CN105821163B - 一种快速鉴定鹅细小病毒与樱桃谷鸭源细小病毒的双重pcr方法 - Google Patents

一种快速鉴定鹅细小病毒与樱桃谷鸭源细小病毒的双重pcr方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种快速鉴定鹅细小病毒与樱桃谷鸭源细小病毒的双重PCR方法，主要是设计并筛选了新的特异性引物，优化了反应过程中的各种参数，利用本组引物建立的针对鹅细小病与樱桃谷鸭源细小病毒的双重PCR方法特异性强、敏感性高，可以快速准确地进行鹅细小病毒和新型樱桃谷鸭源细小病毒的鉴定。本发明建立的双重PCR方法重复性好、可信度高，同时又价格低廉、操作相对简单，适用于大规模流行病学调查。本发明经过1500份样品的检测证明具有很好的可信度，并且只需要普通PCR仪即可进行，由于引物合成价格已经非常便宜，本专利反应成本与普通PCR反应相差无几，实验操作也相对简单，适用于目前我国的畜牧业生产实际。

Description

一种快速鉴定鹅细小病毒与樱桃谷鸭源细小病毒的双重PCR 方法
(一)技术领域
本发明涉及一种快速鉴定鹅细小病毒与樱桃谷鸭源细小病毒的双重PCR方法，属于病毒分子生物学领域。
(二)背景技术
鹅细小病毒(Goose parvovirus,GPV)属于细小病毒科成员之一，能够引起雏鹅和雏番鸭发病，产生以小肠粘膜表层坏死脱落并形成小肠栓塞为主要特征的病变，具有高发病率和死亡率。根据以往的研究，水禽细小病毒的自然感染宿主只有鹅和番鸭，未见其感染其他品种鸭的报道。但是自2015年以来，我国陆续有报道樱桃谷肉鸭出现了不明原因的喙短舌外伸、生长缓慢、体重减轻等症状，临床剖检表现为胸腺肿大，有明显的出血点，肝脏、脾脏轻度出血。经实验室诊断发现造成该病症的主要原因为一种新型鹅细小病毒的感染，暂时命名为樱桃谷鸭源细小病毒——新型鹅细小病毒(NGPV)，该新型鹅细小病毒与传统鹅细小病毒核酸相似率高达95％以上。
通过对GPV与NGPV基因组的序列分析，根据VP1保守区域中这两种病毒的特异性差异来将二者区分。目前，已经建立了检测传统鹅细小病毒病原的PCR、荧光定量PCR、鹅细小病毒与番鸭细小病毒双重PCR方法等，但是没有相关报道能检测传统鹅细小病毒与该新型鹅细小病毒(樱桃谷鸭源细小病毒)混合感染的方法，因此急需一种特异性好灵敏度高的方法来检测传统鹅细小病毒与该新型鹅细小病毒混合感染的状况。
(三)发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种快速鉴定鹅细小病毒与樱桃谷鸭源细小病毒的双重PCR方法，主要是设计并筛选了新的特异性引物，优化了反应过程中的各种参数，利用本组引物建立的针对鹅细小病与樱桃谷鸭源细小病毒的双重PCR方法特异性强、敏感性高，可以快速准确地进行鹅细小病毒和新型樱桃谷鸭源细小病毒的鉴定。
一种快速鉴定鹅细小病毒与樱桃谷鸭源细小病毒的双重PCR方法，其步骤如下：
A、常规方法提取待测鸭各个脏器组织DNA作为模板，进行PCR反应；反应体系为：1μL组织DNA、含有50mM KCl,10mM Tris-HCl，pH值为8.3的1×PCR buffer、1.5mM MgCl2、0.15mM dNTPs、1U Taq DNA Polymerase、引物SEQ 1、SEQ 2各1μL，引物SEQ3 0.7μL、SEQ40.5μL；加水补齐至25μL。PCR扩增程序为：95℃7min；95℃45s，50℃45s，72℃55s，共33个循环；最后72℃延伸10min；
B、对步骤A得到的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测：
