CN104263858B - 鸡滑液囊支原体和禽呼肠孤病毒的二重荧光定量rt-pcr检测试剂盒及其引物组 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种鸡滑液囊支原体和禽呼肠孤病毒的二重荧光定量RT‑PCR检测试剂盒，包括引物组和探针组；引物组有引物1至4，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1和2、SEQ.ID.No.4和5的碱基序列；探针组有探针A和探针B，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.3和6的碱基序列。实验证明，本发明具有检测时间短、检测敏感性高且特异性强的优点，可实现同时检测和鉴别鸡滑液囊支原体和禽呼肠孤病毒两种病原体，并对其相应病原含量进行定量，因而可用于鸡滑液囊支原体和禽呼肠孤病毒疫苗和药物疗效的评估，以及其致病机理等方面的研究，因此本发明对鸡滑液囊支原体和禽呼肠孤病毒的防治有重要意义。

Description

鸡滑液囊支原体和禽呼肠孤病毒的二重荧光定量RT-PCR检测 试剂盒及其引物组
技术领域
本发明属于RT-PCR检测技术领域，尤其涉及一种鸡滑液囊支原体和禽呼肠孤病毒的二重荧光定量RT-PCR检测试剂盒及其引物组。
背景技术
鸡滑液囊支原体(Mycoplasma synoviae，MS)和禽呼肠孤病毒(Avian reovirus，ARV)是禽类重要的病原体之一，可以引起多种综合症，给养鸡业造成巨大的经济损失。鸡滑液囊支原体主要引起鸡、鸭、鹅、鹌鹑、鸽等的一种以关节渗出性的滑液囊膜炎及腱鞘滑膜炎为特征的急性或慢性传染性疾病，在鸡群中普遍存在，主要侵害商品肉鸡、蛋鸡或种鸡。禽呼肠孤病毒是呼肠孤病毒科的RNA病毒，主要危害鸡和火鸡，可引起肠道疾病、慢性呼吸疾病、心肌炎、关节炎/矮小综合症、营养不良综合症等。鸡滑液囊支原体和禽呼肠孤病毒的混合感染在全球鸡群中普遍存在，并且导致鸡只出现严重的免疫抑制、抑郁、生长发育迟缓，降低产蛋量、蛋品质以及孵化率和饲料转化率，降低屠宰时胴体质量，使屠体废弃率升高等。鉴别、控制和清除这些病原体依赖于准确和及时对感染群做出诊断。高度敏感、准确、快速有效的诊断方法对于这些禽病在鸡群中的有效监测和防控是必须的。因此，迫切需要建立一种快速敏感的鸡滑液囊支原体和禽呼肠孤病毒的检测技术，尤其在感染早期若能检测出这些病原体，将为这些疾病的有效防控争取宝贵时间。目前，这两种病原体的传统检测方法有病原培养分离、血清学监测等，但这些检测存在耗时长、敏感性较低、不易标准化等缺点，在实际应用中具有一定的局限性。
荧光定量PCR技术实现了对模板的定量，而且具有敏感、特异、准确可靠、能实现多重反应和实时性好等特点。在实际应用中，当样品量非常大时，单重荧光PCR在成本和时间方面就存在一定的劣势，迫切需要一种高通量、低成本、高效率的方法来进行批量的快速检测。多重荧光PCR采用多对引物扩增检测多个模板，克服了单重荧光PCR的不足。但是，建立一个多重荧光PCR方法比单重的要复杂得多，其对试剂和引物的要求更高，同时需要保证不同探针所标记的荧光基团间无相互干扰，使用的荧光定量PCR仪具有相应的多个检测通道。目前，还未见有应用多重荧光定量PCR技术对鸡滑液囊支原体和禽呼肠孤病毒进行检测和诊断的报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种检测时间短、灵敏度高和特异性强的鸡滑液囊支 原体和禽呼肠孤病毒的二重荧光定量RT-PCR检测试剂盒及其引物组，以实现同时检测并定量鸡滑液囊支原体和禽呼肠孤病毒两种病原体。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：鸡滑液囊支原体和禽呼肠孤病毒的二重荧光定量RT-PCR检测引物组，包括两对特异性引物，分别是引物1和2、引物3和4，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1和2、SEQ.ID.No.4和5的碱基序列。
