CN103146848B - 用于鉴别鸭瘟病毒的引物组合物及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了用于鉴别鸭瘟病毒的引物组合物及试剂盒，属于动物医学领域。所述引物组合物，由上游引物和下游引物组成，所述上游引物和下游引物的序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。所述试剂盒，包括引物组合物、PCR缓冲液、dNTPs和ExTaq酶。采用本发明引物组合物或试剂盒能够鉴别样品是否含有鸭瘟病毒；如果有鸭瘟病毒，究竟是欧洲强毒株、中国强毒株、中国疫苗株（弱毒株）VAC株还是中国疫苗株（弱毒株）Clone-03株。本发明检测方法具有特异、快速、简便、灵敏和经济的优点，适用于科研、生产和临床及出入境检测等，应用前景广阔。
Description
技术领域
本发明涉及动物医学领域，具体涉及用于鉴别鸭瘟病毒的引物组合物及试剂盒。
背景技术
鸭瘟病毒（Duck
Enteritis Virus）是引起鸭瘟（Duck Plague）的病原，属于一种疱疹病毒，能感染48种以上的雁形目的家禽和野生禽类。鸭瘟，又称鸭病毒性肠炎，是一种急性传染病，其发病率和病死率可达100%，鸭瘟的病变包括血管损伤，胃肠道粘膜的进行性变化，淋巴器官病变和实质性器官的退行性变化。接种鸭瘟弱毒疫苗是控制该病的有效方法。鸭瘟病毒能在三叉神经节形成持续性感染。鸭瘟病毒的诊断方法有病毒中和试验（NT）、酶联免疫吸附试验（ELISA）和 PCR试验等。NT、ELISA和普通的PCR方法只能诊断是否是鸭瘟病毒，但无法鉴别鸭瘟病毒是强毒株还是弱毒株。公开的发明专利“一种鉴别鸭瘟病毒强毒与疫苗毒的PCR检测方法”（申请号：201210116719.2），通过UL2基因差异区分鸭瘟病毒强、弱毒株，但此方法仅能鉴别鸭瘟病毒是强毒还是弱毒，而无法鉴别鸭瘟病毒是欧洲源的强毒，还是中国源的强毒，也无法鉴别是中国的疫苗毒（弱毒）的VAC株或是Clone-03株。
发明内容
本发明的目的是提供用于鉴别鸭瘟病毒的引物组合物，特异性强，能够鉴别样品是否感染鸭瘟病毒；如果样品感染鸭瘟病毒，究竟是欧洲强毒株、中国强毒株、中国疫苗株（弱毒株）VAC株还是中国疫苗株（弱毒株）Clone-03株。
本发明的另一目的是提供用于鉴别鸭瘟病毒的试剂盒，能够鉴别样品是否感染鸭瘟病毒；如果样品感染鸭瘟病毒，究竟是欧洲强毒株、中国强毒株、中国疫苗株（弱毒株）VAC株还是中国疫苗株（弱毒株）Clone-03株。
本发明的再一目的是提供上述引物组合物的应用。
用于鉴别鸭瘟病毒的引物组合物，由上游引物和下游引物组成，所述上游引物和下游引物的序列分别如SEQ
ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。
所述上游和下游引物的浓度为0.01mol/ml。
用于鉴别鸭瘟病毒的试剂盒，包括所述引物组合物、PCR缓冲液、dNTPs和ExTaq酶。
所述dNTPs为dATP、dTTP、dGTP和dCTP的等浓度混合物，所述dATP、dTTP、dGTP或dCTP的浓度均为2.5Mm。
所述引物组合物在制备用于鉴别鸭瘟病毒的试剂盒中的应用。
一种应用所述引物组合物鉴别鸭瘟病毒的方法：
（1）提取待检样品的DNA；
（2）以步骤（1）中所述DNA为模板，用权利要求1或2所述引物组合物为引物，进行PCR扩增反应，获得PCR产物；
（3）将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，判断所述PCR产物的长度；当PCR产物长度为4430-4460bp时，待检样品感染中国来源的鸭瘟病毒强毒株；当PCR产物长度为3260-3290bp时，待检样品感染欧洲来源的鸭瘟病毒强毒株；当PCR产物长度为920-950bp，待检样品感染中国来源的鸭瘟病毒VAC株；当PCR产物长度为2510-2540bp，待检样品感染中国来源的鸭瘟病毒Clone-03。
