CN101671747B

CN101671747B - 用于检测禽流感h5n1和新城疫病毒的引物及其检测方法和试剂盒

Info

Publication number: CN101671747B
Application number: CN 200910193196
Authority: CN
Inventors: 曹永长; 薛春宜; 张芸
Original assignee: National Sun Yat Sen University
Current assignee: Sun Yat Sen University; National Sun Yat Sen University
Priority date: 2009-10-21
Filing date: 2009-10-21
Publication date: 2013-03-20
Anticipated expiration: 2029-10-21
Also published as: CN101671747A

Abstract

本发明提供了用于检测禽流感H5N1和新城疫病毒的引物，该引物包括所述禽流感H5N1的HA基因中的序列或其互补序列以及所述新城疫病毒的F基因中的序列或其互补序列，如SEQ ID NO：1～8所示的寡核苷酸或其互补链。本发明还提供了检测禽流感H5N1和新城疫病毒的方法和试剂盒，利用上述引物，通过多重环介导的等温扩增方法对禽流感H5N1和新城疫病毒的核苷酸序列进行扩增。本发明的引物特异性强、灵敏度高；本发明的检测NDV和H5N1的m-LAMP方法及其试剂盒新型有效，可检测多个病毒的混合样品，不需变温扩增仪器，适合在条件简陋的实验室以及发展中国家得到进一步推广。

Description

用于检测禽流感H5N1和新城疫病毒的引物及其检测方法和试剂盒

技术领域

本发明涉及病毒检测技术领域，特别涉及用于检测禽流感H5N1和新城疫病毒的引物及其检测方法和试剂盒。

背景技术

新城疫病毒(Newcastle Disease Virus，NDV)是可引起禽类的一种以呼吸道、消化道粘膜出血为典型症状的急性传染病。新城疫病毒属于副粘病毒科、副粘病毒亚科、腮腺炎病毒属。禽副粘病毒共有9个血清型，即PMV-1至PMV-9，其中新城疫病毒(NDV)是禽副粘病毒1型(APMV-1)的主要成员。试验表明，有250多种鸟类可被NDV感染，其危害和引发的后果极其严重。1999年农业部发布的动物疫病目录中将其列为I类疫病，世界动物卫生组织(OIE)将其列为A类疫病。高致病性禽流感甲型流感病毒H5N1亚型(Highly pathogenic avianinfluenza virus of type A of subtype H5N1)是由正粘病毒科流感病毒属病毒引起的急性接触性传染病，被国际兽疫局(OIE)定为一类传染病，可表现出临诊症状、呼吸道疾病、消化道症状、产蛋率下降、致死率高的急性出血性疾病.在禽类中传染性极强，发病突然，病症严重，死亡快速，死亡率可达100％。

在临床症状上，两种疾病有很高的相似性。它们往往突然爆发，死亡率极高。病程稍长可见精神萎顿，不食，衰弱，羽毛送乱，结膜肿胀发炎，鼻腔内有粘性分泌物，呼吸困难等。

因此，需要发明一种新的可以对两种病毒的进行快速且准确的诊断方法以解决上述问题。

发明内容

本发明的主要目的之一在于基于现有技术的不足而提供一种灵敏度高、特异性强的检测禽流感H5N1和新城疫病毒的引物。

本发明提供的一组用于检测禽流感H5N1和新城疫病毒的引物包括所述禽流感H5N1的HA基因中的序列或其互补序列以及所述新城疫病毒的F基因中的序列或其互补序列。

作为本发明优选实施方式，本发明用于检测禽流感H5N1和新城疫病毒的引物为SEQ ID NO：1～8所示的寡核苷酸：

5′-CATTCCACAACATACACC-3′；

5′-TGACTCCATCTATTGCCT-3′；

5′-CTGAGTCCAGTCGCAAGGACTAATCTGTTTTTCTCACCATCGGGGAA-3′；

5′-GGATGGCAGGGAATGGTAGATGGTTTTGTATCCACTCCCCTGCTCATC-3′；

5′-AGGAGCACAATCCAACTCAC-3′；

5′-TGGATGTCGCCTGAGAGG-3′；

5′-GTACCACCTGCCGTGTTGCGAATTCAGTCTCTTGCAGTCCGC-3′；

5′-CAGGAATACCGGGCTTACTGCAGAATTCGGCTGATGTCTTGGTGTTG-3′；

或者SEQ ID NO：1～8所示的寡核苷酸的互补链。

本发明的另一个目的是提供一种灵敏度高、特异性强、反应时间短、操作简单的检测禽流感H5N1和新城疫病毒的方法，通过多重环介导的等温扩增方法对所述禽流感H5N1和新城疫病毒的核苷酸序列进行扩增，其中引物为所述禽流感H5N1的HA基因中的序列或其互补序列以及所述新城疫病毒的F基因中的序列或其互补序列。

