CN111139309A - 一种用于快速检测弓形虫的实时重组酶介导等温扩增核酸试剂盒及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于快速检测弓形虫的实时重组酶介导等温扩增核酸试剂盒及应用，包括标准品，所述标准品为含有529基因序列的阳性质粒以及针对弓形虫529基因设计的特异性引物和探针，根据弓形虫529基因的特异性保守靶序列设计用以定性检测组织器官、粪便或血液样品中的弓形虫529基因，所述引物包括上游引物和下游引物，本发明采用实时荧光RAA技术建立快速检测弓形虫的方法，与荧光定量PCR相比具有成本小，简便快捷的优点，能够在恒温36℃、20min内进行检测，通过便携式仪器直接读取检测结果，该方法最低检出弓形虫基因组量为10²拷贝数，灵敏度与传统荧光定量PCR相当，适于临床样本及实验室快速诊断。

Description

一种用于快速检测弓形虫的实时重组酶介导等温扩增核酸试 剂盒及应用

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及到一种用于快速检测弓形虫的实时重组酶介导等温扩增核酸试剂盒及应用。

背景技术

刚地弓形虫是一种胞内寄生虫，寄生范围广泛，几乎包括所有温血脊椎动物。刚地弓形虫病是一种世界性的人畜共患寄生虫病，由于人类可通过食用受污染的食品或水、与宠物猫密切接触等多种途径感染，已对人类健康造成严重威胁。据报道世界范围内有近三分之一的人感染弓形虫，多为隐性感染。猫是各种易感动物的主要感染源，猫排出的卵囊在外界短期发育便具有感染能力，卵囊可污染土壤、牧草、饲料、饮水和用具等，病人、病畜和带虫动物的尸体、肌肉、内脏、血液、渗出物以及急性期病畜的分泌物和排泄物均可带有弓形虫生的假囊和包囊，也是重要的感染源。临床上多数动物是无症状的带虫者，仅有少数出现症状，其症状的表现从不明显的感染到急性致死病不一，孕妇感染后可导致早产、流产、胎儿发育畸形。

目前，已有病原学诊断、免疫学诊断以及分子生物学诊断等传统方法用于检测弓形虫，其中PCR技术检测特异性及敏感性更好，在临床样本检测时可信度高，更加受检测者青睐，然而，PCR技术依赖精密昂贵的仪器，检测时间长，成本高并且需要专业人士操作的特点使其难以普及，在临床应用过程中有一定的局限性，难以满足基层检测的需要。为弥补难以实现现场即时检测这一空缺，新型等温扩增技术的出现为临床工作者带来了新的福音，该方法克服了依赖精密仪器、检测时间长等缺陷，尤其适用于基础设施、实验设备及试验技术难以支持使用PCR诊断的地方，具有极其广泛的应用前景。

重组酶介导扩增(Recombinase-aid Amplification,RAA)是一种恒温扩增技术，其原理是重组酶结合引物，寻找模板DNA上的同源序列，定位结合后引发链置换反应，引物结合到对应模板上，在DNA聚合酶的作用下进行延伸，同时单链DNA结合蛋白结合到单链，防止双链重新聚合。据悉，该反应在34℃-45℃、5-20分钟内即可实现样品的快速扩增。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有较好的敏感性和特异性，快速准确的检测到待检样本中的弓形虫基因的用于快速检测弓形虫的实时重组酶介导等温扩增核酸试剂盒及应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明包括标准品，所述标准品为含有529基因序列的阳性质粒，其特征在于，还包括针对弓形虫529基因设计的特异性引物和探针，根据弓形虫529基因的特异性保守靶序列设计用以定性检测组织器官、粪便或血液样品中的弓形虫529基因，所述引物包括上游引物和下游引物，包括核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示，所述探针的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：3所示。

