CN102260749B

CN102260749B - H5、h7、h9亚型禽流感病毒检测试剂盒

Info

Publication number: CN102260749B
Application number: CN 201110103295
Authority: CN
Inventors: 钱爱东; 张文慧; 李影; 王铁峰; 张旺
Original assignee: Jilin Agricultural University
Current assignee: Jilin Agricultural University
Priority date: 2011-04-25
Filing date: 2011-04-25
Publication date: 2012-12-19
Anticipated expiration: 2031-04-25
Also published as: CN102260749A

Abstract

本发明公开了H5、H7、H9亚型禽流感病毒检测试剂盒，在GenBank中搜索三种亚型HA基因序列，设计特异性引物。经过大量的试验和实际检测，筛选、优化出3对引物及其反应体系，所扩增的cDNA片段大小分别为427、312、和826bp。结果表明，通过对多重RT-PCR扩增条件的优化，制成了同时检测三种亚型AIV的多重RT-PCR检测试剂盒，最低检出量均为10pg。而对多种鸡传染病及正常组织不存在交叉反应，特异性强，对三种亚型检测敏感性一致。基层实验室就可以在短时间内确诊禽流感，定位到亚型，为禽流感的防控争取了时间，及时采取措施，使禽流感传播控制在尽可能小的范围内。

Description

H5、H7、H9亚型禽流感病毒检测试剂盒

技术领域

[0001] 本发明属生物技术领域，确切地说是H5、H7、H9亚型禽流感病毒检测试剂盒背景技术

[0002] 禽流感（Avian influenza, Al)是由正黏病毒科A型流感病毒引起的一种禽类的急性、烈性传染病，除了可感染禽类外，还可感染人、猪和马等多种动物，被OIE列为A类传染病。禽流感病毒（AIV)属于A型流感病毒，禽流感病毒（AIV)变异频繁，血清亚型众多。根据HA抗原性差异分为16个HA亚型。抗原变异性强，宿主范围广泛，亚型间无交叉保护性，使得禽流感频繁暴发，成为养禽业的一大毁灭性疾病。

[0003] 高致病性禽流感主要是由H5或H7亚型AIV引起的，潜伏期极短，突然爆发，多不见任何临床症状而突然死亡，发病率和死亡率可高达100%，给养禽业带来严重经济损失，另外还可感染人，甚至导致死亡。据世界卫生组织（WHO)报道，截止到2009年5月22日，全世界共有H5N1亚型禽流感病毒感染人429例，死亡262例；我国共有感染病例38例，死亡25例。目前，我国部分地区以H9亚型为主的中低致病力禽流感的流行，能造成鸡产蛋量下降，给我国养禽业造成很大的经济损失，这一点已引起国内各界的广泛关注。所以早期快速检测无疑是预防、控制禽流感的前提条件，尤其是针对H5、H7和H9亚型的AIV。病毒分离、血清学试验至今仍是诊断Al和对AIV进行定型普遍采用的方法。但这些方法操作繁琐复杂；难以对Al进行快速诊断；十分不利于Al的防治。自从美国PE-Cetus公司的人类遗传研究室Mullis等发明了具有划时代意义的聚合酶链式反应（PCR)以来，PCR已经成为了分子生物学领域最基本也是最重要的技术手段之。聚合酶链式反应（PCR)是一种体外基因扩增技术，可以在数小时内对某段基因进行扩大数百万倍。该技术特异性强、敏感性高。为AIV早期快速诊断提供了敏感、快速、实用的方法。

[0004] 多重RT-PCR(Multiplex RT-PCR)技术其反应原理，反应试剂和操作过程与一般PCR相同。但与多个单项PCR相比，多重PCR具有以下显著的优点：高效性，它可在同一 PCR管内同时扩增多个靶基因，或对有多个型别的目的基因进行分型；系统性，多重PCR很适宜于多种病原体的同时检测，如肝炎病毒、肠道致病性细菌和无芽孢厌氧菌的同时检测；经济简便性，多个靶基因在同一反应管内同时扩增，将大大的节省时间，节省试剂，节约经费开支，为临床提供更多更准确的诊断信息。自从1988年首次报道以来，作为一种临床和实验室快速筛选技术，多重PCR已经成功应用到很多领域，如基因缺失、突变和多态性的分析、RNA检测和基因组测序分析。

