CN113151528A

CN113151528A - 检测隐孢子虫的lamp引物组和试剂盒及应用

Info

Publication number: CN113151528A
Application number: CN202110515526.3A
Authority: CN
Inventors: 尹静; 杨忠委; 王华然; 李君文; 于铭川; 师丹阳; 杨栋; 周树青; 金敏; 陈郑珊; 李海北
Original assignee: Environmental Medicine and Operational Medicine Institute of Military Medicine Institute of Academy of Military Sciences
Current assignee: Environmental Medicine and Operational Medicine Institute of Military Medicine Institute of Academy of Military Sciences
Priority date: 2021-05-12
Filing date: 2021-05-12
Publication date: 2021-07-23

Abstract

本发明提供了检测隐孢子虫的LAMP引物组和试剂盒及应用，涉及病原虫检测技术领域。本发明所述LAMP引物组以隐孢子虫SSU rRNA基因为靶基因设计得到。利用本发明所述LAMP引物组或试剂盒进行隐孢子虫的检测时，最低检测限为5×10²拷贝/μl；灵敏度为0.01ng/μl；特异性良好；同时不同浓度梯度的基因组重复性良好，稳定性高。

Description

检测隐孢子虫的LAMP引物组和试剂盒及应用

技术领域

本发明属于病原虫检测技术领域，具体涉及检测隐孢子虫的LAMP引物组和试剂盒及应用。

背景技术

隐孢子虫(Cryptosporidium)是一种极为常见的机会致病性人兽共患病原虫，可以通过饮水、食品、接触等方式进行传播，导致隐孢子虫病或感染性腹泻的暴发。美国食源性疾病监测组织把隐孢子虫归类为食源性疾病监测的十大寄生虫之一。美国和英国等国家至今已发生超过20起大规模人体感染隐孢子虫的事件，隐孢子虫最早暴发的记录是1984年在美国的德州卡罗尔顿市，超过一万人感染，最严重且规模最大的暴发事件为1993年美国密尔沃基市，在整个城市160万人口中，有超过40万人受感染，导致上百人死亡，此次爆发为隐孢子虫卵囊污染市政供水系统。2012年，英国爆发隐孢子虫疫情，感染人数超过300人，起因为食用的蔬菜沙拉被隐孢子虫卵囊污染。

鉴于隐孢子虫介水、食物传播事件的发生，开展环境介质中隐孢子虫污染检测工作就成为控制隐孢子虫病暴发的关键环节。目前，环境介质中隐孢子虫污染检测的主要方法有病原学、分子生物学、免疫学等。病原学检测方法包括湿片或染色后显微镜镜检的方法，其中改良抗酸染色法和碘染色法被认为是诊断隐孢子虫的“金标准”，但该方法需要检测人员具有一定的实际经验，导致本方法存在一定的漏检和误检情况；分子生物学检测方法主要有PCR、RPA、LAMP等技术，优点为检测结果可靠，可以处理高通量样品，还可以进一步对隐孢子虫种进行种类鉴定、基因分型、进化树分析等；缺点是过程步骤繁琐、费时费力，客观因素导致的问题较多；免疫学检测法包括荧光标记抗体检测、酶标记抗体检测等方法基于抗原和抗体的特异性结合原理，需要提取血清或组织，但操作稍困难。此方法具有一定的特异性和灵敏度，但相较分子生物学诊断方法较低。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于检测隐孢子虫的LAMP引物组和试剂盒及应用，同时建立基于LAMP微流控芯片的隐孢子虫检测方法，检测方法简单、特异性好，检出率高。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一组检测隐孢子虫的LAMP引物组，所述LAMP引物组包括：外引物F3、外引物B3、内引物FIP、内引物BIP、环引物LF和环引物LB；

所述外引物F3的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述外引物B3的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，所述内引物FIP的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述内引物BIP的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，所述环引物LF的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，所述环引物LB的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。

本发明还提供了一种包含上述LAMP引物组的检测隐孢子虫的LAMP试剂盒。

优选的，所述试剂盒中还包括WarmStart LAMP 2×Master Mix和molecularbiology grade H₂O。

本发明还提供了上述LAMP引物组或上述试剂盒在制备特异性检测隐孢子虫的工具中的应用。

优选的，利用所述工具特异性检测隐孢子虫时，构建检测体系进行LAMP反应，所述检测体系以25μl计，包括：WarmStart LAMP 2×Master Mix 12.5μl，LAMP引物组0.5μl，DNA模板5μl和余量的molecular biology grade H2O。

优选的，所述检测体系中，LAMP引物组的总浓度为44μmol/L。

优选的，所述检测体系中，内引物FIP和内引物BIP的浓度均为16μmol/L，外引物F3和外引物B3的浓度均为2μmol/L，环引物LF和环引物LB的浓度均为4μmol/L。

