CN116397054B - 用于鸡圆圈病毒AGV2、GyV3、GyV7鉴别诊断的多重PCR引物组及试剂盒 - Google Patents
用于鸡圆圈病毒AGV2、GyV3、GyV7鉴别诊断的多重PCR引物组及试剂盒 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116397054B CN116397054B CN202310242279.3A CN202310242279A CN116397054B CN 116397054 B CN116397054 B CN 116397054B CN 202310242279 A CN202310242279 A CN 202310242279A CN 116397054 B CN116397054 B CN 116397054B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- agv2
- gyv3
- gyv7
- viruses
- chicken
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 title claims abstract description 62
- 241000700605 Viruses Species 0.000 title claims abstract description 54
- 238000007403 mPCR Methods 0.000 title claims abstract description 21
- 238000003748 differential diagnosis Methods 0.000 title claims abstract description 14
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 17
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 13
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 claims description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 10
- 241000711404 Avian avulavirus 1 Species 0.000 abstract description 8
- 241000886677 Duck adenovirus 1 Species 0.000 abstract description 8
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 abstract description 3
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 abstract description 3
- 241000701792 avian adenovirus Species 0.000 abstract description 2
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 47
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 10
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 9
- 208000003322 Coinfection Diseases 0.000 description 8
- 241000316868 Gyrovirus Species 0.000 description 7
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 6
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 6
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 6
- 241000323253 Avian leukosis virus ev/J Species 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 5
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 4
- 101710197658 Capsid protein VP1 Proteins 0.000 description 4
- 241001533399 Circoviridae Species 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 101710081079 Minor spike protein H Proteins 0.000 description 4
