CN110195120B - 一种同时检测ms-h疫苗株和通用型的二重pcr引物组及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物检测技术领域，涉及一种同时检测MS‑H疫苗株和通用型的二重PCR引物组及试剂盒，该引物组包含两对引物，分别是MS‑H疫苗株上下游引物对和通用型上下游引物对；其中，MS‑H疫苗株上下游引物对为SEQ ID NO:1所示的疫苗株上游引物、SEQ ID NO:2所示的疫苗株下游引物，通用型上下游引物对为SEQ ID NO:3所示的通用型上游引物和SEQ ID NO:4所示的通用型下游引物。利用本发明提供的试剂盒检测鸡滑液囊支原体MS‑H疫苗株和通用型准确性高、特异性强、灵敏度高、易于操作、快速且结果可靠。

Description

一种同时检测MS-H疫苗株和通用型的二重PCR引物组及试 剂盒

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，涉及一种检测支原体MS的引物组及试剂盒，具体涉及一种同时检测MS-H疫苗株和通用型的二重PCR引物组及试剂盒。

背景技术

禽滑液囊支原体病是由鸡滑液囊支原体(MycopLasma snoviae,MS)引起禽的急性或慢性传染病，以呼吸道型和关节病型为主要特征，呈现为关节病型的滑液囊膜炎及腱鞘滑膜炎和亚临床型的呼吸道疾病。病鸡和隐性感染的鸡是本病的传染源，本病不仅能通过病鸡咳嗽、喷嚏的飞沫和尘埃等接触来水平传播还能够经卵垂直传播。感染此病后，幼鸡生长不良，成年鸡产蛋下降，气囊炎使肉鸡胴体品质下降、废弃率增加，发病群用药增加，可造成严重的经济损失。

MS感染可以垂直和水平传播，其中种鸡的垂直传播会给下游企业带来持续不断的巨大经济损失，现被行业内广泛重视，也是可净化的一种重要垂直传播性疾病。

目前鸡滑液囊支原体(MS)疾病的控制，一般会采用活疫苗或活疫苗和灭活疫苗结合免疫，MS支原体医用较为广泛的活疫苗菌株有MS-H株。MS-H株可在鸡的上呼吸道携带，会感染临床样品PCR的检测结果，另外，疫苗的应用过程中其回复突变导致一定的毒力，因此基于弱毒活疫苗的有效性及安全性考虑，建立鉴别MS疫苗株和野毒株的方法十分重要。可以了解鸡群在MS-H株活苗免疫后鸡群是否还存在野毒感染，为该病的净化控制提供参考。

发明内容

为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种同时检测MS-H疫苗株和通用型的双重PCR引物组及试剂盒，利用本发明提供的试剂盒检测鸡滑液囊支原体MS-H疫苗株和通用型准确性高、特异性强、灵敏度高、易于操作、快速且结果可靠。

为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：

一种同时检测MS-H疫苗株和通用型的二重PCR引物组，其特征在于，该引物组包含两对引物，分别是MS-H疫苗株上下游引物对和通用型上下游引物对；其中，MS-H疫苗株上下游引物对为SEQIDNO:1所示的疫苗株上游引物、SEQIDNO:2所示的疫苗株下游引物，通用型上下游引物对为SEQIDNO:3所示的通用型上游引物和SEQIDNO:4所示的通用型下游引物。

其中，优选方案如下：

疫苗株上游引物、疫苗株下游引物、通用型上游引物和通用型下游引物的摩尔比为1：1：1：1。

本发明还提供了一种同时检测MS-H疫苗株和通用型的二重PCR试剂盒，其特征在于，含有以下试剂：

A液：PCR反应液含2xTaq PCR Mix 12.5uL、权利要求1所述的MS-H疫苗株上下游引物对1uL、权利要求1所述的通用型上下游引物对1uL、ddH₂O6.5uL，其中引物对浓度均为10uM；

B液：含有MS-H和通用目的基因的人工质粒各50uL，作为阳性对照；

C液：ddH₂O 100uL，作为阴性对照。

其中，优选方案如下：

该试剂盒的PCR扩增反应的反应程序为：95℃变性3min；95℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸20s，循环30次；72℃延伸10min。

该试剂盒判定待测样品中是否含有鸡滑液囊支原体MS-H疫苗株或野毒株的方法为：在紫外灯下观察电泳检测图并与标准分子量相对照，若待测样品于384bp和260bp处出现了两条明亮的条带，阴性对照没有目的条带，则证明该待测样品中存在鸡滑液囊支原体MS-H疫苗株；若待测样品仅在384bp出现一条带，阴性对照没有目的条带，则证明该待测样品是鸡滑液囊支原体野毒感染。

