CN113462819A

CN113462819A - 一种利用热对流pcr检测非洲猪瘟病毒的试剂盒及方法

Info

Publication number: CN113462819A
Application number: CN202110816861.7A
Authority: CN
Inventors: 蒋析文; 朱小亚; 徐小解; 侯广山; 廖丽玲
Original assignee: Guangzhou Da'an Gene Co ltd
Current assignee: Guangzhou Da'an Gene Co ltd
Priority date: 2021-07-20
Filing date: 2021-07-20
Publication date: 2021-10-01

Abstract

本发明提供了一种利用热对流PCR检测非洲猪瘟病毒的试剂盒及方法，具体的地，本发明经过多轮筛选验证，从大量引物探针组合中获得了灵敏度高、特异性强、重复性好，适用于热对流PCR并且能够进行多重检测的引物探针组合。使用本发明的试剂盒及检测方法，基于热对流PCR，可实现超快速PCR扩增检测，而且检测灵敏度极高。

Description

一种利用热对流PCR检测非洲猪瘟病毒的试剂盒及方法

技术领域

本发明属于生物技术和分子诊断领域，具体地说，本发明涉及一种利用热对流PCR检测非洲猪瘟病毒的试剂盒及方法。

背景技术

非洲猪瘟(ASF)是猪的一种高度传染性病毒病，致死率接近100％。非洲猪瘟病毒是世界粮农组织和各国政府密切关注的主要传染病之一。根据OIE制定的《陆生动物卫生法典》年版，被列为法定报告的疫病之一，在我国被列为“一类动物疫病”。

感染非洲猪瘟病毒的家猪会出现致命的出血热，目前尚无有效的疫苗可进行防御。对疾病控制的唯一的确切可用方法是对疫区的隔离同时对疫区内的猪进行屠宰然后无害化销毁，并花费大量的人力对疫区的传播媒介(蜱虫等)进行扑灭。自从1909年肯尼亚首次报道发现非洲猪瘟病毒，非洲猪瘟病毒已经肆虐非洲，欧洲，亚洲，美洲等150多个国家。

家猪肉类是我国主要的肉类食物，自2018年非洲猪瘟病毒在我国沈阳首次被发现以来，我国家猪养殖业受到严重影响，猪肉价格频频上涨，加重了国民负担。非洲猪瘟病毒是一种传染性极强的病毒，早发现、早隔离就尤为重要。

目前，市场已有的非洲猪瘟核酸检测方法对实验环境要求较高，检测时间较长，无法进行现场检测。因此亟需研发出一种灵敏度高、特异性好且可现场快速检测非洲猪瘟病毒的试剂盒。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种基于热对流PCR平台，定性检测非洲猪瘟病毒的引物、探针、试剂盒及方法。具有实验过程简单、快速、实时等优点。

在本发明的第一方面，提供了一种用于检测非洲猪瘟病毒的引物对集，所述引物对集包括：

第一引物对，所述第一引物对包括：

如SEQ ID NO.1所示的正向引物；和，如SEQ ID NO.2所示的反向引物。

在另一优选例中，所述引物对集还包括：

内标引物对，所述内标引物对包括：

如SEQ ID NO.3所示的正向引物；和，如SEQ ID NO.4所示的反向引物。

本发明的第二方面，提供了一种多重检测非洲猪瘟病毒核酸的探针集，所述探针集包括核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的第一探针。

