号５９および配列番号６５からなる群より選択される、プライマー。
- 請求項４１に記載のプライマーであって、ここで前記１セットのプライマーは以下：第１のプライマーおよび第２のプライマーを含み、ここで、該第１のプライマーの標的配列は、配列番号４６、配列番号５２、配列番号５８、配列番号６４からなる群より選択され；ここで、該第２のプライマーの標的配列は、配列番号４８、配列番号５４、配列番号６０および配列番号６６からなる群より選択される、プライマー。
- 請求項４１に記載のプライマーであって、ここで前記１セットのプライマーは以下：第１のプライマーおよび第２のプライマーを含み、ここで、該第１のプライマーの標的配列は、配列番号４９、配列番号５５、配列番号６１、配列番号６７からなる群より選択され；ここで、該第２のプライマーの標的配列は、配列番号５０、配列番号５６、配列番号６２および配列番号６８からなる群より選択される、プライマー。
- 試験サンプル中のＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ生物の存在を決定する用途のためのオリゴヌクレオチドであって、該オリゴヌクレオチドは、少なくとも１０個の連続した塩基領域を有し、該少なくとも１０個の連続した塩基領域は、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ生物に由来する核酸に含まれる標的配列中に存在する少なくとも１０個の連続した塩基領域に対して少なくとも８０％相補的であり、ここで、
該標的配列は、配列番号１、配列番号２、配列番号３．配列番号４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７および配列番号６８からなる群より選択され、ここで、該オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡポリメラーゼにより認識されるかまたはＲＮＡポリメラーゼによる開始もしくは伸長を増強する５’配列を必要に応じて含む、オリゴヌクレオチド。 - 請求項４７に記載のオリゴヌクレオチドであって、ここで、該オリゴヌクレオチドの塩基配列が、前記標的配列の塩基配列に対して少なくとも８０％相補的である、オリゴヌクレオチド。
- 請求項４７に記載のオリゴヌクレオチドであって、ここで、該オリゴヌクレオチドの塩基配列が、前記標的配列の塩基配列に対して完全に相補的である、オリゴヌクレオチド。
- 試験サンプル中のＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ生物の存在を決定する方法であって、該方法は以下の工程：
ストリンジェントな条件下で、該試験サンプルと請求項１〜１８のいずれか１項に記載のプローブとを接触させる工程；および
該試験サンプル中のＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ生物の存在の指標としてのプローブ：標的ハイブリッドが形成されたか否かを決定する工程、
を包含する、方法。 - 試験サンプル中に存在し得るＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ核酸を増幅する方法であって、該方法は以下の工程：
該増幅条件下で、該試験サンプルと請求項２３〜４０のいずれか１項に記載のプライマーとを接触させる工程；および
試験サンプル中に存在し得るＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ生物由来の核酸に存在する標的配列を増幅する工程、
を包含する、方法。 - 請求項５１に記載の方法であって、ここで、前記標的配列が、配列番号４５、配列番号５１、配列番号５７および配列番号６３からなる群より選択される、方法。
- 請求項５１に記載の方法であって、ここで、前記標的配列が、配列番号４６、配列番号５２、配列番号５８および配列番号６４より選択される、方法。
- 請求項５１に記載の方法であって、ここで、前記標的配列が、配列番号４７、配列番号５３、配列番号５９および配列番号６５からなる群より選択される、方法。
- 請求項５１に記載の方法であって、ここで、前記標的配列が、配列番号４８、配列番号５４、配列番号６０および配列番号６６からなる群より選択される、方法。
- 請求項５１に記載の方法であって、ここで、前記標的配列が、配列番号４９、配列番号５５、配列番号６１および配列番号６７からなる群より選択される、方法。
- 請求項５１に記載の方法であって、ここで、前記標的配列が、配列番号５０、配列番号５６、配列番号６２および配列番号６８からなる群より選択される、方法。
- 請求項５１〜５７のいずれか１項に記載の方法であって、ハイブリダイゼーションアッセイプローブを用いて、試験サンプルにおいて増幅された標的配列の存在を決定する工程をさらに包含する、方法。
- 請求項５８に記載の方法であって、前記決定する工程は請求項１〜１８のいずれか１項に記載されるプローブを用いて実施される、方法。
- 試験サンプル中に存在し得るＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ核酸を増幅する方法であって、該方法は以下の工程：
増幅条件下で、該試験サンプルと請求項４１〜４６のいずれか１項に記載の１セットのプライマーとを接触させる工程；および
該試験サンプル中に存在し得るＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ生物に由来する核酸に存在する標的配列を増幅する工程、
を包含する、方法。 - 請求項６０に記載の方法であって、前記決定する工程が請求項１〜１８に記載のいずれか１項に記載のプローブを用いて実施される、方法。
