CN108893526A

CN108893526A - 一种微小隐孢子虫荧光lamp检测方法

Info

Publication number: CN108893526A
Application number: CN201810186378.3A
Authority: CN
Inventors: 赵光辉; 宋军科; 王莎莎
Original assignee: Northwest A&F University
Current assignee: Northwest A&F University
Priority date: 2018-03-07
Filing date: 2018-03-07
Publication date: 2018-11-27

Abstract

本发明为一种微小隐孢子虫荧光LAMP检测方法，其特异、灵敏、检测成本低、耗时短、高效、操作简便。本发明采用的技术方案为：（1）微小隐孢子虫SSU RNA、COWP、actin、HSP70基因位点的特异性引物的筛选确定；（2）设计合成微小隐孢子虫荧光LAMP的引物，并进行反应条件的优化和标准曲线和熔解曲线的绘制；（3）特异、敏感性和重复性试验以及临床样品的检测应用。

Description

一种微小隐孢子虫荧光LAMP检测方法

一、技术领域：

本发明涉及生物检测方法，具体涉及一种微小隐孢子虫(Cryptosporidiumparvum)的简便、灵敏、特异、快速检测方法，能够广泛应用于人、动物以及各种环境中微小隐孢子虫的快速检测。

二、背景技术：

隐孢子虫(Cryptosporidium)作为一种广泛寄生于人和多种动物消化道的原虫，主要引起宿主腹泻为主的综合征，造成营养不良、生长滞缓。而作为人兽共患种之一的微小隐孢子虫(C.parvum)，不仅可以通过动物的奶、肉以及毛皮等动物性制品感染人，而且也可通过其粪便污染水源，给人类健康和公共卫生构成严重威胁。研究表明，世界各地数百种动物以及人类中均可遭受隐孢子虫感染。在世界范围内，从1984年至今因病畜粪便污染饮水和食物而引发的暴发性和散发性隐孢子虫病例报道据不完全统计有近百起，最严重的一次是美国威斯康星州密尔沃基市因自来水水源被污染而引起的隐孢子虫病暴发，160万的城市人口中近40万人感染，死亡近百人。我们通过对陕西省不同地区，不同品种家禽家畜(山羊、牛、鸡)的隐孢子虫感染研究发现，均存在微小隐孢子虫(C.parvum)的感染。

目前，临床上检测隐孢子虫的常用方法主要有传统显微形态学观察，酶联免疫吸附试验和直接免疫荧光抗体试验等免疫学方法以及常规PCR、巢式PCR、多重PCR、Real-timePCR、多重Real-time PCR等分子生物学方法。传统形态学显微观察耗时耗力检出率也较低，而且也需要具备一定的专业知识。免疫学方法和基于PCR的分子生物学方法虽灵敏、特异，可有效的区分隐孢子虫种类，但检测成本非常高，需要较多昂贵的仪器(酶标仪、荧光显微镜、PCR仪、凝胶成像系统、荧光定量PCR仪等)，因此，在基层应用推广中很难被接受。鉴于此，本发明根据2000年Notomi博士发明的一种新型的核酸体外扩增技术——环介导等温扩增技术(Loop-Mediated Isothermal Amplification，LAMP)，建立一种特异、灵敏、检测成本低、耗时短、高效、操作简便的微小隐孢子虫荧光LAMP检测方法。

三、发明内容

本发明的目的在于提供一种微小隐孢子虫荧光LAMP检测方法，其特异、灵敏、检测成本低、耗时短、高效、操作简便。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种微小隐孢子虫荧光LAMP检测方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)微小隐孢子虫不同基因位点SSU RNA、COWP、actin、HSP70的特异性引物的筛选确定；

(2)设计合成微小隐孢子虫荧光LAMP的引物，并进行反应条件的优化和标准曲线和熔解曲线的绘制；

(3)特异、敏感性和重复性试验以及临床样品的检测应用。

所述的上述步骤的具体步骤为：

(1)微小隐孢子虫不同基因位点的特异性引物筛选确定，引物序列见表1；

(2)根据步骤(1)所确定的微小隐孢子虫特异性PCR扩增引物，以及进行扩增产物的电泳检测；

(3)根据步骤(1)和步骤(2)的试验数据，设计合成微小隐孢子虫荧光LAMP的引物，微小隐孢子虫荧光LAMP的引物见表2；

(4)对设计合成的特异性引物进行灵敏度实验；

(5)对设计合成的特异性引物进行特异性实验；

(6)小隐孢子虫荧光LAMP检测方法临床样品检测。

与现有技术相比，本发明具有如下优点和效果：

(1)本发明只需一台水浴锅或恒温箱就能实现反应，不仅在设备需求上实现了简单便捷化而且无须特殊的分子检测仪器(如PCR仪，电泳仪等)，而大大降低了检测成本；

(2)本发明在实验操作程序方面，建立的该方法不论检测对象DNA还是RNA，只需将反应液、酶和模板混合于反应管中，置于水浴锅或恒温箱中63℃左右保温30～60min，肉眼观察结果即可。

(3)本发明灵敏度实验结果显示，微小隐孢子虫标准阳性样品稀释100倍(即浓度达到0.02ng/μL)后，50min也能够检出；特异性实验结果表明，除微小隐孢子虫外，样品中的蓝氏贾第虫、毕氏肠微孢子虫、芽囊原虫、球虫、沙门氏菌，志贺氏菌和大肠杆菌均未检出。

