KR20180136686A - Lamp를 이용한 가금류 면역억제 바이러스 검출용 프라이머 및 그 용도 - Google Patents
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Abstract
본원은 가금류에서 면역을 억제하여 각종 질환을 유발하는 바이러스를 등온증폭 방식으로 검출할 수 있는 프라이머 세트 및 이를 이용한 상기 바이러스 검출 방법을 개시한다. 본원에 따른 프라이머는 높은 민감도와 특이성은 물론 신속하게 감염원 혹은 오염원에서 병원체의 감염 혹은 오염 여부를 확인할 수 있어 수의분야, 식품산업분야, 환경 및 인체분야에서 널리 이용될 수 있으며, 또한 필요한 경우 반응 종결 후 전기영동과 같은 별도의 처리 없이 바로 검출이 가능하여 편리성이 증대된다.
Description
본원은 LAMP 방식을 이용한 가금류 면역억제 바이러스를 정확하고 신속하게 검출하는 프라이머 및 그 용도와 관련된 것이다.
닭 전염성빈혈증(CIA)는 재생불량성 빈혈, 면역억제와 더불어 임파절의 위축을 특징으로 하는 질병으로서 감염되면 질병 방어능력이 떨어져 바이러스, 세균, 곰팡이 등 이차적으로 질병이 발생하는 경우가 많다. 이 질병에 감염된 어린 일령의 닭은 성장이 느려지며 치사율이 일반적으로 10~20%에까지 이르며 심할 경우 60%에 달하기도 한다. CIA를 유발하는 바이러스(CIAV)는 서코바이러스과(Circoviridae)의 자이로바이러스속(Genus Gyrovirus)에 속하는 DNA 바이러스이다. 닭 전염성빈혈증을 진단하는 방법으로서는 바이러스의 분리 및 동정, 혈청검사법이 있다. 바이러스는 간장, 비장 및 흉선 조직에서 주로 분리되나 세포에 접종하여 분리하는 것은 시간이 많이 걸리는 단점이 있어서 PCR 등을 이용한 유전자 증폭법이 많이 사용되고 있다. 닭 전염성빈혈증은 조류 백혈병바이러스, 닭 전염성 에프낭병, 마렉병과 나타나는 증상이 유사하기 때문에 이들과의 감별이 중요하다. 닭 전염성빈혈로 인한 피해는 난계대전염이나 조기 감염될 경우 주로 나타나기 때문에 종계에 대한 감염개체의 검색과 백신을 접종하여 예방하는 것이 최선책이다.
마렉병(Marek's Disease; MD)은 닭에서 흔히 볼 수 있는 종양성 질병으로서 말초혈관과 눈, 피부와 같은 다양한 조직에서 단핵세포의 침윤을 특징으로 한다. 특히, 흉선, F낭, 비장 등의 임파구에 세포용해성 감염을 일으킨다. 이 질병에 이환된 산란계에서는 60%까지 폐사될 수 있으며, 육계에서는 이 질병으로 인해 폐기율이 10%에 이르기도 한다. 마렉병 바이러스(MDV)는 세포 결합성 허피스바이러스(Herpes Virus)로서 림프세포에 친화성을 가지는 DNA 바이러스이다. 마렉병은 바이러스를 분리 동정하거나 혈청검사로서 진단을 할 수 있다. 바이러스 분리에는 혈중 임파구, 혈액, 비장 및 종양세포가 이용되며 닭의 신장세포나 배아세포에 접종하여 바이러스를 분리할 수 있다. 조직병리검사 및 PCR 등을 이용한 유전자 검사를 이용하여 진단할 수 있다. 감염시 유사한 증상 때문에 조류 백혈병, 닭 전염성빈혈증, 세망내피증, 닭 전염성 F낭병과의 감별이 중요하다. 마렉병에 대한 효과적인 치료법은 현재까지 없는 실정이며 조기검색과 예방이 최선책이다.