在另一优选例中，所述探针集还包括核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的内标探针。

在另一优选例中，各探针的5’端包含有荧光报告基团；和/或，各探针的3’端包含有荧光淬灭基团。

在另一优选例中，各探针标记的荧光报告基团互不相同。

本发明的第三方面，提供了一种基于热对流PCR检测非洲猪瘟病毒的试剂盒，所述试剂盒包括本发明第一方面所述的引物对集。

在另一优选例中，所述试剂盒还包括本发明第二方面所述的探针集。

在另一优选例中，所述试剂盒还包括选自下组的一种或多重组分：qPCR缓冲液(qPCR-Buffer)、无核酸酶水、ASFV裂解试剂、阳性质控品、内标溶液。

在另一优选例中，所述试剂盒包括第一容器，所述第一容器内包含引物探针混合液，所述引物探针混合液中包含序列如SEQ ID NO.1-6所示的多核苷酸。

在另一优选例中，所述第一容器还包含qPCR缓冲液(qPCR-Buffer)、和 /或无核酸酶水。

在另一优选例中，所述试剂盒还包括第二容器，所述第二容器内包含dNTP 混合物。

在另一优选例中，所述第二容器还包含PCR反应酶系，所述PCR反应酶系包括热启动酶。

在另一优选例中，所述试剂盒还包括第三容器，所述第三容器内包含阴性质控品。

在另一优选例中，所述试剂盒还包括第四容器，所述第四容器内包含阳性质控品。

在另一优选例中，所述试剂盒还包括第五容器，所述第四容器内包含ASFV 裂解试剂。

在另一优选例中，所述试剂盒还包括第六容器，所述第六容器内包含纯水。

本发明的第四方面，提供了一种基于热对流PCR检测非洲猪瘟病毒的方法，所述方法包括步骤：

(1)提供待检测对象的核酸样本；

(2)制备热对流PCR反应体系并进行PCR检测：

其中，所述热对流PCR反应体系包括：步骤(1)提供的所述核酸样本、本发明第一方面所述的引物对集、和本发明第二方面所述的探针组。

在另一优选例中，所述核酸样本可来自猪组织样本、猪体液样本(如血液样本)、猪粪便样本或环境样本(如饲料、污水样品)。

在另一优选例中，所述方法为非诊断目的的检测方法。

在另一优选例中，所述PCR反应体系还包括阳性质控品，和/或阴性质控品。

在另一优选例中，所述PCR反应体系还包括PCR反应酶系。

本发明的第五方面，提供了本发明第一方面所述的引物对集、和/或本发明第二方面所述的探针组的用途，用于制备PCR检测试剂盒，所述PCR检测试剂盒用于检测非洲猪瘟病毒核酸。

在另一优选例中，所述PCR为荧光定量PCR或热对流PCR。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了灵敏度检测结果。

图2显示了部分样本扩增图。

图3显示了对照检测体系1的检测结果。

图4显示了对照检测体系2的检测结果。

具体实施方式

本发明人通过广泛而深入的研究，获得一种快速检测非洲猪瘟病毒核酸的试剂盒及方法，本发明经过多轮筛选验证，从大量引物探针组合中获得了灵敏度高、特异性强、重复性好，适用于热对流PCR，并且能够进行多重检测的引物探针组合。使用本发明的试剂盒及检测方法，基于热对流PCR，可实现15min 完成50个循环的超快速PCR扩增检测，而且检测灵敏度极高。

具体地说，本发明提供了一种基于热对流实时荧光PCR平台，定性检测非洲猪瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)的方法、引物、探针及包括该引物探针混合液的试剂盒。本试剂盒选取非洲猪瘟病毒保守基因作为扩增靶区域，设计特异性引物及荧光探针用于体外现场快速定性检测样本中是否含有非洲猪瘟病毒核酸。同时，本发明还包含一种快速的直接裂解核酸的释放剂，可快速得到所需样本的核酸的方法。

在描述本发明之前，应当理解本发明不限于所述的具体方法和实验条件，因为这类方法和条件可以变动。还应当理解本文所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案，并且不意图是限制性的，本发明的范围将仅由所附的权利要求书限制。

除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、 99.3、99.4等)。

虽然在本发明的实施或测试中可以使用与本发明中所述相似或等价的任何方法和材料，本文在此处例举优选的方法和材料。

热对流PCR

热对流PCR是在一个封闭的空间中，维持其上下表面温度保持不变，产生了热流体上升冷流体下降的规则滚动的斑图现象，把上下温差引起空间内流体的密度变化引起的热对流应用于DNA扩增。毛细管的下部受到不断加热影响使得其底部样品发生变性反应，同时其密度变小，浮力慢慢变大，当大于粘性力和重力后向上浮动，上升到达靠近管顶部的较低温度区域时，样品又发生退火和延伸反应，同时受到冷却影响，密度又变大，开始慢慢下沉并重复进行加热冷却过程。以这种方式，通过热对流实现PCR反应。