- 244000144992 flock Species 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 101000805768 Banna virus (strain Indonesia/JKT-6423/1980) mRNA (guanine-N(7))-methyltransferase Proteins 0.000 description 3
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 3
- 101000686790 Chaetoceros protobacilladnavirus 2 Replication-associated protein Proteins 0.000 description 3
- 101000864475 Chlamydia phage 1 Internal scaffolding protein VP3 Proteins 0.000 description 3
- 101000803553 Eumenes pomiformis Venom peptide 3 Proteins 0.000 description 3
- 101000583961 Halorubrum pleomorphic virus 1 Matrix protein Proteins 0.000 description 3
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 3
- 101710118046 RNA-directed RNA polymerase Proteins 0.000 description 3
- 101710108545 Viral protein 1 Proteins 0.000 description 3
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 238000010206 sensitivity analysis Methods 0.000 description 3
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 3
- 241000714230 Avian leukemia virus Species 0.000 description 2
- 241000725585 Chicken anemia virus Species 0.000 description 2
- 208000005577 Gastroenteritis Diseases 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- 108091092724 Noncoding DNA Proteins 0.000 description 2
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 2
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 2
- 208000007502 anemia Diseases 0.000 description 2
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 2
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 2
- 238000012257 pre-denaturation Methods 0.000 description 2
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001339993 Anelloviridae Species 0.000 description 1
- 241001533384 Circovirus Species 0.000 description 1
- 108020004638 Circular DNA Proteins 0.000 description 1
- 208000020401 Depressive disease Diseases 0.000 description 1
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 description 1
- 108091092584 GDNA Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 101710136297 Protein VP2 Proteins 0.000 description 1
- 101710106388 Structural protein VP1 Proteins 0.000 description 1
- 208000012873 acute gastroenteritis Diseases 0.000 description 1