所述中国来源的鸭瘟病毒强毒株为鸭瘟病毒LH2011株和CHv株中的一种或两种；所述欧洲来源的鸭瘟病毒强毒株为鸭瘟病毒Jansen、Holland、D11-JW-016和v2085株中的一种或两种以上。
步骤（2）中PCR扩增反应的条件为： 94℃预变性3min；94℃变性30sec，52℃退火40sec，72℃延伸3min40sec，循环40次；最后72℃延伸10min。
本发明提供的引物组合物或试剂盒，能够鉴别样品是否感染了鸭瘟病毒；如果感染鸭瘟病毒，究竟是欧洲强毒株、中国强毒株、中国疫苗株（弱毒株）VAC株还是中国疫苗株（弱毒株）Clone-03株。
采用本发明的引物组合物或试剂盒鉴别鸭瘟病毒，快速、简便，特异性和敏感性强，而且成本低廉。适用于临床诊断，科学研究，疫苗生产和出入境检测等，应用前景广阔。
附图说明：
图1为不同毒株鸭瘟病毒的LORF11等位基因序列的比较。图中Jansen、Holland、D11-JW-016和v2085株是欧洲鸭瘟强毒株，LH2011和CHv株是中国鸭瘟强毒株，VAC株和Clone-03株是中国疫苗株。该图中，具有相同填充的条带表示相同序列或者仅有个别碱基发生同义或非同义替代的序列；线条引出标注了各段条带的序列长度。
图2为应用本发明试剂盒鉴别鸭瘟病毒毒株的电泳图。图中M：DNA Marker；Lane 1：以鸭瘟病毒v2085株为模板的PCR产物；Lane 2：以鸭瘟病毒LH2011株为模板的PCR产物；Lane 3：以鸭瘟病毒VAC株为模板的PCR产物；Lane 4：以鸭瘟病毒Clone-03株为模板的PCR产物；Lane 5为以鸡胚成纤维细胞为模板的PCR产物。
图3为本发明试剂盒特异性试验的电泳图。图中M：DNA Marker；Lane 1：以鸭瘟病毒v2085株为模板的PCR产物；Lane 2：以鸭瘟病毒LH2011株为模板的PCR产物；Lane 3：以鸭瘟病毒VAC株为模板的PCR产物；Lane 4：以鸭瘟病毒Clone-03株为模板的PCR产物；Lane5-14：分别以鸭病毒性肝炎病毒、番鸭细小病毒、禽流感病毒、鸭沙门氏菌、巴氏杆菌、鸭大肠杆菌、鸭疫里默氏菌、传染性法氏囊病病毒、鸡新城疫病毒和鸭坦布苏病毒为模板的PCR产物。
图4本发明试剂盒对鸭瘟病毒LH2011株LD50敏感性试验的电泳图；其中M-Marker，泳道1-9均为PCR产物，其DNA模板分别提取于：稀释10倍、102倍、103倍、104倍、105倍、106倍、107倍、108倍和109倍的组织提取物。
图5为本发明试剂盒对鸭瘟病毒VAC株TCID50敏感性试验的电泳图；其中M-Marker，泳道1-9均为PCR产物，其DNA模板分别提取于：稀释10倍、102倍、103倍、104倍、105倍、106倍、107倍、108倍和109倍的组织提取物。
图6为本发明试剂盒对鸭瘟病毒Clone-03株TCID50敏感性试验的电泳图；其中M-Marker，泳道1-9均为PCR产物，其DNA模板分别提取于：稀释10倍、102倍、103倍、104倍、105倍、106倍、107倍、108倍和109倍的组织提取物。
图7为本发明试剂盒对鸭瘟病毒v2085株LD50敏感性试验的电泳图；其中M-Marker，泳道1-9均为PCR产物，其DNA模板分别提取于：稀释10倍、102倍、103倍、104倍、105倍、106倍、107倍、108倍和109倍的组织提取物。
图8本发明试剂盒检测鸭组织样本得到的电泳图。图中M：DNA Marker；Lane 1为以鸭瘟病毒v2085株感染鸭的肝脏样品为模板的PCR产物；Lane 2为以鸭瘟病毒LH2011株感染鸭的肝脏样品为模板的PCR产物；Lane 3为以鸭瘟病毒VAC株接种鸭的肝脏样品为模板的PCR产物；Lane 4为以鸭瘟病毒Clone-03株接种鸭的肝脏样品为模板的PCR产物；Lane 5为以健康鸭肝脏样品为模板的PCR产物。
具体实施方式：
实施例
1
用于鉴别鸭瘟病毒的试剂盒的组成
本发明用于鉴别鸭瘟病毒的试剂盒，包括如下试剂：
（1）引物组合物，由上游引物Primer F和下游引物Primer R组成，其序列如下：
上游引物Primer F（SEQ ID NO:1）: 5’-CATCTCGTGTCAGTTAAAGG-3’，
下游引物Primer R（SEQ
ID NO:2）: 5’- AAAACAAGAGTCAAGAGCCG-3’。
上游和下游引物的浓度均为0.01mol/ml。制备方法为：由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。
引物设计过程：发明人应用Invitrogen软件，参考现公开发表的全部鸭瘟病毒株的LORF11等位基因序列（GenBank登录号：Jansen株，JQ430740.1；Holland株，JQ595417.1；D11-JW-016株，JQ430739.1；V2085株，JF999965.1；LH2011株，JX885588；CHv株，JQ647509.1；VAC株，EU082088.2；Clone-03株，EU294364.1），在其开放阅读框的上游5bp和下游101bp的位置分别设计了引物Primer F和Primer R。
鸭瘟病毒Jansen、Holland、D11-JW-016和v2085株是欧洲强毒株，鸭瘟病毒LH2011和CHv株是中国强毒株，鸭瘟病毒VAC株和Clone-03株是中国疫苗株（弱毒株）。发明人分析了鸭瘟病毒欧洲强毒株、中国强毒株及中国弱毒株的LORF11等位基因序列，具体见图1。鸭瘟病毒欧洲强毒株的LORF11等位基因的开放阅读框（ORF）为3171bp。鸭瘟病毒中国强毒株的LORF11等位基因序列中则发生了基因片段的插入，使其等位核苷酸序列变为4342bp，同时ORF也发生改变，变为LORF11A和LORF11B两个ORF。鸭瘟病毒VAC株（中国疫苗株）的LORF11等位基因大小为828bp，鸭瘟病毒Clone-03（中国疫苗株）的LORF11等位基因大小为2412bp。另外，发明人发现上述各病毒株LORF11等位基因开放阅读框的上游50bp和下游150bp序列高度同源，因此在其开放阅读框的上游5bp和下游101bp的位置分别设计了引物Primer F和Primer R。采用引物Primer F和Primer R，欧洲强毒株的理论扩增长度为3277bp，中国强毒株的理论扩增长度为4448bp，鸭瘟病毒VAC株的理论扩增长度为934bp，鸭瘟病毒Clone-03株的理论扩增长度为2518bp。申请人选择鸭瘟病毒VAC株、Clone-03株，从欧洲来源的强毒株中选择v2085株，从中国来源的强毒株中选择LH2011株，来验证本发明引物组合物及试剂盒的作用、特异性、灵敏度。
（2）10×PCR缓冲液购自大连宝生物工程有限公司。
（3）dNTPs，为dATP、dTTP、dGTP和dCTP的等浓度混合物，所述dATP、dTTP、dGTP或dCTP的浓度均为2.5mM，购自大连宝生物工程有限公司
（4）ExTaq酶购自大连宝生物工程有限公司，5U/μL。
实施例
2
应用本发明试剂盒鉴别不同来源的鸭瘟病毒毒株
1、材料
9日龄SPF鸡胚，用于制备鸡胚成纤维细胞。
鸭瘟病毒LH2011株，是中国强毒株，由本试验室分离鉴定，对鸭的最小致死剂量为10-5~10-7/mL。
鸭瘟病毒v2085株，是欧洲强毒株，由德国柏林自由大学兽医学院病毒研究所惠赠，对鸭的最小致死剂量为10-4~10-5/mL。（Wang, J., D. Höper, et al. ( 2011 ). "Complete genome sequence
of virulent duck enteritis virus (DEV) strain 2085 and comparison with genome
sequences of virulent and attenuated DEV strains." Virus Res. 160(1-2):
316-325.）
鸭瘟病毒VAC株：中国疫苗株，是弱毒株，来自南京天邦生物科技有限公司。（Li, Y., B. Huang, et al. (2009).
"Molecular characterization of the genome of duck enteritis virus."
Virology 391(2): 151-161。
Wang,
J., D. Höper, et al. ( 2011 ). "Complete genome sequence of virulent duck
enteritis virus (DEV) strain 2085 and comparison with genome sequences of
virulent and attenuated DEV strains." Virus Res. 160(1-2): 316-325.））
鸭瘟病毒Clone-03株：中国疫苗株，是弱毒株，来自南京天邦生物科技有限公司。（Wang,
J., D. Höper, et al. ( 2011 ). "Complete genome sequence of virulent duck
enteritis virus (DEV) strain 2085 and comparison with genome sequences of
virulent and attenuated DEV strains." Virus Res. 160(1-2): 316-325.）
ExTaq酶和PCR反应试剂，购自大连宝生物工程有限公司。
2、实验方法
2.1 鸡胚成纤维细胞的制备
参照《中华人民共和国兽用生物制品规程》2000版附录所述方法进行。
2.2 鸭瘟病毒的增殖与病毒样本提取
鸭瘟病毒LH2011株和v2085株分别取10倍最小致死剂量肌肉接种2月龄健康非免鸭，待鸭只发病后，取鸭只的肝脏等约0.1-0.5g，加入10倍量无菌纯水，研磨后，反复冻融3次，8000rpm离心15min，取上清作为组织提取物备用。鸭瘟病毒VAC株和Clone-03株分别按0.01的感染复数感染鸡胚成纤维细胞，当细胞病变（CPE）达60%-70%时，将上清与细胞一起反复冻融3次，8000rpm离心15min，取上清作为组织提取物备用。同时设未感染鸭瘟病毒的鸡胚成纤维细胞为对照，按感染病毒的细胞相同的方法处理。
2.3 病毒DNA提取
按照下述方法，分别提取各组织提取物的病毒DNA。
病毒DNA的提取：①取组织提取物制备的上清液445μL，加入10%SDS50μL，20mg/mL蛋白酶K2.5μL，混匀；置56℃水浴1h，99℃水浴10min，冷却至室温；②加入Tris饱和酚200μL，混匀，4℃、12000rpm条件下离心5min，取上清。重复2次；③加入Tris饱和酚100μL和氯仿100μL，混匀，4℃、12000rpm条件下离心5min，取上清；④加入1/10体积的3mol/L的醋酸钠，和1-2倍体积无水乙醇，上下颠倒混匀，置-20℃条件下40min至数天；⑤4℃、12000rpm条件下离心20min，弃上清，沉淀用70%乙醇洗涤，4℃、12000rpm条件下离心1min，弃上清，洗涤2次；⑥置超净台中风干，加入20-100μL无菌纯水溶解，作为病毒DNA备用。
2.4 PCR反应
以各病毒DNA为模板，分别进行PCR反应。
PCR反应体系如下：
| 病毒DNA | 1μL |
| ExTaq酶 | 0.5μL |
| Primer F(10pmol/μL) | 2μL |
| Primer R(10pmol/μL) | 2μL |
| dNTPs(2.5 mM each) | 4μL |
| 10×PCR缓冲液 | 5μL |
| Mg2+(25mM) | 4μL |
| ddH2O | 31.5μL |
PCR反应体系经2000rpm离心瞬间混匀后进行PCR反应。
PCR反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30sec，52℃退火40sec，72℃延伸3min40sec，循环40次；最后72℃延伸10min。PCR产物于4℃保存，待检。
取各PCR产物5μL与Marker一起分别点入1%琼脂糖凝胶上，电泳40min，在紫外灯照射下观察扩增片段的长度。
3、PCR结果
如图2所示，以鸭瘟病毒LH2011株为模板的PCR产物为4430-4460bp；以鸭瘟病毒v2085株为模板的PCR产物为3260-3290bp；以鸭瘟病毒VAC株为模板的PCR产物为920-950bp；以鸭瘟病毒Clone-03株为模板的PCR产物为2510-2540bp；以未接毒鸡胚成纤维细胞样品为模板的无条带。
将模板为鸭瘟病毒LH2011株、v2085株、VAC株、Clone-03株DNA的PCR产物分别进行测序，发现其大小分别为4448bp、3277bp、934bp和2518bp，而且序列正确。该结果与电泳结果相符合。
本实施例检测结果说明：本发明试剂盒可以区分鸭瘟病毒为中国毒株还是欧洲毒株；如果是中国毒株，那么是强毒株还是弱毒株；如果是弱毒株究竟是VAC株还是Clone-03。具体判断方法为：将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，判断PCR产物的长度；当PCR产物长度为4430-4460bp时，待检样品感染中国来源的鸭瘟病毒强毒株LH2011株或CHv株，或者待检样品同时感染鸭瘟病毒LH2011株和CHv株；当PCR产物长度为3260-3290bp时，待检样品感染欧洲来源的鸭瘟病毒强毒株Jansen、Holland、D11-JW-016和v2085株中的一种、两种、三种或四种；当PCR产物长度为920-950bp，待检样品感染中国来源的鸭瘟病毒VAC株；当PCR产物长度为2510-2540bp，待检样品感染中国来源的鸭瘟病毒Clone-03。
实施例
3
本发明试剂盒的特异性试验。
1.材料
9日龄SPF鸡胚，用于制备鸡胚成纤维细胞。
RT-PCR反应试剂，购自大连宝生物工程有限公司。
鸭瘟病毒LH2011株、鸭瘟病毒v2085株、鸭瘟病毒VAC株和鸭瘟病毒Clone-03株的来源同上。
鸭坦布苏病毒 JS/2010为申请人分离鉴定。
禽流感病毒CCTCC-V200312购自中国典型培养物保藏中心。
鸭疫里默氏菌 ATCC 11845购自美国标准菌种收藏所。
鸭沙门氏菌CMCC 50083购自中国医学微生物菌种保藏管理中心。
下述毒株购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心：鸭大肠杆菌CVCC 83003、鸭病毒性肝炎病毒CVCC AR2111、番鸭细小病毒CVCC
AV238、传染性法氏囊病病毒 CVCC AV140、鸡新城疫病毒 CVCC AV1615、巴氏杆菌 CVCC
471。
2.实验方法
DNA病毒和细菌按常规方法培养后，分别提取DNA作为模板，采用本发明试剂盒进行PCR反应。
RNA病毒按照常规方法培养后，提取RNA，反转录后得到cDNA，以cDNA为模板采用本发明试剂盒进行PCR反应。
PCR反应体系如下：
| 病毒DNA或cDNA | 1μL |
| ExTaq酶 | 0.5μL |
| Primer F(10pmol/μL) | 2μL |
| Primer R(10pmol/μL) | 2μL |
| dNTPs(2.5 mM each) | 4μL |
| 10×PCR缓冲液 | 5μL |
| Mg2+(25mM) | 4μL |
| ddH2O | 31.5μL |
PCR反应体系经2000rpm离心瞬间混匀后进行PCR反应。
PCR反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30sec，52℃退火40sec，72℃延伸3min40sec，循环40次；最后72℃延伸10min。PCR产物于4℃保存待检。
取各PCR产物5μL与Marker一起分别点入1%琼脂糖凝胶上，电泳40min，在紫外灯照射下观察扩增片段的长度。
3.PCR产物的电泳图及分析
如图3所示，以鸭瘟病毒LH2011株为模板的PCR产物为4430-4460bp；以鸭瘟病毒v2085株为模板的PCR产物为3260-3290bp；以鸭瘟病毒VAC株为模板的PCR产物为920-950bp；以鸭瘟病毒Clone-03株为模板的PCR产物为2510-2540bp；其他各样品为模板的无条带。
将模板为鸭瘟病毒LH2011株、v2085株、VAC株、Clone-03株的PCR产物分别进行测序，发现其大小分别为4448bp、3277bp、934bp和2518bp，而且序列正确。该结果与电泳结果相符合。
特异性检测结果说明：本发明引物组合物具有很好的特异性，其他传染病病原采用本发明引物组合物进行PCR扩增，不会出现条带，即不会出现假阳性。
实施例
4
本发明试剂盒对各病毒
LD50
或
TCID50
的敏感性试验
1、材料
9日龄SPF鸡胚
鸭瘟病毒LH2011株、鸭瘟病毒v2085株、鸭瘟病毒VAC株和鸭瘟病毒Clone-03株的来源同上。
2、实验方法
2.1 鸡胚成纤维细胞的制备
参照《中华人民共和国兽用生物制品规程》2000版附录所述方法进行。
2.2 鸭瘟病毒的增殖与病毒样本提取
鸭瘟病毒LH2011株和v2085株分别取10倍最小致死剂量肌肉接种2月龄健康非免鸭，待鸭只发病后，取鸭只的肝脏等约0.1-0.5g，加入10倍量无菌纯水，研磨后，反复冻融3次，8000rpm离心15min，取上清作为组织提取物备用。测定两种病毒样品组织提取物的LD50，并将各组织提取物应用生理盐水10倍梯度稀释，直到稀释度为10-9。
鸭瘟病毒VAC株和Clone-03株分别按0.01的感染复数感染鸡胚成纤维细胞，当细胞病变（CPE）达60%-70%时，将上清与细胞一起反复冻融3次，8000rpm离心15min，取上清作为组织提取物备用。测定两种病毒样品组织提取物的TCID50，并将各组织提取物应用生理盐水10倍梯度稀释，直到稀释度为10-9。
2.3 病毒DNA提取
对每种病毒样品组织提取物的各稀释液分别提取病毒DNA。
病毒DNA的提取：①取病毒样品组织提取物的稀释液445μL，加入10%SDS50μL，20mg/mL蛋白酶K 2.5μL，混匀；置56℃水浴1h，99℃水浴10min，冷却至室温；②加入Tris饱和酚200μL，混匀，4℃、12000rpm条件下离心5min，取上清。重复2次；③加入Tris饱和酚100μL和氯仿100μL，混匀，4℃、12000 rpm条件下离心5min，取上清；④加入1/10体积的3mol/L的醋酸钠，和1-2倍体积无水乙醇，上下颠倒混匀，置-20℃条件下40min至数天；⑤4℃、12000 rpm条件下离心20min，弃上清，沉淀用70%乙醇洗涤，4℃、12000rpm条件下离心1min，弃上清，洗涤2次；⑥置超净台中风干，加入20-100μL无菌纯水溶解即得病毒DNA。
2.4 PCR反应
以本实施例标题2.3中各病毒DNA为模板，分别进行PCR反应。
PCR反应体系如下：
| 病毒DNA | 1μL |
| ExTaq酶 | 0.5μL |
| Primer F(10pmol/μL) | 2μL |
| Primer R(10pmol/μL) | 2μL |
| dNTPs(2.5 mM each) | 4μL |
| 10×PCR缓冲液 | 5μL |
| Mg2+(25mM) | 4μL |
| ddH2O | 31.5μL |
PCR反应体系经2000rpm离心瞬间混匀后进行PCR反应。
PCR反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30sec，52℃退火40sec，72℃延伸3min40sec，循环40次；最后72℃延伸10min。PCR反应产物于4℃保存待检。
取各PCR产物5μL与Marker一起分别点入1%琼脂糖凝胶上，电泳40min，在紫外灯照射下观察扩增片段的长度。
3、PCR产物的电泳图及分析
本发明试剂盒对鸭瘟病毒LH2011株的LD50敏感性试验电泳图如图4所示。从图4可以看出，以感染鸭瘟病毒LH2011株的组织提取物稀释105倍后提取的DNA为模板，得到的PCR产物，在电泳图中有大小为4430-4460bp的特异性条带；以感染该病毒的组织提取物稀释106倍后提取的DNA为模板，其PCR产物电泳图中没有特异性条带。因为该病毒样品组织提取物的LD50为10-3.3/0.1mL，所以此方法可以检测到0.1LD50的鸭瘟病毒LH2011株。
本发明试剂盒对鸭瘟病毒VAC株TCID50敏感性试验的电泳图如图5所示。从图5可以看出，以感染鸭瘟病毒VAC株的组织提取物稀释107倍后提取的DNA为模板，得到的PCR产物在电泳图中有920-950bp特异性条带。以该病毒的组织提取物稀释108倍后提取的DNA为模板，得到的PCR产物在电泳图种没有特异性条带。因为该病毒样品组织提取物的TCID50为10-5.5/0.1mL，所以此方法可以检测到0.1TCID50的鸭瘟病毒VAC株。
本发明试剂盒对鸭瘟病毒Clone-03株TCID50敏感性试验的电泳图如图6所示。以感染鸭瘟病毒Clone-03的组织提取物稀释106倍后提取的DNA为模板，得到的 PCR产物在电泳图中出现了2510-2540bp特异性条带。以感染该病毒的组织提取物稀释107倍后提取的DNA为模板，得到的PCR产物在电泳图中没有特异性条带。因为该病毒样品组织提取物的TCID50为10-4.5/0.1mL，所以此方法可以检测到0.1TCID50的鸭瘟病毒Clone-03株。
本发明试剂盒对鸭瘟病毒v2085株LD50敏感性试验的电泳图如图7所示。以感染鸭瘟病毒v2085株的组织提取物稀释104倍后提取的DNA为模板，得到的PCR产物在电泳图中出现了3260-3290bp特异性条带。以感染该病毒的组织提取物稀释105倍后提取的DNA为模板，得到的PCR产物在电泳图中没有特异性条带。因为该病毒样品组织提取物的LD50为10-2.6/0.1mL，所以此方法可以检测到0.1LD50的鸭瘟病毒v2085株。
实施例
5
采用本发明试剂盒鉴别鸭组织样品中的鸭瘟病毒
1、材料
60-70龄健康鸭，未曾发生鸭瘟，未接种鸭瘟弱毒活疫苗，鸭瘟抗体阴性。
鸭瘟病毒LH2011株、鸭瘟病毒v2085株、鸭瘟病毒VAC株、鸭瘟病毒Clone-03株的来源同上。
2、实验方法
2.1 鸡胚成纤维细胞的制备
参照《中华人民共和国兽用生物制品规程》2000版附录所述方法进行。
2.2 鸭瘟病毒的增殖与病毒样本提取
鸭瘟病毒LH2011株和v2085株分别取10倍最小致死剂量肌肉接种2月龄健康非免鸭，待鸭只发病后，取鸭只的肝脏约0.1-0.5g。鸭瘟病毒VAC株和Clone-03株分别按1000TCID50的量肌肉接种2月龄健康非免鸭，3天后，取鸭只的肝脏约0.1-0.5g。将肝脏加入10倍量无菌纯水，研磨后，反复冻融3次，8000rpm离心15min，取上清备作为组织提取物用。同时设未感染鸭瘟病毒的鸭肝脏为对照，按感染病毒的样品相同的方法处理得到健康鸭的组织提取物。
2.3 病毒DNA提取
按照下述方法，分别提取本实施例标题2.2中各组织提取物。
病毒DNA的提取：①取制备的组织提取物445μL，加入10%SDS 50μL，20 mg/mL蛋白酶K 2.5μL，混匀；置56℃水浴1h，99℃水浴10min，冷却至室温；②加入Tris饱和酚200μL，混匀，4℃、12000rpm条件下离心5min，取上清，重复2次；③加入Tris饱和酚100μL和氯仿100μL，混匀，4℃、12000rpm条件下离心5min，取上清；④加入1/10体积的3mol/L的醋酸钠，和1-2倍体积无水乙醇，上下颠倒混匀，置-20℃条件下40min至数天；⑤4℃、12000rpm条件下离心20min，弃上清，沉淀用70%乙醇洗涤，4℃、12000rpm条件下离心1min，弃上清，洗涤2次；⑥置超净台中风干，加入20-100μL无菌纯水溶解，即得病毒DNA。
2.4 PCR反应
以各病毒DNA为模板，分别进行PCR反应。
反应体系如下：
| DNA模板 | 1μL |
| ExTaq酶 | 0.5μL |
| Primer F(10pmol/μL) | 2μL |
| Primer R(10pmol/μL) | 2μL |
| dNTPMixture(2.5 mM each) | 4μL |
| 10×Buffer | 5μL |
| Mg2+(25mM) | 4μL |
| ddH2O | 31.5μL |
样品经2000rpm离心瞬间混匀后进行PCR反应。
PCR反应程序为：94℃预变性3min；再94℃变性30sec，52℃退火40sec，72℃延伸3min40sec，循环40次，最后72℃延伸10min，于4℃保存待检。
取各PCR产物5μL与Marker一起分别点入1%琼脂糖凝胶上，电泳40min，在紫外灯照射下观察扩增片段的长度。
3、PCR结果
如图8所示，以鸭瘟病毒v2085株感染鸭肝脏样品为模板的PCR条带为3260-3290bp（测序结果为3277bp）；鸭瘟病毒LH2011株感染鸭肝脏样品为模板的PCR条带为4430-4460bp（测序结果为4448bp）；以鸭瘟病毒VAC株接种鸭肝脏样品为模板的PCR条带为920-950bp（测序结果为934bp）；以鸭瘟病毒Clone-03株接种鸭肝脏样品为模板的PCR条带为2510-2540bp（测序结果为2518bp）；以未接种的健康鸭肝脏样品为模板的无条带。
本实施例说明，采用本发明试剂盒可以检测鸭组织中是否感染鸭瘟病毒，可以区分鸭瘟病毒为中国毒株还是欧洲毒株；如果是中国毒株，那么是强毒株还是弱毒株；如果是弱毒株究竟是VAC株还是Clone-03。具体判断方法为：将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，判断PCR产物的长度；当PCR产物长度为4430-4460bp时，待检样品感染中国来源的鸭瘟病毒强毒株LH2011株或CHv株，或者待检样品同时感染鸭瘟病毒LH2011株和CHv株；当PCR产物长度为3260-3290bp时，待检样品感染欧洲来源的鸭瘟病毒强毒株Jansen、Holland、D11-JW-016和v2085株中的一种、两种、三种或四种；当PCR产物长度为920-950bp，待检样品感染中国来源的鸭瘟病毒VAC株；当PCR产物长度为2510-2540bp，待检样品感染中国来源的鸭瘟病毒Clone-03。
SEQUENCE LISTING
<110>
江苏省农业科学院
<120>
用于鉴别鸭瘟病毒的引物组合物及试剂盒
<130>
20130407
<160>
2
<170>
PatentIn version 3.3
<210>
1
<211>
20
<212>
DNA
<213>
artificial
<220>
<223>
上游引物
<400>
1
catctcgtgt
cagttaaagg
20
<210>
2
<211>
20
<212>
DNA
<213>
artificial
<220>
<223>
下游引物
<400>
2
aaaacaagag
tcaagagccg
20
Claims (8)
1.用于鉴别鸭瘟病毒的引物组合物，由上游引物和下游引物组成，所述上游引物和下游引物的序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。
2.根据权利要求1所述用于鉴别鸭瘟病毒的引物组合物，其特征在于：所述上游和下游引物的浓度为0.01mol/ml。
3.用于鉴别鸭瘟病毒的试剂盒，包括权利要求1或2所述引物组合物、PCR缓冲液、dNTPs和ExTaq酶。
4.根据权利要求3所述用于鉴别鸭瘟病毒的试剂盒，其特征在于:所述dNTPs为dATP、dTTP、dGTP和dCTP的等浓度混合物，所述dATP、dTTP、dGTP或dCTP的浓度均为2.5mM。
5.权利要求1或2所述引物组合物在制备用于鉴别鸭瘟病毒的试剂盒中的应用。
6.应用权利要求1或2所述引物组合物鉴别鸭瘟病毒的用途，
（1）提取待检样品的DNA；
（2）以步骤（1）中所述DNA为模板，用权利要求1或2所述引物组合物为引物，进行PCR扩增反应，获得PCR产物；
（3）将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，判断所述PCR产物的长度；当PCR产物长度为4430-4460bp时，待检样品感染中国来源的鸭瘟病毒强毒株；当PCR产物长度为3260-3290bp时，待检样品感染欧洲来源的鸭瘟病毒强毒株；当PCR产物长度为920-950bp，待检样品感染中国来源的鸭瘟病毒VAC株；当PCR产物长度为2510-2540bp，待检样品感染中国来源的鸭瘟病毒Clone-03。
7.根据权利要求6所述应用所述引物组合物鉴别鸭瘟病毒的用途，其特征在于：所述中国来源的鸭瘟病毒强毒株为鸭瘟病毒LH2011株和CHv株中的一种或两种；所述欧洲来源的鸭瘟病毒强毒株为鸭瘟病毒Jansen、Holland、D11-JW-016和v2085株中的一种或两种以上。
8.根据权利要求7所述应用所述引物组合物鉴别鸭瘟病毒的用途，其特征在于步骤（2）中PCR扩增反应的条件为：94℃预变性3min；94℃变性30sec，52℃退火40sec，72℃延伸3min40sec，循环40次；最后72℃延伸10min。
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