CN116397054B - 用于鸡圆圈病毒AGV2、GyV3、GyV7鉴别诊断的多重PCR引物组及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于鸡圆圈病毒AGV2、GyV3、GyV7鉴别诊断或检测的多重PCR引物组及其试剂盒，所述引物组的序列如SEQ ID NO.1‑4所示，所述试剂盒包括所述的引物组，本发明通过分析AGV2、GyV3和GyV7基因组结构特征，综合利用多种生物信息学工具，巧妙设计引物获得用于AGV2、GyV3和GyV7鉴别诊断的引物组，组装成可用于AGV2、GyV3和GyV7鉴别诊断的试剂盒，该试剂盒简便快速，可同时对AGV2、GyV3和GyV7感染情况进行科学鉴别诊断；特异性强，对常见鸡传染病(如产蛋下降综合征病毒、禽4型腺病毒、禽流感病毒H9、鸡新城疫病毒等)均无交叉。
Description
技术领域
本发明属于禽传染病学领域，具体涉及一种用于鸡圆圈病毒AGV2、GyV3、GyV7鉴别诊断的多重PCR引物组及其试剂盒。
背景技术
圆圈病毒Gyrovirus(GyVs)为单链环状DNA病毒，该病毒属过去只有一个成员，即鸡传染性贫血病毒(chicken infectious anemia virus，CIAV)，2011年以来，研究人员陆续分离到9种与CIAV基因结构类似的病毒。圆圈病毒的宿主较广泛，宿主有鸡、人和野鸟，有的圆圈病毒既可感染鸡也可以感染人。该病毒属曾经属于圆环病毒科(Circoviridae)，由于圆圈病毒在结构上和遗传信息上均与细环病毒科(Anelloviridae)成员更加相似，因此2016年国际病毒分类委员会批准的最新病毒分类法，GyVs被重新分配到细环病毒科家族。圆圈病毒属可以分为三个分支，分别是包含CIAV、HGyV/AGV2、GyV3、GyV6、GyV7和GyV9的A分支；包含GyV4和GyV5的B分支；以及包含GyV8的C分支。圆圈病毒基因组约2.2～2.4kb，由5’端的非编码区和3个重叠的开放阅读框(ORF)组成。三个重叠的ORF分别编码结构蛋白VP1，骨架蛋白VP2以及凋亡蛋白VP3。
2011年，有研究者从健康法国成年人的皮肤表面分离到了人的GyVs(Human GyVs，HGyV)；同一年，从表现为精神沉郁、体重减轻的巴西某患病鸡群的血清中也分离到了一种GyVs，即鸡的GyVs2(Avian GyV2，AGV2)，该病毒与CIAV只有40％的同源性，其VP1、VP2和VP3蛋白的氨基酸序列与CIAV相应蛋白的同源性分别为38.8％、40.3％和32.2％。2012年有研究人员在腹泻患者的粪便中检测到了HGyV，并且检出率为1-9.3％。研究指出，HGyV与AGV2密切相关，HGyV和AGV2的VP1-3蛋白质序列差异性仅为3-7％，表明HGyV与AGV2属于同一种病毒。2012年有研究者首次从智利急性胃肠炎的儿童粪便中分离鉴定出人源GyV3。2018年我国学者首次从患有典型鸡传染性腺胃炎的病鸡腺胃中鉴定出GyV3。又有研究通过鸡和小鼠致病性试验证实：GyV3可引起鸡的传染性腺胃炎和贫血，并且可跨种感染小鼠，引起小鼠胃肠炎和贫血。GyV3的基因组约包含2356个碱基序列，与其他GyVs具有相似的基因组结构，其VP1和VP2蛋白与HGyV/AGV2相应蛋白的氨基酸序列的同源性分别为62％和63％，与其他的已知GyVs VP3氨基酸序列具有57％的相似性。最近，在被感染的鸡的体内检测到GyV7，基因组为2439bp，非编码区514bp，其VP1、VP2和VP3蛋白的氨基酸序列与GyV7相应蛋白的同源性最高分别为49％、53％和63％。
AGV2、GyV3和GyV7是近年来在鸡群中新发现的病毒，这3种病毒共感染的情况在鸡中比较常见。但是，当前尚未见可同时对3种新发鸡圆圈病毒AGV2、GyV3和GyV7进行多重PCR鉴别检测方法的研究报道，本发明的建立可填补国内外相关领域空白。本发明建立的多重PCR检测方法能够对鸡群中流行的AGV2、GyV3和GyV7的进行鉴别诊断，为鸡群中开展新发AGV2、GyV3和GyV7病毒的流行病学调查及后续科学防控相关疾病奠定基础，具有十分重要的研究意义。
发明内容
本发明的目的在于提供用于鸡圆圈病毒AGV2、GyV3、GyV7鉴别诊断的多重PCR引物组及其试剂盒，可同时对鸡圆圈病毒AGV2、GyV3、GyV7的感染情况进行科学鉴别诊断或检测。