优选的，所述LAMP反应包括在65℃反应30min。

本发明提供了一组检测隐孢子虫的LAMP引物组，所述LAMP引物组以隐孢子虫SSUrRNA基因为靶基因设计得到。在本发明实施例中，以含不同拷贝/μl隐孢子虫重组质粒为模板进行LAMP微流控芯片扩增实验，通过观察出现扩增信号的时间(Tt)，证实其最低检测限为5×10²拷贝/μl；以隐孢子虫基因组DNA为模板，其灵敏度为0.01ng/μl；分别以隐孢子虫、旋毛虫、艾美耳球虫、贾第鞭毛虫、戊肝病毒和粪肠球菌的基因组DNA为模板进行相同的检测，只有隐孢子虫显示阳性，特异性良好；同时不同浓度梯度的基因组重复性良好，稳定性高。

附图说明

图1为LAMP微流控芯片方法扩增隐孢子虫基因组DNA结果，可特异性扩增SSU rRNA基因；

图2为以重组质粒为模板，验证隐孢子虫LAMP微流控芯片检测方法的灵敏性，最低检测限为5×10²拷贝/μl；

图3为以隐孢子虫核酸为模板的LAMP微流控芯片方法的灵敏性，灵敏度为0.01ng/μl；

图4为LAMP微流控芯片检测隐孢子虫的特异性实验，特异性良好；

图5为LAMP微流控法检测隐孢子虫的重复性实验，重复性良好；

图6为LAMP微流控法检测隐孢子虫基因组DNA标准曲线，y＝-2.4596x+34.745，x为log₁₀DNA拷贝数，y为Tt(min)；

图7为LAMP微流控法检测隐孢子虫实际样品验证，检出率高。

具体实施方式

所述外引物F3的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述外引物B3的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，所述内引物FIP的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述内引物BIP的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，所述环引物LF的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，所述环引物LB的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示(表1)。

表1 LAMP微流控芯片检测隐孢子虫的引物序列

本发明所述LAMP引物组优选以隐孢子虫SSU rRNA基因序列(GenBank：KY809008)设计引物，由上海生工科技公司合成所述LAMP引物组。

本发明所述试剂盒中优选还包括WarmStart LAMP 2×Master Mix和molecularbiology grade H₂O。本发明所述LAMP引物组的工作浓度优选分别为16μmol/L内引物FIP、16μmol/L内引物BIP、2μmol/L外引物F3、2μmol/L外引物B3、4μmol/L环引物LF和4μmol/L环引物LB。

在本发明中，当利用所述工具特异性检测隐孢子虫时，优选构建检测体系进行LAMP反应，所述检测体系以25μl计，优选包括：WarmStart LAMP 2×Master Mix 12.5μl，LAMP引物组0.5μl，DNA模板5μl和余量的molecular biology grade H2O。在本发明所述检测体系中，所述LAMP引物组的总浓度优选为44μmol/L，其中内引物FIP和内引物BIP的浓度优选均为16μmol/L，外引物F3和外引物B3的浓度优选均为2μmol/L，环引物LF和环引物LB的浓度优选均为4μmol/L；DNA模板的浓度优选为5μl。本发明所述LAMP反应优选包括在65℃反应30min。

本发明提供了一种检测隐孢子虫的方法，包括以下步骤：提取样本环境中的隐孢子虫核酸，然后，通过加热干燥的方法将引物预先固定在4个反应孔中，以灭菌纯净水为空白对照；将含有25μl预混反应液直接用移液枪注入微流控芯片的样品孔中，用薄膜密封样品孔和通风孔；然后将预处理的微流控芯片放入微流控仪内，在65℃下反应30min。本发明对所述隐孢子虫核酸的提取方法并没有特殊限定，优选利用TIANGEN生物科技公司的粪便DNA提取试剂盒提取样本环境中的隐孢子虫核酸。

下面结合实施例对本发明提供的检测隐孢子虫的LAMP引物组和试剂盒及应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

1、针对隐孢子虫SSUrRNA基因序列(GenBank号KY809008)设计引物，由上海生工科技公司合成隐孢子虫特异性引物(表1)，合成整段基因组序列作为模板。

基于LAMP微流控芯片技术检测隐孢子虫的反应体系见表2。首先，通过加热干燥的方法将引物预先固定在4个反应孔中，以灭菌纯净水为空白对照。将含有25μl预混反应液直接用移液枪注入微流控芯片的样品孔中，用薄膜密封样品孔和通风孔。然后将预处理的微流控芯片放入微流控仪内，在65℃下反应30min，扩增结果如图1所示。为验证LAMP体系的准确性，采用1.5％标准琼脂糖凝胶电泳对LAMP扩增产物进行检测。一般情况下，只有在一次重复的实验中样品出现阳性信号，而阴性对照在30min内无阳性信号时，扩增结果才被认为是阳性。

