CN112877476A

CN112877476A - 非洲猪瘟病毒p72基因荧光探针pcr检测引物探针组、试剂盒及方法

Info

Publication number: CN112877476A
Application number: CN202110256899.3A
Authority: CN
Inventors: 翁长仁; 邱龙新
Original assignee: Longyan University
Current assignee: Longyan University
Priority date: 2021-03-09
Filing date: 2021-03-09
Publication date: 2021-06-01

Abstract

本公开提供了一种非洲猪瘟病毒P72基因荧光探针PCR检测引物探针组，所述引物探针组的正向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，特异性荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID No.3，其中，所述特异性荧光探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。本公开还提供了一种非洲猪瘟病毒P72基因荧光探针PCR检测试剂盒及方法。本公开的试剂盒及其检测方法具有覆盖范围广，检测时间短，检测效率高，可用于猪的唾液、鼻腔拭子、血液、组织等样本中的非洲猪瘟病毒检测。

Description

非洲猪瘟病毒P72基因荧光探针PCR检测引物探针组、试剂盒及方法

技术领域

本公开涉及生物技术的领域，尤其涉及一种非洲猪瘟病毒P72基因荧光探针PCR检测引物探针组、试剂盒及方法。

背景技术

非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒引起的猪的一种急性、烈性、出血性、高度接触性传染病，强毒株可在感染后约5-14天内致死家猪，致死率接近100％。由于非洲猪瘟病毒具有复杂的免疫逃避机制，缺乏典型的中和抗体，没有有效的疫苗用于防疫，且无特效治疗药物，所以建立一种快速、准确的检测方法对及时有效防控非洲猪瘟显得尤为重要。研发可检测尽可能多的毒株的检测方法必不可少。

目前，市面上已经有用于非洲猪瘟病毒核酸检测的操作简单、快速方便的实时荧光定量PCR试剂盒，已经被广泛应用于非洲猪瘟病毒基因检测。但是，这些试剂盒的或是检测灵敏度不足；或是基于个别毒株设计的引物探针，只能检测为数不多的病毒毒株。有鉴于此，本发明人研究和设计出了一种非洲猪瘟病毒P72基因荧光探针PCR检测引物、试剂盒及方法。

发明内容

本公开提供了一种非洲猪瘟病毒P72基因荧光探针PCR检测引物探针组、试剂盒及方法，在扩大检测覆盖毒株数的同时，以提高检测灵敏度。

根据本公开的一个方面，一种非洲猪瘟病毒P72基因荧光探针PCR 检测引物探针组，所述引物探针组的正向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1 所示，反向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，特异性荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID No.3，其中，所述特异性荧光探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。

根据本公开的至少一个实施方式，所述特异性荧光探针的荧光报告基团选自FAM、VIC、JOE、TET、CY3、CY5、ROX、Texas Red或LC RED460 中的一种，荧光淬灭基因选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcy1或Tamra中的一种。

根据本公开的一个方面，一种非洲猪瘟病毒P72基因荧光探针PCR 检测试剂盒，所述试剂盒包括如上所述的引物探针组。

根据本公开的至少一个实施方式，所述试剂盒还包括2×Taq PCR Mix。

根据本公开的至少一个实施方式，所述试剂盒还包括阴性对照及阳性对照。

根据本公开的至少一个实施方式，所述阴性对照为双蒸水。

根据本公开的至少一个实施方式，所述阳性对照为含P72基因的克隆质粒，所述克隆质粒为pUC19；所述P72基因的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

根据本公开的一个方面，一种非洲猪瘟病毒P72基因荧光探针PCR 检测方法，提取待测样本的DNA，以待测样本的DNA为模板，采用上所述的试剂盒进行实时荧光PCR反应，根据实时荧光PCR扩增曲线分析待测样本，确定待测样本是否存在非洲猪病病毒P72基因。

根据本公开的至少一个实施方式，所述实时荧光PCR反应体系为： PCR扩增的反应总体积为25μl，其中包括12.5μl的2×Taq PCR Mix， 1.25μl的10μM正向引物和1.25μl的10μM反向引物，0.5ul的10μM 特异性荧光探针，5μl的模板核酸样本，4.5μl的超纯水。