进一步的，所述探针中间荧光报告基团和荧光淬灭基因分别标记在T碱基上，两个基团中间THF替代G或C，3’端磷酸基团修饰。

作为优选，还包括引物混合液、特异性荧光探针、ABuffer、B Buffer、RAA干粉试剂和ddH2O。

进一步的，包括A Buffer为20％PEG，B Buffer为280mM MgAc。

作为优选，所述的RAA干粉试剂的成分如下：1mmol/L dNTP、90ng/μL SSB蛋白、120ng/μLrecA重组酶蛋白或30ng/μL Rad51、30ng/μLBsu DNA聚合酶、100mmol/L Tricine、20％PEG、5mmol/L二硫苏糖醇、100ng/μL肌酸激酶、Exo核酸外切酶。

进一步的，所述弓形虫基因标准品的序列如序列表中SEQ ID NO：1所示，

一种基于RT-RAA技术检测弓形虫的方法，包括操作步骤如下：提取待测样品的DNA，以待测样品的DNA为模板，在上游引物、下游引物、探针及RAA干粉试剂、A Buffer、BBuffer和ddH2O存在下进行实时荧光RAA反应，所述荧光RAA反应体系的加入量分别为BufferA 40.9μl，上游引物2μl，下游引物2μl，探针0.6μl，模板2μl；BufferB 2.5μl；根据实时荧光RAA扩增曲线分析待测样本，确定待测样本是否含有弓形虫基因组。

作为优选，所述上游引物终浓度为400nM；所述下游引物终浓度为400nM，所述探针终浓度为120nM；所述实时荧光RAA反应条件为：36℃，1min，共计20个循环。

进一步的，所述扩增曲线和CT值分析待测样本的分析方法包括当待测样本FAM通道扩增曲线呈“S”型且CT值≤35，判断为弓形虫529基因阳性结果，则当前样本为弓形虫感染样本；当待测样本无明显扩增曲线且CT值≥40，判断为弓形虫529基因阴性结果，则当前样本为弓形虫阴性样本；当待测样本FAM通道扩增曲线呈“S”型且35＜CT值＜40，判为可疑，需要排除环境污染造成的不准确结果后，再次检测，若样本的结果仍然为35＜Ct值＜40，以阴性对照作为参照标准，检测阴性对照的Ct值，若阴性对照Ct值≥40，则该待测样本判为阳性。

用于检测弓形虫的实时重组酶介导等温扩增核酸试剂盒在病毒检测中的应用。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

1)本发明系首次采用实时荧光RAA检测技术建立快速检测弓形虫RAA的检测方法，具有高灵敏度、特异性、重复性的优势。

2)本发明对弓形虫529基因的保守区域设计多对引物进行筛选，最终获取特异型好、扩增效率高的引物及探针，同时与中型艾美耳球虫、混合艾美耳球虫、旋毛虫、华支睾吸虫的DNA无交叉反应。

3)与传统荧光定量PCR相比，RT-RAA可实现30分钟内获得检测结果，不需要昂贵的热循环仪器设备，灵敏度可达10²copies/μL，根据实时荧光数据，直接判断扩增结果，无需电泳检测，尤其适用于基层实验室及现场检测。

附图说明

图1为弓形虫RAA凝胶检测系统建立及引物筛选结果图；

图2为实时荧光RAA检测体系引物优化结果图；

图3为温度条件优化结果图。

图4为RT-RAA敏感性分析结果图。

图5为RT-PCR检测敏感性分析结果图.

图6为RT-RAA检测体系特异性检测，分别弓形虫、中型艾美耳球虫、混合艾美耳球虫、旋毛虫、华支睾吸虫阳性样品检测扩增结果。

具体实施方式

下面结合附图说明和实施例对本发明作进一步说明，本发明的方式包括但不仅限于以下实施例。

下面结合具体实例来进一步详述本发明。需要说明的是，下面描述均是范例，这些范例性实施并不对本发明的使用范围构成限制。本领域技术人员应该理解为，在不偏离本发明的精神和范围之内可对本发明技术方案的细节和形式进行修改和替换，但均在本发明的保护范围之内。

一、RAA恒温荧光检测引物、探针的设计与筛选

本发明通过对已公布的弓形虫529基因进行序列分析，选取保守区域，应用引物设软件Premier5.0设计多条引物，同时用生物软件Oligo7.0对引物进行筛选，以确保引物之间产生二聚体的几率较低，随后用所筛引物对阳性标准品进行普通RAA扩增，扩增结果经纯化后，用1％琼脂糖凝胶电泳，筛选扩增效果最佳的引物，随后针对扩增片段设计探针，进行实时荧光RAA扩增。所有引物及探针由上海生工生物合成。最终共设计引物及探针序列如表一所示：

表一 针对529设计的引物及探针序列

二、弓形虫529基因实时荧光RAA反应

1.寄生虫基因组及临床样品

本研究使用的弓形虫、中型艾美耳球虫、混合艾美耳球虫、旋毛虫、华支睾吸虫的DNA由中国农业大学赠送，犬、猫弓形虫血液样品来从中国农业大学动物医院收集，猪血液样品为本实验室送检样品。

2.弓形虫DNA的提取

使用AXYGEN公司AxyPrep体液病毒DNA/RNA小量试剂盒，按照说明书提取血液中弓形虫DNA基因组，最终用40μlBuffer TE(nuclease-free)洗脱。提取的DNA存放于-80℃冰箱中备用。

3.阳性标准品的制备

(1)人工合成529序列(Genbank：AF146527.1)，构建在pUC57载体上，阳性标准质粒pUC57-529由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，该质粒包含的529基因碱基序列如下：

ctgcagggag gaagacgaaa gttgtttttt tatttttttt tctttttgtt tttctgatttttgttttttt tgactcgggc ccagctgcgt ctgtcgggat gagaccgcgg agccgaagtg cgttttctttttttgacttt tttttgtttt ttcacaggca agctcgcctg tgcttggagccacagaaggg acagaagtcgaaggggacta cagacgcgat gccgctcctc cagccgtcttggaggagaga tatcaggact gtagatgaaggcgagggtga ggatgagggg gtggcgtggt tgggaagcga cgagagtcgg agagggagaa gatgtttccggcttggctgc ttttcctgga gggtggaaaa agagacaccg gaatgcgatc cagacgagac gacgctttcctcgtggtgat ggcggagaga attgaagagt ggagaagagg gcgagggaga cagagtcgga ggcttggacgaagggaggag gaggggtagg agaggaatcc agatgcactg tgtctgcag(SEQ ID No.1)

重组质粒拷贝数：拷贝数(copies/μL)＝6.02×10²³×质粒浓度(ng/μL)×10^-9/(质粒碱基数×660)。

4.对设计的RPA扩增引物进行筛选

以pUC57-529阳性质粒为模板进行扩增，设计的引物对为F1/R1，F2/R2-1，F2/2-2，试验体系如下：向含有重组酶冻干粉的八联管中依次加入41.5μlABuffer缓冲液、2μl 10μM上游引物，2μl 10μM下游引物，2μl DNA模板，在反应管盖上加2.5μl B buffer，瞬时离心后，震荡混匀，再离心,将八连管放在38℃条件下的恒温金属浴中，反应5min、15min、25min、反应产物经胶回收试剂盒纯化后，最终产物溶解在20μl的Elution Buffer中，进行1％琼脂糖凝胶电泳，最早出现扩增条带且无杂带的扩增引物为效果最好的引物。试验结果如图1所示，RAA扩增产物用1％琼脂糖凝胶进行电泳，其中泳道1-4表示上下游引物引物为F2、R2-2，以ddH2O为模板，扩增25min阴性对照、以pUC57-529质粒为模板分别扩增5min、15min、25min产物电泳亮度关系图；泳道5-8、9-12、各表示所用上下游引物为：F2/R2-1，F1/R1，最终筛得F2/R2-2为最佳引物。F2/R2-2引物扩增效果较好。

所筛引物序列如下：

上游引物：5’—AGCCACAGAAGGGACAGAAGTCGAAGGGGACT—3’

下游引物：5’—CAGGAAAAGCAGCCAAGCCGGAAACATCTT—3

5.弓形虫实时荧光RAA检测体系的建立及引物序列的进一步优化

(1)探针根据所筛选上下游引物扩增的目的片段，设计48bp长度的探针，探针中间FAM基团和BHQ1基团分别标记在T碱基上，两个基团中间THF替代G或C，3’端磷酸基团修饰，探针与探针自身及所筛引物尽量避免二聚体的产生。

探针序列如下:

5’-AGCCGTCTTGGAGGAGAGATATCAGGACTG(FAM-dT)AG(THF)A(BHQ1-dT)GAAGGCGAGGGTGAG-P-3’

(2)实时荧光RAA反应体系具体实施步骤：

向含有重组酶冻干粉的八联管中依次加入40.9μlABuffer缓冲液、2μl 10μM上游引物，2μl 10μM下游引物，0.6μl 10μM探针，2μl DNA模板，在反应管盖上加2.5μl Bbuffer，瞬时离心后，震荡混匀，再离心,反应程序设置为38℃，1min，共计25个循环。

(3)结果图2所示，以529-mutation-F1，529-mutation-R3为上下游引物反应的扩增曲线最优，出峰最早，荧光强度最高(纵坐标值)并且有明显的指数期和平台期。其它引物探针曲线上升峰高较低，出峰时间较晚。说明529-mutation-F1，529-mutation-R3引物和探针目的产物的复制速度更快、数量更多，扩增反应效率更高。

6.实时荧光RAA方法扩增条件的优化

确定最佳孵育温度，以3.2×10⁵copies/μl的重组质粒pUC57-529为模板，分别设定34.0℃、34.6℃、36.0℃、37.9℃、42.3℃、43.4℃、44.0℃不同反应温度，反应时间设定为25min。结果如图3所示，反应体系分别在34.0℃、34.6℃、36.0℃、37.9℃、42.3℃、43.4℃、44.0℃条件下，反应25min，温度在34℃-44℃条件下反应均有荧光曲线，随着温度的升高，荧光强度最高值有所下降，有可能是酶的活性受到高温的影响，在36-38℃时，荧光强度最高。随后，阳性标准品依次进行10倍稀释，稀释出拷贝数依次为3.2×10⁴、3.2×10³、3.2×10²、3.2×10¹、3.2×10⁰copies/μl浓度梯度的样品作为模板，分别在36℃、38℃条件下反应25min，结果如图4所示，扩增体系分别在36℃、38℃条件下，反应25min，从左到右依次为10⁴copies/μL、10³copies/μL、10²copies/μL、10¹copies/μL、10⁰copies/μL 5个的阳性标准品的扩增结果以及阴性对照。反应条件为36℃时，最低检测限为3.2×10²copies/μl，我们选择36℃为孵育温度。

7.实时荧光RAA检测体系敏感性分析

在实时荧光RAA检测体系敏感性分析中，所用模板为上述构建的阳性标准质粒pUC57-529，将阳性标准品依次进行10倍稀释，稀释出拷贝数依次为3.2×10⁴、3.2×10³、3.2×10²、3.2×10¹、3.2×10⁰浓度梯度的样品作为模板，在36℃条件下反应25min，结果如图3所示。同时，参照已发表的建立的荧光定量PCR方法设计的引物，上游引物序列5’-AAGGCGAGGGTGAGGATGAG-3’，下游引物序列5’-CCAGGAAAAGCAGCCAAGC-3’，对上述浓度梯度模板进行荧光定量PCR扩增，反应程序为：95℃1min后进入循环，95℃10s，60℃5s，72℃15s，共40个循环，结果如图5所示。从左到右依次为10⁴copies/μL、10³copies/μL、10²copies/μL、10¹copies/μL、10⁰copies/μL 5个的阳性标准品的扩增结果以及阴性对照。反应条件为：95℃1min后进入循环，95℃10s，60℃5s，72℃15s，共40个循环。从结果中可见里看出实时荧光RAA检测体系的最低检测检测限度为3.2×10²copies/μl，且检测范围较广，10⁴-10²拷贝数均可检出，检测灵敏度与荧光定量PCR等同。

8.实时荧光RAA检测体系特异性分析

使用上述构建的实时荧光RAA检测体系，分别对中型艾美耳球虫、混合艾美耳球虫、旋毛虫、华支睾吸虫阳性样品进行检测，以DNA为模板，进行RAA反应，反应体系如上具体实施步骤所述，从结果图6中可以看到，只有弓形虫扩增可见阳性荧光曲线，其他寄生虫均未见扩增，说明该方法具有良好的特异性，不与其他寄生虫基因组发生交叉扩增反应。

三、实时荧光RAA检测体系检测临床样品

采集中国农业大学动物医院猫血液样本20份以及本实验室送检猪血液样本12份，提取血液中基因组，分别用RT-PCR方法及RT-RAA方法进行检测。在20份猫血液样本中，RT-RAA检测出阳性4份，阴性16份，RT-PC检出阳性3份，阴性17份(其中RT-RAA方法检测为阳性的一份样品，RT-PCR方法检测为阴性)；在12份猪血液样本中，两种方法均检测出3份阳性样本及9份阴性样本。

本发明设计了引物及探针，构建了RT-RAA对弓形虫基因组的检测方法，该方法简单、快速且有效，降低检测成本的同时提高了效率，用普通的便携式恒温荧光采集器就能进行检测，适于临床样本及实验室快速诊断。

此外，本方法并不局限于上述实施案例，普通技术人员可基于上述方法、根据不同的组合及环境做相应变动，但由此引申出的变化或变动仍在本发明的保护范围之内。上述实施例仅为本发明的优选实施方式之一，不应当用于限制本发明的保护范围，但凡在本发明的主体设计思想和精神上作出的毫无实质意义的改动或润色，其所解决的技术问题仍然与本发明一致的，均应当包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所

<120> 一种用于弓形虫的RAA恒温荧光快速检测试剂盒及应用

<141> 2020-03-05

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 32

<212> DNA

<213> 引物529-mutation-F1(2 Ambystoma laterale x Ambystomajeffersonianum)

<400> 1

agccagagaa gggacagaag tcgaagggga ct 32

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 引物529-mutation-R3(2 Ambystoma laterale x Ambystomajeffersonianum)

<400> 3

caggaaaagc agcgaagctg gaaacatctt 30

<210> 3

<211> 48

<212> DNA

<213> 探针529-Pe(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 3

agccgtcttg gaggagagat atcaggactg agagaaggcg agggtgag 48

<210> 4

<211> 529

<212> DNA

<213> 529基因序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 4

ctgcagggag gaagacgaaa gttgtttttt tatttttttt tctttttgtt tttctgattt 60

ttgttttttt tgactcgggc ccagctgcgt ctgtcgggat gagaccgcgg agccgaagtg 120

cgttttcttt ttttgacttt tttttgtttt ttcacaggca agctcgcctg tgcttggagc 180

cacagaaggg acagaagtcg aaggggacta cagacgcgat gccgctcctc cagccgtctt 240

ggaggagaga tatcaggact gtagatgaag gcgagggtga ggatgagggg gtggcgtggt 300

tgggaagcga cgagagtcgg agagggagaa gatgtttccg gcttggctgc ttttcctgga 360

gggtggaaaa agagacaccg gaatgcgatc cagacgagac gacgctttcc tcgtggtgat 420

ggcggagaga attgaagagt ggagaagagg gcgagggaga cagagtcgga ggcttggacg 480

aagggaggag gaggggtagg agaggaatcc agatgcactg tgtctgcag 529

Claims (10)