鸡滑液囊支原体和禽呼肠孤病毒的二重荧光定量RT-PCR检测试剂盒，包括引物组和探针组；引物组有引物1至4，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1和2、SEQ.ID.No.4和5的碱基序列；探针组有探针A和探针B，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.3和6的碱基序列。
探针A的5’端标记有报告荧光染料ROX，3’端标记有淬灭荧光染料Eclipse；探针B的5’端标记有报告荧光染料FAM，3’端标记有淬灭荧光染料Eclipse。
引物1、引物2、探针A、引物3、引物4和探针B的摩尔比为1：1：1：1：1：1。
该试剂盒含有以下试剂：
A液：PCR扩增缓冲液、引物1、引物2、探针A、引物3、引物4、探针B；
B液：MS+ARV模板，作为阳性对照；
C液：灭菌蒸馏水，作为阴性对照。
A液中引物1、引物2、探针A终浓度均为0.3μM，引物3、引物4、探针B终浓度均为0.3μM。
针对目前缺乏对鸡滑液囊支原体和禽呼肠孤病毒同时进行检测和诊断的有效可靠的技术，发明人研究筛选了两套特异性的探针和引物，并通过进行不同浓度的配比，获得最佳引物和探针的浓度组合，据此建立了鸡滑液囊支原体和禽呼肠孤病毒的二重荧光定量RT-PCR的检测方法，并制备了相应的检测试剂盒。实验证明，本发明具有如下优点：
本发明的实验证明，本发明的引物和方法具有如下优点：
1)检测时间短
应用本发明可实现一管二检的目的，并且反转录和PCR一步完成，仅需约30分钟，并且反应结果可以直接通过电脑观察，而常规的RT-PCR方法起码需要3.5小时来完成扩增反应，然后还得花2小时进行凝胶电泳来观察结果；
2)检测敏感性高且特异性强
当鸡滑液囊支原体和禽呼肠孤病毒同时存在时，本发明对其检测的CT值与单个病毒检测的CT值比较，结果基本一样，并未影响对鸡滑液囊支原体和禽呼肠孤病毒的检出及检出的敏感性。另外，利用本发明还可对样品中相应病原含量进行定量，并且检测敏感性非常高，均能检测到10个拷贝的鸡滑液囊支原体和禽呼肠孤病毒，比常规PCR方法敏感性高100倍，因而可用于鸡滑液囊支原体和禽呼肠孤病毒疫苗和药物疗效的评估，以及其致病机理等方面的研究。因此，本发明对鸡滑液囊支原体和禽呼肠孤病毒的防治有重要意义。
附图说明
图1是荧光定量RT-PCR检测鸡滑液囊支原体的敏感性(ROX通道)结果图，图中：1～8分别为1×108～1×101拷贝/μl，9空白对照(为灭菌蒸馏水)。
图2是荧光定量RT-PCR检测鸡滑液囊支原体的敏感性(ROX通道)的标准曲线。
图3是荧光定量RT-PCR检测禽呼肠孤病毒的敏感性(FAM通道)结果图，图中：1～8分别为1×108～1×101拷贝/μl，9空白对照(为灭菌蒸馏水)。
图4是荧光定量RT-PCR检测禽呼肠孤病毒的敏感性(FAM通道)的标准曲线。
图5是荧光定量RT-PCR检测鸡滑液囊支原体的特异性(ROX通道)结果图，图中：1鸡滑液囊支原体+禽呼肠孤病毒，2 鸡滑液囊支原体，3 禽呼肠孤病毒，4 传染性支气管炎病毒，5 鸡传染性喉支气管炎病毒，6 新城疫病毒，7 H9亚型禽流感病毒，8 鸡毒支原体S6株，9 鸡毒支原体K-2221株，10 鸡依阿华支原体，11 火鸡支原体，12 dH2O。