- キットであって、該キットは、パッケージ化された組み合わせにて、試験サンプル中のＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ生物の存在を決定する用途のための２以上のオリゴヌクレオチドを備え、該オリゴヌクレオチドの各々は、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ生物由来の核酸に含まれる標的配列中に存在する少なくとも１０個の連続した塩基領域に対して、少なくとも８０％相補的である少なくとも１０個の連続した塩基領域を有し、ここで、該標的配列は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７および配列番号６８からなる群より選択され、そして、ここで１以上の該オリゴヌクレオチドは５’配列を必要に応じて含み、該５’配列は、ＲＮＡポリメラーゼにより認識されるかまたはＲＮＡポリメラーゼによる開始もしくは伸長を増強する、キット。
- 請求項６２に記載のキットであって、前記２以上のオリゴヌクレオチドは、第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドを備え、
該第１のオリゴヌクレオチドの標的配列は、配列番号１、配列番号２、配列番号３および配列番号４からなる群より選択され；そして
該第２のオリゴヌクレオチドの標的配列は、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７および配列番号６８からなる群より選択される、
キット。 - 請求項６３に記載のキットであって、前記第２のオリゴヌクレオチドの標的配列は、配列番号４５、配列番号５１、配列番号５７および配列番号６３からなる群より選択される、キット。
- 請求項６３に記載のキットであって、前記第２のオリゴヌクレオチドの標的配列は、配列番号４６、配列番号５２、配列番号５８および配列番号６４からなる群より選択される、キット。
- 請求項６３に記載のキットであって、前記第２のオリゴヌクレオチドの標的配列は、配列番号４７、配列番号５３、配列番号５９および配列番号６５からなる群より選択される、キット。
- 請求項６３に記載のキットであって、前記第２のオリゴヌクレオチドの標的配列は、配列番号４８、配列番号５４、配列番号６０および配列番号６６からなる群より選択される、キット。
- 請求項６３に記載のキットであって、前記第２のオリゴヌクレオチドの標的配列は、配列番号４９、配列番号５５、配列番号６１および配列番号６７からなる群より選択される、キット。
- 請求項６３に記載のキットであって、前記第２のオリゴヌクレオチドの標的配列は、配列番号５０、配列番号５６、配列番号６２および配列番号６８からなる群より選択される、キット。
- 請求項６２に記載のキットであって、前記２以上のオリゴヌクレオチドは、第１のオリゴヌクレオチド、第２のオリゴヌクレオチドおよび第３のオリゴヌクレオチドを備え、ここで、
該第１のオリゴヌクレオチドの標的配列は、配列番号１、配列番号２、配列番号３および配列番号４からなる群より選択され；そして
該第２のオリゴヌクレオチドの標的配列は、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５８、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６４、および配列番号６７からなる群より選択され、
該第３のオリゴヌクレオチドの標的配列は、配列番号４７、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６５、配列番号６６、および配列番号６８からなる群より選択される、
キット。 - 請求項７０に記載のキットであって、
前記第２のオリゴヌクレオチドの標的配列は、配列番号４５、配列番号５１、配列番号５７、および配列番号６３からなる群より選択され、
前記第３のオリゴヌクレオチドの標的配列は、配列番号４７、配列番号５３、配列番号５９および配列番号６５からなる群より選択される、
キット。 - 請求項７０に記載のキットであって、
前記第２のオリゴヌクレオチドの標的配列は、配列番号４５、配列番号５１、配列番号５７、および配列番号６３からなる群より選択され、
前記第３のオリゴヌクレオチドの標的配列は、配列番号４８、配列番号５４、配列番号６０および配列番号６６からなる群より選択される、キット。 - 請求項７０に記載のキットであって、
前記第２のオリゴヌクレオチドの標的配列は、配列番号４６、配列番号５２、配列番号５８、および配列番号６４からなる群より選択され、
前記第３のオリゴヌクレオチドの標的配列は、配列番号４７、配列番号５３、配列番号５９および配列番号６５からなる群より選択される、キット。 - 請求項７０に記載のキットであって、
前記第２のオリゴヌクレオチドの標的配列は、配列番号４６、配列番号５２、配列番号５８、および配列番号６４からなる群より選択され、
前記第３のオリゴヌクレオチドの標的配列は、配列番号４８、配列番号５４、配列番号６０および配列番号６６からなる群より選択される、キット。 - 請求項７０に記載のキットであって、
前記第２のオリゴヌクレオチドの標的配列は、配列番号４９、配列番号５５、配列番号６１、および配列番号６７からなる群より選択され、
前記第３のオリゴヌクレオチドの標的配列は、配列番号５０、配列番号５６、配列番号６２および配列番号６８からなる群より選択される、キット。 - キットであって、該キットは、パッケージ化された組み合わせにて、請求項１〜１８のいずれか１項に記載のプローブおよび少なくとも１つのヘルパーオリゴヌクレオチドを有し、該ヘルパーオリゴヌクレオチドは、標的配列中に存在する少なくとも１０個の連続した塩基領域に対して、少なくとも８０％相補的である少なくとも１０個の連続した塩基領域を有し、ここで、該標的配列は、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７および配列番号２８からなる群より選択される、キット。
- キットであって、該キットは、パッケージ化された組み合わせにて、２以上の増幅プライマーを備え、ここで、該プライマーのうち少なくとも２個は、請求項４１〜４６のいずれか１項に記載のプライマーのセットから選択される、キット。
- キットであって、該キットは、パッケージ化された組み合わせにて、請求項１〜１８のいずれか１項に記載のプローブおよび記載の２３〜４０のいずれかに１項に記載の増幅プライマーを備える、キット。
