CN103320542B - 禽肺炎病毒Taqman探针荧光定量RT-PCR检测试剂盒 - Google Patents
禽肺炎病毒Taqman探针荧光定量RT-PCR检测试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种禽肺炎病毒Taqman探针荧光定量RT-PCR检测试剂盒及其应用。本发明所提供的试剂盒中含有用于检测禽肺炎病毒的组合物，由一个引物对和一个探针组成的组合物；所述引物对由引物1和引物2组成，所述引物1为序列表中序列1所示的单链DNA，所述引物2为序列表中序列2所示的单链DNA；所述探针的序列为序列表中序列3。实验证明，利用本发明所提供的试剂盒进行禽肺炎病毒的Taqman探针荧光定量RT-PCR检测，具有检测时间短、特异性强、灵敏度高、操作简便、价格相对较低的优点。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种禽肺炎病毒Taqman探针荧光定量RT-PCR检测试剂盒及其应用。
背景技术
禽肺炎病毒（avian pneumovirus，APV）是禽偏肺炎病毒属的成员，属于禽副黏病毒科，该病毒主要危害火鸡，但是近几年发现这种病毒也侵害不同品种的鸡，包括种鸡、商品肉鸡和鸡蛋，引起这些鸡发病。该病毒引起鸡发病的日龄一般在4-7周龄，在5-6周龄时最易发生。主要引起上呼吸道的症状，以喷嚏，眼结膜潮红，泪腺肿，明显的症状为头部出现皮下水肿，出现头部肿大；产蛋鸡感染该病毒主要引起产蛋下降，下降幅度在2%-40%之间，种蛋孵化率降低；随着病情的发展，会出神经症状；该病引起的发病率在1%-90%之间，引起鸡死亡率在1%-20%，如继发其它疾病的感染，引起的死亡会更大，对养禽业造成的危害极大。
禽肺炎病毒基因组为不分节段的负链RNA，长度约为14kb，根据其核苷酸和氨基酸序列可以将其经典的分为A、B、C、D等4个亚型，其中A亚型和B亚型呈世界范围内广泛流行，C亚型于1997年在美国科罗拉多分离，D亚型仅存在于法国。其基因组编码有8种蛋白，即N-P-M-F-M2-SH-G-L。其中F为融合蛋白，是该病毒主要抗原结构蛋白，具有吸附作用。
实时荧光定量PCR是一种融PCR和DNA探针杂交技术为一体的基因体外扩增技术，它通过实时检测PCR产物荧光信号的变化而达到检测病原核酸的目的，该技术具有操作简便、结果直观、敏感性高、特异性强、重复性好等优点，已成为动物病原检测的重要方法。另外，该技术还可以根据建立的标准曲线，直接从检测到的荧光阈值推算样品中相应病原的含量，在临床检测和对疾病进程的评价上具有很高的实用价值。
目前，还未见有应用Taqman荧光定量RT-PCR技术对禽肺炎病毒进行检测和诊断的报道。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种用于检测禽肺炎病毒的组合物或探针。
本发明所提供的用于检测禽肺炎病毒的组合物，由一个引物对和一个探针组成的组合物；所述引物对由引物1和引物2组成，所述引物1为序列表中序列1所示的单链DNA，所述引物2为序列表中序列2所示的单链DNA；所述探针的序列为序列表中序列3。
本发明所提供的用于检测禽肺炎病毒的探针的序列为序列表中序列3。
在所述组合物或所述探针中，所述探针的5’端标记有报告荧光染料A，3’端标记有淬灭荧光染料B。
在本发明中，所述报告荧光染料A具体为FAM；所述淬灭荧光染料B具体为Eclipse。
其中，序列1由20个核苷酸组成；序列2由20个核苷酸组成；序列3由22个核苷酸组成。
本发明的第二个目的是提供一种用于检测禽肺炎病毒的试剂。
本发明所提供的用于检测禽肺炎病毒的试剂，由所述组合物（或所述探针）、Taqman探针荧光定量RT-PCR扩增缓冲液和水组成。
所述Taqman探针荧光定量RT-PCR扩增缓冲液，包括dNTPs、Mg2+、DNA聚合酶、反转录酶和RNA酶抑制剂。