但是，使用热对流PCR实现稳定扩增也存在不小的困难，比如热对流流体路径很难保证使规则的，这就导致无法保证反应试剂能充分完成变形、退火和延伸三大步骤，往往存在扩增效率偏低、扩增特异性差及管间差异大等问题。因此，热对流PCR中对反应试剂特别是引物、探针等特异性试剂的设计要求更高。

目前市场上出现的热对流PCR设备有中国台湾瑞基海洋生物科技股份有限公司开发的POCKIT^TM核酸分析仪、阿赫姆生物系统公司(韩国)开发的热对流PCR 检测仪。

多重PCR

多重PCR(multiplex PCR)，又称多重引物PCR或复合PCR，它是在同一 PCR反应体系里加上二对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应，其反应原理，反应试剂和操作过程与一般PCR相同。

影响多重PCR反应的因素有很多，比如：

(1)反应体系不平衡，反应体系的不平衡导致在前期的几轮反应中某些优势引物及其模板迅速扩增，获得大量的扩增产物，而这些扩增产物同时又是 DNA聚合酶的良好抑制剂。所以，随着扩增产物的大量出现，聚合酶的聚合能力被越来越强烈的抑制，因此，前期处于劣势的引物及其模板，这时就更加难以反应，最终导致扩增产物量非常之小，以至于无法检测。

(2)引物特异性，如果引物与体系中其他非目的基因片段结合力更强，那么目的基因结合引物的能力就会受到竟争，从而导致扩增效率下降。

(3)最佳退火温度不一致，将多对引物放置入一个体系中扩增，由于进行PCR反应的退火温度相同，所以要求每一对引物的最佳退火温度接近。

(4)引物二聚体，包括引物间的二聚体以及引物自身所形成的发卡结构，还有一类是第三方DNA介导的聚体，这些二聚体和非特异引物一样都会干扰引物与目标结合位点的竟争，影响扩增效率。

虽然上述提及了影响扩增效率的几个因素，但更多的因素尚不清楚。到目前为止，还没有一个可以明确预测扩增效率的有效方法。

本发明提供了基于热对流实时荧光PCR平台，定性检测非洲猪瘟病毒的引物、探针、试剂盒、及方法。

在本发明的一个优选地实施方式中，本发明提供了一种定性检测非洲猪瘟病毒核酸的引物、探针：

检测非洲猪瘟病毒的上游引物(ASFV-F)核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，下游引物(ASFV R)核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；检测外源内标基因的上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，检测外源内标基因的下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；

所述探针包括检测ASFV基因的探针和外源内标基因探针；检测ASFV基因的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：5，检测外源内标基因的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。

进一步地，SEQ ID NO：5核苷酸序列的5’端标记有FAM、3’端标记有BHQ1， SEQ IDNO：6核苷酸序列的5’端标记有VIC、3’端标记有BHQ1。

优选地，ASFV基因上游引物在反应体系中的终浓度为1μmol/L，ASFV基因下游引物在反应体系中的终浓度为1μmol/L，ASFV基因探针在反应体系中的终浓度为0.5μmol/L；外源内标基因上游引物在反应体系中的终浓度为0.5μmol/L，外源内标基因下游引物在反应体系中的终浓度为0.5μmol/L，外源内标基因探针在反应体系中的终浓度为0.3μmol/L；