- 請求項７８に記載のキットであって、該キットは、少なくとも１個のヘルパーオリゴヌクレオチドをさらに備え、該ヘルパーオリゴヌクレオチドは、標的配列中に存在する少なくとも１０個の連続した塩基領域に対して、少なくとも８０％相補的である少なくとも１０個の連続した塩基領域を有し、該標的配列は、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７および配列番号２８からなる群より選択される、キット。
- オリゴヌクレオチドを含むハイブリダイゼーションアッセイプローブであって、該プローブは、ストリンジェントな条件下で、試験サンプル中のＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ生物由来の核酸に存在する標的配列にハイブリダイズして、検出において安定であるプローブ：標的ハイブリッドを形成し、該オリゴヌクレオチドは、標的配列中に存在する少なくとも１０個の連続した塩基領域に対して、少なくとも８０％相補的である少なくとも１０個の連続した塩基領域を有し、ここで、該標的配列は、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９および配列番号２０からなる群より選択され、そして該プローブは、ストリンジェントな条件下で、試験サンプル中のＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｍｕｒｉｓ、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｂａｉｌｅｙまたはＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｗｒａｉｒｉ生物由来の核酸にハイブリダイズせず検出において安定であるプローブ：非標的ハイブリッドを形成しない、プローブ。
- 請求項８０に記載のプローブであって、前記標的配列は配列番号５、配列番号９、配列番号１３および配列番号１７からなる群より選択される、プローブ。
- 請求項８０に記載のプローブであって、前記標的配列は配列番号６、配列番号１０、配列番号１４および配列番号１８からなる群より選択される、プローブ。
- 請求項８０に記載のプローブであって、前記標的配列は配列番号７、配列番号１１、配列番号１５および配列番号１９からなる群より選択される、プローブ。
- 請求項８０に記載のプローブであって、前記標的配列は配列番号８、配列番号１２、配列番号１６および配列番号２０からなる群より選択される、プローブ。
- 請求項８０〜８４のいずれか１項に記載のプローブであって、前記オリゴヌクレオチドは、標的配列中に存在する少なくとも１０個の連続した塩基領域に対して、少なくとも９０％相補的である少なくとも１０個の連続した塩基領域を有する、プローブ。
- 請求項８０〜８４のいずれか１項に記載のプローブであって、前記オリゴヌクレオチドは、標的配列中に存在する少なくとも１０個の連続した塩基領域に対して、１００％相補的である少なくとも１０個の連続した塩基領域を有する、プローブ。
- 請求項８０〜８４のいずれか１項に記載のプローブであって、前記オリゴヌクレオチドの塩基配列は、標的配列の塩基領域に対して、少なくとも８０％相補的である、プローブ。
- 請求項８０〜８４のいずれか１項に記載のプローブであって、該プローブの塩基配列は、標的配列の塩基領域に対して、少なくとも９０％相補的である、プローブ。
- 請求項８０〜８４のいずれか１項に記載のプローブであって、該プローブの塩基配列は、標的配列の塩基配列に対して、完全に相補的である、プローブ。
- 請求項８０〜８７のいずれか１項に記載のプローブであって、ここで、該プローブは１００塩基までの長さである、プローブ。
- 請求項８０〜８７のいずれか１項に記載のプローブであって、ここで、該プローブは１２〜５０塩基までの長さである、プローブ。
- 請求項８０〜８７のいずれか１項に記載のプローブであって、ここで、該プローブは１８〜３５塩基までの長さである、プローブ。
- 請求項８０〜８７および請求項９０〜９３のうちのいずれか１項に記載のプローブであって、ここで、該プローブは、ストリンジェントな条件下で前記標的配列にハイブリダイズしない場合に、互いにハイブリダイズする塩基配列を含む、プローブ。
- 請求項８０〜８７および請求項９０〜９３のうちのいずれか１項に記載のプローブであって、ここで、該プローブは、１以上の塩基配列を含み、該塩基配列は、ストリンジェントな条件下で、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍに由来する核酸にも前記試験サンプル中に存在する非標的生物に由来する核酸にも安定にハイブリダイズしない、プローブ。
- 請求項９４に記載のプローブであって、該プローブは前記１以上の塩基配列のうちの２つを含み、ここで、該２つの塩基配列は、ストリンジェントな条件下で前記標的配列にハイブリダイズしない場合、互いにハイブリダイズする、プローブ。
- 請求項８０〜９５のいずれか１項に記載されるプローブであって、検出可能な標識をさらに含む、プローブ。
- 請求項９３〜９５のいずれか１項に記載されるプローブであって、相互作用する標識の群をさらに含む、プローブ。
- 請求項９７に記載のプローブであって、ここで前記相互作用する標識が発光標識および消光標識を含む、プローブ。
- 請求項８０〜９８のいずれか１項に記載のプローブであって、ここで前記オリゴヌクレオチドは、リボフラノシル部分に２’−Ｏ−メチル置換を含むように改変された少なくとも１つのリボヌクレオチドを含む、プローブ。
- 請求項８０〜９８のいずれか１項に記載のプローブであって、偽ペプチド骨格が前記オリゴヌクレオチドの塩基の少なくとも一部分を結合する、プローブ。
- 請求項８０〜１００のいずれか１項に記載のプローブであって、ここで、前記ストリンジェントな条件は、５０ｍＭのコハク酸、１％（ｗ／ｖ）ＬＬＳ、７．５ｍＭ アルドリチオール−２、０．６Ｍ ＬｉＣｌ、１１５ｍＭ ＬｉＯＨ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ ＥＧＴＡ、１．５％（ｖ／ｖ）エチルアルコール（無水）、ｐＨ４．７、および約６０℃の試験サンプル温度で構成され、プローブ。