优选的，所述引物为SEQ ID NO：1～8所示的寡核苷酸：

5′-CATTCCACAACATACACC-3′；

5′-TGACTCCATCTATTGCCT-3′；

5′-CTGAGTCCAGTCGCAAGGACTAATCTGTTTTTCTCACCATCGGGGAA-3′；

5′-GGATGGCAGGGAATGGTAGATGGTTTTGTATCCACTCCCCTGCTCATC-3′；

5′-AGGAGCACAATCCAACTCAC-3′；

5′-TGGATGTCGCCTGAGAGG-3′；

5′-GTACCACCTGCCGTGTTGCGAATTCAGTCTCTTGCAGTCCGC-3′；

5′-CAGGAATACCGGGCTTACTGCAGAATTCGGCTGATGTCTTGGTGTTG-3′；

或者SEQ ID NO：1～8所示的寡核苷酸的互补链。

作为本发明优选实施方式，本发明的检测禽流感H5N1和新城疫病毒的方法，包括如下步骤：提取样本的总RNA；对RNA进行逆转录反应，得到cDNA；对cDNA进行多重环介导的等温核酸扩增反应，反应温度为63～66℃，反应时间为60分钟或90分钟；再终止反应，最后检测扩增产物。

作为本发明优选实施方式，本发明的检测禽流感H5N1和新城疫病毒的方法，包括如下步骤：提取样本的总RNA；将RNA的逆转录反应和多重环介导的等温核酸扩增反应在同一条件下同时进行，反应温度为63～66℃，反应时间为90分钟；再终止反应，最后检测扩增产物。

所述的检测扩增产物为通过限制性内切酶Eco RI和KpnI对所述产物酶切后再观察电泳结果。

本发明的第三个目的在于基于现有技术的不足而提供一种灵敏度高、特异性强、反应时间短、操作简单的检测禽流感H5N1和新城疫病毒的试剂盒，所述试剂盒包含检测禽流感H5N1和新城疫病毒的引物，所述引物为所述禽流感H5N1的HA基因中的序列或其互补序列以及所述新城疫病毒的F基因中的序列或其互补序列。

优选的，所述引物为SEQ ID NO：1～8所示的寡核苷酸：

5′-CATTCCACAACATACACC-3′；

5′-TGACTCCATCTATTGCCT-3′；

5′-CTGAGTCCAGTCGCAAGGACTAATCTGTTTTTCTCACCATCGGGGAA-3′；

5′-GGATGGCAGGGAATGGTAGATGGTTTTGTATCCACTCCCCTGCTCATC-3′；

5′-AGGAGCACAATCCAACTCAC-3′；

5′-TGGATGTCGCCTGAGAGG-3′；

5′-GTACCACCTGCCGTGTTGCGAATTCAGTCTCTTGCAGTCCGC-3′；

5′-CAGGAATACCGGGCTTACTGCAGAATTCGGCTGATGTCTTGGTGTTG-3′；

或者SEQ ID NO：1～8所示的寡核苷酸的互补链。

优选的，所述试剂盒还包括dNTPs混合物、甜菜碱、MgSO₄、Bst DNA聚合酶大片段、Bst DNA聚合酶缓冲液和AMV逆转录酶。

与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：

本发明的一套检测NDV和H5N1的特异性引物是针对NDV的F基因和H5N1的HA基因的保守序列而设计的，适用于m-LAMP检测方法，能特异、灵敏、快速检测组织样品中的病毒并通过酶切反应加以区分。本发明的检测NDV和H5N1的m-LAMP方法及其试剂盒用于基因扩增和病毒检测分析，新型有效，可检测多个病毒的混合样品，通过双酶切反应可以区分不同病毒；由于扩增反应从63℃-66℃都可以进行，不需变温扩增仪器，因此该方法可以在条件简陋的实验室以及发展中国家得到进一步推广。