检测ASFV基因和外源内标基因的引物探针序列如下表1：

表1.检测非洲猪瘟病毒的引物探针核苷酸序列信息

上述PCR引物和标有不同类型荧光的探针可用于对ASFV基因和外源内标基因进行检测，根据结果呈现的荧光曲线的Ct值，能够准确检测样本中是否含有非洲猪瘟病毒。

将上述特异性引物和探针制备成试剂盒，基于热对流PCR平台可快速定性检测非洲猪瘟病毒，能够为快速防控非洲猪瘟病毒提供有效的技术指导。

在本发明的一个优选地实施方式中，本发明还公开了一种用于非洲猪瘟病毒检测的试剂盒，所述试剂盒包括用于配制ASFV PCR反应液A的试剂：PCR引物探针混合液、PCRBuffer、和Nuclease-free水。配制ASFV PCR反应液B的试剂：dNTP mix、热启动酶；热启动酶稀释液。ASFV阳性质控品；ASFV阳性质控品；内标溶液；核酸释放剂。其中，PCR引物探针混合液，如表2。

表2.PCR引物探针混合液

所述PCR反应液A的PCR-Buffer包括如下成分，如表3：

表3.PCR-Buffer

编号	组分	组分中的主要成分
			1	PCR-Buffer	(NH4)<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>、KCl、Tris-HCl、MgCl<sub>2</sub>

所述对照品包括如下成分，如表4：

表4.对照样本

所述核酸释放剂包括如下成分，如表5：

表5.ASFV裂解试剂

编号	组分	组分中的主要成分
			1	ASFV裂解试剂	有机溶剂、胍盐、表面活性剂

所述阳性对照中含有：

检测非洲猪瘟病毒的人工合成的DNA片段1(SEQ ID NO.7)：

CGCAGAGGTAAGCTTTCAGGATAGAGATACAGCTCTTCCAGATGCATGTTCATCCATATCTGATATTACCCCCATTACTTATCCGATCACATTACCTATTATTAAAAACATTTCCGTTACTGCTCACGGTATCAATCT TATCGATAAATTTCCATCAAAGTTCTGCAGCTCTTACATACCCTTCCACTACGGAGGCAATTCGATTAAAA CCCCCGACGATCCGGGCGCGATGATGATTACCTTTGCTTTGAAACCACGGGAGGAATACCAACCCAGCGGT CATATTAACGTATCCAGAGCAAGAGAATTTTATATTAGCTGGGACACAGATTATGTGGGGTCTATCACCAC GGCTGATCTTGTGGTATCGGCATCCGCTATTAACTT

检测外源内标基因的人工合成的DNA片段2(SEQ ID NO.8)：

AAAGGGGCTTTGGGCTCTGCCCCCCTCTGCTTGGGAACACTGGGTATTCTCATGAGCTCATCCAAGCCAAGGTTGGACCCCTCCCCAAGAGGCCAACCCAGTGCCCCCTCCCATTTTCCGCTACTGACCAGTTCATCC AGCTTTCCATACAGTTGTTGCTGCCTATTGTGGTGCCGCCTCAGGTTAGGGGCTCTCAGCCATCTCTAACC TCTGCCCTCGCTGCTCTTGGAATTGCGCCCCCAAGATGCTCTCTCCCTTCTCCAATGAGGGAGCCACAGAA TCCTGAGAAGGTGAATGTGCCCTAACCTGCTGCTCTGTGCCCAGGCCTTAGGCATTTGCTGACTGACTCAG CCCCCATGCTTCTGGGGACCTTTCCTACCCCCATCAGCATCAATAAAACCTCCTGTCTCCAGTG