如果从样品中扩增出了779bp和147bp的产物或者单独扩增出147bp的特异性条带，则该样品为樱桃谷鸭源细小病毒阳性，鹅细小病毒阴性；如果从样品中扩增出了779bp和580bp的产物或者单独扩增出580bp的特异性条带，则该样品为鹅细小病毒阳性，樱桃谷鸭源细小病毒阴性；如果同时扩增出了779bp、580bp和147bp的产物，则该样品为鹅细小病毒和樱桃谷鸭源细小病毒同时存在；如果未扩增出779bp、147bp和580bp的产物，则该样品不含有鹅细小病毒和樱桃谷鸭源细小病毒。
所述的特异性引物如下：
SEQ 1：5’-AGACTTATCAACAACCAT(C)T-3’，
SEQ 2：5’-TCACTTATTCCTGCTGTAG-3’，
SEQ 3：5’-CCGTTCCCGTCGGATGTC(G)-3’，
SEQ 4：5’-CATCATCCGTAAAAACTTGG-3’；
所有引物以无菌ddH2O配成25μM的浓度备用。
本发明的创新性主要体现在三个方面：
1、本发明建立的双重PCR方法特异性大大提高。为减少PCR反应过程中的非特异扩增问题(假阳性、假阴性及可疑扩增)，本发明实际上对鹅细小病毒和樱桃谷鸭源细小病毒均建立了通过三条引物同时扩增某一病毒的两种核酸片段的双重PCR方法(也称为半套式双重PCR)来提高PCR反应的特异性，这在水禽细小病毒以往的检测手段中是没有的。
2、本发明建立的双重PCR方法灵敏度大大提高，最低可检测到100个拷贝鹅细小病毒和樱桃谷鸭源细小病毒的DNA。利用该组引物建立的双重PCR方法对山东、江苏、安徽等不同地区12个樱桃谷肉鸭鸭群120只疑似病死鸭的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、脑、法氏囊等10个组织脏器进行PCR检测，结果发现本研究建立的双重PCR方法个体检出率为80.8％，比普通PCR方法的75.8％的检出率高5％；同时，各个脏器的检出率最高为肝脏(93.8％)，平均为56.5％，并且在脑部检出该病毒，检出率为7.2％。而普通PCR方法各个脏器的检出率最高为肝脏(62.6％)，最低为脑部(未检出)，平均为34.5％。由于内引物是以外引物的PCR产物为模板进行扩增，大大提高了检出的灵敏度，即使在外引物扩增的量很少的情况下，经过内引物的扩增，也可大大提高扩增的效率和检出率。在实际检测中，每只病死鸭在检测10个脏器的基础上进行诊断是不太现实的，在检出脏器不多的情况下，半套式PCR方法比普通PCR方法的检出率更具优势，如肝脏(93.8％/62.6％)，脾脏(91.2％/57.1％)，肾脏(89.7/58.2％)。对山东地区10只分离到鹅细小病毒的鹅病理组织进行检测，结果发现表明该方法比普通PCR检测的脏器平均检出率高15％，说明本发明建立的双重PCR方法敏感性更高，适用于GPV和NGPV的快速鉴定。
3、本发明建立的双重PCR方法重复性好、可信度高，同时又价格低廉、操作相对简单，适用于大规模流行病学调查。本发明经过1500份样品的检测证明具有很好的可信度，并且只需要普通PCR仪即可进行，由于引物合成价格已经非常便宜，本专利反应成本与普通PCR反应相差无几，实验操作也相对简单，适用于目前我国的畜牧业生产实际。
(四)附图说明
图1双重PCR特异性检测结果
M,DL2000；1,樱桃谷鸭源细小病毒(NGPV)；2,鹅细小病毒(GPV)；3,鹅细小病毒和樱桃谷鸭源细小病毒混合DNA样品；4,鸭瘟病毒(DPV)；5,鸭圆环病毒(Ducv)；6,鸭乙型肝炎病毒(DHBV)；7,鸭疫里默氏杆菌(Ra)；8,沙门氏菌(Salmonella)；9,大肠杆菌(E.coli)；10,阴性对照.