图6是荧光定量RT-PCR检测禽呼肠孤病毒的特异性(FAM通道)结果图，图中：1 鸡滑液囊支原体+禽呼肠孤病毒，2 鸡滑液囊支原体，3 禽呼肠孤病毒，4 传染性支气管炎病毒，5 鸡传染性喉支气管炎病毒，6 新城疫病毒，7 H9亚型禽流感病毒，8 鸡毒支原体S6株，9 鸡毒支原体K-2221株，10 鸡依阿华支原体，11 火鸡支原体，12 dH2O。
图7是荧光定量RT-PCR检测鸡滑液囊支原体的批内重复性(ROX通道)结果图，图中：1-3分别为第一天、第四天和第七天；4.空白对照。
图8是荧光定量RT-PCR检测禽呼肠孤病毒的批内重复性(FAM通道)结果图，图中：1-3分别为第一天、第四天和第七天；4.空白对照。
具体实施方式
以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。具体所用材料和试剂如下：
Lightcycler2.0荧光定量PCR仪(Roche)；DNA片段回收试剂盒和质粒小量提取试剂盒均购自BioDev公司；pMD18-T试剂盒和Premix ExTaq(Probe qPCR)试剂盒均购自大连宝生物公司；M-MLV体外转录试剂盒和TRizol RNA提取试剂均购自Invitrogen公司。
禽呼肠孤病毒(简称为ARV)记载在“用反转录聚合酶链反应检测禽呼肠孤病毒的研究”，中国预防兽医学报，1999，21(5)：365-367，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得；
鸡滑液囊支原体(简称为MS)记载在“应用多重聚合酶链式反应检测鸡毒支原体、鸡滑液囊支原体和禽衣阿华支原体的研究”，畜牧与兽医,2000,32(5):4-6，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得；
鸡新城疫病毒记载在“用反转录聚合酶链反应检测禽呼肠孤病毒的研究”，中国预防兽医学报，1999，21(5)：365-367，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得；
传染性支气管炎病毒记载在“应用多重聚合酶链式反应检测鸡毒支原体、鸡滑液囊支原体和禽衣阿华支原体的研究”，畜牧与兽医,2000,32(5):4-6，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得；
鸡传染性喉气管炎病毒记载在“应用多重聚合酶链式反应检测鸡毒支原体、鸡滑液囊支原体和禽衣阿华支原体的研究”，畜牧与兽医,2000,32(5):4-6，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得；
H9亚型禽流感病毒记载在“多重反转录聚合酶链反应快速检测鉴别H9亚型禽流感病毒方法的建立”，中国人兽共患病学报,2006,(09):858-860，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得；
鸡毒支原体S6株记载在“应用多重聚合酶链式反应检测鸡毒支原体、鸡滑液囊支原体和禽衣阿华支原体的研究”，畜牧与兽医,2000,32(5):4-6，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得；
鸡毒支原体K-2221株记载在“应用多重聚合酶链式反应检测鸡毒支原体、鸡滑液囊支原体和禽衣阿华支原体的研究”，畜牧与兽医,2000,32(5):4-6，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得；
火鸡支原体记载在“应用多重聚合酶链式反应检测鸡毒支原体、鸡滑液囊支原体和禽衣阿华支原体的研究”，畜牧与兽医,2000,32(5):4-6，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得；