本发明的优点在于：

(1)特异性引物对：本发明设计了对鸡滑液囊支原体MS-H疫苗株和通用型具有特异扩增作用的PCR引物对，并已经对不同厂家的鸡滑液囊支原体MS-H疫苗株和通用样品为供试材料进行了验证，鸡滑液囊支原体MS-H疫苗株的样品能特异性地扩增出384bp、260bp两条电泳条带，通用型样品能特异性地扩增出384bp一条电泳条带，这说明本发明设计的引物对具有很强的特异性和准确性。

(2)检测方法:1)检测周期短：PCR检测方法可以2h得出结果，而传统培养扩增测序方法检测周期要一个星期。2)实用性强：目前国家要求原种鸡场对支原体尽快完成净化，但是如果对支原体疫苗株和通用型无法进行正确的判定，那么净化只能成为一种空想，本发明中两种支原体MS引物对能够有效区分MS-H疫苗株与其他鸡毒支原体，且能有效区分MS-H疫苗株与野毒株，具有重要的实际应用价值。

附图说明

图1是二重PCR特异性试验结果电泳图；

图2是二重PCR鉴别引物敏感性结果电泳图；

图3是对临床样品进行二重PCR鉴别检测电泳图。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。

以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。具体所用材料和试剂如下：

MS-H疫苗株，山东益生畜牧兽医科学研究院实验室提供；

TS11疫苗株，山东益生畜牧兽医科学研究院实验室提供

F疫苗株，山东益生畜牧兽医科学研究院实验室提供

6/85株，山东益生畜牧兽医科学研究院实验室提供

S6株，山东益生畜牧兽医科学研究院实验室提供

R株，山东益生畜牧兽医科学研究院实验室提供

试剂：2000bpMarker、棉拭子DNA提取试剂盒为青岛英赛特生物科技有限公司自主研发；2x Taq PCR Mix购自北京全式金生物技术有限公司。

实施例1：

一、设计特异性引物

根据GenBank中的序列差异，我们用Primer5软件设计了同时检测鸡滑液囊支原体MS-H疫苗株和通用型的二重PCR引物组，具体序列如下：

疫苗株上游引物(SEQIDNO:1所示)：TGTATAGTAACGCCCTTCGC

疫苗株下游引物(SEQIDNO:2所示)：CTTCTTGAAGGTGAAACCAA

通用型上游引物(SEQIDNO:3所示)：CTATTAGCAGCTAGTGCAGTGG

通用型下游引物(SEQIDNO:4所示)：ACCGATCCGCTTAATGCTCTTAC

二、核酸提取

参照青岛英赛特生物科技有限公司的棉拭子DNA提取试剂盒说明书，提取各种支原体的DNA，-20℃保存。

三、鸡滑液囊支原体MS-H疫苗株和通用型二重PCR的特异性试验

本次对鸡滑液囊支原体以及鸡毒支原体的疫苗株与野毒株的核酸进行PCR扩增，电泳图如图1所示，点样顺序从左至右依次为：

泳道1：Marker；

泳道2：鸡滑液囊支原体MS-H疫苗株

泳道3：鸡滑液囊支原体野毒

泳道4：鸡毒支原体TS11疫苗株

泳道5：鸡毒支原体F疫苗株

泳道6：鸡毒支原体6/85株

泳道7：鸡毒支原体R株

泳道8：鸡毒支原体S6株

泳道9：阴性对照。

从电泳结果可以看出，鸡滑液囊支原体MS-H疫苗株特异性的两条扩增条带，野毒株扩增出一条特异性条带，鸡毒支原体TS11疫苗、鸡毒支原体F疫苗株、鸡毒支原体6/85株、R株、S6株与阴性对照均无扩增条带，这说明：本发明提供的检测方法成立，可用于区分MS支原体与MG支原体，并能区分MS-H疫苗与MS通用，从而区分出MS-H疫苗与野毒。

四、鸡滑液囊支原体MS-H疫苗株和通用型二重PCR的敏感性试验

用nanodrop-2000测得MS-H疫苗株与MS通用的人工质粒浓度，并调整至10ng/ul，10倍稀释梯度后等体积混合作为模板，进行二重PCR扩增，对PCR扩增产物进行电泳，结果如图2所示，点样顺序从左至右依次为：