本发明所述试剂盒适用样本为全血、血清、淋巴结、脾脏、肾脏、扁桃体、肺、肌肉、环境样品等样品中非洲猪瘟病毒核酸的检测。优选全血和肌肉组织样本。

本发明所述试剂盒用于判定检测有效性的标准为：

ASFV阳性质控品：呈典型S型扩增曲线且Ct≤30。

ASFV阴性质控品：无典型S型扩增曲线显示。

以上各项同时满足的条件下本次实验有效，否则全部试验应重新进行。

在本发明的一个优选地实施方式中，本发明还公开了一种新的非洲猪瘟定性检测的方法，具体步骤包括：

1.处理待测样本并提取DNA模板；选择待测样本并使用裂解试剂提取核酸，并对样本核酸进行质量检测；

2.配制反应体系，反应体系构成如表6；

表6.反应体系

3.本发明PCR上机程序，使用热对流PCR仪测试56℃的退火温度，每个循环的时间分别是21s，50个循环(Cycles)。

4.结果读取及分析：在仪器正常，ASFV阳性质控品和ASFV阴性质控品均正常的情况下进行结果分析

Ch1通道：

阳性：待测样本检测结果Ct≤40，曲线呈S型或有明显指数增长期，判断为非洲猪瘟病毒病毒阳性；

可疑：待测样本检测结果40≤Ct≤43,此时应对样本进行重复检测，如重读结果Ct值仍然存在相同的范围，曲线呈S型或由明显的指数扩增期，则判断非洲猪瘟病毒病毒阳性，否则判断非洲猪瘟病毒病毒为阴性；

阴性：在Ct≥43或未检出，此次结果判断非洲猪瘟病毒为阴性。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

本发明提供了一种非洲猪瘟病毒定性检测的方法、引物、探针、体系的优化与试剂盒。本试剂盒优化了特异性引物探针，针对非洲猪瘟病毒基因的引物做了大量的筛选工作，获得的产品灵敏度较高，可达500copies/mL，具有检测速率快、所需样本少、性能稳定高效、高准确性等优点，实现真正意义上现场快速定性检测，结果可实时观察。本发明适用于非洲猪瘟病毒核酸进行检测，为指导防疫提供有效的技术支持，值得推广应用。

本发明提出一种非洲猪瘟病毒定性检测的方法、引物、探针、体系的优化及试剂盒，该试剂盒基于热对流PCR平台，具有快速简单的优点的同时，检测体系灵敏度与常规荧光PCR检测方法一致，可达到500copies/mL。具体实施步骤如下，

步骤一、样本采集及处理

1.活猪样品：无菌采集抗凝血或血清5mL。

2.病死猪剖检样品或屠宰场剖检样品：无菌采集死猪的脾、肺、肾、扁桃体、淋巴结、肌肉等组织样品，2-8℃低温运至实验室用于检测。

3.病猪污染的周边环境：采集与病猪相关场所的粪便、饲料、污水样品，2-8℃低温运至实验室用于检测。

步骤二、样本处理方法

1.组织样品：取适当大小的组织块放入盛有PBS缓冲液的研磨管中，6000r/min(或使用便携式研磨器)研磨45s，制成约10％的组织匀浆液，5000r/min离心5min，取200μL上清液进行核酸提取。

2.粪便、饲料样品处理方法：取适量的粪便、饲料放入盛有PBS缓冲液的研磨管中，6000r/min(或使用便携式研磨器)研磨45s，制成约10％的组织匀浆液， 5000r/min离心5min，取200μL上清液进行核酸提取。

3.全血样品：用含有适量抗凝剂的采血管抽取病猪静脉血5mL，3000rpm离心5min，取上清进行核酸提取

4.污水样品处理方法：直接取200μL污水进行核酸提取。

步骤三、DNA核酸提取

取10μL样本(全血、血浆、或组织匀浆)，加入10μL裂解液，吸打混合后室温静止5min；加入80μL蒸馏水，上下颠倒(或振荡数十秒)混匀后，瞬时离心。

注意：处理完成后请观察样本颜色，如果处理后样本呈明显的红色，需对样本再稀释5-10倍，样本接近无色后再进行加样扩增；如果呈明显的黄色，需对样本再稀释2-5倍，样本接近无色后再进行加样扩增。

步骤四、PCR试剂准备和加样

从试剂盒中取出ASFV PCR反应液A和ASFV PCR反应液B，室温融化后振荡混匀，8000rpm离心数秒后使用。

1.ASFV反应体系配置

取一个2mL已灭菌离心管，按照单个反应的用量，计算应加入ASFV PCR反应液A(12μL/样本份)、ASFV PCR反应液B(6μL/样本份)各自所需的总量，移入2mL已灭菌离心管中

2.ASFV反应体系分装和离心

取适量专用PCR反应管，使用窄口枪头对PCR试剂进行分装(每管分装18μL)，分装完成后使用离心机8000rpm下离心1min

3.加样

向上述PCR反应管中分别加入提取好的样本DNA和阴性质控品、阳性质控品各 2μL，盖紧管盖，8000rpm离心3min，离心完成后注意观察反应管中是否有肉眼可见气泡残留，如有需重复一次离心。如无肉眼可见气泡，将各反应管放入fast PCR 仪中。

步骤五、上机扩增

使用热对流PCR仪测试设置56℃的退火温度，设置每个循环的时间分别是21s，进行50个循环。

本发明的有益效果在于：

(1)使用本发明的试剂盒及检测方法，基于热对流PCR，可以在热对流 PCR仪上在15min完成50cycles的超快速PCR扩增检测，而且检测灵敏度与普通荧光定量PCR相当，灵敏度可达500copies/ml。搭配专用的核酸释放剂，整体检测时间不超过25min,比市场中已知快速检测设备快一倍左右，检测时间比市场上同类产品缩短30-60分钟。

(2)本发明通过针对性检测非洲猪瘟病毒的特异性基因，能够高效率、高特异性、低成本的对非洲猪瘟病毒进行检测。

(3)本发明的检测试剂盒，同时包括非洲猪瘟病毒特异性基因核酸靶标检测系统和内源性内标检测系统，为多重荧光检测试剂盒，可以对标本采集、核酸提取过程及PCR扩增过程进行监控，减少假阴性结果的出现。

(4)本发明经过多轮筛选验证，从大量引物探针组合中获得了灵敏度高、特异性强、重复性好，适用于热对流PCR和普通荧光定量PCR，并且能够进行多重检测的引物探针组合。

本发明适用于对非洲猪瘟病毒核酸的检测，为病毒鉴定和防控提供可靠的依据，值得推广应用。另外，本发明的方法同样适用于非诊断的目的，例如，在疫情防控过程中，使用本发明的检测方法对环境中的病毒核酸进行检测，这些病毒核酸信息可以作为农牧部门管理之需。

下面结合具体实施例，进一步详陈本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如美国Sambrook.J等著《分子克隆实验室指南》(黄培堂等译，北京：科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。

实施例1：试剂盒

一种非洲猪瘟病毒核酸检测的试剂盒的组成成分、包装及数量(48反应/ 盒)，如表7：

表7.试剂盒的组成成分、包装及数量

组分	规格
		ASFV PCR反应液A	600μL/管×1管
ASFV PCR反应液B	300μL/管×1管
		ASFV阴性质控品	100μL/管×1管
ASFV阳性质控品	50μL/管×1管
		ASFV裂解试剂	500μL/管×1管
ASFV纯化水	1.8mL/管×3管
		说明书	1份
内标溶液	240μL/管

实施例2：试剂盒的灵敏度检测及最低检出率实验

灵敏度参考品由1种非洲猪瘟病毒与内参基因模板(内参基因拷贝数≥10⁸copies/mL)分别按一定比例混合，混合液的非洲猪瘟病毒核酸浓度为分别为5×10⁷copies/mL、5×10⁶copies/mL、5×10⁵copies/mL、5×10⁴copies/mL、5×10³copies/mL、5×10²copies/mL；其中非洲猪瘟病毒核酸和内标模板来源于人工制备的质粒；阴性对照为Nuclease-free水；

取阴性对照、阳性对照及灵敏度参考品各2μL，加样至反应体系的专用 PCR管中，使每管反应液总体积为20μL；实际测得的如表8和图1所示：

表8.灵敏度检测结果

图1显示了灵敏度检测结果。

试剂盒的灵敏度检测结果与理论值相符，灵敏度检测良好且阳性符合率为100％。

实施例3：试剂盒的准确性检测

本发明试剂盒的准确性进行检测，得到结果如表9和图2:

表9.准确性检测结果

样品

#1

#2

#3

#4

#5

#6

#7

#8

CT

16.0

18.1

22.6

18.0

21.3

NA

23.8

24.7

样品

#9

#10

#11

#12

#13

#14

#15

#16

CT

24.3

26.0

24.9

26.4

30.9

38.4

33.1

28.3

样品

#17

#18

#19

#20

#21

#22

阴控

阳控

CT

29.0

29.5

31.4

33.2

33.9

34.0

NA

22.2

样品

#23

#24

#25

#26

#27

#28

#29

#30

CT

28.1

29.6

30.4

31.1

30.6

32.9

NA

30.9

样品

#31

#32

#33

#34

#35

#36

#37

#38

CT

34.4

16.4

17.9

21.8

NA

26.5

23.7

25.7

样品

#39

#40

#41

#42

#43

#44

阴控

阳控

CT

25.0

NA

19.0

29.5

24.9

22.5

NA

21.4

样品

#45

#46

#47

#48

#49

#50

#51

#52

CT

25.6

29.0

29.6

29.7

31.6

25.2

26.1

16.7

样品

#53

#54

#55

#56

#57

阴控

阳控

CT

NA

28.1

24.4

18.3

22.0

NA

22.0

图2显示了部分样本扩增图。

根据检测结果：

ASFV阳性质控品：呈典型S型扩增曲线且Ct≤30。

ASFV阴性质控品：无典型S型扩增曲线显示。

两项结果同时成立，结果数据有效。检测结果阳性率为100％，符合理论定性标准，表明本发明试剂盒的准确性检测符合要求。

实施例4：试剂盒的重复性检测

本发明试剂盒的重复性进行检测，得到结果如表10。

表10.重复性性检测结果

根据上表所述结果，ASFV阳性质控品：呈典型S型扩增曲线且Ct符合标准。ASFV阴性质控品：无典型S型扩增曲线显示。两项结果同时成立，结果数据有效。重复性检测结果符合理论定性标准，表明本发明试剂盒的重复性检测符合要求。

对比例1

根据非洲猪瘟病毒的序列，分析其基因组的保守区域。在这些保守区域中设计出数十组针对非洲猪瘟病毒靶标基因的特异性引物和探针序列。另外为了对标本采集、核酸提取过程及PCR扩增过程进行监控，设计了内标引物和探针。在引物、探针的设计过程中，尽量避免发卡结构、引物内部二聚体、引物间二聚体以及错配的形成。此外，通过数据库对设计的非洲猪瘟病毒特异性引物和探针序列进行比对分析避免与其他病毒或动物基因发生非特异结合。

由于引物特异性差异、退火温度不一致、以及引物二聚体等原因，不同引物探针组合对于试剂检测灵敏度影响较大，很难获得较优的PCR扩增引物以及探针序列。本发明人通过大量的实验，在常规实时荧光定量PCR上通过多轮筛选和优化后，再通过热对流PCR进行验证，最终确定了扩增效果好，灵敏度高，准确率高的引物组和检测探针。

实验中发现，即使在已经基本确定针对各目标核酸的引物对和探针序列的情况下，不同引物对组合进行多重扩增的效果也存在显著差异。

例如，使用如下的对照引物对进行检测，其它检测步骤和条件同上述实施例：

对照检测体系1：

对照检测体系2：

图3显示了对照检测体系1的检测结果；图4显示了对照检测体系2的检测结果。按照实施例2的方法进行灵敏度检测，检测结果表明对照检测体系1 低浓度核酸样本的曲线较差，灵敏度仅有5×10³copies/mL。对照检测体系2 低浓度核酸样本无法得到曲线，灵敏度仅有5×10⁴copies/mL。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 广州达安基因股份有限公司

<120> 一种利用热对流PCR检测非洲猪瘟病毒的试剂盒及方法

<130> 020083

<160> 15

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 1

cgcagaggta agctttcagg 20

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 2

cgaattgcct ccgtagtgg 19

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 3

ctctgcttgg gaacactgg 19

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 4

gcagaggtta gagatggctg 20

<210> 5

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 5

cagctcttcc agatgcatgt tcatcc 26

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 6

ctcatgagct catccaagcc aaggt 25

<210> 7

<211> 387

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 7

cgcagaggta agctttcagg atagagatac agctcttcca gatgcatgtt catccatatc 60

tgatattacc cccattactt atccgatcac attacctatt attaaaaaca tttccgttac 120

tgctcacggt atcaatctta tcgataaatt tccatcaaag ttctgcagct cttacatacc 180

cttccactac ggaggcaatt cgattaaaac ccccgacgat ccgggcgcga tgatgattac 240

ctttgctttg aaaccacggg aggaatacca acccagcggt catattaacg tatccagagc 300

aagagaattt tatattagct gggacacaga ttatgtgggg tctatcacca cggctgatct 360

tgtggtatcg gcatccgcta ttaactt 387

<210> 8

<211> 415

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 8

aaaggggctt tgggctctgc ccccctctgc ttgggaacac tgggtattct catgagctca 60

tccaagccaa ggttggaccc ctccccaaga ggccaaccca gtgccccctc ccattttccg 120

ctactgacca gttcatccag ctttccatac agttgttgct gcctattgtg gtgccgcctc 180

aggttagggg ctctcagcca tctctaacct ctgccctcgc tgctcttgga attgcgcccc 240

caagatgctc tctcccttct ccaatgaggg agccacagaa tcctgagaag gtgaatgtgc 300

cctaacctgc tgctctgtgc ccaggcctta ggcatttgct gactgactca gcccccatgc 360

ttctggggac ctttcctacc cccatcagca tcaataaaac ctcctgtctc cagtg 415

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 9

ttgttgctgc ctattgtggt 20

<210> 10

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 10

ttctgtggct ccctcattg 19

<210> 11

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 11

catttccgtt actgctcacg gtatc 25

<210> 12

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 12

tctgccctcg ctgctcttgg aat 23

<210> 13

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 13

cattacttat ccgatcacat tacct 25

<210> 14

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 14

ttgctctgga tacgttaata tga 23

<210> 15

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 15

cccttccact acggaggcaa ttc 23

Claims

1.一种用于检测非洲猪瘟病毒的引物对集，其特征在于，所述引物对集包括：

第一引物对，所述第一引物对包括：

2.如权利要求1所述的引物对集，其特征在于，所述引物对集还包括：

内标引物对，所述内标引物对包括：

3.一种多重检测非洲猪瘟病毒核酸的探针集，其特征在于，所述探针集包括核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的第一探针；优选地，所述探针集还包括核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的内标探针。

4.一种基于热对流PCR检测非洲猪瘟病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的引物对集。

5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括权利要求3所述的探针集。

6.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括选自下组的一种或多重组分：qPCR缓冲液(qPCR-Buffer)、无核酸酶水、ASFV裂解试剂、阳性质控品、内标溶液。

7.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括第一容器，所述第一容器内包含引物探针混合液，所述引物探针混合液中包含序列如SEQ ID NO.1-6所示的多核苷酸；优选地，所述第一容器还包含qPCR缓冲液(qPCR-Buffer)、和/或无核酸酶水。

8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括第三容器，所述第三容器内包含阴性质控品；和/或

所述试剂盒还包括第四容器，所述第四容器内包含阳性质控品；和/或

所述试剂盒还包括第五容器，所述第五容器内包含ASFV裂解试剂。

9.一种基于热对流PCR检测非洲猪瘟病毒的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：

(1)提供待检测对象的核酸样本；

(2)制备热对流PCR反应体系并进行PCR检测：

10.权利要求1所述的引物对集、和/或权利要求3所述的探针集的用途，用于制备PCR检测试剂盒，所述PCR检测试剂盒用于检测非洲猪瘟病毒核酸。