禽衣阿华支原体记载在“应用多重聚合酶链式反应检测鸡毒支原体、鸡滑液囊支原体和禽衣阿华支原体的研究”，畜牧与兽医,2000,32(5):4-6，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得。
实施例1、引物与Taqman探针的设计与合成
根据GenBank中鸡滑液囊支原体和禽呼肠孤病毒的保守序列，采用PrimerExpress 3.0软件，设计了多套探针和引物，通过分析其引物之间的二聚体，选定两对特异性引物和两条Taqmam探针(表1)。
表1 引物和TaqMan探针序列(5’-3’)
实施例2、荧光定量RT-PCR检测的建立
一、荧光定量RT-PCR检测方法的确定
1、样本的制备
1)、核酸的提取
参照TRizol RNA提取试剂盒说明书，提取禽呼肠孤病毒、新城疫病毒、传染性支气管炎病毒、鸡传染性喉支气管炎病毒、H9亚型禽流感的RNA，参照谢芝勋的方法(Detectionof Avian Adenovirus by Polymerase Chain Reaction[J].Avian Deseases,1999,43:98O1051)提取鸡滑液囊支原体、鸡毒支原体S6株、鸡毒支原体K-2221株、鸡依阿华支原体和火鸡支原体的DNA。
2)、RNA的反转录
禽呼肠孤病毒S1133 RNA反转录合成cDNA，具体如下：建立如下反转录体系，总反应体积为20μL，上述1)的禽呼肠孤病毒S1133 RNA为5μL(约2μg)，1μL 50μM Oligo(dT)20(Invitrogen公司，产品目录号：C28025-032)，1μL 10mM dNTP(四种碱基)(Invitrogen公司，产品目录号：C28025-032)，用灭菌蒸馏水加至总体积为12μL，65℃加热5min后，冰浴冷却，加入4μl 5x第一链合成缓冲液(Invitrogen公司，产品目录号：C28025-032)，2μL 0.1MDTT(Invitrogen公司，产品目录号：C28025-032)，1μL灭菌蒸馏水，混匀后，37℃下孵育2min，加入1μL M-MLV反转录酶(Invitrogen公司，产品目录号：C28025-032)，离心均匀，于37℃50min，70℃15min，4℃结 束，得到禽呼肠孤病毒S1133株的cDNA。
2、标准品的制备
分别以上述得到的禽呼肠孤病毒S1133的cDNA和鸡滑液囊支原体的DNA为模板进行PCR扩增，反应体系为25μL(含Premix Ex Taq 12.5μl(Takara公司，产品目录号：RR902A)，上、下游引物(10μM)各1μl，5μl cDNA或DNA模板，灭菌水5.5μl)，反应条件为：94℃预变性5min，94℃30s，60℃30s，72℃20s，35个循环，72℃延伸10min。
根据pMD18-T TA克隆试剂盒的操作说明，将PCR产物经TA克隆至pMD18-T载体，阳性克隆菌(pMD18-T-ARV和pMD18-T-MS)送华大公司进行测序，pMD18-T-ARV菌中含有的PCR产物大小为981bp，具有序列表中SEQ.ID.No.11的第1-981位核苷酸，说明为阳性克隆，含有ARV病毒；
pMD18-T-MS菌中含有的PCR产物大小为284bp，具有序列表中SEQ.ID.No.12的第1-284位核苷酸，说明为阳性克隆，含有鸡滑液囊支原体。
表2 试验所使用引物序列
分别提取pMD18-T-ARV菌和pMD18-T-MS菌中的质粒，得到pMD18-T–ARV质粒和pMD18-T–MS质粒。