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000011841 epidemiological investigation Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 101710121537 mRNA (guanine-N(7))-methyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 201000003102 mental depression Diseases 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- 230000004580 weight loss Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Virology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及一种用于鸡圆圈病毒AGV2、GyV3、GyV7鉴别诊断或检测的多重PCR引物组及其试剂盒，所述引物组的序列如SEQ ID NO.1‑4所示，所述试剂盒包括所述的引物组，本发明通过分析AGV2、GyV3和GyV7基因组结构特征，综合利用多种生物信息学工具，巧妙设计引物获得用于AGV2、GyV3和GyV7鉴别诊断的引物组，组装成可用于AGV2、GyV3和GyV7鉴别诊断的试剂盒，该试剂盒简便快速，可同时对AGV2、GyV3和GyV7感染情况进行科学鉴别诊断；特异性强，对常见鸡传染病(如产蛋下降综合征病毒、禽4型腺病毒、禽流感病毒H9、鸡新城疫病毒等)均无交叉。
Description
技术领域
本发明属于禽传染病学领域，具体涉及一种用于鸡圆圈病毒AGV2、GyV3、GyV7鉴别诊断的多重PCR引物组及其试剂盒。
背景技术
圆圈病毒Gyrovirus(GyVs)为单链环状DNA病毒，该病毒属过去只有一个成员，即鸡传染性贫血病毒(chicken infectious anemia virus，CIAV)，2011年以来，研究人员陆续分离到9种与CIAV基因结构类似的病毒。圆圈病毒的宿主较广泛，宿主有鸡、人和野鸟，有的圆圈病毒既可感染鸡也可以感染人。该病毒属曾经属于圆环病毒科(Circoviridae)，由于圆圈病毒在结构上和遗传信息上均与细环病毒科(Anelloviridae)成员更加相似，因此2016年国际病毒分类委员会批准的最新病毒分类法，GyVs被重新分配到细环病毒科家族。圆圈病毒属可以分为三个分支，分别是包含CIAV、HGyV/AGV2、GyV3、GyV6、GyV7和GyV9的A分支；包含GyV4和GyV5的B分支；以及包含GyV8的C分支。圆圈病毒基因组约2.2～2.4kb，由5’端的非编码区和3个重叠的开放阅读框(ORF)组成。三个重叠的ORF分别编码结构蛋白VP1，骨架蛋白VP2以及凋亡蛋白VP3。
2011年，有研究者从健康法国成年人的皮肤表面分离到了人的GyVs(Human GyVs，HGyV)；同一年，从表现为精神沉郁、体重减轻的巴西某患病鸡群的血清中也分离到了一种GyVs，即鸡的GyVs2(Avian GyV2，AGV2)，该病毒与CIAV只有40％的同源性，其VP1、VP2和VP3蛋白的氨基酸序列与CIAV相应蛋白的同源性分别为38.8％、40.3％和32.2％。2012年有研究人员在腹泻患者的粪便中检测到了HGyV，并且检出率为1-9.3％。研究指出，HGyV与AGV2密切相关，HGyV和AGV2的VP1-3蛋白质序列差异性仅为3-7％，表明HGyV与AGV2属于同一种病毒。2012年有研究者首次从智利急性胃肠炎的儿童粪便中分离鉴定出人源GyV3。2018年我国学者首次从患有典型鸡传染性腺胃炎的病鸡腺胃中鉴定出GyV3。又有研究通过鸡和小鼠致病性试验证实：GyV3可引起鸡的传染性腺胃炎和贫血，并且可跨种感染小鼠，引起小鼠胃肠炎和贫血。GyV3的基因组约包含2356个碱基序列，与其他GyVs具有相似的基因组结构，其VP1和VP2蛋白与HGyV/AGV2相应蛋白的氨基酸序列的同源性分别为62％和63％，与其他的已知GyVs VP3氨基酸序列具有57％的相似性。最近，在被感染的鸡的体内检测到GyV7，基因组为2439bp，非编码区514bp，其VP1、VP2和VP3蛋白的氨基酸序列与GyV7相应蛋白的同源性最高分别为49％、53％和63％。
AGV2、GyV3和GyV7是近年来在鸡群中新发现的病毒，这3种病毒共感染的情况在鸡中比较常见。但是，当前尚未见可同时对3种新发鸡圆圈病毒AGV2、GyV3和GyV7进行多重PCR鉴别检测方法的研究报道，本发明的建立可填补国内外相关领域空白。本发明建立的多重PCR检测方法能够对鸡群中流行的AGV2、GyV3和GyV7的进行鉴别诊断，为鸡群中开展新发AGV2、GyV3和GyV7病毒的流行病学调查及后续科学防控相关疾病奠定基础，具有十分重要的研究意义。
发明内容
本发明的目的在于提供用于鸡圆圈病毒AGV2、GyV3、GyV7鉴别诊断的多重PCR引物组及其试剂盒，可同时对鸡圆圈病毒AGV2、GyV3、GyV7的感染情况进行科学鉴别诊断或检测。
本发明的目的通过如下技术方案实现：
一种用于鸡圆圈病毒AGV2、GyV3、GyV7鉴别诊断(或检测)的多重PCR引物组，所述引物组的序列如下所示：