- 請求項８０〜１０１のいずれか１項に記載のプローブおよび１以上のヘルパーオリゴヌクレオチドを含むプローブミックスであって、該ヘルパーオリゴヌクレオチドの各々は、標的配列中に存在する少なくとも１０個の連続した塩基領域に対して、少なくとも８０％相補的である少なくとも１０個の連続した塩基領域を有し、ここで、該標的配列は、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３，配列番号３４，配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３および配列番号４４からなる群より選択される、プローブミックス。
- 請求項１０２に記載のプローブミックスであって、ここで、前記プローブの標的配列は、配列番号５、配列番号６、配列番号９、配列番号１０、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１７、および配列番号１８からなる群より選択され、そして
前記ヘルパーオリゴヌクレオチドのうちの１つの標的配列は、配列番号２９、配列番号３３、配列番号３７、配列番号４１からなる群より選択される、プローブミックス。 - 請求項１０２に記載のプローブミックスであって、ここで、
前記プローブの標的配列は、配列番号５、配列番号６、配列番号９、配列番号１０、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１７および配列番号１８からなる群より選択され；そして
前記ヘルパーオリゴヌクレオチドのうちの１つ標的配列は、配列番号３０、配列番号３４、配列番号３８、および配列番号４２からなる群より選択される、
プローブミックス。 - 請求項１０２に記載のプローブミックスであって、ここで、
前記プローブの標的配列は、配列番号５、配列番号６、配列番号９、配列番号１０、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１７および配列番号１８からなる群より選択され；そして
前記ヘルパーオリゴヌクレオチドの標的配列は、配列番号３１、配列番号３５、配列番号３９、および配列番号４３からなる群より選択される、
プローブミックス。 - 請求項１０２に記載のプローブミックスであって、ここで、
前記プローブの標的配列は、配列番号５、配列番号６、配列番号９、配列番号１０、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１７および配列番号１８からなる群より選択され；そして
前記ヘルパーオリゴヌクレオチドのうちの１つの標的配列は、配列番号３２、配列番号３６、配列番号４０、および配列番号４４からなる群より選択される、プローブミックス。 - 請求項１０２に記載のプローブミックスであって、ここで、
前記プローブの標的配列は、配列番号５、配列番号６、配列番号９、配列番号１０、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１７および配列番号１８からなる群より選択され；そして
前記１以上のヘルパーオリゴヌクレオチドは、第１のヘルパーオリゴヌクレオチドおよび第２のヘルパーオリゴヌクレオチドを含み、該第１のヘルパーオリゴヌクレオチドの標的配列は、配列番号２９、配列番号３３、配列番号３７、および配列番号４１からなる群より選択され、そして、ここで、該第２のヘルパーオリゴヌクレオチドの標的配列は、配列番号３１、配列番号３５、配列番号３９、および配列番号４３からなる群より選択される、
プローブミックス。 - 請求項１０２に記載のプローブミックスであって、ここで、
前記プローブの標的配列は、配列番号５、配列番号６、配列番号９、配列番号１０、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１７、および配列番号１８からなる群より選択され；そして
前記１以上のヘルパーオリゴヌクレオチドは、第１のヘルパーオリゴヌクレオチドおよび第２のヘルパーオリゴヌクレオチドを含み、ここで、該第１のヘルパーオリゴヌクレオチドの標的配列は、配列番号２９、配列番号３３、配列番号３７、および配列番号４１からなる群より選択され、そして、ここで、該第２のヘルパーオリゴヌクレオチドの標的配列が、配列番号３２、配列番号３６、配列番号４０、配列番号４４からなる群より選択される、
プローブミックス。 - 請求項１０２に記載のプローブミックスであって、ここで、
前記プローブの標的配列は、配列番号５、配列番号６、配列番号９、配列番号１０、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１７、および配列番号１８からなる群より選択され；そして
前記１以上のヘルパーオリゴヌクレオチドは、第１のヘルパーオリゴヌクレオチドおよび第２のヘルパーオリゴヌクレオチドを含み、ここで、該第１のヘルパーオリゴヌクレオチドの標的配列は、配列番号３０、配列番号３４、配列番号３８、および配列番号４２からなる群より選択され、そして、ここで、前記第２のヘルパーオリゴヌクレオチドの標的配列は、配列番号３１、配列番号３５、配列番号３９、配列番号４３からなる群より選択される、プローブミックス。 - 請求項１０２に記載のプローブミックスであって、ここで、
前記プローブの標的配列は、配列番号５、配列番号６、配列番号９、配列番号１０、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１７、および配列番号１８からなる群より選択され；そして
前記１以上のヘルパーオリゴヌクレオチドは、第１のヘルパーオリゴヌクレオチドおよび第２のヘルパーオリゴヌクレオチドを含み、ここで、該第１のヘルパーオリゴヌクレオチドの標的配列は、配列番号３０、配列番号３４、配列番号３８、および配列番号４２からなる群より選択され、そして、ここで、前記第２のヘルパーオリゴヌクレオチドの標的配列は、配列番号３２、配列番号３６、配列番号４０、配列番号４４からなる群より選択される、プローブミックス。 - 請求項１０２に記載のプローブミックスであって、ここで、