图1显示：使用建立的双重PCR方法进行特异性检测，结果发现，针对单独感染樱桃谷鸭源细小病毒的鸭病理组织DNA，扩增出779bp和147bp的两条目的条带；针对单独感染鹅细小病毒的鹅病理组织DNA，扩增出779bp和580bp的两条目的条带；针对NGPV和GPV混合感染的组织DNA，扩增出779bp、580bp和147bp的三条目的条带；而针对鸭瘟(DPV)、鸭圆环病毒(DuCV)、鸭乙型肝炎病毒(DHBV)、鸭疫里默氏杆菌(Ra)、沙门氏菌(Salmonella)和大肠杆菌(E.coli)的病原DNA，均没有扩增产物。这说明本发明建立的检测GPV和NGPV的双重PCR方法具有很强的特异性。
图2双重PCR针对GPV和NGPV模板DNA的敏感性检测结果
M,DL2000；1-10,分别为按10倍梯度稀释的1010-101拷贝的GPV和NGPV模板DNA
图2显示：以不同拷贝数的含有GPV和NGPV通用引物扩增出的779bp片段的阳性质粒为模板，对双重PCR的扩增灵敏度进行检测，结果表明，本发明建立的双重PCR灵敏度高，最低可分别检测出含有100个拷贝的GPV和NGPV病毒DNA。
(五)具体实施方式
1引物设计
通过对参考GenBank上已发表的GPV和NGPV的序列进行比对，选择在GPV和NGPV的VP1保守区分别设计一对针对GPV和NGPV的通用特异性引物SEQ 1/SEQ 2，传统鹅细小病毒特异性引物SEQ3和樱桃谷鸭源细小病毒(新型鹅细小病毒)特异性引物SEQ4，利用常规方法对两种GPV和NGPV病毒样品进行扩增。
SEQ 1：5’-AGACTTATCAACAACCAT(C)T-3’，
SEQ 2：5’-TCACTTATTCCTGCTGTAG-3’，
SEQ 3：5’-CCGTTCCCGTCGGATGTC(G)-3’，
SEQ 4：5’-CATCATCCGTAAAAACTTGG-3’；
GPV与NGPV的通用引物SEQ 1/SEQ 2扩增片段大小为779bp，GPV的特异性引物SEQ2/SEQ 3扩增片段大小为580bp，NGPV的特异性引物SEQ 1/SEQ 4扩增片段大小为147bp。所有引物以无菌ddH2O配成25μM的浓度备用。
2DNA提取
使用常规方法提取细小病毒感染鸭各种组织的总DNA作为模板。
3双重PCR条件的优化
对PCR反应用引物、dNTPs、Buffer的浓度，及退火温度等参数进行优化，得到双重PCR最佳反应体系和反应程序。
反应总体积为25μL，最佳反应体系为：1μL组织DNA、含有50mM KCl,10mM Tris-HCl，pH值为8.3的1×PCR buffer、1.5mM MgCl2、0.15mM dNTPs、1U Taq DNA Polymerase、1μM的引物SEQ 1和SEQ 2，0.7μM的引物SEQ3、0.5μM的引物SEQ4，加水补齐至25μL。
PCR扩增程序为：95℃7min；95℃45s，50℃45s，72℃55s，共33个循环；最后72℃延伸10min。
4特异性试验
分别以鸭瘟(DPV)、鸭圆环病毒(DuCV)、鸭乙型肝炎病毒(DHBV)、鸭疫里默氏杆菌(Ra)、沙门氏菌(Salmonella)和大肠杆菌(E.coli)的病原DNA为模板，用上述优化的条件进行双重PCR检测，同时用GPV和NGPV单独感染以及用GPV和NGPV混合感染的组织DNA做阳性对照，用健康鸭肝提取的DNA做阴性对照，进行双重PCR的特异性检测。对双重PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果可知，建立的双重PCR方法只能特异性的针对GPV和NGPV的单独或混合感染进行扩增，对其他家禽常发病的病原扩增为阴性，可作为特异性鉴定GPV、NGPV的快速方法(见图1)。
5敏感性试验