세망내피증(Reticuloendotheliosis; RE)은 면역능력이 저하되고 간, 비장, 신장 등 내부 장기에 종양이 나타나는 질병이다. 감염되면 왜소증을 유발하거나 만성적으로 종양을 유발하여 심각한 경제적 손실을 유발하고, 면역억제를 일으켜 백신의 효과를 떨어뜨리기도 한다. RE를 유발하는 바이러스(REV)는 레트로바이러스과(Retroviridae)에 속하는 retrovirus로서 DNA 바이러스이다. 세망내피증을 진단하는데에는 바이러스 분리 및 동정, 혈청학적 검사법이 있다. 바이러스의 분리에는 혈액, 간, 선위, 흉선, F낭 등의 다양한 조직이 시료가 될 수 있으며 계태아섬유세포를 이용하여 접종한 후 특이항체를 이용한 형광항체법을 이용하거나 PCR 등의 유전자 증폭법을 이용한다. 흉선 및 F낭의 위축을 가져오는 질병들과의 감별이 중요하다. REV 감염으로 인한 피해는 난계대 전염이나 조기 감염될 경우 주로 나타나므로 이에 대한 예방대책이 중요하다. 그러나 세망내피증 바이러스에 대한 예방 백신은 개발되어 있지 않으므로 종계에서 REV가 감염되지 않도록 위생적으로 관리해야 하며 감염된 계군을 검색하여 종계로 사용하지 말아야 한다. 또한, REV는 마렉병과 계두 백신 등에 오염되어 전파될 수 있으므로 이들 백신 제조시 REV가 오염되지 않도록 관리해야 한다.
닭 전염성F낭병(Infectious Bursal Disease; IBD)은 닭의 급성전염병으로 어린 닭의 임파조직인 F낭에 심각한 손상을 유발시켜 면역억제를 일으키는 것이 특징이다. 이로 인해 2차적인 병원체의 기회감염이 증대될 수 있고 타 백신에 대한 면역형성 저하를 일으켜 전 세계적으로 양계산업에 큰 경제적 피해를 끼치고 있는 질병이다. 이 질병에 감염시 3주령 이상의 닭에서 바이러스의 병원성에 따라 60%까지 치사율을 나타내며 어린 닭에서는 심각한 면역저하를 유발하여 경제적인 손실을 가져오게 한다. 닭 전염성 F낭병을 유발하는 바이러스(IBDV)는 2개의 분절로 이루어진 이중 나선구조의 RNA 바이러스이다. 진단에는 바이러스의 분리 및 동정과 혈청학적 검사법이 있다. 바이러스 분리에는 F낭 조직이 시료로 이용되며 닭배아장뇨막(CAM)에 접종한다. 또한 바이러스의 VP 단백질 부분을 표적 유전자로 하여 RT-PCR 등 유전자 증폭법이 많이 이용되고 있다. F낭의 위축 등이 현저한 병변이지만 유사한 증상을 유발하는 다른 면역억제성 질병과의 감별이 중요하다. 닭 전염성 F낭병은 급성으로 진행되는 질병이므로 발병 후 치료는 큰 의미가 없으며 조기 검색과 예방이 중요하다.
상기 바이러스성 면역억제질병은 가금산업에서 단독 혹은 복합감염되어 바이러스 감염 자체에 기인한 피해뿐만 아니라 면역억제에 대한 이차적인 질병감염으로 피해가 나타난다. 이들 면역억제질병에 대한 예방대책은 조기검색과 감별진단을 통해 효과적인 대처방안을 마련하기 위해 이에 기존의 분리 및 동정, PCR법 등의 유전자 증폭법이 가진 한계를 극복하고 현장에서 효과적으로 적용할 수 있는 진단법의 개발이 필요하다.
본원은 높은 민감도와 특이성을 나타내면서도 신속하고 간편하게 Chicken anemia virus, Marek's disease virus, Reticuloendotheliosis virus 및 Infectious bursal disease virus의 감염여부를 검출할 수 있는 방법을 제공하고자 한다.
한 양태에서 본원은 하기로 구성되는 군으로부터 선택되는 Chicken anemia virus, Marek's disease virus 및 Reticuloendotheliosis virus 검출용 LAMP 분석용 프라이머 세트를 제공한다: 서열번호 1 내지 4, 서열번호 7 내지 10 또는 서열번호 13 내지 16로 표시되는 프라이머를 포함하는 Chicken anemia virus 특이적 프라이머 세트; 서열번호 19 내지 22, 서열번호 25 내지 28 또는 서열번호 31 내지 34로 표시되는 프라이머를 포함하는 Marek's disease virus 특이적 프라이머 세트 및 서열번호 37 내지 40, 서열번호 43 내지 46, 서열번호 49 내지 52 또는 서열번호 55 내지 58로 표시되는 프라이머를 포함하는 Reticuloendotheliosis virus 특이적 프라이머 세트.