附图说明

图1是本发明的检测禽流感H5N1和新城疫病毒的多重环介导等温扩增反应在不同反应温度下扩增的一个优选实施例的产物电泳图；

图2是本发明的检测禽流感H5N1和新城疫病毒的多重环介导等温扩增反应在不同60分钟和90分钟的两种反应时间下扩增的一个优选实施例的产物电泳图；其中，图a是反应60分钟的所得产物的电泳图，图b是反应90分钟的所得产物的电泳图，图a和图b中M泳道是2000bp的DNA Marker，泳道1-6分别是混合样品、NDV、H5N1、IBDV、IBV、H3N2；

图3是多重环介导等温扩增方法检测禽流感H5N1和新城疫病毒的产物酶切后的电泳图；

图4是用RT-PCR和多重环介导等温扩增方法检测禽流感H5N1和新城疫病毒的敏感性比照的一个优选实施例的结果，其中，M泳道是2000bp DNAMarker；标注1～10^-3的泳道为模板按10倍稀释后的扩增结果；图a是分别用RT-PCR和m-LAMP检测H5N1的产物的电泳比较图；图b是用RT-PCR和m-LAMP检测NDV的产物的电泳比较图；图c是混合样品的m-LAMP反应产物电泳结果图。

具体实施方式

为使本发明更加容易理解，下面将进一步阐述本发明的具体实施例。

本发明实施例中所用到的新城疫病毒(NDV)来自广东温氏集团，灭活的禽流感病毒(A/goose/Guangdong/1996/01)H5N1鸡胚尿囊液由华南农业大学家禽研究室提供。传染性支气管炎病毒(IBV)疫苗毒株H52为梅里亚动物保健公司产品，传染性法氏囊病病毒(IBDV)毒株来自来自梅里亚动物保健公司，流感病毒(A/Swine/Guangdong/2002/101)H3N2由华南农业大学动物科学学院家禽研究室提供。

实施例一：通过多重环介导的等温扩增法(Multiple-LAMP，m-LAMP)检测禽流感H5N1和新城疫病毒的方法

总RNA抽提：

(1)在1.5ml离心管中加入200ul病毒液，再加入800μl TRIZOL，振摇直至变粘稠。室温放置5分钟，使核酸和蛋白充分解离。

(2)加入200μl氯仿，剧烈振荡15s，混合均匀。室温放置15分钟。

(3)4℃，13,000r/min，离心15min，取上层水相于另一新1.5ml离心管中，并加入等体积异戊醇，混匀后室温放置10～15分钟。

(4)4℃，13,000rpm离心10～15min，沉淀RNA。小心弃尽上清，用4℃的75％乙醇1ml洗涤沉淀，最后，13,000r/min离心10min。

(5)小心弃净上清，超净工作台内风干RNA沉淀。

(6)以20μl RNase-free水溶解沉淀，2μl用于RT-LAMP(反应体系为25μl)4μl用于RT-PCR(反应体系为50μl)。

引物设计和合成：

下载GeneBank上的NDV(新城疫病毒)的F基因和AIV(低致病性禽流感病毒)H5N1毒株的HA基因的序列，通过DNAStar、ClustalX等软件比对序列找到保守的区域，用来设计LAMP引物，一共包括4条引物，互补于模板的8个片段。引物序列见表1，表1是m-LAMP引物列表。RT-PCR引物采用F3/B3引物。

表1

引物序列送至上海生工有限公司合成，合成后稀释成10μM，分装后置于-20℃保存。

多重环介导的等温扩增法反应：

反应体系由内引物各40pmol、外引物各5pmol、dNTPs mix各(TaKaRa公司)1.4mM、甜菜碱betaine(Sigma公司)0.8M、MgSO₄6mM、Bst DNA聚合酶(largefragment；New England Biolabs公司)1μl、1×提供的Bst DNA聚合酶缓冲液、AMV逆转录酶(TaKaRa)0.125U，RNA模板各1μl组成，反应体系共25μl。另外，为防止气溶胶粒子污染，在体系上添加20μl的矿物油(Sigma)，起到液封的作用。

为了确定最佳的反应温度和时间，分别设计了反应的温度梯度和时间梯度。m-LAMP反应在65℃反应60min和90min(时间梯度)，在63℃，64℃，65℃和66℃反应90min(温度梯度)。反应最后80℃持续5min以灭活Bst DNA聚合酶来终止反应。反应完后，取5μl的产物在2％浓度、用EB染色的凝胶上电泳。在建立m-LAMP检测方法时，都使用DEPC处理的无菌水做阴性模板。