将pMD18-T-ARV质粒和pMD18-T–MS质粒作为阳性标准品，按照文献(Vaitomaa,J.,Rantala A.,Halinen K.,Rouhiainen L.,Tallberg P.,Mokelke L.& Sivonen K.(2003)Quantitative Real-Time PCR for Determination of Microcystin Synthetase E CopyNumbers for Microcystis and Anabaena in Lakes.Applied and EnvironmentalMicrobiology.69:7289-7297.)计算拷贝数，结果分别为拷贝数为3.7×1010拷贝/μl和6.1×1010拷贝/μl。
3、荧光定量RT-PCR的反应体系中引物和探针浓度的确立
用pMD18-T-ARV质粒和pMD18-T-MS质粒(二者的拷贝比为1:1)作为模板，将表1中的引物和探针在终浓度为0.2-0.8μmol/L之间，进行不同浓度的配比进行荧光定量RT-PCR，选择引物和探针的最佳浓度。
扩增反应总体积为20μl，其中2×Premix Ex Taq(Probe qPCR)(大连宝生物工程有限公司，产品目录号：RR390A)10μl；2μl模板，终浓度均为0.2-0.8μmol/L的ARV F、ARV R和ARV P；终浓度均为0.2-0.8μmol/L的MS F、MS R和MS P；余下用灭菌蒸馏水补足，均匀混合，置Lightcycler荧光定量PCR仪上进行自动化扩增反应。温度转换率为20℃/s，在每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测。反应程序为95℃10s；然后按95℃变性10s、60℃退火延伸30s进行45个循环；最后于40℃5s结束反应。
结果显示，不同的引物和探针终浓度对试验结果影响比较大，鸡滑液囊支原体上、下游引物及探针终浓度分别为0.3μmol/L，禽呼肠孤病毒上、下游引物及探针终浓度分别为0.3μmol/L，对标准品的检测可获得较小的Ct值。
因此，优化的荧光定量RT-PCR的反应体系如下：扩增反应总体积为20μl，其中2×Premix Ex Taq(Probe qPCR)(大连宝生物工程有限公司，产品目录号：RR390A)10μl；2μl模板，终浓度均为0.3μM的MS F、MS R和MS P；终浓度均为0.3μM的ARV F、ARV R和ARV P；余下用灭菌DEPC水补足，均匀混合，置Lightcycler荧光定量PCR仪上进行自动化扩增反应。温度转换率为20℃/s，在每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测。反应程序为：95℃10s；然后按95℃变性10s、60℃退火延伸30s进行45个循环；最后于40℃5s结束反应。
FAM在530nm激发光下发荧光，用来检测禽呼肠孤病毒；ROX在610nm激发光下发荧光，用来检测鸡滑液囊支原体。
二、荧光定量RT-PCR的敏感性试验
分别以10倍系列稀释的pMD18-T-ARV(禽呼肠孤病毒)和pMD18-T-MS质粒(鸡滑液囊支原体)，得到拷贝数均为1×108-1×101拷贝/μl的pMD18-T-ARV和pMD18-T-MS质粒，再将各种拷贝数的pMD18-T-ARV和pMD18-T-MS质粒混合作为模板进行二重荧光定量PCR扩增，扩增体系和条件如一、3中优化的荧光定量RT-PCR的反应体系和反应程序。
在610nm激发光下的结果(ROX)如图1和2所示；在530nm激发光下的结果(FAM) 如图3和4所示。从荧光曲线可见，对鸡滑液囊支原体和禽呼肠孤病毒的检测10拷贝仍有荧光曲线，表明该检测方法对鸡滑液囊支原体和禽呼肠孤病毒的灵敏度均为10拷贝，比常规PCR方法敏感性高100倍，重复检测的结果一致。从标准曲线可见扩增成线性，说明所建立的方法具有很好的扩增效率。