또한 Infectious bursal disease virus 검출용 RT-LAMP 분석용 프라이머 세트를 제공한다: 서열번호 61 내지 64, 서열번호 67 내지 70 또는 서열번호 73 내지 76으로 표시되는 프라이머세트.
본원에 따른 프라이머 세트는 신속한 반응을 위해 LF 프라이머 및 LB 프라이머를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 Chicken anemia virus 특이적 프라이머 세트는 서열번호 5 및 6, 서열번호 11 및 12 또는 서열번호 17 및 18로 표시되는 프라이머; 상기 Marek's disease virus 특이적 프라이머 세트는 서열번호 23 및 24, 서열번호 29 및 30 또는 서열번호 35 및 36으로 표시되는 프라이머; 상기 Reticuloendotheliosis virus 특이적 프라이머 세트는 서열번호 41 및 42, 서열번호 47 및 48, 서열번호 53 및 54 또는 서열번호 59 및 60으로 표시되는 프라이머; 상기 Infectious bursal disease virus 특이적 프라이머 세트는 서열번호 65 및 66, 서열번호 71 및 72 또는 서열번호 77 및 78로 표시되는 프라이머에서 선택된다.
본원에 따른 프라이머 세트는 실시간으로 또는 반응 종결시 증폭산물의 검출을 위해 필요한 경우, 각 세트에 포함된 하나 이상의 프라이머는 검출가능한 표지 물질로 표지될 수 있다.
다른 양태에서 본원은 또한 본원에 개시된 프라이머 세트를 사용한 인비트로에서 Chicken anemia virus, Marek's disease virus, Reticuloendotheliosis virus 및 Infectious bursal disease virus를 검출하는 방법으로, 상기 방법은 Chicken anemia virus, Marek's disease virus, Reticuloendotheliosis virus 및 Infectious bursal disease virus의 감염이 의심되는 대상체의 시료를 제공하는 단계; 본원에 따른 프라이머 세트 중 어느 하나를 제공하는 단계; 상기 시료 및 프라이머 세트를 이용하여 LAMP 또는 RT-LAMP 반응을 수행하는 단계; 및 상기 LAMP 또는 RT-LAMP 반응 결과물을 분석하고 이를 대조군 시료와 비교하여 차이가 있는 경우, 이를 Chicken anemia virus, Marek's disease virus, Reticuloendotheliosis virus 및 Infectious bursal disease virus의 감염 또는 오염으로 판정하는 단계를 포함한다.
본원에 따른 프라이머 세트는 Chicken anemia virus, Marek's disease virus, Reticuloendotheliosis virus 및 Infectious bursal disease virus의 검출이 필요한 다양한 시료, 예를 들면 흉선, 비장, F낭 등 면역장기 및 종양 조직이 이용될 수 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.
본원에 따른 방법에서 LAMP 또는 RT-LAMP 반응 결과의 분석은 실시간 또는 반응 종료 후에 모두 가능하며, 증폭 여부는 예를 들면 색변화 측정 또는 탁도 (turbidity) 중 하나 이상을 이용한 측정을 통해 결정되며, 대조군과 비교하여 색이 변화하거나 탁도가 증가한 경우, 증폭이 된 것으로 Chicken anemia virus, Marek's disease virus, Reticuloendotheliosis virus 및 Infectious bursal disease virus 양성으로 판단할 수 있다.
본원에 따른, Chicken anemia virus, Marek's disease virus, Reticuloendotheliosis virus 및 Infectious bursal disease virus를 등온증폭 방식으로 특이적으로 검출할 수 있는 프라이머 세트 및 이를 이용한 상기 바이러스들의 검출 방법은 높은 민감도와 특이성은 물론 다양한 검체에서 신속하게 병원체의 오염 여부를 검출할 수 있다. 이는 수의분야의 병성감정 시료, 양계농장의 질병 모니터링에서 널리 이용될 수 있으며, 또한 필요한 경우 반응 종결 후 전기영동과 같은 별도의 처리 없이 바로 검출이 가능하여 편리성이 증대된다.
도 1은 본원의 일 구현예 따른 표 1에 기재된 조합의 프라이머세트에 대한 Chicken anemia virus 특이적 LAMP 프라이머 세트의 특이도 및 민감도를 색변화 및 아가로스젤 전기영동으로 검출한 결과이다.