根据本公开的至少一个实施方式，所述实时荧光PCR反应程序为： 50℃2min的UDG酶作用时间；95℃30s的预变性；40个循环95℃10s， 56℃10s，72℃10s的扩增；在72℃扩增延伸阶段采集信号。

本公开所述检测方法需要实时荧光PCR反应结束后，利用实时荧光 PCR仪分析软件，根据实时荧光PCR的扩增曲线分析待测样品。优选的，当待测样本FAM通道扩增曲线呈“S”型且CT值≤40，判断为非洲猪瘟病毒P72基因阳性结果，则当前样本为非洲猪瘟野毒株感染样本；当待测样本无明显扩增曲线且CT值≥45，判断为非洲猪瘟病毒P72基因阴性结果，则当前样本为非洲猪瘟P72疫苗猪或阴性猪只；当待测样本FAM 通道扩增曲线呈“S”型且40＜CT值＜45，判为可疑，需要排除环境污染造成的不准确结果后，再次检测，若样本的结果仍然为40＜Ct值＜45，则该待测样本判为非洲猪瘟病毒P72基因阳性。

采用上述技术方案之后，本公开具有以下有益效果：

1)本公开试剂盒引物和探针覆盖了基因II型非洲猪瘟病毒的257 个病毒毒株，即可以检测257个非洲猪瘟病毒毒株；

2)检测灵敏度高，可以检测2.5拷贝/反应的阳性对照模拟样本；

3)检测时间短，检测效率高，整个检测过程从DNA提取到得到检测结果只需约50分钟；

4)可用于猪的唾液、鼻腔拭子、血液、组织等样本中的非洲猪瘟病毒检测。

附图说明

附图示出了本公开的示例性实施方式，并与其说明一起用于解释本公开的原理，其中包括了这些附图以提供对本公开的进一步理解，并且附图包括在本说明书中并构成本说明书的一部分。

图1是梯度变性温度的凝胶电泳图。

图2是扩增反应荧光曲线图。其中：每个模板浓度梯度设3个重复，灭菌水为阴性对照。

具体实施方式

下面结合附图和实施方式对本公开作进一步的详细说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于解释相关内容，而非对本公开的限定。另外还需要说明的是，为了便于描述，附图中仅示出了与本公开相关的部分。

需要说明的是，在不冲突的情况下，本公开中的实施方式及实施方式中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施方式来详细说明本公开。

实施例1引物设计及非洲猪瘟病毒pUC19-扩增片段重组质粒的构建

下载GenBank上收录的中国流行株所在的非洲猪瘟病毒基因II型相关的257个毒株p72基因序列，如表1所示，筛选保守区域，保守基因核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示，该区域内如果有不一致的碱基，则采用IUPAC国际标准进行简并处理，简并核苷酸序列如SEQID NO：5所示，用简并p72基因序列设计引物，设计出20对引物和配套探针，引物不包含简并碱基，从这20套的引物探针中筛选出特异性和灵敏度最高的组合作为试剂盒的组分,表2是筛选出的正、反向引物和探针的序列。利用设计的正、反向引物，可以扩增得到101个碱基对的片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。

表1 257个毒株p72基因序列

表2正向引物、反向引物、和特异性荧光探针的序列

其中，特异性荧光探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。

实施例2非洲猪瘟病毒P72基因的荧光PCR检测试剂盒

本实施例提供了一种非洲猪瘟病毒P72基因荧光探针PCR检测试剂盒，所述试剂盒包括如实施例1所述的的引物探针组。

根据本公开的至少一个实施方式，所述阴性对照为双蒸水。

实施例3非洲猪瘟病毒P72基因的荧光PCR检测方法

本实施例应用实施例2的试剂盒对非洲猪瘟病毒P72基因进行检测：

1、样品核酸的提取

核酸提取：采用天根血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(购自天根生化科技(北京)有限公司)，按照说明步骤提取待测样本基因组DNA。