在本发明的一个实施例中，所述Taqman探针荧光定量RT-PCR扩增缓冲液（记为缓冲液A）中，所述dNTPs、所述Mg2+、所述DNA聚合酶、所述反转录酶和所述RNA酶抑制剂的配比为：0.1μmol：0.25μmol：2.5U：200U：40U。进一步，所述Taqman探针荧光定量RT-PCR扩增缓冲液，为来自于大连宝生物工程有限公司Takara产品：One Step PrimeScript RT-PCR Kit（产品目录号：RR064A）。更加具体的，所述Taqman探针荧光定量RT-PCR扩增缓冲液，为将所述One Step PrimeScript RT-PCR Kit（产品目录号：RR064A）中的2×One Step RT-PCR Buffer III（内含25mM Mg2+，10mM dNTPs，大连宝生物工程有限公司，产品目录号：RR064A）、Takara Ex Taq HS（5U/μL，大连宝生物工程有限公司，产品目录号：RR064A）、PrimeScript RT Enzyme Mix II（含反转录酶200U/μL，RNA酶抑制剂40U/μL，大连宝生物工程有限公司，产品目录号：RR064A）按照体积比为10：0.5：1的比例混合后所得溶液。当然，使用其他公司的类似产品也可以。
在本发明的另一个实施例中，所述Taqman探针荧光定量RT-PCR扩增缓冲液（记为缓冲液B），具体由反转录缓冲液和Taqman探针荧光PCR缓冲液组成。其中，所述反转录缓冲液中含有所述dNTPs、所述Mg2+、所述反转录酶和所述RNA酶抑制剂；所述dNTPs、所述Mg2+、所述反转录酶和所述RNA酶抑制剂的配比为0.02μmol：0.1μmol：2.5U：20U。更加具体的，所述反转录缓冲液由AMV反转录酶（5U/μL，大连宝生物工程有限公司，产品目录号：D2620），RNA酶抑制剂（40U/μL，大连宝生物工程有限公司，产品目录号：D2313A），随机引物（50μmol/μL，大连宝生物工程有限公司，产品目录号：D3802），10mM dNTPs Mix(四种碱基，大连宝生物工程有限公司，产品目录号：D4030RA)，5×RTbuffer(含25mM Mg2+，AMV反转录酶中包含有该buffer，大连宝生物工程有限公司，产品目录号：D2620)，按照体积比为1：1：2： 4：8的比例混合后所得溶液。所述Taqman探针荧光PCR缓冲液中含有所述dNTPs、所述Mg2+和所述DNA聚合酶；所述dNTPs、所述Mg2+和所述DNA聚合酶的配比为0.01μmol：0.025μmol：5U。更加具体的，所述Taqman探针荧光PCR缓冲液，为Premix Ex Taq(probe qPCR)(内含10mM dNTP Mixture，25mM Mg2+，5U/μL转录酶Takara Ex Taq HS等，大连宝生物工程有限公司，产品目录号：RR390A)。当然，使用其他公司的类似产品也可以。
本发明的第三个目的是提供一种用于检测禽肺炎病毒的试剂盒。
本发明所提供的用于检测禽肺炎病毒的试剂盒，含有下述a)和b)：
a)禽肺炎病毒阳性质粒；
b)所述组合物，或所述探针，或所述的试剂。
在所述试剂盒中，所述禽肺炎病毒阳性质粒为含有序列表中序列4的第753-849位核苷酸的质粒。
进一步，所述禽肺炎病毒阳性质粒为将序列表中序列4的第753-849位核苷酸所示DNA片段与pMD18-T载体相连后得到的重组质粒。
在所述组合物，或所述试剂，或所述试剂盒中，所述引物1、所述引物2和所述探针在反应体系中的摩尔比为1：1：0.5。
本发明的第四个目的是提供如下c)或d)的应用。
c)所述引物对在制备所述试剂或所述试剂盒中的应用；
d)所述组合物，或所述探针，或所述试剂，在制备检测或辅助检测待测样品中是否含有禽肺炎病毒的产品中的应用。
在d)所述应用中，所述检测或辅助检测待测样品中是否含有禽肺炎病毒可为用所述组合物，或所述探针，或所述试剂，或所述试剂盒对所述待测样品进行Taqman探针荧光定量RT-PCR反应。
所述进行Taqman探针荧光定量RT-PCR反应的退火温度可为60℃-62℃(如60℃)。
进一步，利用所述Taqman探针荧光定量RT-PCR扩增缓冲液(缓冲液A)进行所述Taqman探针荧光定量RT-PCR反应的程序具体可为：42℃15min；95℃2min；然后按95℃变性15s、60℃退火延伸20s进行40个循环；最后于40℃10秒结束反应。利用所述Taqman探针荧光定量RT-PCR扩增缓冲液(缓冲液B)进行所述Taqman探针荧光定量RT-PCR反应的程序具体可为：首先进行反转录：25℃10min；42℃60min；95℃5min；然后进行Taqman实时荧光PCR扩增：95℃变性15s；60℃退火延伸20s进行40个循环；最后于40℃10秒结束反应。
所述进行Taqman探针荧光定量RT-PCR反应的温度转换率为20℃/s，在每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测。
在d）所述应用中，所述检测或辅助检测待测样品中是否含有禽肺炎病毒时所述引物1和所述引物2在反应体系中的终浓度均可为0.2μmol/μL；所述探针在反应体系中的终浓度均可为0.1μmol/μL。