前記プローブの標的配列は、配列番号７、配列番号１１、配列番号１５および配列番号１９からなる群より選択され；そして
前記ヘルパーオリゴヌクレオチドのうちの１つの標的配列は、配列番号２９、配列番号３３、配列番号３７、および配列番号４１からなる群より選択される、プローブミックス。 - 請求項１０２に記載のプローブミックスであって、ここで、
前記プローブの標的配列は、配列番号７、配列番号１１、配列番号１５および配列番号１９からなる群より選択され；そして
前記ヘルパーオリゴヌクレオチドのうちの１つの標的配列は、配列番号３０、配列番号３４、配列番号３８、および配列番号４２からなる群より選択される、プローブミックス。 - 試験サンプル中のＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ生物の存在を決定する用途のためのオリゴヌクレオチドであって、該オリゴヌクレオチドは、少なくとも１０個の連続した塩基領域を含むオリゴヌクレオチドを有し、該少なくとも１０個の連続した塩基領域は、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ生物に由来する核酸に含まれる標的配列中に存在する少なくとも１０個の連続した塩基領域に対して少なくとも８０％相補的であり、ここで、該標的配列は、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９および配列番号２０からなる群より選択され、ここで、該オリゴヌクレオチドは５’配列を必要に応じて含み、該５’配列は、ＲＮＡポリメラーゼにより認識されるかまたはＲＮＡポリメラーゼによる開始もしくは伸長を増強する、オリゴヌクレオチド。
- 請求項１１３に記載のオリゴヌクレオチドであって、ここで、該オリゴヌクレオチドの塩基配列は、前記標的配列の塩基配列に対して少なくとも８０％相補的である、オリゴヌクレオチド。
- 請求項１１３に記載のオリゴヌクレオチドであって、ここで、該オリゴヌクレオチドの塩基配列は、前記標的配列の塩基配列に対して完全に相補的である、オリゴヌクレオチド。
- 試験サンプル中のＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ生物の存在を決定する方法であって、該方法は、以下の工程：
ストリンジェントな条件下で、該試験サンプルと請求項８０〜１０１のうちいずれか１項に記載のプローブとを接触させる工程；および
プローブ：標的ハイブリッドが、試験サンプル中のＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍの存在の指標としてストリンジェントな条件下で形成されるか否かを決定する工程、
を包含する、方法。 - 請求項１１６に記載の方法であって、該方法は、増幅条件下において、前記試験サンプルに対して１以上の増幅プライマーを提供し、該プライマーの各々は、少なくとも１０個の連続した塩基領域を含むオリゴヌクレオチドを含み、該少なくとも１０個の連続した塩基領域は、標的配列中に存在する少なくとも１０個の連続した塩基領域に対して少なくとも８０％相補的であり、
該標的配列は、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７および配列番号６８からなるからなる群より選択され、そして、ここで、該プライマーは５’配列を必要に応じて含み、該５’配列は、ＲＮＡポリメラーゼにより認識されるかまたはＲＮＡポリメラーゼによる開始もしくは伸長を増強する、方法。 - 請求項１１７に記載の方法であって、前記プライマーのうちの１つの標的配列が、配列番号４５、配列番号５１、配列番号５７および配列番号６３からなる群より選択される、方法。
- 請求項１１７に記載の方法であって、前記プライマーのうちの１つの標的配列が、配列番号４６、配列番号５２、配列番号５８および配列番号６４からなる群より選択される、方法。
- 請求項１１７に記載の方法であって、前記プライマーのうちの１つの標的配列が、配列番号４７、配列番号５３、配列番号５９および配列番号６５からなる群より選択される、方法。
- 請求項１１７に記載の方法であって、前記プライマーのうちの１つの標的配列が、配列番号４８、配列番号５４、配列番号６０および配列番号６６からなる群より選択される、方法。
- 請求項１１７に記載の方法であって、前記プライマーのうちの１つの標的配列が、配列番号４９、配列番号５５、配列番号６１および配列番号６７からなる群より選択される、方法。
- 請求項１１７に記載の方法であって、前記プライマーのうちの１つの標的配列が、配列番号５０、配列番号５６、配列番号６２および配列番号６８からなる群より選択される、方法。
- 請求項１１７に記載の方法であって、ここで、前記１以上のプライマーが、第１のプライマーおよび第２のプライマーを含み、ここで、該第１のプライマーの標的配列は、配列番号４５、配列番号５１、配列番号５７および配列番号６３からなる群より選択され、そしてここで、該第２のプライマーの標的配列は、配列番号４７、配列番号５３、配列番号５９および配列番号６５からなる群より選択される、方法。
- 請求項１１７に記載の方法であって、ここで、前記１以上のプライマーは、第１のプライマーおよび第２のプライマーを含み、ここで、該第１のプライマーの標的配列は、配列番号４５、配列番号５１、配列番号５７および配列番号６３からなる群より選択され、そしてここで、該第２のプライマーの標的配列は、配列番号４８、配列番号５４、配列番号６０および配列番号６６からなる群より選択される、方法。
- 請求項１１７に記載の方法であって、ここで、前記１以上のプライマーは、第１のプライマーおよび第２のプライマーを含み、ここで、該第１のプライマーの標的配列は、配列番号４６、配列番号５２、配列番号５８および配列番号６４からなる群より選択され、そしてここで、該第２のプライマーの標的配列は、配列番号４７、配列番号５３、配列番号５９および配列番号６５からなる群より選択される、方法。