2、PCR反应体系的配置：每个检测样品对应一个PCR反应管，每个 PCR反应管中各反应组分和所加入的体积：PCR扩增的反应总体积为 25μl，其中包括12.5μl的2×Taq PCRMix，1.25μl的10μM正向引物和1.25μl的10μM反向引物，0.5ul的10μM特异性荧光探针，5μl的模板核酸样本，4.5μl的超纯水。

进一步地，本实施例建立的方法中为了避免所用试剂失效或受到污染，设置有阳性对照品及阴性对照品，其中，阴性对照品为双蒸水，阳性对照品为为含P72基因的克隆质粒，所述克隆质粒为pUC19；所述P72 基因的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。阴性对照的设计能有效验证所用试剂是否受到污染，避免假阳性发生，阳性对照的设计能有效验证受用试剂的有效性，避免假阴性的发生。

3、扩增变性温度用梯度温度PCR仪选取最佳变性温度。变性温度梯度区间为55.6-62.4℃，PCR扩增反应程序为：95℃30s的预变性，40 个循环95℃10s，55.6-62.4℃10s，72℃10s的扩增。将扩增产物用琼脂糖凝胶电泳分离，确认片段大小与预期一致，结果如图1所示，并且确定最佳变性温度为56.5℃。将扩增片段用pUC19质粒克隆，测序质粒克隆的片段，确认序列与扩增片段序列一致，该克隆质粒可用作阳性对照。

4、将配置好反应体系的PCR反应管放置于荧光PCR扩增仪中，按照下列程序进行PCR扩增：50℃2min的UDG酶作用时间；95℃30s的预变性；40个循环95℃10s，56℃10s，72℃10s的扩增；在72℃扩增延伸阶段采集信号。

5、根据实时荧光PCR扩增曲线分析待测样本，确定待测样本是否存在非洲猪病病毒P72基因。

实施例4用非洲猪瘟病毒P72基因荧光探针PCR检测方法检测非洲猪瘟病毒核酸样本

本实施例按照实施例3的检测方法，对21个已知的从生猪血液提取的核酸样本进行检测，已知样本由商业非洲猪瘟荧光PCR检测试剂盒检测，其中17个检测为阳性，4个阴性。采用本试剂盒检测，结果19个阳性，2个阴性，两个商业试剂盒报告为阴性的样本，本试剂盒检测为阳性。检测结果对比在表3中列出。两个结果不相符的样本经过另一个进口非洲猪瘟病毒核酸荧光PCR检测试剂盒验证，结果也是阳性。

表3非洲猪瘟病毒核酸荧光PCR检测比较

以上两个样本，2号和11号的检测结果说明：1)本公开的检测试剂盒能覆盖更多的病毒毒株。用于对比的商用试剂盒没有覆盖2和11号样本，所以不能检测这两个样本。2号样本更像是这种情况，因为这个样本检出的循环数只有24.6，说明这个样本的病毒载量比较大，按常理这个病毒载量不会因为灵敏度偏低而不能检出；2)本公开检测方法有更高的灵敏度，11号样本有可能是这种情况，因为本发明检测方法检出结果是 34.6，这个循环数是有可能因为低灵敏度而不能检出。

实施例5本公开的检测试剂盒的重复性和灵敏度测试

标准品被稀释到每微升5000、500、50、5、0.5、0.05、0拷贝的浓度梯度，每个梯度设三个重复进行荧光PCR扩增，每个PCR扩增反应加样5微升，相当于每个PCR扩增反应加入25000、2500、250、25、2.5、 0.25、0拷贝。扩增反应荧光曲线图如图2所示，CT值和变异系数见表4。

数据显示本公开检测试剂盒检测不到水和最低浓度的样本，但是可以检测到样本浓度为0.5拷贝/微升的非洲猪瘟病毒，相当于每个反应2.5 个拷贝。数据的重复性高，最高的CV值只有2.55％。

表4扩增反应CT值和变异系数

综上所述，结果显示本发明的非洲猪瘟病毒核酸荧光PCR检测试剂盒能覆盖更多的非洲猪瘟病毒毒株、更高的检测灵敏度。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例/方式”、“一些实施例/方式”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例/方式或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本申请的至少一个实施例/方式或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例/方式或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例/方式或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例/方式或示例以及不同实施例/方式或示例的特征进行结合和组合。