三、荧光定量RT-PCR的特异性试验及干扰性试验
1、荧光定量RT-PCR的特异性试验
按照上述一、3中优化的荧光定量RT-PCR的反应体系和反应程序进行荧光定量RT-PCR，不同的是模板分别为鸡滑液囊支原体pMD18-T-MS、鸡滑液囊支原体pMD18-T-MS+禽呼肠孤病毒pMD18-T-ARV、禽呼肠孤病毒pMD18-T-ARV、鸡毒支原体S6株DNA、鸡毒支原体K-2221株DNA、鸡依阿华支原体DNA和火鸡支原体DNA、新城疫病毒cDNA、传染性支气管炎病毒cDNA、鸡传染性喉支气管炎病毒cDNA、H9亚型禽流感病毒cDNA，以dH2O作为阴性对照。
在610nm激发光下检测鸡滑液囊支原体的特异性，结果(ROX)如图5所示，可见，样品1和2有PCR产物，得到相应病毒的特异性荧光曲线，而样品3-12均没有特异性荧光曲线，证实所设计的引物探针具有特异性，该方法特异性强，与其它检测对象无交叉反应。
在530nm激发光下检测禽呼肠孤病毒的特异性，结果(FAM)如图6所示，可见，样品1和3有PCR产物，得到相应病毒的特异性荧光曲线，而样品2、4-12均没有特异性荧光曲线，证实所设计的引物探针具有特异性，该方法特异性强，与其它检测对象无交叉反应。
应用建立的二重荧光定量PCR，进行检测以确定两种模板存在时是否对检测的Ct值产生影响，图5中鸡滑液囊支原体pMD18-T-MS、鸡滑液囊支原体pMD18-T-MS+禽呼肠孤病毒pMD18-T-ARV混合样本(2)检测的CT值分别为13.78和13.53；图6中，呼肠孤病毒pMD18-T-ARV(3)、鸡滑液囊支原体pMD18-T-MS+禽呼肠孤病毒pMD18-T-ARV混合样本(2)检测的CT值分别为13.35和13.51。结果说明，样品中存在两种病毒与存在单种病毒，检测的CT值变异非常小，并未影响对鸡滑液囊支原体和禽呼肠孤病毒的检出及检出的敏感性。因此，本发明的引物、探针及其建立的二重荧光定量RT-PCR检测方法可应用于鉴定未知样本是否感染鸡滑液囊支原体和禽呼肠孤病毒，二重荧光PCR反应结果的判断如下：
反应结果为一条直线，则为阴性；反应结果为S型曲线，则为阳性；
若在610nm激发光下(ROX)的反应结果为S型曲线，则待测样本中含鸡滑液囊支原体；反之，则样品中不含有含鸡滑液囊支原体；若在530nm激发光下(FAM)的反应结果为S型曲线，则待测样本中含有禽呼肠孤病毒；反之，则样品中不含有禽呼肠孤病毒；
若在610nm激发光下(ROX)和530nm激发光下(FAM)的反应结果均为S型曲线，则样品中含有含鸡滑液囊支原体和禽呼肠孤病毒；若在610nm激发光下(ROX)和530nm激发光下(FAM)的反应结果均不为S型曲线，则样品中均不含有鸡滑液囊支原体和禽呼肠孤病毒。
四、重复性试验
按照上述一、3中优化的荧光定量RT-PCR的反应体系和反应程序进行荧光定量RT-PCR，不同的是模板为拷贝数均为1×108拷贝/μl的鸡滑液囊支原体pMD18-T-MS+禽呼肠孤病毒pMD18-T-ARV混合的阳性样品。分为3个标本同时检测。通过计算Ct值的标准差(S)和变异系数(CV)来验证荧光定量RT-PCR的批内重复性。三天后重复检测保存于-20℃的模板，来验证模板的稳定性及荧光定量RT-PCR的批间重复性。
检测结果如图7-8和表3所示，图7为在610nm激发光(ROX)下检测鸡滑液囊支原体pMD18-T-MS通道，图8为在530nm激发光(FAM)下禽呼肠孤病毒pMD18-T-ARV通道，可见，变异系数均小于3％(表3)。结果说明此方法具有良好的准确性和重复性。
表3 批间重复性
实施例3、检测试剂盒的组装
根据实施例1和2的研究结果，组装检测试剂盒以方便使用。