- 請求項１１７に記載の方法であって、ここで、前記１以上のプライマーは、第１のプライマーおよび第２のプライマーを含み、ここで、該第１のプライマーの標的配列は、配列番号４６、配列番号５２、配列番号５８および配列番号６４からなる群より選択され、そしてここで、該第２のプライマーの標的配列は、配列番号４８、配列番号５４、配列番号６０および配列番号６６からなる群より選択される、方法。
- 請求項１１７に記載の方法であって、ここで、前記１以上のプライマーは、第１のプライマーおよび第２のプライマーを含み、ここで、該第１のプライマーの標的配列は、配列番号４９、配列番号５５、配列番号６１および配列番号６７からなる群より選択され、そしてここで、該第２のプライマーの標的配列は、配列番号５０、配列番号５６、配列番号６２および配列番号６８からなる群より選択される、方法。
- キットであって、該キットは、パッケージ化された組み合わせにて、請求項１１３〜１１５のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドおよび１以上のオリゴヌクレオチドを有し、該オリゴヌクレオチドは、標的配列中に存在する少なくとも１０個の連続した塩基領域に対して、少なくとも８０％相補的である少なくとも１０個の連続した塩基領域を有し、ここで、該標的配列は、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７および配列番号６８からなる群より選択され、ここで、前記プライマーは５’配列を必要に応じて含み、該５’配列は、ＲＮＡポリメラーゼにより認識されるかまたはＲＮＡポリメラーゼによる開始もしくは伸長を増強する、キット。
- 請求項１２９に記載のキットであって、該キットは、第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドを備え、
該第１のオリゴヌクレオチドの標的配列は、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８および配列番号１９からなる群より選択され；そして
該第２のオリゴヌクレオチドの標的配列は、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６および配列番号６７からなる群より選択される、キット。 - 請求項１３０に記載のキットであって、ここで、
前記第１のオリゴヌクレオチドの標的配列は、配列番号５、配列番号９、配列番号１３、および配列番号１７からなる群より選択され；そして、
前記第２のオリゴヌクレオチドの標的配列は、配列番号４５、配列番号５１、配列番号５７、配列番号６３からなる群より選択される、キット。 - 請求項１３０に記載のキットであって、ここで、
前記第１のオリゴヌクレオチドの標的配列は、配列番号５、配列番号９、配列番号１３、および配列番号１７からなる群より選択され；そして、
前記第２のオリゴヌクレオチドの標的配列は、配列番号４６、配列番号５２、配列番号５８、配列番号６４からなる群より選択される、キット。 - 請求項１３０に記載のキットであって、ここで、
前記第１のオリゴヌクレオチドの標的配列は、配列番号５、配列番号９、配列番号１３、および配列番号１７からなる群より選択され；そして、
前記第２のオリゴヌクレオチドの標的配列は、配列番号４７、配列番号５３、配列番号５９、配列番号６５からなる群より選択される、キット。 - 請求項１３０に記載のキットであって、ここで、
前記第１のオリゴヌクレオチドの標的配列は、配列番号５、配列番号９、配列番号１３、および配列番号１７からなる群より選択され；そして、
前記第２のオリゴヌクレオチドの標的配列は、配列番号４８、配列番号５４、配列番号６０、配列番号６６からなる群より選択される、キット。 - 請求項１３０に記載のキットであって、ここで、
前記第１のオリゴヌクレオチドの標的配列は、配列番号６、配列番号１０、配列番号１４、および配列番号１８からなる群より選択され；そして、
前記第２のオリゴヌクレオチドの標的配列は、配列番号４５、配列番号５１、配列番号５７、配列番号６３からなる群より選択される、キット。 - 請求項１３０に記載のキットであって、ここで、
前記第１のオリゴヌクレオチドの標的配列は、配列番号６、配列番号１０、配列番号１４、および配列番号１８からなる群より選択され；そして、
前記第２のオリゴヌクレオチドの標的配列は、配列番号４６、配列番号５２、配列番号５８、配列番号６４からなる群より選択される、キット。 - 請求項１３０に記載のキットであって、ここで、
前記第１のオリゴヌクレオチドの標的配列は、配列番号６、配列番号１０、配列番号１４、および配列番号１８からなる群より選択され；そして、
前記第２のオリゴヌクレオチドの標的配列は、配列番号４７、配列番号５３、配列番号５９、配列番号６５からなる群より選択される、キット。 - 請求項１３０に記載のキットであって、ここで、
前記第１のオリゴヌクレオチドの標的配列は、配列番号６、配列番号１０、配列番号１４、および配列番号１８からなる群より選択され；そして、
前記第２のオリゴヌクレオチドの標的配列は、配列番号４８、配列番号５４、配列番号６０、配列番号６６からなる群より選択される、キット。 - 請求項１３０に記載のキットであって、ここで、
前記第１のオリゴヌクレオチドの標的配列は、配列番号７、配列番号１１、配列番号１５、および配列番号１９からなる群より選択され；そして、
前記第２のオリゴヌクレオチドの標的配列は、配列番号４５、配列番号５１、配列番号５７、配列番号６３からなる群より選択される、キット。 - 請求項１３０に記載のキットであって、ここで、
前記第１のオリゴヌクレオチドの標的配列は、配列番号７、配列番号１１、配列番号１５、および配列番号１９からなる群より選択され；そして、
前記第２のオリゴヌクレオチドの標的配列は、配列番号４６、配列番号５２、配列番号５８、配列番号６４からなる群より選択される、キット。 - 請求項１３０に記載のキットであって、ここで、
前記第１のオリゴヌクレオチドの標的配列は、配列番号７、配列番号１１、配列番号１５、および配列番号１９からなる群より選択され；そして、