[0005] 各类PCR成功的关键在于设计出合理的引物，合适的引物是决定PCR扩增特异性和敏感性的关键。多重PCR对引物的要求更加严格，以便同时检测出多种病原微生物。

[0006] 多重PCR的各对引物必须具有相近的退火温度，使得所有的靶位点可以用相同的PCR程序在单个的反应中得到有效的扩增。而其之间不能形成稳定二聚体和发夹结构。同时保证了扩增产物的大小能够通过电泳分开。

[0007] 虽然有很多能帮助设计引物的软件，例如“Premier Primer 5. 0”、“01io 6，，、“Vector N TI Suit”、“DNAsis”和“DNAstar”都带有引物自动搜索功能，但搜索结果并不是十分理想。要想得到效果很好的引物，在自动搜索的基础上，还要各软件搭配使用。

[0008] 尽管上述软件能够对帮助设计引物，但它毕竟是在科技人员大量研究成果的基础上，设计出的固定程序。人工分析、实际操作经验是必不可少的。可靠的多重PCR检测体系，还要通过科技人员大量试验验证、筛选。

发明内容

[0009] 本发明的目的是提供一种利用多重RT-PCR可同时检测H5、H7、H9亚型禽流感病毒的H5、H7、H9亚型禽流感病毒检测试剂盒。

[0010] H5、H7、H9亚型禽流感病毒检测试剂盒，它是由RNA反转录体系，以及PCR反应体系组成，其中引物为：

[0011] P5-1 ：5/ -CCAATCCAGCCAATGACC-3

[0012] P5-2 ：5/ -TCTATGGCAACCCTTCTT-3

[0013] P7-1 ：5/ -GAGTCAATGGACTTCACC-3'

[0014] P7-2 ： 5' -AGGTTCGGTCTGCTCGCT-3'

[0015] P9-1 ：5/ -TCTATGGCAACCCTTCTTGT-3'

[0016] P9-2 ：5/ -TATAACCCTGACCAACCTCC-3 ；

[0017] 所述的反转录体系还包括引物P5-1、P7-1和P9-1 ；

[0018] 所述的引物还包括：

[0019] P9 内-1:5' -ACAAGCAAAGCATGCTCAGG-3'

[0020] P9 内-2:5' -ACAAGATAACATCCAAAGTA-3

[0021] 所述的反转录体系为：双蒸水2. 7 μ L、反转录酶缓冲液2. O μ L、三磷酸脱氧核糖核苷I. O μ L、反转录酶抑制剂O. 3 μ L、反转录酶O. 5 μ L及三种亚型上游引物各O. 5 μ L的IOuL反转录体系；

[0022] 所述的PCR体系为：双蒸水29. 7 μ LU0XPCR缓冲液5. O μ L、三磷酸脱氧核糖核苷 4. O μ L、DNA 聚合酶 O. 5 μ L 及引物 Ρ5-2、Ρ5-2、Ρ7-1、Ρ7-2、Ρ9-1 和 Ρ9-2 各 O. 8 μ L 的50 μ L的反应体系。

[0023] 本发明提供的Η5、Η7、Η9亚型禽流感病毒检测试剂盒，在GenBank中搜索三种亚型HA基因序列，设计特异性引物。经过大量的试验和实际检测，筛选、优化出3对引物及其反应体系，所扩增的cDNA片段大小分别为427、312、和826bp。结果表明，通过对多重RT-PCR扩增条件的优化，制成了同时检测三种亚型AIV的多重RT-PCR检测试剂盒，最低检出量均为10pg。而对鸡传染性支气管炎病毒、鸡传染性法氏囊病毒、鸡传染性喉气管炎病毒、鸡新城疫病毒、鸡白痢沙门氏菌病原核酸及正常组织不存在交叉反应，特异性强，对三种亚型检测敏感性一致。基层实验室就可以在短时间内确诊禽流感，定位到亚型，为禽流感的防控争取了时间，及时采取措施，使禽流感传播控制在尽可能小的范围内。