综上所述，本发明是一种可以对不同来源临床样品中的微小隐孢子虫进行快速、高效、特异地进行检测的方法。本发明可为微小隐孢子虫的临床检测应用和推广提供理论依据和技术支撑。

四、附图说明

图1为微小隐孢子虫SSU RNA基因扩增产物的电泳检测结果图；

图2为微小隐孢子虫荧光LAMP灵敏度实验图；

图3为对设计合成的特异性引物进行特异性实验结果图；

图4为部分临床样品微小隐孢子虫SSU RNA基因PCR检测结果图；

图5和图6为部分临床样品微小隐孢子虫LAMP检测结果图；

五、具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

微小隐孢子虫荧光LAMP检测方法包括以下步骤：

1.首先根据GenBank中的微小隐孢子虫DNAJ-like protein基因参考序列(AF177278)，参考序列如下：

2、微小隐孢子虫不同基因位点(SSU RNA、GP60、HSP70、actin)的特异

性引物筛选确定。引物序列如表1：

表1微小隐孢子虫巢式PCR检测特异性引物

3、根据步骤2所确定的微小隐孢子虫特异性PCR扩增引物，以及扩增产物的电泳检测结果如图1：

4、根据步骤2和步骤3的试验数据，设计合成微小隐孢子虫荧光LAMP的引物，并进行反应条件的优化以及特异性检测、敏感染性检测和临床样品检测。LAMP反应体系：25μL体系

10×LAMP buffer组分：(Mg²⁺free)

反应条件：

63℃ 1h

根据参考序列设计合成用于本发明中微小隐孢子虫LAMP检测的特异性引物，见表2。

表2微小隐孢子虫荧光LAMP荧光检测特异性引物

5、对设计合成的特异性引物进行灵敏度实验。

用微小隐孢子虫标准阳性样品(起始浓度为2ng/μL)，依次做5倍、10倍、100倍稀释。稀释后不同浓度的样品在本研究中设定的反应体系和条件下进行实验。实验结果如图2：

6、对设计合成的特异性引物进行特异性实验。

以微小隐孢子虫阳性样品为对照，用本发明设计合成引物分别对蓝氏贾第虫、毕氏肠微孢子虫、芽囊原虫、球虫、大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌进行检测。实验结果如图3：

7、微小隐孢子虫荧光LAMP检测方法临床样品检测

利用本发明建立的检测方法对采集的500份临床样品中的微小隐孢子虫进行检测，检测结果与普通PCR方法检测结果一致。部分临床样品微小隐孢子虫普通PCR检测方法和荧光LAMP检测方法结果如图4和图5：

上述结果充分说明本发明是一种具有灵敏度高、检测时间短、特异性强、操作简单的微小隐孢子虫检测方法。具有一定的开发、利用和易于广泛推广的潜在价值。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，并非用于限定本发明的保护范围，凡是利用本发明的说明书及附图内容所做的等同结构变化，均应包含在本发明的专利保护范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 西北农林科技大学

<120> 一种微小隐孢子虫荧光LAMP检测方法

<130> 2018

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 452

<212> DNA

<213> GenBank

<400> 1

ccgagtttga tccaaaaagt tacgaagaaa aatccagaga tcaaaagaca aagaatactc 60

aaagcgaaga tgaccttttt gatttgttta tgaaggaggt taatgaagca aacagtaaaa 120

gcactaacca aggaaaaaac attggcagaa ataatcattc aaaaagggtc aaaatatcaa 180

agttattaat tgaaggaaaa ataaaggaag ccattagtag ctcatatggc aatgatgaat 240

taactatagg aacctcagaa gaagaaatcc tacgtctaac ttcacgtgtg tttgccaatg 300

catatgaagt tatagggata ccagtcgatt ctgatgattc tgtgattggt aaaaagtata 360

gaaagctctc attattgatc caccctgata agacaagtca tgaaaaggct agagaagcgt 420

ttgaaatact caataaggca tatgaggagc ta 452

Claims

1.一种微小隐孢子虫荧光LAMP检测方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）微小隐孢子虫不同基因位点SSU RNA、COWP、actin、HSP70的特异性引物的筛选确定；

（2）设计合成微小隐孢子虫荧光LAMP的引物，并进行反应条件的优化和标准曲线和熔解曲线的绘制；

（3）特异、敏感性和重复性试验以及临床样品的检测应用。

2.根据权利要求1所述的一种微小隐孢子虫荧光LAMP检测方法，其特征在于：所述的上述步骤的具体步骤为：

（1）微小隐孢子虫不同基因位点的特异性引物筛选确定，引物序列见表1；

（2）根据步骤（1）所确定的微小隐孢子虫特异性PCR扩增引物，以及进行扩增产物的电泳检测；

（3）根据步骤（1）和步骤（2）的试验数据，设计合成微小隐孢子虫荧光LAMP的引物，微小隐孢子虫荧光LAMP的引物见表2；

（4）对设计合成的特异性引物进行灵敏度实验；

（5）对设计合成的特异性引物进行特异性实验；

（6）小隐孢子虫荧光LAMP检测方法临床样品检测。