GyV-F：5’-GCCGGAKSCMCGGGCAAGA-3’(SEQ ID NO.1)；
AGV2-R：5’-AACAAATGCTTGAGCCTCCGGA-3’(SEQ ID NO.2)；
GyV3-R：5’-TGCCCCTGGCTGTCTAGATGAT-3’(SEQ ID NO.3)；
GyV7-R：5’-CAGGCATCCGTAAGTCCAGAGCAT-3’(SEQ ID NO.4)；
其中，引物GyV-F中，K＝G/T，S＝C/G，M＝A/C。
所述的引物组在制备用于鉴别诊断鸡圆圈病毒AGV2、GyV3、GyV7的试剂盒中的应用。
一种用于鉴别鸡圆圈病毒AGV2、GyV3、GyV7的诊断试剂盒，其包括所述的引物组。
所述用于鉴别鸡圆圈病毒AGV2、GyV3、GyV7的诊断试剂盒的反应体系如下所示：
50μL体系进行扩增，其中2×Multiplex PCR Buffer PCR扩增反应液25μL、(20μM)上游引物GyV-F 1.5μL、分别针对AGV2、GyV3和GyV7的下游引物(20μM)AGV2-R、(20μM)GyV3-R和(20μM)GyV7-R各0.5μL、Multiplex PCR Enzyme Mix PCR扩增酶0.25μL，制备的cDNA模板各1.0μL、补充灭菌水至终体积50μL，混匀后进行PCR扩增。
优化后的扩增条件为：94℃预变性2min后进入循环，94℃变性30s、58℃退火45s、72℃延伸55s，35个循环结束后，72℃延伸10min，反应结束后按照常规琼脂糖凝胶电泳鉴定。
用于鉴别鸡圆圈病毒AGV2、GyV3、GyV7的诊断试剂盒，所述试剂盒同时对鸡圆圈病毒AGV2、GyV3、GyV7进行鉴别，判定方法为：
(1)当仅出现扩增条带为671bp时，判为鸡圆圈病毒AGV2感染阳性。
(2)当仅出现扩增条带为926bp时，判为鸡圆圈病毒GyV3感染阳性。
(3)当仅出现扩增条带为314bp时，判为鸡圆圈病毒GyV7感染阳性。
(4)当出现扩增条带为671bp和926bp时，判为鸡圆圈病毒AGV2和GyV3共感染阳性。
(5)当出现扩增条带为671bp和314bp时，判为鸡圆圈病毒AGV2和GyV7共感染阳性。
(6)当出现扩增条带为926bp和314bp时，判为鸡圆圈病毒GyV3和GyV7共感染阳性。
(7)当出现扩增条带为671bp、926bp和314bp时，判为鸡圆圈病毒AGV2、GyV3和GyV7共感染阳性。
较之现有技术而言，本发明的优点在于：
本发明通过分析AGV2、GyV3和GyV7基因组结构特征，综合利用多种生物信息学工具，巧妙设计引物获得用于AGV2、GyV3和GyV7鉴别诊断的引物组，组装成可用于AGV2、GyV3和GyV7鉴别诊断的试剂盒。该试剂盒简便快速，可同时对AGV2、GyV3和GyV7感染情况进行科学鉴别诊断；特异性强，对常见鸡传染病(产蛋下降综合征病毒、禽4型腺病毒、禽流感病毒H9、鸡新城疫病毒、J亚群禽白血病病毒等)均无交叉；优化程序简单(常规针对3个病原需设计6条引物而本发明仅需设计4条引物，便于条件优化)；易于观察，本发明的结果在设计上考虑到了目前实验应用最多(成本最低廉)的DNA分子量标准(DL2000)，扩增条带分别位于DNA分子量标准(DL2000)各条特征性条带不同区域，观察结果非常直观。本发明的建立可填补国内外相关领域空白。
附图说明
图1是多重PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果图，其中M：DNA分子量DL2000；1：AGV2(第1泳道)；2：GyV3(第2泳道)；3：GyV7(第3泳道)；4：AGV2和GyV3共感染(第4泳道)；5：AGV2和GyV7共感染(第5泳道)；6：GyV3和GyV7共感染(第6泳道)；7：AGV2、GyV3和GyV7共感染(第7泳道)；8：EDSV(第8泳道)；9：FAdV-4(第9泳道)；10：AIV H9(第10泳道)；11：NDV(第11泳道)；12：ALV-J(第12泳道)。
图2是AGV2敏感性分析结果图，其中M：DNA分子量DL2000；1：7.11×105pg；2：7.11×104pg；3：7.11×103pg；4：7.11×102pg；5：7.11×101pg；6：7.11×100pg；7：试验阴性对照。
图3是AGV3敏感性分析结果图，其中M：DNA分子量DL2000；1：4.89×105pg；2：4.89×104pg；3：4.89×103pg；4：4.89×102pg；5：4.89×101pg；6：4.89×100pg；7：试验阴性对照。
图4是AGV7敏感性分析结果图，其中M：DNA分子量DL2000；1：5.37×105pg；2：5.37×104pg；3：5.37×103pg；4：5.37×102pg；5：5.37×101pg；6：5.37×100pg；7：试验阴性对照。
具体实施方式
下面结合说明书附图和实施例对本发明内容进行详细说明：
实施例1：
1、材料与方法
1.1毒株
试验用病原鸡圆圈病毒2型(AGV2)、鸡圆圈病毒7型(GyV7)、产蛋下降综合征病毒(EDSV)、禽4型腺病毒(FAdV-4)、禽流感病毒H9(AIV H9)、鸡新城疫病毒(NDV)、J亚群禽白血病病毒(ALV-J)均由福建省农业科学院畜牧兽医研究所鉴定和保存。