前記第２のオリゴヌクレオチドの標的配列は、配列番号４７、配列番号５３、配列番号５９、配列番号６５からなる群より選択される、キット。 - 請求項１３０に記載のキットであって、ここで、
前記第１のオリゴヌクレオチドの標的配列は、配列番号７、配列番号１１、配列番号１５、および配列番号１９からなる群より選択され；そして、
前記第２のオリゴヌクレオチドの標的配列は、配列番号４８、配列番号５４、配列番号６０、配列番号６６からなる群より選択される、キット。 - 請求項１２９に記載のキットであって、該キットは、第１のオリゴヌクレオチド、第２のオリゴヌクレオチドおよび第３のオリゴヌクレオチドを備え、
該第１のオリゴヌクレオチドの標的配列は、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８および配列番号１９からなる群より選択され；
該第２のオリゴヌクレオチドの標的配列は、配列番号４５、配列番号４６、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５７、配列番号５８、配列番号６３、配列番号６４からなる群より選択され；そして
該第３のオリゴヌクレオチドの標的配列は、配列番号４７、配列番号４８、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６５、および配列番号６６からなる群より選択される、キット。 - 請求項１４３に記載のキットであって、ここで、
前記第１のオリゴヌクレオチドの標的配列は、配列番号５、配列番号９、配列番号１３、配列番号１７からなる群より選択され；
前記第２のオリゴヌクレオチドの標的配列は、配列番号４５、配列番号５１、配列番号５７、配列番号６３からなる群より選択され；そして
前記第３のオリゴヌクレオチドの標的配列は、配列番号４７、配列番号５３、配列番号５９および配列番号６５からなる群より選択される、キット。 - 請求項１４３に記載のキットであって、ここで、
前記第１のオリゴヌクレオチドの標的配列は、配列番号５、配列番号９、配列番号１３、および配列番号１７からなる群より選択され；
前記第２のオリゴヌクレオチドの標的配列は、配列番号４５、配列番号５１、配列番号５７、および配列番号６３からなる群より選択され；そして
前記第３のオリゴヌクレオチドの標的配列は、配列番号４８、配列番号５４、配列番号６０、および配列番号６６からなる群より選択される、キット。 - 請求項１４３に記載のキットであって、ここで、
前記第１のオリゴヌクレオチドの標的配列は、配列番号５、配列番号９、配列番号１３、および配列番号１７からなる群より選択され；
前記第２のオリゴヌクレオチドの標的配列は、配列番号４６、配列番号５２、配列番号５８、配列番号６４からなる群より選択され；そして
前記第３のオリゴヌクレオチドの標的配列は、配列番号４７、配列番号５３、配列番号５９、および配列番号６５からなる群より選択される、キット。 - 請求項１４３に記載のキットであって、ここで、
前記第１のオリゴヌクレオチドの標的配列は、配列番号５、配列番号９、配列番号１３、および配列番号１７からなる群より選択され；
前記第２のオリゴヌクレオチドの標的配列は、配列番号４６、配列番号５２、配列番号５８、および配列番号６４からなる群より選択され；そして
前記第３のオリゴヌクレオチドの標的配列は、配列番号４８、配列番号５４、配列番号６０および配列番号６６からなる群より選択される、キット。 - 請求項１４３に記載のキットであって、ここで、
前記第１のオリゴヌクレオチドの標的配列は、配列番号６、配列番号１０、配列番号１４、および配列番号１８からなる群より選択され；
前記第２のオリゴヌクレオチドの標的配列は、配列番号４５、配列番号５１、配列番号５７、および配列番号６３からなる群より選択され；そして
前記第３のオリゴヌクレオチドの標的配列は、配列番号４７、配列番号５３、配列番号５９、および配列番号６５からなる群より選択される、キット。 - 請求項１４３に記載のキットであって、ここで、
前記第１のオリゴヌクレオチドの標的配列は、配列番号６、配列番号１０、配列番号１４、および配列番号１８からなる群より選択され；
前記第２のオリゴヌクレオチドの標的配列は、配列番号４５、配列番号５１、配列番号５７、および配列番号６３からなる群より選択され；そして、
前記第３のオリゴヌクレオチドの標的配列は、配列番号４８、配列番号５４、配列番号６０、および配列番号６６からなる群より選択される、キット。 - 請求項１４３に記載のキットであって、ここで、
前記第１のオリゴヌクレオチドの標的配列は、配列番号６、配列番号１０、配列番号１４、および配列番号１８からなる群より選択され；
前記第２のオリゴヌクレオチドの標的配列は、配列番号４６、配列番号５２、配列番号５８、配列番号６４からなる群より選択され；そして
前記第３のオリゴヌクレオチドの標的配列は、配列番号４７、配列番号５３、配列番号５９、および配列番号６５からなる群より選択される、キット。 - 請求項１４３に記載のキットであって、ここで、
前記第１のオリゴヌクレオチドの標的配列は、配列番号６、配列番号１０、配列番号１４、および配列番号１８からなる群より選択され；
前記第２のオリゴヌクレオチドの標的配列は、配列番号４６、配列番号５２、配列番号５８および配列番号６４からなる群より選択され；そして
前記第３のオリゴヌクレオチドの標的配列は、配列番号４８、配列番号５４、配列番号６０、および配列番号６６からなる群より選択される、キット。 - 請求項１４３に記載のキットであって、ここで、
前記第１のオリゴヌクレオチドの標的配列は、配列番号７、配列番号１１、配列番号１５および配列番号１９からなる群より選択され；
前記第２のオリゴヌクレオチドの標的配列は、配列番号４５、配列番号５１、配列番号５７、および配列番号６３からなる群より選択され；そして
前記第３のオリゴヌクレオチドの標的配列は、配列番号４７、配列番号５３、配列番号５９および配列番号６５からなる群より選択される、キット。 - 請求項１４３に記載のキットであって、ここで、
前記第１のオリゴヌクレオチドの標的配列は、配列番号７、配列番号１１、配列番号１５、および配列番号１９からなる群より選択され；