本发明的目的通过如下技术方案实现：
一种用于鸡圆圈病毒AGV2、GyV3、GyV7鉴别诊断(或检测)的多重PCR引物组，所述引物组的序列如下所示：
GyV-F：5’-GCCGGAKSCMCGGGCAAGA-3’(SEQ ID NO.1)；
AGV2-R：5’-AACAAATGCTTGAGCCTCCGGA-3’(SEQ ID NO.2)；
GyV3-R：5’-TGCCCCTGGCTGTCTAGATGAT-3’(SEQ ID NO.3)；
GyV7-R：5’-CAGGCATCCGTAAGTCCAGAGCAT-3’(SEQ ID NO.4)；
其中，引物GyV-F中，K＝G/T，S＝C/G，M＝A/C。
所述的引物组在制备用于鉴别诊断鸡圆圈病毒AGV2、GyV3、GyV7的试剂盒中的应用。
一种用于鉴别鸡圆圈病毒AGV2、GyV3、GyV7的诊断试剂盒，其包括所述的引物组。
所述用于鉴别鸡圆圈病毒AGV2、GyV3、GyV7的诊断试剂盒的反应体系如下所示：
50μL体系进行扩增，其中2×Multiplex PCR Buffer PCR扩增反应液25μL、(20μM)上游引物GyV-F 1.5μL、分别针对AGV2、GyV3和GyV7的下游引物(20μM)AGV2-R、(20μM)GyV3-R和(20μM)GyV7-R各0.5μL、Multiplex PCR Enzyme Mix PCR扩增酶0.25μL，制备的cDNA模板各1.0μL、补充灭菌水至终体积50μL，混匀后进行PCR扩增。
优化后的扩增条件为：94℃预变性2min后进入循环，94℃变性30s、58℃退火45s、72℃延伸55s，35个循环结束后，72℃延伸10min，反应结束后按照常规琼脂糖凝胶电泳鉴定。
用于鉴别鸡圆圈病毒AGV2、GyV3、GyV7的诊断试剂盒，所述试剂盒同时对鸡圆圈病毒AGV2、GyV3、GyV7进行鉴别，判定方法为：
(1)当仅出现扩增条带为671bp时，判为鸡圆圈病毒AGV2感染阳性。
(2)当仅出现扩增条带为926bp时，判为鸡圆圈病毒GyV3感染阳性。
(3)当仅出现扩增条带为314bp时，判为鸡圆圈病毒GyV7感染阳性。
(4)当出现扩增条带为671bp和926bp时，判为鸡圆圈病毒AGV2和GyV3共感染阳性。
(5)当出现扩增条带为671bp和314bp时，判为鸡圆圈病毒AGV2和GyV7共感染阳性。
(6)当出现扩增条带为926bp和314bp时，判为鸡圆圈病毒GyV3和GyV7共感染阳性。
(7)当出现扩增条带为671bp、926bp和314bp时，判为鸡圆圈病毒AGV2、GyV3和GyV7共感染阳性。
较之现有技术而言，本发明的优点在于：
本发明通过分析AGV2、GyV3和GyV7基因组结构特征，综合利用多种生物信息学工具，巧妙设计引物获得用于AGV2、GyV3和GyV7鉴别诊断的引物组，组装成可用于AGV2、GyV3和GyV7鉴别诊断的试剂盒。该试剂盒简便快速，可同时对AGV2、GyV3和GyV7感染情况进行科学鉴别诊断；特异性强，对常见鸡传染病(产蛋下降综合征病毒、禽4型腺病毒、禽流感病毒H9、鸡新城疫病毒、J亚群禽白血病病毒等)均无交叉；优化程序简单(常规针对3个病原需设计6条引物而本发明仅需设计4条引物，便于条件优化)；易于观察，本发明的结果在设计上考虑到了目前实验应用最多(成本最低廉)的DNA分子量标准(DL2000)，扩增条带分别位于DNA分子量标准(DL2000)各条特征性条带不同区域，观察结果非常直观。本发明的建立可填补国内外相关领域空白。
附图说明
图1是多重PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果图，其中M：DNA分子量DL2000；1：AGV2(第1泳道)；2：GyV3(第2泳道)；3：GyV7(第3泳道)；4：AGV2和GyV3共感染(第4泳道)；5：AGV2和GyV7共感染(第5泳道)；6：GyV3和GyV7共感染(第6泳道)；7：AGV2、GyV3和GyV7共感染(第7泳道)；8：EDSV(第8泳道)；9：FAdV-4(第9泳道)；10：AIV H9(第10泳道)；11：NDV(第11泳道)；12：ALV-J(第12泳道)。
图2是AGV2敏感性分析结果图，其中M：DNA分子量DL2000；1：7.11×105pg；2：7.11×104pg；3：7.11×103pg；4：7.11×102pg；5：7.11×101pg；6：7.11×100pg；7：试验阴性对照。