1.2引物的设计
根据美国国家生物技术信息中心(National Center of BiotechnologyInformation，NCBI)数据库GenBank上参考鸡圆圈病毒AGV2、GyV3和GyV7的基因组特点，综合应用多种生物学软件，巧妙设计鉴别AGV2、GyV3和GyV7的引物组，引物均在生工生物工程(上海)股份有限公司合成。设计的特异性引物序列信息如下：
GyV-F：5’-GCCGGAKSCMCGGGCAAGA-3’；
AGV2-R：5’-AACAAATGCTTGAGCCTCCGGA-3’；
GyV3-R：5’-TGCCCCTGGCTGTCTAGATGAT-3’；
GyV7-R：5’-CAGGCATCCGTAAGTCCAGAGCAT-3’。
PCR产物大小：AGV2：671bp；GyV3：926bp；GyV7：314bp。
1.3病毒核酸的制备
按照病毒核酸提取试剂盒(EasyPure Viral DNA/RNA Kit)提取AGV2、GyV3、GyV7、EDSV、FAdV-4的DNA以及AIV H9、NDV和ALV-J的RNA。利用反转录试剂盒(One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix)将提取的RNA反转录为cDNA备用。
1.4多重PCR方法建立
根据多重PCR试剂盒(Multiplex PCR Assay Kit Ver.2)推荐的50μL体系进行扩增，其中2×Multiplex PCR Buffer PCR扩增反应液25μL、上游引物(20μM)GyV-F 1.5μL、分别针对AGV2、GyV3和GyV7的下游引物(20μM)AGV2-R、(20μM)GyV3-R和(20μM)GyV7-R各0.5μL、Multiplex PCR Enzyme Mix PCR扩增酶0.25μL，制备的cDNA模板各1.0μL、补充灭菌水至终体积50μL，混匀后进行PCR扩增。
经优化的扩增条件为：94℃预变性2min后进入循环，94℃变性30s、58℃退火45s、72℃延伸55s，35个循环结束后，72℃延伸10min，反应结束后按照常规琼脂糖凝胶电泳鉴定。
结果判定：
建立的多重PCR方法可同时对鸡圆圈病毒AGV2、GyV3、GyV7扩增，并可同时对鸡圆圈病毒AGV2、GyV3、GyV7进行鉴别诊断，其判断方法为：
(1)当仅出现扩增条带为671bp时，判为鸡圆圈病毒AGV2感染阳性。
(2)当仅出现扩增条带为926bp时，判为鸡圆圈病毒GyV3感染阳性。
(3)当仅出现扩增条带为314bp时，判为鸡圆圈病毒GyV7感染阳性。
(4)当出现扩增条带为671bp和926bp时，判为鸡圆圈病毒AGV2和GyV3共感染阳性。
(5)当出现扩增条带为671bp和314bp时，判为鸡圆圈病毒AGV2和GyV7共感染阳性。
(6)当出现扩增条带为926bp和314bp时，判为鸡圆圈病毒GyV3和GyV7共感染阳性。
(7)当出现扩增条带为671bp、926bp和314bp时，判为鸡圆圈病毒AGV2、GyV3和GyV7共感染阳性。
结果见图1：AGV2目的片段大小为671bp(第1泳道)；GyV3目的片段大小为926bp(第2泳道)；GyV7目的片段大小为314bp(第3泳道)；AGV2和GyV3双阳性的扩增目的片段大小有2条，分别为671bp和926bp(第4泳道)；AGV2和GyV7双阳性的扩增目的片段大小有2条，分别为671bp和314bp(第5泳道)；GyV3和GyV7双阳性的扩增目的片段大小有2条，分别为926bp和314bp(第6泳道)；AGV2、GyV3和GyV7共阳性的扩增目的片段大小有3条，分别为671bp、926bp和314bp(第7泳道)。
1.5多重PCR方法的特异性
根据优化后的多重PCR条件，对EDSV、FAdV-4的DNA以及AIV H9、NDV和ALV-J的RNA反转录的cDNA模板进行扩增，结果见图1，EDSV(第8泳道)、FAdV-4(第9泳道)、AIV H9(第10泳道)、NDV(第11泳道)、ALV-J(第12泳道)均未见条带扩增，表明本发明建立的方法特异性强。
1.6多重PCR方法的敏感性
根据优化后的多重PCR条件，对AGV2、GyV3和GyV7提取的DNA经连续10倍稀释后(AGV2浓度分别为7.11×105pg-7.11×100pg、GyV3浓度分别为4.89×105pg-4.89×100pg、GyV7浓度分别为5.37×105pg-5.37×100pg)进行反转录后进行扩增，结果分别如图2、图3、图4所示。
结果可见：AGV2的最低检测限为7.11×101pg(即71.1pg)(图2第5泳道)；GyV3的最低检测限为4.89×101pg(即48.9pg)(图3第5泳道)；GyV7的最低检测限为5.37×101pg(即53.7pg)(图4第5泳道)。
1.7临床应用