在本发明中，利用所述Taqman探针荧光定量RT-PCR扩增缓冲液（缓冲液A）进行所述Taqman探针荧光定量RT-PCR反应的体系具体如下：2×One Step RT-PCR Buffer III（内含25mM Mg2+，10mM dNTPs，大连宝生物工程有限公司，产品目录号：RR064A）10μL；Takara Ex Taq HS（5U/μL，大连宝生物工程有限公司，产品目录号：RR064A）0.5μL；PrimeScript RT Enzyme Mix II（含反转录酶200U/μL，RNA酶抑制剂40U/μL，大连宝生物工程有限公司，产品目录号：RR064A）1μL；模板（RNA或DNA）2μL（约20μg）；所述引物1和所述引物2在反应体系中的终浓度均为0.2μmol/μL；所述探针在反应体系中的终浓度为0.1μmol/μL；DEPC水补足20μL。
在本发明中，利用所述Taqman探针荧光定量RT-PCR扩增缓冲液（缓冲液B）进行所述Taqman探针荧光定量RT-PCR反应的体系具体为如下反转录体系和Taqman探针荧光PCR扩增体系：
反转录体系（20μL）：AMV反转录酶（5U/μL，大连宝生物工程有限公司，产品目录号：D2620）0.5μL；RNA酶抑制剂（40U/μL，大连宝生物工程有限公司，产品目录号：D2313A）0.5μL；随机引物（50μmol/μL，大连宝生物工程有限公司，产品目录号：D3802）1μL；10mM dNTPs Mix(四种碱基，大连宝生物工程有限公司，产品目录号：D4030RA)2μL；5×RTbuffer(含25mM Mg2+，AMV反转录酶中包含有该buffer，大连宝生物工程有限公司，产品目录号：D2620)4μL；模板（RNA）2μL（约20μg）；DEPC水补足20μL。
Taqman探针荧光PCR扩增体系扩增体系（20μL）：Premix Ex Taq(probe qPCR)buffer（2×）(内含10mM dNTP Mixture，25mM Mg2+，5U/μL转录酶Takara Ex Taq HS等，大连宝生物工程有限公司，产品目录号：RR390A)10μL；模板(反转录所得的cDNA或病毒DNA)2μL（约20μg）；所述引物1和所述引物2在反应体系中的终浓度均为0.2μmol/μL；所述探针在反应体系中的终浓度为0.1μmol/μL；DEPC水补足20μL。
在d）所述应用中，所述待测样品可来自健康的动物或死亡的动物，可为DNA和/或RNA。
实验证明，本发明具有如下优点：
1）检测时间短
本研究通过Primer Express3.0软件，设计扩增禽肺炎病毒的引物和探针，通过比对分析设计的引物之间的二聚体、发夹结构等，最终设计出了1对引物和一条Taqman 探针。建立了禽肺炎病毒的Taqman探针荧光定量RT-PCR方法。该方法无需进行电泳，仅需要约30分钟的时间完成扩增，并且可以直接通过电脑来观察反应结果，而常规的RT-PCR方法起码需要3.5小时来完成扩增反应，然后需要花2小时进行凝胶电泳来观察结果。
2）检测特异性强且敏感性高
采用Taqman探针建立的荧光定量PCR方法，在扩增时形成的引物二聚体不影响检测结果，无需进行溶解曲线分析引物二聚体的形成，在扩增退火时检测荧光，扩增特异性强。用该方法对禽肺炎病毒毒株和其它禽的毒株进行检测，只有禽肺炎病毒毒株核酸出现特异的曲线，为阳性，其它对照毒株核酸均没有曲线出现，为阴性，结果特异性好；用建立的Taqman探针荧光定量RT-PCR方法对样品中禽肺炎病毒的含量进行定量，其检测的敏感性非常高，能检测到限量为10个拷贝的禽肺炎病毒质粒，常规PCR为1000个拷贝。建立的方法可用于禽肺炎病毒的鉴别检测，因此该方法的建立对禽肺炎病毒的准确诊断和预防有重要意义。
附图说明
图1为Taqman探针荧光定量RT-PCR方法检测禽肺炎病毒的标准曲线。图中各点对应为1：1.0×107拷贝数/μL；2：1.0×106拷贝数/μL；3：1.0×105拷贝数/μL；4：1.0×104拷贝数/μL；5：1.0×103拷贝数/μL；6：1.0×102拷贝数/μL；7：1.0×101拷贝数/μL。
图2为Taqman探针荧光定量RT-PCR方法检测禽肺炎病毒的特异性曲线。其中，1：禽肺炎病毒APV/MN；2：鸡新城疫病毒（Lasota）；3：H9亚型禽流感病毒；4：鸡传染性支气管炎病毒（Mass41）；5：禽脑脊髓炎病毒（AE Van）；6：禽呼肠孤病毒（Reo S1133）；7：鸡马立克氏病（MDV）疫苗毒；8：鸡传染性喉气管炎病毒（北京株）；9：鸡毒霉形体（MG）；10：禽大肠杆菌（E.coli O2）；11：dH2O。