图3是AGV3敏感性分析结果图，其中M：DNA分子量DL2000；1：4.89×105pg；2：4.89×104pg；3：4.89×103pg；4：4.89×102pg；5：4.89×101pg；6：4.89×100pg；7：试验阴性对照。
图4是AGV7敏感性分析结果图，其中M：DNA分子量DL2000；1：5.37×105pg；2：5.37×104pg；3：5.37×103pg；4：5.37×102pg；5：5.37×101pg；6：5.37×100pg；7：试验阴性对照。
具体实施方式
下面结合说明书附图和实施例对本发明内容进行详细说明：
实施例1：
1、材料与方法
1.1毒株
试验用病原鸡圆圈病毒2型(AGV2)、鸡圆圈病毒7型(GyV7)、产蛋下降综合征病毒(EDSV)、禽4型腺病毒(FAdV-4)、禽流感病毒H9(AIV H9)、鸡新城疫病毒(NDV)、J亚群禽白血病病毒(ALV-J)均由福建省农业科学院畜牧兽医研究所鉴定和保存。
1.2引物的设计
根据美国国家生物技术信息中心(National Center of BiotechnologyInformation，NCBI)数据库GenBank上参考鸡圆圈病毒AGV2、GyV3和GyV7的基因组特点，综合应用多种生物学软件，巧妙设计鉴别AGV2、GyV3和GyV7的引物组，引物均在生工生物工程(上海)股份有限公司合成。设计的特异性引物序列信息如下：
GyV-F：5’-GCCGGAKSCMCGGGCAAGA-3’；
AGV2-R：5’-AACAAATGCTTGAGCCTCCGGA-3’；
GyV3-R：5’-TGCCCCTGGCTGTCTAGATGAT-3’；
GyV7-R：5’-CAGGCATCCGTAAGTCCAGAGCAT-3’。
PCR产物大小：AGV2：671bp；GyV3：926bp；GyV7：314bp。
1.3病毒核酸的制备
按照病毒核酸提取试剂盒(EasyPure Viral DNA/RNA Kit)提取AGV2、GyV3、GyV7、EDSV、FAdV-4的DNA以及AIV H9、NDV和ALV-J的RNA。利用反转录试剂盒(One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix)将提取的RNA反转录为cDNA备用。
1.4多重PCR方法建立
根据多重PCR试剂盒(Multiplex PCR Assay Kit Ver.2)推荐的50μL体系进行扩增，其中2×Multiplex PCR Buffer PCR扩增反应液25μL、上游引物(20μM)GyV-F 1.5μL、分别针对AGV2、GyV3和GyV7的下游引物(20μM)AGV2-R、(20μM)GyV3-R和(20μM)GyV7-R各0.5μL、Multiplex PCR Enzyme Mix PCR扩增酶0.25μL，制备的cDNA模板各1.0μL、补充灭菌水至终体积50μL，混匀后进行PCR扩增。
经优化的扩增条件为：94℃预变性2min后进入循环，94℃变性30s、58℃退火45s、72℃延伸55s，35个循环结束后，72℃延伸10min，反应结束后按照常规琼脂糖凝胶电泳鉴定。
结果判定：
建立的多重PCR方法可同时对鸡圆圈病毒AGV2、GyV3、GyV7扩增，并可同时对鸡圆圈病毒AGV2、GyV3、GyV7进行鉴别诊断，其判断方法为：
(1)当仅出现扩增条带为671bp时，判为鸡圆圈病毒AGV2感染阳性。
(2)当仅出现扩增条带为926bp时，判为鸡圆圈病毒GyV3感染阳性。
(3)当仅出现扩增条带为314bp时，判为鸡圆圈病毒GyV7感染阳性。
(4)当出现扩增条带为671bp和926bp时，判为鸡圆圈病毒AGV2和GyV3共感染阳性。
(5)当出现扩增条带为671bp和314bp时，判为鸡圆圈病毒AGV2和GyV7共感染阳性。
(6)当出现扩增条带为926bp和314bp时，判为鸡圆圈病毒GyV3和GyV7共感染阳性。
(7)当出现扩增条带为671bp、926bp和314bp时，判为鸡圆圈病毒AGV2、GyV3和GyV7共感染阳性。