将215份临床送检鸡源病料按照常规方法处理后，利用病毒核酸提取试剂盒EasyPure Viral DNA/RNA Kit提取相应的核酸DNA后，利用建立的多重PCR方法进行AGV2、GyV3和GyV7感染的检测。结果可见，检测到26份AGV2单一感染阳性，阳性率为12.09％；检测到41份GyV3单一感染阳性，阳性率为19.07％；检测到17份GyV7单一感染阳性，阳性率为7.91％；检测到13份AGV2和GyV3共感染阳性，阳性率为6.05％；检测到8份AGV2和GyV7共感染阳性，阳性率为3.72％；检测到6份GyV3和GyV7共感染阳性，阳性率为2.79％；检测到3份AGV2、GyV3和GyV7共感染阳性，阳性率为1.40％。
上述实施方式旨在举例说明本发明可为本领域专业技术人员实现或使用，对上述实施方式进行修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，故本发明包括但不限于上述实施方式，任何符合本权利要求书或说明书描述，符合与本文所公开的原理和新颖性、创造性特点的方法、工艺、产品，均落入本发明的保护范围之内。
Claims (3)
1.一种用于鸡圆圈病毒AGV2、GyV3、GyV7鉴别诊断的多重PCR引物组，其特征在于：所述引物组的序列如下所示：
GyV-F：5’-GCCGGAKSCMCGGGCAAGA-3’；
AGV2-R：5’-AACAAATGCTTGAGCCTCCGGA-3’；
GyV3-R：5’-TGCCCCTGGCTGTCTAGATGAT-3’；
GyV7-R：5’-CAGGCATCCGTAAGTCCAGAGCAT-3’。
2.一种用于鉴别鸡圆圈病毒AGV2、GyV3、GyV7的诊断试剂盒，其特征在于：其包括权利要求1所述的引物组。
3.根据权利要求2所述的用于鉴别鸡圆圈病毒AGV2、GyV3、GyV7的诊断试剂盒，其特征在于：所述试剂盒同时对鸡圆圈病毒AGV2、GyV3、GyV7进行鉴别，判定方法为：
(1)当仅出现扩增条带为671bp时，判为鸡圆圈病毒AGV2感染阳性；
(2)当仅出现扩增条带为926bp时，判为鸡圆圈病毒GyV3感染阳性；
(3)当仅出现扩增条带为314bp时，判为鸡圆圈病毒GyV7感染阳性；
(4)当出现扩增条带为671bp和926bp时，判为鸡圆圈病毒AGV2和GyV3共感染阳性；
(5)当出现扩增条带为671bp和314bp时，判为鸡圆圈病毒AGV2和GyV7共感染阳性；
(6)当出现扩增条带为926bp和314bp时，判为鸡圆圈病毒GyV3和GyV7共感染阳性；
(7)当出现扩增条带为671bp、926bp和314bp时，判为鸡圆圈病毒AGV2、GyV3和GyV7共感染阳性。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310242279.3A CN116397054B (zh) | 2023-03-14 | 2023-03-14 | 用于鸡圆圈病毒AGV2、GyV3、GyV7鉴别诊断的多重PCR引物组及试剂盒 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310242279.3A CN116397054B (zh) | 2023-03-14 | 2023-03-14 | 用于鸡圆圈病毒AGV2、GyV3、GyV7鉴别诊断的多重PCR引物组及试剂盒 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN116397054A CN116397054A (zh) | 2023-07-07 |
| CN116397054B true CN116397054B (zh) | 2024-01-16 |
Family
ID=87011455
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202310242279.3A Active CN116397054B (zh) | 2023-03-14 | 2023-03-14 | 用于鸡圆圈病毒AGV2、GyV3、GyV7鉴别诊断的多重PCR引物组及试剂盒 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN116397054B (zh) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110938707A (zh) * | 2019-08-09 | 2020-03-31 | 山东省农业科学院家禽研究所 | 一种鸡新型环状病毒GyV3的荧光定量PCR检测方法 |
| CN114592089A (zh) * | 2022-02-28 | 2022-06-07 | 山东农业大学 | 一种同时检测三种圆圈病毒的三重TaqMan荧光定量PCR试剂盒 |
-
2023
- 2023-03-14 CN CN202310242279.3A patent/CN116397054B/zh active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110938707A (zh) * | 2019-08-09 | 2020-03-31 | 山东省农业科学院家禽研究所 | 一种鸡新型环状病毒GyV3的荧光定量PCR检测方法 |