实施例二：m-LAMP的敏感性和特异性实验

在敏感性试验中，分别取NDV和H5N1的DNA作为模板，按10倍的倍比来稀释，每个DNA浓度梯度都取2μl用于m-LAMP，借以判断检测的稀释极限。

特异性实验是用m-LAMP来检测NDV和AIV分离株以及混合样品的RNA，以IBDV(传染性囊病病毒)、IBV(传染性支气管炎病毒)和IV H3N2亚型的RNA，DEPC处理的无菌水做阴性对照。

实施例三：通过多重环介导的等温扩增法检测检测禽流感H5N1和新城疫病毒的最佳反应温度和时间

反应温度是m-LAMP扩增的一个最重要的参数，4条引物要根据先后退火的顺序来起始和延续整个反应。图1是本发明的检测禽流感H5N1和新城疫病毒的多重环介导等温扩增反应在不同反应温度下扩增的一个优选实施例的产物电泳图；其中，M泳道是2000bp的DNAMarker，N泳道是阴性对照，标注63～66的泳道表示不同的反应温度(单位℃)。图1显示，在63～66℃范围内扩增都能进行，选择65℃作为最佳反应温度。反应的时间，如图2所示，图2是本发明的检测禽流感H5N1和新城疫病毒的多重环介导等温扩增反应在60分钟和90分钟的两种反应时间下扩增的一个优选实施例的产物电泳图；其中，图a是反应60分钟的所得产物的电泳图，图b是反应90分钟的所得产物的电泳图，图a和图b中M泳道是2000bp的DNA Marker，泳道1-6分别是混合样品、NDV、H5N1、IBDV、IBV、H3N2。图2结果显示，60min并不能看到明显特征性的梯状条带，在90min产生明亮的条带。

实施例四：PCR和多重环介导等温扩增方法检测禽流感H5N1和新城疫病毒的敏感性对比实验

为了比较m-LAMP和PCR扩增的敏感性，进行了两种方法的对比实验，引物序列分别采用LAMP引物的F3/B3。

反应按试剂盒说明书来操作，50μl反应体系包含0.4μM的UP和DN引物、r-Taq DNA聚合酶和2μl的DNA模板。

UP 5′-ATTGTTCCGTTCATACGGAGC-3′

DN 5′-GCTCCGTATGAACGGAACAAT-3′

PCR反应的程序为：

94℃，2min

72℃，10min

根据PCR仪(Biometra公司)的显示，PCR反应大概需要60min。

反应完后，取5μl的产物在2％浓度的用EB染色的凝胶上电泳，预期的扩增片段为210bp。

m-LAMP反应后的产物双酶切反应检测结果：

扩增产物经过限制性内切酶Eco RI和KpnI(TaKaRa公司)来进行双酶切反应以区分病毒类型。

酶切反应的体系为：

10×内切酶反应缓冲液 2μl

Eco RI酶/KpnI酶 0.5μl

m-LAMP的扩增产物 3μl

ddH₂O 补至20μl

酶切反应结果如图3所示，图3是多重环介导等温扩增方法检测禽流感H5N1和新城疫病毒的产物酶切后的电泳图；M泳道是2000bp的DNA Marker；泳道1是NDV酶切产物；泳道2是H5N1酶切产物。理论上，NDV引物组的酶切片段大小为252bp和142bp，H5N1引物组的酶切片段为173bp，330bp和358bp三个片段。

在近期LAMP方法研究中，限制性酶切位点主要被用来确定所扩增片段是否为目的基因片段。在本发明中，为了区别混合样品中不同种类的病毒，设计了不同的酶切位点，用双酶切后不同大小的片段来区别病毒种类，使之成为理想的适用于简易实验室的病原诊断方法。在NDV的两条内引物FIP/BIP的TTTT区域插入EcoRI限制性酶切位点(GAATTC)并结合在H5N1的HA基因中存在的KpnI酶切位点，使用双酶切LAMP产物后产生不同大小的片段来区分NDV和H5N1病毒。酶切结果表明所建立的m-LAMP方法不仅具有特异性，而且可以简单区分NDV和H5N1两种病毒。