도 2는 본원의 다른 구현예 따른 표 2에 기재된 조합의 프라이머세트에 대한 Marek's disease virus 특이적 LAMP 프라이머 세트의 특이도 및 민감도를 색변화 및 아가로스젤 전기영동으로 검출한 결과이다.
도 3은 본원의 다른 구현예 따른 표 3에 기재된 조합의 프라이머세트에 대한 Reticuloendotheliosis virus 특이적 LAMP 프라이머 세트의 특이도 및 민감도를 색변화 및 아가로스젤 전기영동으로 검출한 결과이다.
도 4는 본원의 다른 구현예 따른 표 4에 기재된 조합의 프라이머세트에 대한 Infectious bursal disease virus 특이적 RT-LAMP 프라이머 세트의 특이도 및 민감도를 색변화 및 아가로스젤 전기영동으로 검출한 결과이다.
상기 각 도면에서 민감도는 적색으로 표시하였다. 각 세트별로 총 7개의 다른 농도 및 음성대조군에서 반응이 수행되었으며 각 농도는 다음과 같다: Chicken anemia virus의 DNA 농도는 1: 6.25 x 103 copies, 2: 1.25 x 103 copies, 3: 2.5 x 102 copies, 4: 50copies, 5: 10copies, 6: 2copies, 7: 0.4copy 및 8:음성 대조군 ; Marek's disease virus의 DNA 농도는 1: 1.25 x 104 copies, 2: 2.5 x 103 copies, 3: 5.0 x 102 copies, 4: 1.0 x 102 copies, 5: 20copies, 6: 4copies, 7: 0.8copy 및 8:음성 대조군 ; Reticuloendotheliosis virus의 DNA 농도는 1: 1.0 x 104 copies, 2: 2.0 x 103 copies, 3: 4.0 x 102 copies, 4: 80copies, 5: 16copies, 6: 3.2copies, 7: 0.64copy 및 8: 음성 대조군 및 Infectious bursal disease virus의 DNA 농도는 1: 6.25 x 103 copies, 2: 1.25 x 103 copies, 3: 2.50 x 102 copies, 4: 50copies, 5: 10copies, 6: 2copies, 7: 0.4copy 및 8:음성 대조군.
도 2는 본원의 다른 구현예 따른 표 2에 기재된 조합의 프라이머세트에 대한 Marek's disease virus 특이적 LAMP 프라이머 세트의 특이도 및 민감도를 색변화 및 아가로스젤 전기영동으로 검출한 결과이다.
도 3은 본원의 다른 구현예 따른 표 3에 기재된 조합의 프라이머세트에 대한 Reticuloendotheliosis virus 특이적 LAMP 프라이머 세트의 특이도 및 민감도를 색변화 및 아가로스젤 전기영동으로 검출한 결과이다.
도 4는 본원의 다른 구현예 따른 표 4에 기재된 조합의 프라이머세트에 대한 Infectious bursal disease virus 특이적 RT-LAMP 프라이머 세트의 특이도 및 민감도를 색변화 및 아가로스젤 전기영동으로 검출한 결과이다.
상기 각 도면에서 민감도는 적색으로 표시하였다. 각 세트별로 총 7개의 다른 농도 및 음성대조군에서 반응이 수행되었으며 각 농도는 다음과 같다: Chicken anemia virus의 DNA 농도는 1: 6.25 x 103 copies, 2: 1.25 x 103 copies, 3: 2.5 x 102 copies, 4: 50copies, 5: 10copies, 6: 2copies, 7: 0.4copy 및 8:음성 대조군 ; Marek's disease virus의 DNA 농도는 1: 1.25 x 104 copies, 2: 2.5 x 103 copies, 3: 5.0 x 102 copies, 4: 1.0 x 102 copies, 5: 20copies, 6: 4copies, 7: 0.8copy 및 8:음성 대조군 ; Reticuloendotheliosis virus의 DNA 농도는 1: 1.0 x 104 copies, 2: 2.0 x 103 copies, 3: 4.0 x 102 copies, 4: 80copies, 5: 16copies, 6: 3.2copies, 7: 0.64copy 및 8: 음성 대조군 및 Infectious bursal disease virus의 DNA 농도는 1: 6.25 x 103 copies, 2: 1.25 x 103 copies, 3: 2.50 x 102 copies, 4: 50copies, 5: 10copies, 6: 2copies, 7: 0.4copy 및 8:음성 대조군.