本领域的技术人员应当理解，上述实施方式仅仅是为了清楚地说明本公开，而并非是对本公开的范围进行限定。对于所属领域的技术人员而言，在上述公开的基础上还可以做出其它变化或变型，并且这些变化或变型仍处于本公开的范围内。

序列表

<110> 龙岩学院

<120> 非洲猪瘟病毒P72基因荧光探针PCR检测引物探针组、试剂盒及方法

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cagctcttcc agacgcat 18

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

accatgagca gttacgga 18

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atattagccc cgttacgtat c 21

<210> 4

<211> 407

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atgcagccca ctcaccacgc agagataagc tttcaggata gagatacagc tcttccagac 60

gcatgttcat ctatatctga tattagcccc gttacgtatc cgatcacatt acctattatt 120

aaaaacattt ccgtaactgc tcatggtatc aatcttatcg ataaatttcc atcaaagttc 180

tgcagctctt acataccctt ccactacgga ggcaatgcga ttaaaacccc cgatgatccg 240

ggtgcgatga tgattacctt tgctttgaag ccacgggagg aataccaacc cagtggtcat 300

attaacgtat ccagagcaag agaattttat attagttggg acacggatta cgtggggtct 360

atcactacgg ctgatcttgt ggtatcggca tctgctatta actttct 407

<210> 5

<211> 415

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atgcagccya ctcaycacgc agagataagc tttcaggata gagatacagc tcttccagac 60

gcatgttcat statatcrga tattagcccc gttacgtatc cgatcacatt acctattatt 120

aaaaacattt ccgtaactgc tcatggtatc aatcttatcg ataagtttcc atcaaagttc 180

tgcagctcwt acataccctt ccactacgga ggcartgcra ttaaaacccc cgaygatccg 240

ggtgcgatga tgattacctt tgctttgaag ccacgggagg aataccaacc cagtggtcat 300

attaacgtat cyagagcaag agaattttat attwgttggg ayacrgatta cgtggggtct 360

atcactycgg ctgatcttgt ggtatcggca tctgctatta actttcttct tcttc 415

<210> 6

<211> 101

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cagctcttcc agacgcatgt tcatstatat crgatattag ccccgttacg tatccgatca 60

cattacctat tattaaaaac atttccgtaa ctgctcatgg t 101

Claims

1.一种非洲猪瘟病毒P72基因荧光探针PCR检测引物探针组，其特征在于，所述引物探针组的正向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，特异性荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID No.3，其中，所述特异性荧光探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。

2.如权利要求1所述的引物探针组，其特征在于，所述特异性荧光探针的荧光报告基团选自FAM、VIC、JOE、TET、CY3、CY5、ROX、Texas Red或LC RED460中的一种，荧光淬灭基因选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcy1或Tamra中的一种。

3.一种非洲猪瘟病毒P72基因荧光探针PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1所述的引物探针组。

4.如权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括2×Taq PCR Mix。

5.如权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阴性对照及阳性对照。

6.如权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于，所述阴性对照为双蒸水。

7.如权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于，所述阳性对照为含P72基因的克隆质粒，所述克隆质粒为pUC19；所述P72基因的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

8.一种非洲猪瘟病毒P72基因荧光探针PCR检测方法，其特征在于，提取待测样本的DNA，以待测样本的DNA为模板，采用如权利要求3所述的试剂盒进行实时荧光PCR反应，根据实时荧光PCR扩增曲线分析待测样本，确定待测样本是否存在非洲猪病病毒P72基因。

9.如权利要求8所述的检测方法，其特征在于，所述实时荧光PCR反应体系为：PCR扩增的反应总体积为25μl，其中包括12.5μl的2×Taq PCR Mix，1.25μl的10μM正向引物和1.25μl的10μM反向引物，0.5ul的10μM特异性荧光探针，5μl的模板核酸样本，4.5μl的超纯水。

10.如权利要求8所述的检测方法，其特征在于，所述实时荧光PCR反应程序为：50℃2min的UDG酶作用时间；95℃30s的预变性；40个循环95℃10s，56℃10s，72℃10s的扩增；在72℃扩增延伸阶段采集信号。