附图说明

[0024] 图I为H9亚型AIV RT-PCR扩增结果，其中，M =DNAMaker DL2000 I :外侧引物扩增条带2 :内侧引物扩增条带3 :水对照；[0025] 图2为三种亚型AIV的多重RT-PCR敏感性实验扩增结果，其中，M =DNA分子质量标准，I :为 IOng, 2 :为 Ing, 3 :为 IOOpg, 4 :为 IOpg, 5 :为 Ipg

具体实施方式

[0026] 实施例I

[0027] 禽流感病毒H5、H7和H9亚型标准毒株由哈尔滨兽医生物技术国家重点实验室保存。鸡传染性支气管炎病毒（IBV)H52、鸡传染性法氏囊病毒（IBDV)B87、鸡传染性喉气管炎病毒（ILTV)疫苗株、鸡新城疫病毒（NDV)Lasota株、鸡白痢沙门氏菌（SP) CVCC528，由吉林农业大学预防兽医教研室保存。

[0028] 用Trizol提取病毒或疑似禽流感的病料（肺脏、淋巴结、脾脏）I〜4g的总RNA，提取过程中所有的器皿及消耗品均用DEPC水处理。

[0029] (I)将收集好的尿囊液以4000rpm 4°C离心30min,弃沉淀，上清液移至新的Eppendorf管中4°C IOOOOrpm超速离心2h，收集沉淀，以原尿囊液1/20体积的PBS (pH7. 4)

重悬毒液。

[0030] (2)抽取浓缩病毒液250 μ L至灭菌的2. OmLEppendorf管中，加入750 μ L Trizol裂解液，剧烈振荡15s，室温静置15min。

[0031] (3)加入200 μ L氯仿，振荡15s充分混匀，室温静置5min，12000rpm离心15min。

[0032] (4)取上清夜至新的I. 5mL Eppendorf管中，加入等体积的异丙醇,充分混勻，室温静置 IOmin, 12000rpm 离心 18min。

[0033] (5)小心弃去上清液，加入75%乙醇（用DEPC水配制）混匀，洗涤沉淀，12000rpm 离心8min。

[0034] (6)弃去上清液,将Eppendorf管置于超净工作台中通风干燥沉淀5-10min。

[0035] (7)加入灭菌的DEPC水20 μ L溶解沉淀。

[0036] (8)将核酸分装成每管5 μ 1，-70°C保存备用；

[0037] 按下表反应体系：

[0038] 表I反转录反应体系各组成成分

[0039] Tabl Composition of reaction system for reverse transcription

[0040]

.^^ Si

Ix蒸水

反转录酶缓冲液 2·ΰ

三磷酸脱氧核糖核苷 1ΌμΙ^

反转录酶抑制剂 α3

反转录酶 μ

三种亚型上游引物

2.0 pL

RNA模板

ΙΟ.Ομί

总计[0041] 注：三种亚型上游引物见表2

[0042] 轻轻混匀，瞬离，按反应条件：42°C 45min，99°C 5min，4°C 5min结束，在PCR仪上设定程序进行反转录；

[0043] 人工合成表2中引物：

[0044] 表2多重RT-PCR弓丨物

[0045] Tab. 2Multiplex RT-PCR primers

[0046]

[0047] 按表3反应体系：

[0048] 表3H5、H7和H9亚型AIV多重PCR反应体系组成成分

[0049] Tab. 3Composition of multiplex PCR reaction system for H5、H7 and H9

subtypes AIV

[0050]

[0051] 按反应条件：95°C预变性3min ;然后进入95°C变性45s，59°C退火45s，72°C延伸lmin，共33个循环；72°C延伸10min，4°C保温；在PCR仪上设定程序进行扩增；