图3为Taqman探针荧光定量RT-PCR方法检测禽肺炎病毒的灵敏度检测结果。其中，1：1.0×107拷贝数/μL；2：1.0×106拷贝数/μL；3：1.0×105拷贝数/μL；4：1.0×104拷贝数/μL；5：1.0×103拷贝数/μL；6：1.0×102拷贝数/μL；7：1.0×101拷贝数/μL；8：1.0×100拷贝数/μL；9：空白对照（以等量RNase Free dH2O代替模板）。
图4为重复性曲线结果。其中，1和2：1.0×104拷贝数/μL；3和4：1.0×102拷贝数/μL；5：空白对照（以等量RNase Free dH2O代替模板）。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中所用一些材料和试剂如下：
Lightcycler2.0荧光定量PCR仪（Roche公司产品）。DNA片断回收试剂盒和质粒小量提取试剂盒购自BioDev公司；One Step PrimeScript RT-PCR Kit、pMD18-T试剂盒购自大连宝生物工程（TaKaRa）公司；TIANamp病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒购自天根生化科技有限公司。
禽肺炎病毒APV/MN株：记载于“谢志勤等，环介导等温可视扩增（LAMP）检测禽肺炎病毒方法的建立.中国动物检疫，2013，30（3）：48-51”一文，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得；
鸡新城疫病毒（Lasota）：记载于“谢芝勋等，新城疫植物油乳剂苗的研究.中国预防兽医学报，2000，(04)：23-27”一文，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得；
H9亚型禽流感病毒：记载在“多重反转录聚合酶链反应快速检测鉴别H9亚型禽流感病毒方法的建立.中国人兽共患病学报，2006，(09)：858-860”一文，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得；
禽脑脊髓炎病毒（AE Van）、鸡传染性支气管炎病毒（Mass41）、鸡传染性喉气管炎病毒（北京株）、鸡毒霉形体（MG）均由本室保存；其中，禽脑脊髓炎病毒（AE Van）记载于“张二芹，赵心力，赵振华等.禽脑脊髓炎病毒Van Roekel株衣壳蛋白基因原核表达及其ELISA检测研究.动物医学进展，2005年第01期”一文，见文中“禽脑脊髓炎病毒Van Roekel株”；鸡传染性支气管炎病毒（Mass41）记载于“李秉鸿.重组IBV Mass41株S1基因的禽痘疫苗.畜牧兽医科技信息，2003年第04期”一文，见文中“IBV Mass41”；鸡传染性喉气管炎病毒（北京株）记载于“袁克湖，张曼夫.传染性喉气管炎病毒北京株胸苷激酶基因的克隆和序列分析.农业生物技术学报，2002年04期”一文，见文中“传染性喉气管炎病毒北京株”；鸡毒霉形体（MG）记载于“何士军，黄烨，唐顺发.鸡毒霉形体病(MG)免疫防治对策.2005年23期”一文，见文中“鸡毒霉形体病(MG)”；
禽呼肠孤病毒（Reo S1133）、禽大肠杆菌（E.coli O2）：记载于“Zhiqin Xie（谢志勤）等，Reverse transcriptase polymerase chain reaction to detect avian Encephalomyelitis virus.Avian Disease(美国禽病杂志)，2005,49:227-230”和“谢志勤等，应用二温式多重PCR技术鉴别鸡传染性支气管炎病毒和鸡传染性喉气管炎病毒.广西科学，2001,8（2）：152-153”中，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得；
鸡马立克氏病（MDV）疫苗毒购自南京梅里亚动物保健品公司。
实施例1、引物的设计与合成
根据GenBank中禽肺炎病毒F基因（GenBank：AF187154，序列表中序列4）的保守序列，采用Primer Express3.0软件，设计一对特异性引物和一条Taqmam探针（表 1）。
表1引物和的寡核苷酸序列
实施例2、Taqman探针荧光定量RT-PCR检测