泳道1：Marker；

泳道2：10^-1稀释度；

泳道3：10^-2稀释度；

泳道4：10^-3稀释度；

泳道5：10^-4稀释度；

泳道6：10^-5稀释度；

泳道7：10^-6稀释度；

泳道8：10^-7稀释度；

泳道9：10^-8稀释度；

泳道10：阴性对照。

从电泳结果可以看出，鸡滑液囊支原体MS-H疫苗株和通用型二重PCR鉴别检测试剂盒，对鸡滑液囊支原体MS-H人工质粒的最低检出限为10^-5稀释度。

五、检测试剂盒的组装

A液：PCR反应液，含2xTaq PCR Mix 12.5uL(北京全式金，货号：N10102，有效期至20210102)、MS-H疫苗株上下游引物对1uL、通用型上下游引物对1uL、ddH₂O 6.5uL，其中引物浓度均为10uM；

B液为阳性对照，含有MS-H和通用目的基因的人工质粒各50uL；

C液为阴性对照，100uL ddH₂O。

六、对临床样本进行检测

采用本发明提供的检测方法对采集的10份病料进行检测，先提取核酸，再按照试剂盒中PCR程序进行扩增电泳，若病料在384bp和260bp处出现了两条明亮的条带，阴性对照没有目的条带，则证明该病料中存在鸡滑液囊支原体MS-H疫苗株；若病料仅在384bp出现一条带，阴性对照没有目的条带，则证明该待测样品是鸡滑液囊支原体野毒感染。检测结果见图3，点样顺序如下：

泳道1：Marker；

泳道2～11：临床样品；

泳道12：阴性对照。

从电泳结果可以看出，2、8、9号样品为MS野毒感染，可以将MS野毒感染的鸡只进行淘汰。

需要说明的是，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。

序列表

<110> 青岛英赛特生物科技有限公司

山东益生种畜禽股份有限公司

<120> 一种同时检测MS-H疫苗株和通用性的二重PCR引物组及试剂盒

<141> 2019-06-20

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

tgtatagtaa cgcccttcgc 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

cttcttgaag gtgaaaccaa 20

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

ctattagcag ctagtgcagt gg 22

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

accgatccgc ttaatgctct tac 23

Claims (5)

1.一种同时检测MS-H疫苗株和通用型的二重PCR引物组，其特征在于，该引物组包含两对引物，分别是MS-H疫苗株上下游引物对和通用型上下游引物对；其中，MS-H疫苗株上下游引物对为SEQ ID NO:1所示的疫苗株上游引物、SEQ ID NO:2所示的疫苗株下游引物，通用型上下游引物对为SEQ ID NO:3所示的通用型上游引物和SEQ ID NO:4所示的通用型下游引物。

2.根据权利要求1所述的一种同时检测MS-H疫苗株和通用型的二重PCR引物对，其特征在于，疫苗株上游引物、疫苗株下游引物、通用型上游引物和通用型下游引物的摩尔比为1：1：1：1。

3.一种同时检测MS-H疫苗株和通用型的二重PCR试剂盒，其特征在于，含有以下试剂：

A液：PCR反应液含2xTaq PCR Mix 12.5uL、权利要求1所述的MS-H疫苗株上下游引物对1uL、权利要求1所述的通用型上下游引物对1uL、ddH₂O 6.5uL，其中引物对浓度均为10uM；

B液：含有MS-H和通用目的基因的人工质粒各50uL，作为阳性对照；

C液：ddH₂O 100uL，作为阴性对照。

4.根据权利要求3所述的一种同时检测MS-H疫苗株和通用型的二重PCR试剂盒，其特征在于，该试剂盒的PCR扩增反应的反应程序为：95℃变性3min；95℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸20s，循环30次；72℃延伸10min。

5.根据权利要求3所述的一种同时检测MS-H疫苗株和通用型的二重PCR试剂盒，其特征在于，该试剂盒判定待测样品中是否含有鸡滑液囊支原体MS-H疫苗株或野毒株的方法为：在紫外灯下观察电泳检测图并与标准分子量相对照，若待测样品于384bp和260bp处出现了两条明亮的条带，阴性对照没有目的条带，则证明该待测样品中存在鸡滑液囊支原体MS-H疫苗株；若待测样品仅在384bp出现一条带，阴性对照没有目的条带，则证明该待测样品是鸡滑液囊支原体野毒感染。

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