结果见图1：AGV2目的片段大小为671bp(第1泳道)；GyV3目的片段大小为926bp(第2泳道)；GyV7目的片段大小为314bp(第3泳道)；AGV2和GyV3双阳性的扩增目的片段大小有2条，分别为671bp和926bp(第4泳道)；AGV2和GyV7双阳性的扩增目的片段大小有2条，分别为671bp和314bp(第5泳道)；GyV3和GyV7双阳性的扩增目的片段大小有2条，分别为926bp和314bp(第6泳道)；AGV2、GyV3和GyV7共阳性的扩增目的片段大小有3条，分别为671bp、926bp和314bp(第7泳道)。
1.5多重PCR方法的特异性
根据优化后的多重PCR条件，对EDSV、FAdV-4的DNA以及AIV H9、NDV和ALV-J的RNA反转录的cDNA模板进行扩增，结果见图1，EDSV(第8泳道)、FAdV-4(第9泳道)、AIV H9(第10泳道)、NDV(第11泳道)、ALV-J(第12泳道)均未见条带扩增，表明本发明建立的方法特异性强。
1.6多重PCR方法的敏感性
根据优化后的多重PCR条件，对AGV2、GyV3和GyV7提取的DNA经连续10倍稀释后(AGV2浓度分别为7.11×105pg-7.11×100pg、GyV3浓度分别为4.89×105pg-4.89×100pg、GyV7浓度分别为5.37×105pg-5.37×100pg)进行反转录后进行扩增，结果分别如图2、图3、图4所示。
结果可见：AGV2的最低检测限为7.11×101pg(即71.1pg)(图2第5泳道)；GyV3的最低检测限为4.89×101pg(即48.9pg)(图3第5泳道)；GyV7的最低检测限为5.37×101pg(即53.7pg)(图4第5泳道)。
1.7临床应用
将215份临床送检鸡源病料按照常规方法处理后，利用病毒核酸提取试剂盒EasyPure Viral DNA/RNA Kit提取相应的核酸DNA后，利用建立的多重PCR方法进行AGV2、GyV3和GyV7感染的检测。结果可见，检测到26份AGV2单一感染阳性，阳性率为12.09％；检测到41份GyV3单一感染阳性，阳性率为19.07％；检测到17份GyV7单一感染阳性，阳性率为7.91％；检测到13份AGV2和GyV3共感染阳性，阳性率为6.05％；检测到8份AGV2和GyV7共感染阳性，阳性率为3.72％；检测到6份GyV3和GyV7共感染阳性，阳性率为2.79％；检测到3份AGV2、GyV3和GyV7共感染阳性，阳性率为1.40％。
上述实施方式旨在举例说明本发明可为本领域专业技术人员实现或使用，对上述实施方式进行修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，故本发明包括但不限于上述实施方式，任何符合本权利要求书或说明书描述，符合与本文所公开的原理和新颖性、创造性特点的方法、工艺、产品，均落入本发明的保护范围之内。
Claims (3)
1.一种用于鸡圆圈病毒AGV2、GyV3、GyV7鉴别诊断的多重PCR引物组，其特征在于：所述引物组的序列如下所示：
GyV-F：5’-GCCGGAKSCMCGGGCAAGA-3’；
AGV2-R：5’-AACAAATGCTTGAGCCTCCGGA-3’；
GyV3-R：5’-TGCCCCTGGCTGTCTAGATGAT-3’；
GyV7-R：5’-CAGGCATCCGTAAGTCCAGAGCAT-3’。
2.一种用于鉴别鸡圆圈病毒AGV2、GyV3、GyV7的诊断试剂盒，其特征在于：其包括权利要求1所述的引物组。
3.根据权利要求2所述的用于鉴别鸡圆圈病毒AGV2、GyV3、GyV7的诊断试剂盒，其特征在于：所述试剂盒同时对鸡圆圈病毒AGV2、GyV3、GyV7进行鉴别，判定方法为：
(1)当仅出现扩增条带为671bp时，判为鸡圆圈病毒AGV2感染阳性；
(2)当仅出现扩增条带为926bp时，判为鸡圆圈病毒GyV3感染阳性；
(3)当仅出现扩增条带为314bp时，判为鸡圆圈病毒GyV7感染阳性；
(4)当出现扩增条带为671bp和926bp时，判为鸡圆圈病毒AGV2和GyV3共感染阳性；
(5)当出现扩增条带为671bp和314bp时，判为鸡圆圈病毒AGV2和GyV7共感染阳性；
(6)当出现扩增条带为926bp和314bp时，判为鸡圆圈病毒GyV3和GyV7共感染阳性；
(7)当出现扩增条带为671bp、926bp和314bp时，判为鸡圆圈病毒AGV2、GyV3和GyV7共感染阳性。
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