A液：PCR扩增缓冲液、引物1、引物2、探针A、引物3、引物4、探针B；其中，PCR扩增缓冲液包括2×Premix Ex Taq(Probe qPCR)(大连宝生物工程有限公司，产品目录号：RR390A)；引物1、引物2、探针A终浓度均为0.3μM，引物3、引物4、探针B终浓度均为0.3μM；
B液：MS+ARV模板，作为阳性对照；
C液：灭菌蒸馏水，作为阴性对照。
实施例4、临床病料的检测
待测样本为广西地区鸡群收集的120份病料(编号为1-120)，分别提取鸡病料(病鸡的跗关节腔内的关节液及其内容物、病鸡的脾脏或病鸡的肺脏)的RNA和DNA。分别将编号为1-120各个样本的DNA和RNA混合(体积比为1:1)作为模板，按照实施例2一、3中优化的荧光定量RT-PCR的反应体系和反应程序进行荧光定量RT-PCR。
参照上述判断标准评价检测结果如下：
检出鸡滑液囊支原体5份(阳性率为4.16％，编号为12-16)，检出禽呼肠孤病毒11份(阳性率为9.16％，编号为1-11)，其他样本均未检出鸡滑液囊支原体和禽呼肠孤病毒。
同时，将120份病料(编号为1-120)分别参照文献[1](邓显文,谢芝勋,谢志勤,廖敏,庞耀珊,刘加波,唐小飞,何竞铭；应用多重聚合酶链反应检测四种霉形体的研究[J].中国兽医科技,2003,33(6):14-17.)和文献[2](童桂香,谢芝勋,黄琦,文艳玲,谢丽基,庞耀珊,刘加波,邓显文；禽呼肠孤病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立[J].中国兽医科学,2007,37(09):767-771.)中的方法进行鸡滑液囊支原体和禽呼肠孤病毒检测，结果与本发明一致，说明本发明的方法正确。
上述结果说明广西地区的鸡群存在鸡滑液囊支原体的感染，并且禽呼肠孤病毒的感染普遍存在，该二重荧光定量RT-PCR方法的建立，对广西地区鸡群的疫病控制有指导意义。

Claims (6)

1.鸡滑液囊支原体和禽呼肠孤病毒的二重荧光定量RT-PCR检测引物组，其特征在于包括两对特异性引物，分别是引物1和2、引物3和4，它们分别为序列表SEQ.ID.No.1和2、SEQ.ID.No.4和5的碱基序列。
2.一种鸡滑液囊支原体和禽呼肠孤病毒的二重荧光定量RT-PCR检测试剂盒，其特征在于包括引物组和探针组；引物组有引物1至4，它们分别为序列表SEQ.ID.No.1和2、SEQ.ID.No.4和5的碱基序列；探针组有探针A和探针B，它们分别为序列表SEQ.ID.No.3和6的碱基序列。
3.根据权利要求2所述的鸡滑液囊支原体和禽呼肠孤病毒的二重荧光定量RT-PCR检测试剂盒，其特征在于：所述探针A的5’端标记有报告荧光染料ROX，3’端标记有淬灭荧光染料Eclipse；所述探针B的5’端标记有报告荧光染料FAM，3’端标记有淬灭荧光染料Eclipse。
4.根据权利要求2所述的鸡滑液囊支原体和禽呼肠孤病毒的二重荧光定量RT-PCR检测试剂盒，其特征在于：所述引物1、引物2、探针A、引物3、引物4和探针B的摩尔比为1：1：1：1：1：1。
5.根据权利要求4所述的鸡滑液囊支原体和禽呼肠孤病毒的二重荧光定量RT-PCR检测试剂盒，其特征在于该试剂盒含有以下试剂：
A液：PCR扩增缓冲液、引物1、引物2、探针A、引物3、引物4、探针B；
B液：MS+ARV模板，作为阳性对照；
C液：灭菌蒸馏水，作为阴性对照。
6.根据权利要求5所述的鸡滑液囊支原体和禽呼肠孤病毒的二重荧光定量RT-PCR检测试剂盒，其特征在于：所述A液中引物1、引物2、探针A终浓度均为0.3μM，引物3、引物4、探针B终浓度均为0.3μM。
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