表2隐孢子虫LAMP扩增反应体系

2、LAMP微流控芯片技术检测隐孢子虫灵敏性

将隐孢子虫的18SrRNA基因连接在PUC57克隆载体的Smal位点形成的质粒，此为本发明中隐孢子虫检测方法建立的模板。分别以含10⁴拷贝/μl、10³拷贝/μl、10²拷贝/μl、10¹拷贝/μl、10⁰拷贝/μl、10^-1拷贝/μl隐孢子虫重组质粒，为模板进行LAMP微流控芯片扩增实验，通过观察出现扩增信号的时间(Tt)，评价其对隐孢子虫人工合成质粒检测的灵敏性。结果如图2所示，最低检测限为5×10²拷贝/μl。

分别以含1ng/μl、0.1ng/μl、0.01ng/μl、0.001ng/μl浓度的隐孢子虫基因组DNA为模板进行LAMP微流控芯片扩增实验，通过观察Tt，评价其对隐孢子虫基因组检测的敏感性。结果如图3所示，灵敏度为0.01ng/μl。

3、LAMP微流控芯片技术检测隐孢子虫特异性

分别以隐孢子虫、旋毛虫、艾美耳球虫、贾第鞭毛虫、戊肝病毒和粪肠球菌的基因组DNA为模板，利用上述的隐孢子虫LAMP微流控芯片检测技术进扩增检测，通过观察Tt，评价方法的特异性。结果如图4所示，对隐孢子虫的特异性良好。

4、LAMP微流控芯片技术检测隐孢子虫重复性

将隐孢子虫的18SrRNA基因连接在PUC57克隆载体的Smal位点形成的质粒，此为本发明中隐孢子虫检测方法建立的模板。分别以高(10⁸拷贝/μl)、中(10⁶拷贝/μl)、低(10⁴拷贝/μl)浓度的隐孢子虫人工合成质粒为模板，通过LAMP微流控芯片扩增，通过观察Tt，通过统计学分析，评价方法对隐孢子虫检测的重复性。结果如图5所示，不同浓度梯度的基因组重复性良好。

5、LAMP微流控芯片技术检测隐孢子虫稳定性

将隐孢子虫的18SrRNA基因连接在PUC57克隆载体的Smal位点形成的质粒，此为本发明中隐孢子虫检测方法建立的模板。分别以10³～10⁸拷贝/μl的人工合成质粒为模板，通过LAMP微流控芯片方法进行隐孢子虫扩增，以Tt为评价指标，分析样本浓度与Tt之间的相关性，评价方法的稳定性。结果如图6所示，r＝0.989(r_0.01,4＝0.917)，表明隐孢子虫模板浓度与扩增信号出现时间之间具有良好的统计学关系。

6、LAMP微流控芯片技术检测隐孢子虫阳性样本验证

取6份隐孢子虫感染阳性牛粪样本，提取核酸后，利用建立的LAMP微流控芯片技术进行方法验证，以蒸馏水为阴性对照。结果如图7所示，6份隐孢子虫感染阳性牛粪样本均可被检测出来，呈阳性。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 军事科学院军事医学研究院环境医学与作业医学研究所

<120> 检测隐孢子虫的LAMP引物组和试剂盒及应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 1

tctaaggaag gcagcagg 18

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 2

tgcaacaact ttaatatacg cta 23

<210> 3

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 3

aaccgtaagg ctctgtattg ttattgcgca aattacccaa tcc 43

<210> 4

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 4

accccttaac aagtatcaat tggagttgga gctggaatta ccg 43

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 5

tcttgtcact acctccctgt 20

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 6

caagtctggt gccagcag 18

Claims

1.一组检测隐孢子虫的LAMP引物组，其特征在于，所述LAMP引物组包括：外引物F3、外引物B3、内引物FIP、内引物BIP、环引物LF和环引物LB；

所述外引物F3的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述外引物B3的核苷酸序列如SEQID No.2所示，所述内引物FIP的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述内引物BIP的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，所述环引物LF的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，所述环引物LB的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。

2.一种包含权利要求1所述LAMP引物组的检测隐孢子虫的LAMP试剂盒。

3.根据权利要求2所述试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括WarmStart LAMP 2×Master Mix和molecular biology grade H2O。

4.权利要求1所述LAMP引物组或权利要求2或3所述试剂盒在制备特异性检测隐孢子虫的工具中的应用。

5.根据权利要求4所述应用，其特征在于，利用所述工具特异性检测隐孢子虫时，构建检测体系进行LAMP反应，所述检测体系以25μl计，包括：WarmStart LAMP 2×Master Mix12.5μl，LAMP引物组0.5μl，DNA模板5μl和余量的molecular biology grade H₂O。

6.根据权利要求5所述应用，其特征在于，所述检测体系中，LAMP引物组的总浓度为44μmol/L。

7.根据权利要求6所述应用，其特征在于，所述检测体系中，内引物FIP和内引物BIP的浓度均为16μmol/L，外引物F3和外引物B3的浓度均为2μmol/L，环引物LF和环引物LB的浓度均为4μmol/L。

8.根据权利要求5所述应用，其特征在于，所述LAMP反应包括在65℃反应30min。