前記第２のオリゴヌクレオチドの標的配列は、配列番号４５、配列番号５１、配列番号５７、および配列番号６３からなる群より選択され；そして
前記第３のオリゴヌクレオチドの標的配列は、配列番号４８、配列番号５４、配列番号６０および配列番号６６からなる群より選択される、キット。 - 請求項１４３に記載のキットであって、ここで、
前記第１のオリゴヌクレオチドの標的配列は、配列番号７、配列番号１１、配列番号１５および配列番号１９からなる群より選択され；
前記第２のオリゴヌクレオチドの標的配列は、配列番号４６、配列番号５２、配列番号５８および配列番号６４からなる群より選択され；そして
前記第３のオリゴヌクレオチドの標的配列は、配列番号４７、配列番号５３、配列番号５９および配列番号６５からなる群より選択される、キット。 - 請求項１４３に記載のキットであって、ここで、
前記第１のオリゴヌクレオチドの標的配列は、配列番号７、配列番号１１、配列番号１５および配列番号１９からなる群より選択され；
前記第２のオリゴヌクレオチドの標的配列は、配列番号４６、配列番号５２、配列番号５８、配列番号６４からなる群より選択され；そして
前記第３のオリゴヌクレオチドの標的配列は、配列番号４８、配列番号５４、配列番号６０、および配列番号６６からなる群より選択される、キット。 - 請求項１２９に記載のキットであって、ここで、該キットは、第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドを備え、
該第１のオリゴヌクレオチドの標的配列は、配列番号８、配列番号１２、配列番号１６および配列番号２０からなる群より選択され；
該第２のオリゴヌクレオチドの標的配列は、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５５、配列番号５６、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６７および配列番号６８からなる群より選択される、キット。 - 請求項１５６に記載のキットであって、ここで、前記第２のオリゴヌクレオチドの標的配列は、配列番号４９、配列番号５５、配列番号６１および配列番号６７からなる群より選択される、キット。
- 請求項１５６に記載のキットであって、ここで、前記第２のオリゴヌクレオチドの標的配列は、配列番号５０、配列番号５６、配列番号６２、および配列番号６８からなる群より選択される、キット。
- 請求項１２９に記載のキットであって、該キットは、第１のオリゴヌクレオチド、第２のオリゴヌクレオチドおよび第３のオリゴヌクレオチドを備え、
該第１のオリゴヌクレオチドの標的配列は、配列番号８、配列番号１２、配列番号１６、および配列番号２０からなる群より選択され；
該第２のオリゴヌクレオチドの標的配列は、配列番号４９、配列番号５５、配列番号６１、および配列番号６７からなる群より選択され；そして
該第３のオリゴヌクレオチドの標的配列は、配列番号５０、配列番号５６、配列番号６２、配列番号６８からなる群より選択される、キット。 - キットであって、該キットは、パッケージ化された組み合わせにて、請求項８０〜１０１のいずれか１項に記載のプローブおよび少なくとも１つのヘルパーオリゴヌクレオチドを備え、該ヘルパーオリゴヌクレオチドは、標的配列中に存在する少なくとも１０個の連続した塩基領域に対して、少なくとも８０％相補的である少なくとも１０個の連続した塩基領域を有し、ここで、該標的配列は、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３および配列番号４４からなる群より選択さる、キット。
- キットであって、該キットは、パッケージ化された組み合わせにて、請求項８０〜１０１のいずれか１項に記載のプローブおよび増幅プライマーを備え、該増幅プライマーは、標的配列中に存在する少なくとも１０個の連続した塩基領域に対して、少なくとも８０％相補的である少なくとも１０個の連続した塩基領域を有するオリゴヌクレオチドを含み、ここで、該標的配列は、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７および配列番号６８からなる群より選択され、該プライマーは、５’配列を必要に応じて含み、該５’配列は、ＲＮＡポリメラーゼにより認識されるかまたはＲＮＡポリメラーゼによる開始もしくは伸長を増強する、キット。
- 請求項１６１に記載のキットであって、該キットは、少なくとも１つのヘルパーオリゴヌクレオチドをさらに含み、該ヘルパーオリゴヌクレオチドは、標的配列中に存在する少なくとも１０個の連続した塩基領域に対して、少なくとも８０％相補的である少なくとも１０個の連続した塩基領域を有し、該標的配列は、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３および配列番号４４からなる群より選択される。
- 生存可能なオーシストから精製ＲＮＡを得る方法であって、該方法は、以下の工程：
オーシストを含有すると推測される流体サンプルを遠心分離する工程であって、該流体サンプルを含む容器中で該オーシストを濃縮するのに十分な速度および時間にて遠心分離する工程；
該容器から上清を取り出す工程；
存在する場合に、緩衝溶液中において、該濃縮されたオーシストを再懸濁する工程；
複数の粒子の存在下で該緩衝溶液を攪拌する工程であって、該オーシストを溶解し、該溶解したオーシストからＲＮＡを放出するのに十分な速度および時間にて攪拌する工程；
該放出されたＲＮＡをＲＮＡ結合フィルターに固定する工程；
緩衝液で該フィルターを１回以上洗浄して該放出されたＲＮＡ以外のオーシスト成分を取り出すことによって該放出されたＲＮＡを精製する工程；および
該精製されたＲＮＡを該フィルターから取り出す工程、
を包含する、方法。 - 請求項１６３に記載の方法であって、前記攪拌する工程が前記緩衝溶液を含む容器を振動することを包含する、方法。
- 請求項１６３に記載の方法であって、前記粒子が一般的に球形状および約０．１ｍｍから約２．５ｍｍの範囲にある平均直径を有する、方法。
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