通过将目标RNA按10倍倍比稀释后，取同等浓度的RNA作为m-LAMP和RT-PCR反应的模板。图4是用RT-PCR和多重环介导等温扩增方法检测禽流感H5N1和新城疫病毒的敏感性比照的一个优选实施例的结果，其中，M泳道是2000bp DNA Marker；标注1～10^-3的泳道为模板按10倍稀释后的扩增结果；图a是分别用RT-PCR和m-LAMP检测H5N1的产物的电泳比较图；图b是用RT-PCR和m-LAMP检测NDV的产物的电泳比较图；图c是混合样品的m-LAMP反应产物电泳结果图。图4显示，在单独检测中，NDV的RT-PCR的检测极限为RNA稀释10倍，而m-LAMP的检测极限是稀释10²倍。H5N1的RT-PCR和m-LAMP的检测极限均为10^-1倍。在混合样品的m-LAMP检测中，m-LAMP的检测极限是稀释10^-2倍。总的说来，m-LAMP比PCR更为敏感。

实施例五：RT-LAMP检测禽流感H5N1和新城疫病毒的特异性

如图2所示，所使用的新城疫病毒和禽流感H5N1病毒以及他们的混合样品都表现出阳性(+)，而其他三个阴性对照禽类病毒的毒株表现出阴性(-)。没有出现与其他病毒的交叉反应说明所建立的m-LAMP技术具有很强的特异性。

实施例六检测禽流感H5N1和新城疫病毒的引物

一组用于检测禽流感H5N1和新城疫病毒的引物，该引物为所述禽流感H5N1的HA基因中的序列或其互补序列以及所述新城疫病毒的F基因中的序列或其互补序列。

优选的，所述引物为SEQ ID NO：1～8所示的寡核苷酸：

5′-CATTCCACAACATACACC-3′；

5′-TGACTCCATCTATTGCCT-3′；

5′-CTGAGTCCAGTCGCAAGGACTAATCTGTTTTTCTCACCATCGGGGAA-3′；

5′-GGATGGCAGGGAATGGTAGATGGTTTTGTATCCACTCCCCTGCTCATC-3′；

5′-AGGAGCACAATCCAACTCAC-3′；

5′-TGGATGTCGCCTGAGAGG-3′；

5′-GTACCACCTGCCGTGTTGCGAATTCAGTCTCTTGCAGTCCGC-3′；

5′-CAGGAATACCGGGCTTACTGCAGAATTCGGCTGATGTCTTGGTGTTG-3′；

或者SEQ ID NO：1～8所示的寡核苷酸的互补链。

这里所用的“寡核苷酸”是指任何长度的含嘌呤和嘧啶的聚合物，可以是多核糖核苷酸，可以是多脱氧核糖核苷酸，或是混合的多核糖-多脱氧核糖核苷酸。它包括单链和双链分子，例如DNA-DNA，DNA-RNA和RNA-RNA杂合体，以及通过与氨基酸主链共轭碱基形成的“蛋白质核酸”(PNA)。它还包括含有修饰碱基的核酸。

这里所用的“引物”是长度约为5个至50个核苷酸的寡核苷酸，优选长度为大约6个至25个核苷酸，特别优选长度为大约6个至18个核苷酸，它与相关的单链核酸序列形成一个双链体，并且可以用例如逆转录酶或DNA聚合酶使互补链发生聚合反应。

这里所用的核酸序列的“互补链”是指参与与原始序列沃森-克里克碱基配对的反义序列。

实施例七检测禽流感H5N1和新城疫病毒的试剂盒

本发明的检测禽流感H5N1和新城疫病毒的试剂盒，包含检测禽流感H5N1和新城疫病毒的引物，引物为所述禽流感H5N1的HA基因中的序列或其互补序列以及所述新城疫病毒的F基因中的序列或其互补序列。

具体来说，引物序列如SEQ ID NO：1～8所示的寡核苷酸：

5′-CATTCCACAACATACACC-3′；

5′-TGACTCCATCTATTGCCT-3′；

5′-CTGAGTCCAGTCGCAAGGACTAATCTGTTTTTCTCACCATCGGGGAA-3′；

5′-GGATGGCAGGGAATGGTAGATGGTTTTGTATCCACTCCCCTGCTCATC-3′；

5′-AGGAGCACAATCCAACTCAC-3′；

5′-TGGATGTCGCCTGAGAGG-3′；

5′-GTACCACCTGCCGTGTTGCGAATTCAGTCTCTTGCAGTCCGC-3′；

5′-CAGGAATACCGGGCTTACTGCAGAATTCGGCTGATGTCTTGGTGTTG-3′；

或者SEQ ID NO：1～8所示的寡核苷酸的互补链。

该试剂盒还包括dNTPs混合物、甜菜碱、MgSO₄、Bst DNA聚合酶大片段、Bst DNA聚合酶缓冲液和AMV逆转录酶。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