一、Taqman探针荧光定量RT-PCR检测方法的确定
1、待测样本的制备
参照TIANamp病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒说明书，提取禽肺炎病毒APV/MN、鸡新城疫病毒（Lasota）、H9亚型禽流感病毒、鸡传染性支气管炎病毒（Mass41）、禽脑脊髓炎病毒（AE Van）、禽呼肠孤病毒（Reo S1133）的RNA；提取鸡传染性喉气管炎病毒（北京株）、鸡马立克氏病（MDV）疫苗毒、鸡毒霉形体（MG）、禽巴氏杆菌（C48-1）和禽大肠杆菌（E.coli O2）的DNA。
2、标准品的制备
以步骤1得到的禽肺炎病毒APV/MN的cDNA为模板进行PCR扩增，反应体系为50μL：2×Premix TaqTM mix25μL（大连宝生物工程有限公司Takara产品，产品目录号：RR003A，含10μM dNTPs，Mg2+，5U Taq酶），cDNA4μL，50pmol/μL的APV上、下游引物（表1中的APV1和APV2）各0.5μL，灭菌超纯水加至50μL。反应程序为94℃预变性5min，然后进入94℃1min，55℃1min，72℃1min，共进行35个循环；72℃延伸10min，最后停止于4℃。
PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳，回收目的片断后克隆至pMD18-T载体，重组质粒送大连宝生生物技术有限公司进行测序。将测序结果表明含有序列表中序列4的第753-849位核苷酸的重组质粒为阳性，将其命名为pMD18-APV。
将pMD18-APV质粒作为阳性标准品，按照文献“Vaitomaa,J.,Rantala A.,Halinen K.,Rouhiainen L.,Tallberg P.,Mokelke L.&Sivonen K.(2003)Quantitative Real-Time PCR for Determination of Microcystin Synthetase E Copy Numbers for Microcystis and Anabaena in Lakes.Applied and Environmental Microbiology.69:7289-7297.”计算拷贝数，结果拷贝数为2.4×1010拷贝/μl。
3、标准曲线的确定
荧光定量PCR标准曲线的确定，对质粒pMD-APV DNA进行定量，然后按10倍 进行稀释至100-107拷贝数/μL，将稀释的拷贝数作为模板进行Taqman探针荧光定量PCR扩增，建立标准曲线。扩增反应体系为20μL，Premix Ex Taq（Probe qPCR，大连宝生物工程有限公司Takara产品，产品号RR390A，内含5U/μL Takara Ex Taq HS，10mM dNTP Mixture，25mM Mg2+）10μL，质粒pMD-APV DNA1μL（约20μg），浓度为10μmol/μL的APV上游引物和下游引物（表1中的APV1和APV2）各0.4μL，浓度为10μmol/μL的APV Taqman探针（表1中的APV Probe）0.2μL，RNase Free dH2O补足20μL。同时设置空白对照（以等量RNase Free dH2O代替模板）。然后进行标准曲线的扩增，扩增的程序为95℃15s，然后95℃20s、60℃20s进行40个循环后，以45℃20s结束。
标准曲线如图1所示，从图中可以看出，各点在一直线上，即表明标准曲线好。
4、Taqman探针荧光定量RT-PCR的反应体系中引物和探针浓度的确立
1）一步反应法
反应体系：2×One step RT-PCR bufferⅢ（大连宝生物工程有限公司Takara产品，产品目录号：RR064A，内含10mM dNTP Mixture，25mM Mg2+）10μL；Takara Ex Taq HS（大连宝生物工程有限公司Takara产品，产品目录号：RR064A，5U/μL）0.5μL；PremeScript RT Enzyme MixⅡ（大连宝生物工程有限公司Takara产品，产品目录号：RR064A，内含反转录酶200U/μL，RNA酶抑制剂40U/μL）1μL；模板（病毒RNA或病毒DNA）2μL（约20μg）；浓度为10μmol/μL的APV上游引物和下游引物（表1中的APV1和APV2）各0.4μL，两引物在反应体系中的终浓度各为0.2μmol/μL；浓度为10μmol/μL的APV Taqman探针（表1中的APV Probe）0.2μL，探针在反应体系中的终浓度为0.1μmol/μL；灭菌DEPC水补足20μL。