将分别含有SEQ1与SEQ2扩增出的779bp片段鹅细小病毒基因和樱桃谷鸭源细小病毒基因连接至pMD18-T载体，转化大肠杆菌，挑取阳性菌落培养，使用质粒纯化试剂盒(QIAprep Spin Miniprep kit,购自QiagenT公司)制备纯化的质粒并进行核酸定量，计算出拷贝数，按照109拷贝/μL～101拷贝/μL的浓度进行10倍梯度稀释，分别取1μL各稀释度的质粒DNA作为模板，按步骤3)所述优化好的反应体系及反应条件进行双重PCR的扩增灵敏度检测。结果可知该双重PCR方法最低可检测到100个拷贝的病毒DNA(见图2)。
6临床样本检测
利用该组引物建立的双重PCR方法对山东、江苏、安徽等不同地区12个樱桃谷肉鸭鸭群120只疑似病死鸭的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、脑、法氏囊等10个组织脏器进行PCR检测，结果发现本研究建立的双重PCR方法个体检出率为80.8％，比普通PCR方法的75.8％的检出率高5％；同时，各个脏器的检出率最高为肝脏(93.8％)，平均为56.5％，并且在脑部检出该病毒，检出率为7.2％。而普通PCR方法各个脏器的检出率最高为肝脏(62.6％)，最低为脑部(未检出)，平均为34.5％。由于内引物是以外引物的PCR产物为模板进行扩增，大大提高了检出的灵敏度，即使在外引物扩增的量很少的情况下，经过内引物的扩增，也可大大提高扩增的效率和检出率。在实际检测中，每只病死鸭在检测10个脏器的基础上进行诊断是不太现实的，在检出脏器不多的情况下，半套式PCR方法比普通PCR方法的检出率更具优势，如肝脏(93.8％/62.6％)，脾脏(91.2％/57.1％)，肾脏(89.7/58.2％)。对山东地区10只分离到鹅细小病毒的鹅病理组织进行检测，结果发现表明该方法比普通PCR检测的脏器平均检出率高15％，说明本发明建立的双重PCR方法敏感性更高，适用于GPV和NGPV的快速鉴定。

Claims (1)

1.一种用于非诊疗目的的快速鉴定鹅细小病毒与樱桃谷鸭源细小病毒的双重PCR方法，其特征在于步骤如下：
A、常规方法提取待测鸭各个脏器组织DNA作为模板，进行PCR反应；反应体系为：1 μL组织DNA、含有50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl，pH值为8.3的1× PCR buffer、1.5 mM MgCl2、0.15 mM dNTPs、1 U Taq DNA Polymerase、引物SEQ 1、SEQ 2各1 μL ，引物SEQ3 0.7 μL、SEQ4 0.5μL；加水补齐至25μL；PCR扩增程序为：95℃ 7min；95℃ 45s，50℃ 45s，72℃ 55s，共33个循环；最后72℃延伸10min；
B、对步骤A得到的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测：
如果从样品中扩增出了779bp和147bp的产物或者单独扩增出147bp的特异性条带，则该样品为樱桃谷鸭源细小病毒阳性，鹅细小病毒阴性；如果从样品中扩增出了779bp和580bp的产物或者单独扩增出580bp的特异性条带，则该样品为鹅细小病毒阳性，樱桃谷鸭源细小病毒阴性；如果同时扩增出了779bp、580bp和147bp的产物，则该样品为鹅细小病毒和樱桃谷鸭源细小病毒同时存在；如果未扩增出779bp、147bp和580bp的产物，则该样品不含有鹅细小病毒和樱桃谷鸭源细小病毒；
所述的特异性引物如下：
SEQ 1：5’- AGACTTATCAACAACCAT(C)T -3’，
SEQ 2：5’- TCACTTATTCCTGCTGTAG -3’，
SEQ 3：5’- CCGTTCCCGTCGGATGTC(G) -3’，
SEQ 4：5’- CATCATCCGTAAAAACTTGG -3’。
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