序列表

<110>中山大学

<120>用于检测禽流感H5N1和新城疫病毒的引物及其检测方法和试剂盒

<160>10

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列H5N1-F3

<400>1

cattccacaa catacacc 18

<210>2

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列H5N1-B3

<400>2

tgactccatc tattgcct 18

<210>3

<211>47

<212>DNA

<213>人工序列H5N1-FIP

<400>3

ctgagtccag tcgcaaggac taatctgttt ttctcaccat cggggaa 47

<210>4

<211>48

<212>DNA

<213>人工序列H5N1-BIP

<400>4

ggatggcagg gaatggtaga tggttttgta tccactcccc tgctcatc 48

<210>5

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列NDV-F3

<400>5

aggagcacaa tccaactcac 20

<210>6

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列NDV-B3

<400>6

tggatgtcgc ctgagagg 18

<210>7

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列NDV-FIP

<400>7

gtaccacctg ccgtgttgcg aattcagtct cttgcagtcc gc 42

<210>8

<211>47

<212>DNA

<213>人工序列NDV-BIP

<400>8

caggaatacc gggcttactg cagaattcgg ctgatgtctt ggtgttg 47

<210>9

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列UP

<400>9

attgttccgt tcatacggag c 21

<210>10

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列DN

<400>10

gctccgtatg aacggaacaa t 21

Claims

1.用于检测禽流感H5N1和新城疫病毒的引物，所述的引物包括所述禽流感H5N1的HA基因中的序列或其互补序列以及所述新城疫病毒的F基因中的序列或其互补序列，其特征在于，所述引物为SEQ ID NO：1～8所示的寡核苷酸：

5′-CATTCCACAACATACACC-3′；

5′-TGACTCCATCTATTGCCT-3′；

5′-CTGAGTCCAGTCGCAAGGACTAATCTGTTTTTCTCACCATCGGGGAA-3′；

5′-GGATGGCAGGGAATGGTAGATGGTTTTGTATCCACTCCCCTGCTCATC-3′；

5′-AGGAGCACAATCCAACTCAC-3′；

5′-TGGATGTCGCCTGAGAGG-3′；

5′-GTACCACCTGCCGTGTTGCGAATTCAGTCTCTTGCAGTCCGC-3′；

5′-CAGGAATACCGGGCTTACTGCAGAATTCGGCTGATGTCTTGGTGTTG-3′；

或者SEQ ID NO：1～8所示的寡核苷酸的互补链。

2.一种检测禽流感H5N1和新城疫病毒的试剂盒，所述试剂盒包含检测禽流感H5N1和新城疫病毒的引物，所述引物包括所述禽流感H5N1的HA基因中的序列或其互补序列以及所述新城疫病毒的F基因中的序列或其互补序列，其特征在于，所述引物为SEQ ID NO：1～8所示的寡核苷酸：

5′-CATTCCACAACATACACC-3′；

5′-TGACTCCATCTATTGCCT-3′；

5′-CTGAGTCCAGTCGCAAGGACTAATCTGTTTTTCTCACCATCGGGGAA-3′；

5′-GGATGGCAGGGAATGGTAGATGGTTTTGTATCCACTCCCCTGCTCATC-3′；

5′-AGGAGCACAATCCAACTCAC-3′；

5′-TGGATGTCGCCTGAGAGG-3′；

5′-GTACCACCTGCCGTGTTGCGAATTCAGTCTCTTGCAGTCCGC-3′；

5′-CAGGAATACCGGGCTTACTGCAGAATTCGGCTGATGTCTTGGTGTTG-3′；

或者SEQ ID NO：1～8所示的寡核苷酸的互补链。

3.根据权利要求2所述的检测禽流感H5N1和新城疫病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括dNTPs混合物、甜菜碱、MgSO₄、Bst DNA聚合酶大片段、Bst DNA聚合酶缓冲液和AMV逆转录酶。