[0052] 取5yL PCR反应产物以O. 8%琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下观察扩增片段。结果同时扩增出427bp、312bp、826bp大小的三条DNA片段。

[0053] 实施例2 [0054] 人工合成表4引物；

[0055] 表4H9亚型禽流感病毒巢式PCR内侧引物

[0056]

[0057] 取H9亚型AIV按实施例I的PCR方法扩增，取反应产物，按表4反应体系；

[0058] 表5H9亚型AIV巢式PCR反应体系各组成成分

[0059]

[0060] 按反应条件：94°C预变性3min后，进入94°C变性45s，53°C退火lmin，72°C延伸lmin,共循环30次，然后72 V再延伸lOmin，于4°C结束PCR扩增。取PCR产物5 μ L，用

0.8kg/L琼脂糖凝胶进行电泳，观察扩增结果。电泳检测结果见图I。

[0061] 实施例3特异性试验

[0062] 将H5、H7和H9亚型AIV的RNA以及鸡传染性支气管炎病毒（IBV) H52、鸡传染性法氏囊病毒（IBDV)B87、鸡传染性喉气管炎病毒（ILTV)疫苗株、鸡新城疫病毒（NDV)Lasota株、鸡白痢沙门氏菌（SP) CVCC528，及取健康禽类组织的RNA、DNA分别按实施例1、2方法，在相同条件下进行扩增。回收、纯化扩增片段，送上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序，分析测序结果，检测RT-PCR的特异性。

[0063] H5、H7和H9亚型AIV的cDNA经PCR扩增，结果H5亚型AIV在427bp位置出现一条cDNA扩增带，H7亚型AIV则在312bp位置出现一条cDNA扩增带，H9亚型AIV在826bp位置出现一条cDNA扩增带，而鸡传染性支气管炎病毒、鸡传染性法氏囊病毒、鸡传染性喉气管炎病毒、鸡新城疫病毒和鸡白痢沙门氏菌及正常组织，无论在427bp、312还是826bp处均无cDNA扩增带出现，即为阴性。对所回收的427、312和826bp cDNA扩增片段进行测序，并对测序结果经DNAStar基因分析软件分析，这些cDNA片段分别与AIV H5亚型HA基因、H7亚型HA基因和H9亚型HA基因有着高度同源性，表明这些扩增基因的序列与原参考序列的基因来源完全一致，分别来源于AIV H5亚型HA基因、H7亚型HA基因和H9亚型HA基因。

[0064] 实施例4敏感性试验 [0065] 将H5、H7和H9亚型AIV的反转录产物（10 μ g/mL) 10倍梯度稀释，按照上述试验确定的PCR最适条件进行敏感性检测，测定该RT-PCR对三种亚型AIV cDNA的最低检测量。H5、H7、H9亚型AIV的多重RT-PCR检测的最低检出量均为IOpg (见图2)，H9亚型AIV cDNA的巢式PCR的最低检测量为10fg。

[0066] 实施例5 H5、H7和H9亚型AIV多重PCR检测方法

[0067].取疑似禽流感的病料（肺脏、淋巴结、脾脏等）I〜4g于无菌研钵，研磨并加入适量的RNAiso Reagent后匀浆，室温放置5〜10分钟；加入250 μ L氯仿，漩涡振荡15秒混匀；室温下放置5分钟；12000r/min离心15分钟，取上层水相，转移到一个新的EP管中，再加入等体积的异丙醇混匀，室温放置10分钟。12000r/min离心10分钟，弃去上清，力口入75%乙醇700 μ L，充分洗涤沉淀的RNA后，12000r/min离心5分钟，小心吸去上清。室温晾干或到置于超净工作台内风干15-30分钟。用IOyL DEPC水中溶解，即为模板，即用或-70°C冻存备用；