在上述反应体系中，dNTPs、Mg2+、DNA聚合酶、反转录酶和RNA酶抑制剂的配比具体为：0.1μmol：0.25μmol：2.5U：200U：40U。
将反应体系均匀混合，置Lightcycler荧光定量PCR仪上进行自动化扩增反应。
反应程序：42℃15min；95℃2min；然后按95℃变性15s、60℃退火延伸20s进行40个循环；最后于40℃10秒结束反应。其中，进行Taqman探针荧光定量RT-PCR反应的温度转换率为20℃/s，在每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测。
在530nm激发光下发荧光，用来检测禽肺炎病毒。
2）两步反应法
第一步：RNA的反转录
将步骤1所得禽肺炎病毒APV/MN RNA及其它病毒RNA反转录合成cDNA，具体如下：针对每种病毒均建立如下反转录体系，总反应体积为20μL，模板——禽肺炎病毒APV/MN RNA或其它病毒RNA2μL（约20μg），AMV反转录酶（5U/μL，大 连宝生物工程有限公司，产品目录号：D2620）0.5μL，RNA酶抑制剂（40U/μL，大连宝生物工程有限公司，产品目录号：D2313A）0.5μL，随机引物（50μmol/μL，大连宝生物工程有限公司Takara产品，产品目录号：D3802）1μL，10mM dNTPs Mix(大连宝生物工程有限公司，产品目录号：D4030RA)2μL，5×RT buffer（含25mM Mg2+，AMV反转录酶中有该buffer，大连宝生物工程有限公司，产品目录号：D2620）4μL，DEPC水补足20μL，瞬时离心，于25℃10min，42℃60min，95℃5min，4℃结束，得到各病毒的cDNA。
在上述反应体系中，dNTPs、Mg2+、反转录酶和RNA酶抑制剂的配比具体为：0.02μmol：0.1μmol：2.5U：20U。
第二步：Taqman探针荧光定量PCR扩增
反应体系（20μL）：Premix Ex Taq(probe qPCR)buffer（2×）(内含10mM dNTP Mixture，25mM Mg2+，5U/μL Takara Ex Taq HS，大连宝生物工程有限公司，产品目录号：RR390A)10μL；模板(第一步反转录所得的cDNA或步骤1得到的病毒DNA)2μL（约20μg）；浓度为10μmol/μL的APV上游引物和下游引物（表1中的APV1和APV2）各0.4μL，两引物在反应体系中的终浓度各为0.2μmol/μL；浓度为10μmol/μL的APV Taqman探针（表1中的APV Probe）0.2μL，探针在反应体系中的终浓度为0.1μmol/μL；灭菌DEPC水补足20μL。
在上述反应体系中，dNTPs、Mg2+和DNA聚合酶的配比具体为：0.01μmol：0.025μmol：5U。
Taqman探针荧光定量PCR反应的程序具体为：按95℃变性15s、60℃退火延伸20s进行40个循环；最后于40℃10秒结束反应。其中，进行Taqman探针荧光定量RT-PCR反应的温度转换率为20℃/s，在每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测。
FAM在530nm激发光下发荧光，用来检测禽肺炎病毒。
二、Taqman探针荧光定量RT-PCR的特异性试验
按照上述步骤一4中2）两步反应法建立的Taqman探针荧光定量RT-PCR方法进行特异性试验，参试的毒株模板为禽肺炎病毒APV/MN RNA以及对照的鸡新城疫病毒（Lasota）RNA、H9亚型禽流感病毒RNA、鸡传染性支气管炎病毒（Mass41）RNA、鸡传染性喉气管炎病毒（北京株）DNA、禽脑脊髓炎病毒（AE Van）RNA、禽呼肠孤病毒（Reo S1133）RNA、鸡马立克氏病（MDV）疫苗毒DNA、鸡毒霉形体（MG）DNA、禽大肠杆菌（E.coli O2）DNA，以H2O作为阴性对照。