1.一种用于快速检测弓形虫的实时重组酶介导等温扩增核酸试剂盒，包括弓形虫基因标准品，所述弓形虫基因标准品为含有529基因序列的阳性质粒，其特征在于，还包括针对弓形虫529基因设计的特异性引物和探针，根据弓形虫529基因的特异性保守靶序列设计用以定性检测组织器官、粪便或血液样品中的弓形虫529基因，所述引物包括上游引物和下游引物，包括核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示，所述探针的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：3所示。

2.根据权利要求1所述的用于快速检测弓形虫的实时重组酶介导等温扩增核酸试剂盒，其特征在于，所述探针中间荧光报告基团和荧光淬灭基因分别标记在T碱基上，两个基团中间THF替代G或C，3’端磷酸基团修饰。

3.根据权利要求1所述的用于快速检测弓形虫的实时重组酶介导等温扩增核酸试剂盒，其特征在于，还包括引物混合液、特异性荧光探针、ABuffer、B Buffer、RAA干粉试剂和ddH2O。

4.根据权利要求3所述的用于快速检测弓形虫的实时重组酶介导等温扩增核酸试剂盒，其特征在于，包括A Buffer为20％PEG，B Buffer为280mM MgAc。

5.根据权利要求3所述的用于快速检测弓形虫的实时重组酶介导等温扩增核酸试剂盒，其特征在于，所述的RAA干粉试剂的成分如下：1mmol/L dNTP、90ng/μL SSB蛋白、120ng/μLrecA重组酶蛋白或30ng/μL Rad51、30ng/μLBsu DNA聚合酶、100mmol/L Tricine、20％PEG、5mmol/L二硫苏糖醇、100ng/μL肌酸激酶、Exo核酸外切酶。

6.根据权利要求3所述的用于快速检测弓形虫的实时重组酶介导等温扩增核酸试剂盒，其特征在于，所述弓形虫基因标准品的序列如序列表中SEQ ID NO：4所示。

7.一种基于RT-RAA技术检测弓形虫的方法，其特征在于，操作步骤如下：提取待测样品的DNA，以待测样品的DNA为模板，在上游引物、下游引物、探针及RAA干粉试剂、A Buffer、BBuffer和ddH2O存在下进行实时荧光RAA反应，所述荧光RAA反应体系的加入量分别为BufferA 40.9μl，上游引物2μl，下游引物2μl，探针0.6μl，模板2μl；BufferB 2.5μl；根据实时荧光RAA扩增曲线分析待测样本，确定待测样本是否含有弓形虫基因组。

8.如权利要求7所述的一种基于RT-RAA技术检测弓形虫的方法，其特征在于：所述上游引物终浓度为400nM；所述下游引物终浓度为400nM，所述探针终浓度为120nM；所述实时荧光RAA反应条件为：36℃，1min，共计20个循环。

9.如权利要求7所述的一种基于RT-RAA技术检测弓形虫的方法，其特征在于：所述扩增曲线和CT值分析待测样本的分析方法包括当待测样本FAM通道扩增曲线呈“S”型且CT值≤35，判断为弓形虫529基因阳性结果，则当前样本为弓形虫感染样本；当待测样本无明显扩增曲线且CT值≥40，判断为弓形虫529基因阴性结果，则当前样本为弓形虫阴性样本；当待测样本FAM通道扩增曲线呈“S”型且35＜CT值＜40，判为可疑，需要排除环境污染造成的不准确结果后，再次检测，若样本的结果仍然为35＜Ct值＜40，以阴性对照作为参照标准，检测阴性对照的Ct值，若阴性对照Ct值≥40，则该待测样本判为阳性。

10.如权利要求1所述的用于检测弓形虫的实时重组酶介导等温扩增核酸试剂盒在病毒检测中的应用。

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