[0068] 按实施例I的反转录体系及反应条件反转录；

[0069] 取反转录产物进行H5、H7和H9亚型AIV多重PCR检测，反应体系按表6

[0070] 表6H5、H7和H9亚型AIV多重PCR反应体系组成成分

[0071] Tab. 3Composition of multiplex PCR reaction system for H5、H7 and H9subtypes AIV

[0072]

[0073] 按反应条件：95°C预变性3min ;然后进入95°C变性45s，59°C退火45s，72°C延伸lmin,共33个循环；72°C延伸10min，4°C保温；在PCR仪上设定程序进行扩增；取卩0?产物5 μ L，用O. 8kg/L琼脂糖凝胶进行电泳，观察扩增结果。

[0074] 在312bp位置出现一条cDNA扩增带，H5亚型AIV阳性；无为阴性。

[0075] 在427bp位置出现一条cDNA扩增带，H7亚型AIV阳性；无为阴性

[0076] 在826bp位置出现一条cDNA扩增带；H9亚型AIV阳性；无为阴性

[0077] 当H9亚型阴性时，取上述多重RT-PCR产物按实施例2的反应体系（表5)及反应条件，扩增出693bp条带，H9亚型为阳性；无为阴性。

[0078] 该方法特别适合基层实验室使用，方便快捷，简单实用，经济节约，可以在较近的地点，最短时间内确诊禽流感，并可直接定位到亚型。使禽流感的传播锁定在一个较小的范围。

[0079] 可同时检测三种亚型AIV的多重RT-PCR检测试剂盒，最低检出量均为10pg。H5和H7毒力较强，感染后病毒浓度大，检出量IOpg即可定性；而H9为中等毒力，特别是隐性感染时，症状不明显，病毒浓度低，对多重RT-PCR产物再进行内引物检测，以排除隐性感染。

Claims

1. H5、H7、H9亚型禽流感病毒检测试剂盒，它是由RNA反转录体系，以及PCR反应体系组成，所述的反转录体系为：双蒸水2. 7 PL、反转录酶缓冲液2. O PL、三磷酸脱氧核糖核苷1.0 μί、反转录酶抑制剂O. 3 μί、反转录酶O. 5 PL及三种亚型上游引物Ρ5-1、Ρ7-1和Ρ9-1各O. 5 μί ;加上待检病料RNA模板2. O μί的ΙΟμί反转录体系；所述的PCR体系为：双蒸水29. 7PL、10XPCR缓冲液5. Ομί、三磷酸脱氧核糖核苷4. Ομί、DNA 聚合酶 O. 5μί 及引物 Ρ5-1、Ρ5-2、Ρ7-1、Ρ7-2、Ρ9-1 和 Ρ9-2 各 O. 8μΐ ;加上待检的所述的RNA反转录体系的，病料RNA反转录产物cDNA模板6. Ομί的50μί反应体系；所述的其中引物为： Ρ5-1 ：5/ -CCAATCCAGCCAATGACC- 3 Ρ5-2 ：5/ -TCTATGGCAACCCTTCTT- 3 Ρ7-1 ：5/ - GAGTCAATGGACTTCACC - 3' Ρ7-2 ：5/ - AGGTTCGGTCTGCTCGCT - 3' Ρ9-1 ：5/ - TCTATGGCAACCCTTCTTGT - 3' Ρ9-2 ：5/ - TATAACCCTGACCAACCTCC - 3。

2.根据权利要求I所述的Η5、Η7、Η9亚型禽流感病毒检测试剂盒，其特征在于，还包括一个Η9亚型AIV巢式PCR反应体系：10XPCR缓冲液2. 5μί、三磷酸脱氧核糖核苷2. Ομί、DNA聚合酶O. 3μί、内引物Ρ9-内I和Ρ9-内2各O. 3μί、双蒸水18. ΐμί ;加上权利要求I的50μί反应体系的PCR反应产物I. 5μί的25μί反应体系；所述内引物： Ρ9 内-1 :5' -ACAAGCAAAGCATGCTCAGG-3' Ρ9 内-2 :5' -ACAAGATAACATCCAAAGTA- 3。