| CN114592089A (zh) * | 2022-02-28 | 2022-06-07 | 山东农业大学 | 一种同时检测三种圆圈病毒的三重TaqMan荧光定量PCR试剂盒 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| A new gyrovirus in human fecas;Tung Gia Phan等;Virus Genes;第51卷(第1期);摘要、第1页第2段、第6页Fig.1c * |
| Novel Gyroviruses, including chicken Anaemia virus, in clinical and chicken samples from south Africa;Heidi E.M. Smuts;Advances in Virology;第2014卷;第2页左栏最后一段 * |
| 邹小波等.《现代食品检测技术》.中国轻工业出版社,2021,第323页. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN116397054A (zh) | 2023-07-07 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Jóźwik et al. | Comparison of the immunofluorescence assay with RT-PCR and nested PCR in the diagnosis of canine distemper | |
| CN107058634A (zh) | 鸭腺病毒2型和鸭腺病毒a型双重pcr检测引物及试剂盒 | |
| CN111876527A (zh) | 一种非洲猪瘟病毒野毒株和疫苗株鉴别检测试剂盒 | |
| Ashmi et al. | Molecular characterization of canine distemper virus from Tamil Nadu, India | |
| CN113564280A (zh) | 一种用于检测禽腺病毒i群12个血清型的raa引物及其检测方法 | |
| CN110669870A (zh) | 一种帕利亚姆血清群病毒血清型的实时荧光定量rt-pcr检测引物、探针及检测试剂盒 | |
| CN105821163B (zh) | 一种快速鉴定鹅细小病毒与樱桃谷鸭源细小病毒的双重pcr方法 | |
| CN111118215A (zh) | 一种用于检测山羊痘病毒属病毒的荧光pcr引物、探针及试剂盒 | |
| CN110592278A (zh) | PRoV、PoSaV和PAstV的多重RT-PCR试剂盒 | |
| CN110643740B (zh) | 帕利亚姆血清群病毒的实时荧光定量rt-pcr检测引物、探针及检测试剂盒 | |
| CN113174446A (zh) | 一种用于牛病毒性腹泻病毒分型的一步法双重rt-pcr检测方法 | |
| CN116397054B (zh) | 用于鸡圆圈病毒AGV2、GyV3、GyV7鉴别诊断的多重PCR引物组及试剂盒 | |
| CN116814857A (zh) | 猫细小病毒及其试剂盒和荧光重组酶聚合酶扩增的方法 | |
| Panickan et al. | Molecular characterization and pathogenicity of an Indian isolate of duck enteritis virus recovered from a natural outbreak | |
| CN114085929B (zh) | 一种用于检测非洲猪瘟病毒野毒株和疫苗株的试剂盒 | |
| CN113265488B (zh) | 共同检测流行性出血病病毒和帕利亚姆血清群病毒的rpa-lfd引物、探针及试剂盒 | |
| CN112359148B (zh) | 用于快速检测三种鱼类病毒的pcr引物组及其应用 | |
| CN115094164A (zh) | 不同基因缺失型ASFV的多重qPCR试剂盒及检测方法 | |
| CN111500774B (zh) | 一种流行性出血病病毒及血清型鉴定rt-pcr试剂盒 | |
| KR102525970B1 (ko) | 전염성후두기관염 바이러스, 계두 바이러스 및 세망내피증 바이러스의 동시 다중 pcr 검출용 프라이머 및 그 용도 | |
| CN116287461A (zh) | 用于鸡圆圈病毒AGV2和GyV7鉴别检测的双重PCR引物组及其试剂盒 | |
| CN112195289A (zh) | 新型E型禽腺病毒Fiber荧光定量PCR检测试剂盒及其应用 | |
| CN116536450A (zh) | 用于同时检测鸡圆圈病毒AGV2、GyV3和GyV7的通用引物 | |
| TWI302570B (en) | Canine distemper virus isolated in korea and recombinant vaccine using the same | |
| KR20180136686A (ko) | Lamp를 이용한 가금류 면역억제 바이러스 검출용 프라이머 및 그 용도 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |