CN104059998B - 一种快速鉴定鸭圆环病毒基因型的双重pcr方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种快速鉴定鸭圆环病毒基因型的双重PCR方法，通过对参考GenBank上已发表的DuCV-1和DuCV-2的序列进行比对，选择在DuCV-1和DuCV-2的保守区分别设计一对针对DuCV的通用特异性引物SEQ1/SEQ2，1型鸭圆环病毒特异性引物SEQ3和2型鸭圆环病毒特异性引物SEQ4；本发明主要是设计并筛选了新的特异性引物，优化了反应过程中的各种参数，利用本组引物建立的针对鸭圆环病毒的双重PCR分型方法特异性强、敏感性更高，可以快速准确地进行DuCV-1和DuCV-2的鉴定。

Description

一种快速鉴定鸭圆环病毒基因型的双重PCR方法
(一)技术领域
本发明所涉及的是一种用于快速鉴定鸭圆环病毒不同基因型的双重PCR方法，属于病毒分子生物学领域。
(二)背景技术
鸭圆环病毒(Duckcircovirus，DuCV)是圆环病毒科的新成员，流行病学调查显示在我国鸭群中普遍存在DuCV感染，且常与鸭疫里默氏杆菌、鸭病毒性肝炎病毒、鸭大肠杆菌等病原微生物发生混合感染。研究表明，鸭子感染DuCV后会呈现羽毛凌乱、生长迟缓、体重减轻等症状；对DuCV感染鸭的组织病理学分析显示该病毒感染主要引起鸭法氏囊淋巴细胞减少、萎缩、组织细胞增生等；原位荧光检测表明DuCV感染鸭后能够在鸭的脾脏、胸腺和法氏囊中形成明显的病灶；这表明DuCV感染会侵害鸭的免疫器官并导致免疫细胞的凋亡。尽管目前未发现DuCV感染在临床中引起严重的发病和死亡，但其很可能引起免疫抑制导致其他鸭的病原微生物危害加重，从而引起较为严重的生产问题。
依据DuCV的基因组及Cap基因的序列分析，目前将DuCV分为两个基因型：DuCV-1和DuCV-2，这两个基因型的病毒均在我国鸭群中普遍存在。目前，已经建立了检测DuCV病原的PCR、荧光定量PCR、核酸探针杂交以及检测抗体的ELISA方法，但这些方法均不能区分两种基因型DuCV的混合感染。至今仍然未见对两型鸭圆环病毒分型检测的报道。
(三)发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种快速鉴定鸭圆环病毒不同基因型的双重PCR方法，主要是设计并筛选了新的特异性引物，优化了反应过程中的各种参数，利用本组引物建立的针对鸭圆环病毒的双重PCR分型方法特异性强、敏感性更高，可以快速准确地进行DuCV-1和DuCV-2的鉴定。
一种用于快速鉴定鸭圆环病毒不同基因型的双重PCR特异性引物，是通过对参考GenBank上已发表的DuCV-1和DuCV-2的序列进行比对，选择在DuCV-1和DuCV-2的的保守区分别设计一对针对DuCV的通用特异性引物SEQ1/SEQ2，1型鸭圆环病毒特异性引物SEQ3和2型鸭圆环病毒特异性引物SEQ4，
SEQ1：5’-CGGGAAATGACGTAGTCGTCATG-3’，
SEQ2：5’-GG(A/C)(C/T)T(G/A)AACATGAGATGGGC-3’，
SEQ3：5’-GTTCACTCC(G/T)GTTGTGTTGTC(C/T)GG-3’，
SEQ4：5’-GATAATGCGAC(C/T)GGCGACG-3’；
所有引物以无菌ddH2O(Rnasefree)配成25pmol/μl的浓度备用；
上述引物的使用方法如下：
A、常规方法提取待测鸭各个脏器组织DNA作为模板，进行PCR反应；反应体系为：1μL组织DNA、1×PCRbuffer(50mMKCl,10mMTris-HCl[pH8.3])、1.5mMMgCl2、0.2mMdNTPs、1UTaqDNAPolymerase、引物SEQ1、SEQ2、SEQ3和SEQ4各1μL，加水补齐至25μL。PCR扩增程序为：94℃5min；94℃45s，68℃90s，共35个循环；最后72℃延伸10min；
B、对步骤A得到的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测：
如果从样品中扩增出了1032bp和446bp的产物，则该样品为DuCV-1阳性，DuCV-2阴性；如果从样品中扩增出了1032bp和599bp的产物，则该样品为DuCV-2阳性，DuCV-1阴性；如果同时扩增出了1032bp、446bp和599bp的产物，则该样品为DuCV-1和DuCV-2亚型同时存在；如果未扩增出了1032bp、446bp和599bp的产物，则该样品不含有DuCV-1和DuCV-2。
本发明的双重PCR方法最低可检测到10个拷贝DuCV-1和DuCV-2的病毒DNA，表明本方法具有很高的灵敏性。
利用该组引物建立的双重PCR方法对山东不同地区12个鸭群86只分离到DuCV-1或/和DuCV-2的雏鸭病理组织进行检测，结果发现所有样品的检测结果与使用单重PCR检测结果符合率为100％，说明本发明建立的双重PCR方法适合于基因1型和2型鸭圆环病毒的快速鉴定。由于本方法可以通过一次PCR完成对DuCV-1和DuCV-2的鉴定，可快速鉴定鸭圆环病毒基因型。
(四)附图说明
图1双重PCR特异性检测结果
M,DL2000；1,1型鸭圆环病毒(DuCV-1)；2,2型鸭圆环病毒(DuCV-2)；3,1型和2型鸭圆环病毒混合感染样品(DuCV-1和DuCV-2)；4,鸭瘟病毒(DPV)；5,产蛋下降综合征病毒(EDSV)；6,鸭乙型肝炎病毒(DHBV)；7,番鸭细小病毒(MDPV)；8,鸭疫里默氏杆菌(Ra)；9,沙门氏菌(Salmonella)；10,大肠杆菌(E.coli)；11,阴性对照.
图1显示：使用建立的双重PCR方法进行特异性检测，结果发现，针对单独感染DuCV-1的鸭病理组织DNA，扩增出1032bp和446bp的两条目的条带；针对单独感染DuCV-2的鸭病理组织DNA，扩增出1032bp和599bp的两条目的条带；针对DuCV-1和DuCV-2混合感染的鸭病理组织DNA，扩增出1032bp、599bp和446bp的三条目的条带；而针对鸭瘟(DPV)、减蛋综合症病毒(EDSV)、鸭乙型肝炎病毒(DHBV)、番鸭细小病毒(MDPV)、鸭疫里默氏杆菌(Ra)、沙门氏菌(Salmonella)和大肠杆菌(E.coli)的病原DNA，均未没有扩增产物。这说明本发明建立的检测两个基因型DuCV的双重PCR方法具有很强的特异性。
图2双重PCR针对DuCV模板DNA的敏感性检测结果
M,DL2000；1-9,分别为按10倍梯度稀释的108-100拷贝的DuCV-1和DuCV-2模板DNA
图2显示：以不同拷贝数的含有两个基因型DuCV完整基因组的阳性质粒为模板，对双重PCR的扩增灵敏度进行检测，结果表明，本发明建立的双重PCR灵敏度高，最低可分别检测出含有10个拷贝的DuCV-1和DuCV-2病毒DNA。
(五)具体实施方式
1引物设计
通过对参考GenBank上已发表的DuCV-1和DuCV-2的序列进行比对，选择在DuCV-1和DuCV-2的的保守区分别设计一对针对DuCV的通用特异性引物SEQ1/SEQ2，1型鸭圆环病毒特异性引物SEQ3和2型鸭圆环病毒特异性引物SEQ4，利用常规方法对两种病毒样品进行扩增。
SEQ1：5’-CGGGAAATGACGTAGTCGTCATG-3’，
SEQ2：5’-GG(A/C)(C/T)T(G/A)AACATGAGATGGGC-3’，
SEQ3：5’-GTTCACTCC(G/T)GTTGTGTTGTC(C/T)GG-3’，
SEQ4：5’-GATAATGCGAC(C/T)GGCGACG-3’；
DuCV的通用引物SEQ1/SEQ2扩增片段大小为1032bp，DuCV-1特异性引物SEQ2/SEQ3扩增片段大小为446bp，DuCV-2特异性引物SEQ1/SEQ4扩增片段大小为599bp。所有引物以无菌ddH2O(Rnasefree)配成25pmol/μl的浓度备用。
2DNA提取
使用常规方法提取DuCV感染鸭各种组织的总DNA作为模板。
3双重PCR条件的优化
对PCR反应用引物、dNTPs、Buffer的浓度，及退火温度等参数进行优化，得到双重PCR最佳反应体系和反应程序。
反应总体积为25μL，最佳反应体系为：1μL组织DNA、1×PCRbuffer(50mMKCl,10mMTris-HCl[pH8.3])、1.5mMMgCl2、0.2mMdNTPs、1UTaqDNAPolymerase、引物SEQ1、SEQ2、SEQ3和SEQ4各1μL，加水补齐至25μL。
PCR扩增程序为：94℃5min；94℃45s，68℃90s，共35个循环；最后72℃延伸10min。
4特异性试验
分别以鸭瘟(DPV)、减蛋综合症病毒(EDSV)、鸭乙型肝炎病毒(DHBV)、番鸭细小病毒(MDPV)、鸭疫里默氏杆菌(Ra)、沙门氏菌(Salmonella)和大肠杆菌(E.coli)的病原DNA为模板，用上述优化的条件进行双重PCR检测，同时用DuCV-1和DuCV-2单独感染以及用DuCV-1和DuCV-2混合感染的鸭病理组织DNA做阳性对照，用健康鸭肝提取的DNA做阴性对照，进行双重PCR的特异性检测。对双重PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果可知，建立的双重PCR方法只能特异性的针对DuCV-1和DuCV-2的单独或混合感染进行扩增，对其他家禽常发病的病原扩增为阴性，可作为特异性鉴定DuCV-1、DuCV-2的快速方法(见图1)。
5敏感性试验
将分别含有FJ0601株DuCV-1(Jiangetal.,2008)和WF0701株DuCV-2(Zhangetal.,2012)完整基因组的阳性质粒pDuCV-1和pDuCV-2转化大肠杆菌，使用质粒纯化试剂盒(QIAprepSpinMiniprepkit,购自Qiagen公司)制备纯化的质粒并进行核酸定量，计算出拷贝数，按照108拷贝/μL～1拷贝/μL的浓度进行10倍梯度稀释，分别取1μL各稀释度的质粒DNA作为模板，按步骤3)所述优化好的反应体系及反应条件进行双重PCR的扩增灵敏度检测。结果可知该双重PCR方法最低可检测到10个拷贝的病毒DNA(见图2)。
6临床样本检测
用建立的双重PCR方法对山东不同地区12个鸭群86只分离到DuCV-1或/和DuCV-2的雏鸭病理组织进行检测，结果发现所有样品的检测结果与使用单重PCR检测结果符合率为100％，说明本发明建立的双重PCR方法适合于DuCV-1和DuCV-2的快速鉴定。

Claims (1)

1.一种快速鉴定鸭圆环病毒基因型的双重PCR特异性引物，通过对参考GenBank上已发表的DuCV-1和DuCV-2的序列进行比对，选择在DuCV-1和DuCV-2的保守区分别设计一对针对DuCV的通用特异性引物SEQ1/SEQ2，1型鸭圆环病毒特异性引物SEQ3和2型鸭圆环病毒特异性引物SEQ4，所有引物以无菌Rnasefree的ddH2O配成25pmol/μL的浓度备用；其特征在于：
SEQ1：5’-CGGGAAATGACGTAGTCGTCATG-3’，
SEQ2：5’-GG(A/C)(C/T)T(G/A)AACATGAGATGGGC-3’，
SEQ3：5’-GTTCACTCC(G/T)GTTGTGTTGTC(C/T)GG-3’，
SEQ4：5’-GATAATGCGAC(C/T)GGCGACG-3’；
具体检测方法如下：
A、常规方法提取待测鸭各个脏器组织DNA作为模板，进行PCR反应；反应体系为：1μL组织DNA、1×PCRbuffer：50mMKCl,10mMTris-HCl，pH8.3、1.5mMMgCl2、0.2mMdNTPs、1UTaqDNAPolymerase、引物SEQ1、SEQ2、SEQ3和SEQ4各1μL，加水补齐至25μL；PCR扩增程序为：94℃5min；94℃45s，68℃90s，共35个循环；最后72℃延伸10min；
B、对步骤A得到的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测：
如果从样品中扩增出了1032bp和446bp的产物，则该样品为DuCV-1阳性，DuCV-2阴性；如果从样品中扩增出了1032bp和599bp的产物，则该样品为DuCV-2阳性，DuCV-1阴性；如果同时扩增出了1032bp、446bp和599bp的产物，则该样品为DuCV-1和DuCV-2亚型同时存在；如果未扩增出了1032bp、446bp和599bp的产物，则该样品不含有DuCV-1和DuCV-2。
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