在530nm激发光下检测禽肺炎病毒的特异性的结果，如图2所示，1：禽肺炎病毒APV/MN；2：鸡新城疫病毒（Lasota）；3：H9亚型禽流感病毒；4：鸡传染性支气管炎病毒（Mass41）；5：禽脑脊髓炎病毒（AE Van）；6：禽呼肠孤病毒（Reo S1133）； 7：鸡马立克氏病（MDV）疫苗毒；8：鸡传染性喉气管炎病毒（北京株）；9：鸡毒霉形体（MG）；10：禽大肠杆菌（E.coli O2）；11：dH2O。从图中可以看出，1有相应病毒的特异性荧光曲线，而2-11均没有特异性荧光曲线，证实所设计的引物和探针扩增禽肺炎病毒特异性好，与其它检测毒株无交叉反应。因此，步骤一用APV上游引物和下游引物（表1中的APV1和APV2）和APV Taqman探针（表1中的APV Probe）建立的Taqman探针荧光定量RT-PCR检测方法可用于鉴定未知样本是否有禽肺炎病毒核酸的存在。
说明，Taqman探针荧光定量RT-PCR反应结果的判断如下：
若在530nm激发光下（FAM），反应结果为一条直线，则为阴性；反应结果为S型曲线，则为阳性；
结果在530nm激发光下（FAM），禽肺炎病毒样品的反应出现S型曲线，其它参试对照样品为一条直线，判定本方法特异性好。
三、Taqman探针荧光定量RT-PCR的灵敏度试验
以10倍系列稀释上述步骤一2中制备的pMD-APV质粒，得到拷贝数为1×107-1×100拷贝/μL的系列稀释液，将含有不同的质粒拷贝数的稀释液作为模板（同时设置以等量RNase Free dH2O代替模板的空白对照）进行Taqman探针荧光定量RT-PCR扩增和常规PCR扩增。其中，Taqman探针荧光定量RT-PCR采用上述步骤一4中2）两步反应法得到的优化后反应体系和反应程序；常规PCR的反应体系和反应程序如下：反应体系为50μL，其中，2×Premix TaqTM mix25μL（大连宝生物工程有限公司Takara产品，产品目录号：RR003A，含10μM dNTPs，Mg2+，5U Taq酶），pMD-APV质粒4μL，50pmol/μL的APV上、下游引物（表1中的APV1和APV2）各0.5μL，灭菌超纯水加至50μL。反应程序为94℃预变性5min，然后进入94℃1min，55℃1min，72℃1min，共进行35个循环；72℃延伸10min，最后停止于4℃。
Taqman探针荧光定量RT-PCR检测，在530nm激发光下的结果，如图3所示，1：1.0×107拷贝数/μL；2：1.0×106拷贝数/μL；3：1.0×105拷贝数/μL；4：1.0×104拷贝数/μL；5：1.0×103拷贝数/μL；6：1.0×102拷贝数/μL；7：1.0×101拷贝数/μL；8：1.0×100拷贝数/μL；9：空白对照（以等量RNase Free dH2O代替模板）。从图中的荧光曲线可见，对禽肺炎病毒的检测10拷贝仍有荧光曲线，表明Taqman探针荧光定量RT-PCR检测方法对禽肺炎病毒的灵敏度为10拷贝，比常规PCR方法（检测限仅为1000拷贝）的灵敏度高100倍。另外，本发明的发明人进行了三次重复检测，重复检测的结果一致。
四、Taqman探针荧光定量RT-PCR的重复性试验
按照上述步骤一4中2）两步反应法建立的Taqman探针荧光定量RT-PCR方法， 选取两个不同浓度的上述步骤一2中制备的pMD-APV质粒DNA作为模板，每个模板浓度做两个重复，通过计算Ct值的标准差（S）和变异系数（CV）来验证荧光定量RT-PCR的批内重复性；另选取一个浓度的pMD-APV质粒DNA作为模板，进行荧光PCR扩增，间隔7d重复一次，共进行3次重复，然后计算Ct值的变异系数（CV），验证荧光定量RT-PCR的批间重复性。
选取1.0×104拷贝/μL和1.0×102拷贝/μL二个浓度的pMD-APV质粒作重复试验，其所得的Ct值分别为14.85、14.92和21.27、21.56，其Ct值变异系数均小于5%；选取1.0×104/μL的pMD-APV质粒，每间隔7天共三次进行荧光PCR测定，其Ct值的变异系数也小于5%。其重复性好。重复性试验如图4所示。其中1和2：1.0×104拷贝数/μL；3和4：1.0×102拷贝数/μL；5：空白对照（以等量RNase Free dH2O代替模板）。
实施例3、临床病料的检测
待测样本为广西不同地区鸡场收集的肿头且有呼吸道症状的病鸡肺和气管共54份（编号为C1-C54），分别提取这些病料的总RNA。
以提取的54份病料的总RNA分别作为模板，按照实施例2中步骤一4中2）两步反应法建立的Taqman探针荧光定量RT-PCR方法进行检测。
若在530nm激发光下（FAM）的反应结果为S型曲线，则待测样本中含有禽肺炎病毒；若反应结果为一条直线，则待测样本中不含有禽肺炎病毒。
检测结果如下：
经测定，在530nm激发光下，待检样本中出现S型曲线的样品有2份（编号为C1和C2），为一条直线的样品52份（编号为C3-C54），说明待测样品中有2份（编号为C1和C2）为禽肺炎病毒阳性，52份样品（编号为C3-C54）为禽肺炎病毒阴性，即不含有禽肺炎病毒。
本发明的发明人同时将以上54份（编号为C1-C54）病料分别提取总RNA后，通过反转录得到cDNA，对所得cDNA采用针对禽肺炎病毒基因组（序列4）进行序列测定的方法进一步证实本发明所提供的Taqman探针荧光定量RT-PCR检测方法的正确性。测序结果显示，待测样品中有2份（编号为C1和C2）为禽肺炎病毒阳性，52份样品（编号为C3-C54）为禽肺炎病毒阴性，与Taqman探针荧光定量RT-PCR检测方法结果完全一致。
Claims (15)
1.用于检测禽肺炎病毒的组合物，由一个引物对和一个探针组成的组合物；所述引物对由引物1和引物2组成，所述引物1为序列表中序列1所示的单链DNA，所述引物2为序列表中序列2所示的单链DNA；所述探针的序列为序列表中序列3。
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于：所述探针的5’端标记有报告荧光染料A，3’端标记有淬灭荧光染料B。
3.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于：所述报告荧光染料A为FAM；所述淬灭荧光染料B为Eclipse。
4.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于：所述引物1、所述引物2和所述探针的摩尔比为1：1：1。
5.用于检测禽肺炎病毒的探针，其特征在于：所述探针的序列为序列表中序列3。
6.根据权利要求5所述的探针，其特征在于：所述探针的5’端标记有报告荧光染料A，3’端标记有淬灭荧光染料B。
7.根据权利要求6所述的探针，其特征在于：所述报告荧光染料A为FAM；所述淬灭荧光染料B为Eclipse。
8.用于检测禽肺炎病毒的试剂，由权利要求1-4中任一所述的组合物、Taqman探针荧光定量RT-PCR扩增缓冲液和水组成。
9.根据权利要求8所述的试剂，其特征在于：所述Taqman探针荧光定量RT-PCR扩增缓冲液，包括dNTPs、Mg2+、DNA聚合酶、反转录酶和RNA酶抑制剂。
10.根据权利要求9所述的试剂，其特征在于：所述Taqman探针荧光定量RT-PCR扩增缓冲液为如下缓冲液A或缓冲液B：
所述缓冲液A中，所述dNTPs、所述Mg2+、所述DNA聚合酶、所述反转录酶和所述RNA酶抑制剂的配比为：0.1μmol：0.25μmol：2.5U：200U：40U；
所述缓冲液B，由反转录缓冲液和Taqman探针荧光PCR缓冲液组成；所述反转录缓冲液中含有配比为0.02μmol：0.1μmol：2.5U：20U的所述dNTPs、所述Mg2+、所述反转录酶和所述RNA酶抑制剂；所述Taqman探针荧光PCR缓冲液中含有配比为0.01μmol：0.025μmol：5U的所述dNTPs、所述Mg2+和所述DNA聚合酶。
11.用于检测禽肺炎病毒的试剂盒，含有下述a)和b)：
a)禽肺炎病毒阳性质粒；
b)权利要求1-4中任一所述的组合物，或权利要求8-10中任一所述的试剂。
12.根据权利要求11所述的试剂盒，其特征在于：所述禽肺炎病毒阳性质粒为含有序列表中序列4的第753-849位核苷酸的质粒。
13.根据权利要求12所述的试剂盒，其特征在于：所述禽肺炎病毒阳性质粒为将序列表中序列4的第753-849位核苷酸所示DNA片段与pMD18-T载体相连后得到的重组质粒。
14.如下c)或d)的应用：
c)权利要求1-3中任一所述的组合物或权利要求5-7中任一所述的探针，在制备权利要求8-10中任一所述的试剂或权利要求11-13中任一所述的试剂盒中的应用；
d)权利要求1-3中任一所述的组合物、或权利要求5-7中任一所述的探针、或权利要求8-10中任一所述的试剂、或权利要求11-13中任一所述的试剂盒，在制备检测或辅助检测待测样品中是否含有禽肺炎病毒的产品中的应用。
15.根据权利要求14所述的应用，其特征在于：d)所述应用中，所述检测或辅助检测待测样品中是否含有禽肺炎病毒为用权利要求1-3中任一所述的组合物、或权利要求5-7中任一所述的探针、或权利要求8-10中任一所述的试剂、或权利要求11-13中任一所述的试剂盒，对所述待测样品进行Taqman探针荧光定量RT-PCR反应；
所述进行Taqman探针荧光定量RT-PCR反应的退火温度为60℃-62℃。
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