본원은 LAMP 및 RT-LAMP 방식을 이용하여 Chicken anemia virus, Marek's disease virus, Reticuloendotheliosis virus 및 Infectious bursal disease virus를 핵산 수준에서 높은 정확도와 민감도로 용이하게 검출할 수 있다는 발견에 근거한 것이다.
양계산업 및 SPF(Specific Pathogen Free) 닭과 종란을 생산하는 업계에서는 바이러스성 면역억제질병이 매우 중요하다. 이들 면역억제질병 원인체들은 단독 혹은 복합감염되어 바이러스 감염 자체에 기인한 피해뿐만 아니라 면역억제에 대한 이차적인 질병발생 주요 원인으로 작용하여 심각한 경제적 피해를 유발하기 때문이다. 이들 면역억제질병에 대한 효과적인 대처방안은 이들 면역억제질병 원인체의 조기검색 및 도태, 유사한 질병과의 감별진단을 통해 원인 바이러스 존재여부를 신속하게 파악하고, 백신접종 등 예방법을 마련하는 것이다. 이에 기존의 분리 및 동정, PCR법 등의 유전자 증폭법이 가진 한계를 극복하고 현장에서 효과적으로 적용할 수 있으며, 가금의 주요한 면역억제질병 원인체를 동시에 검출할 수 있는 검출법을 개발하고자 하였다.
본원에 따른 LAMP-CIAV:MDV:REV:IBDV법은 닭 전염성빈혈병 바이러스, 마렉병 바이러스, 세망내피증 바이러스 및 닭 전염성 F낭병 바이러스에 대한 특이 프라이머를 작성하고 Loop-Mediated Isothermal Amplification(LAMP)법을 이용하여 상기 4종류의 바이러스를 동시에 검출할 수 있다.
이에 본원은 LAMP 방식으로 Chicken anemia virus, Marek's disease virus 및 Reticuloendotheliosis virus, RT-LAMP 방법으로 Infectious bursal disease virus를 특이적으로 검출할 수 있는 프라이머 세트 및 이를 이용한 Chicken anemia virus, Marek's disease virus, Reticuloendotheliosis virus 및 Infectious bursal disease virus의 검출 방법을 개시한다.
한 양태에서 본원은 Chicken anemia virus, Marek's disease virus, Reticuloendotheliosis virus 및 Infectious bursal disease virus를 각각 특이적으로 검출할 수 있는 LAMP 분석용 프라이머 세트에 관한 것이다.
본원에서 사용된 용어 “프라이머”는 단일가닥의 올리고뉴클레오타이드로 폴리머라제를 이용한 핵산 증폭 또는 합성 반응에서 그 3´ 말단에 뉴클레오타이드가 공유결합에 의해 추가되어 연장되는 핵산 분자를 일컫는 것이다. 본원에 따른 프라이머 세트는 핵산의 증폭 즉 LAMP 또는 RT-LAMP 분석에 사용되는 것이다.
본원에서 용어 “핵산”은 단일가닥 또는 이중 가닥의 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드로, 하나 이상의 뉴클레오타이드를 포함하는 RNA 또는 DNA 분자 또는 그 유사체 및 그 유도체를 일컫는 것이다. 본원에 따른 프라이머 세트가 사용되는 Chicken anemia virus, Marek's disease virus, Reticuloendotheliosis virus 및 Infectious bursal disease virus 핵산은 유전체의 전부 또는 일부를 포함하고, 일 구현예에서는 DNA 또는 RNA를 포함하는 것이다.
본원에서 사용된 용어 “올리고뉴클레오타이드” 및 “폴리뉴클레오타이드”는 혼용되어 사용되며, 어느 하나는 양자를 모두 포함하는 것이다. 용어 “프라이머”도 “올리고뉴클레오타이드” 및 “폴리뉴클레오타이드”와 혼용되어 사용될 수 있으며, 핵산(RNA or DNA), 앱타머 등을 포함하는 것이다.
본원에서 용어 “검출”은 Chicken anemia virus, Marek's disease virus, Reticuloendotheliosis virus 및 Infectious bursal disease virus의 오염 또는 감염 여부를 핵산의 존재여부 또는 존재할 경우 그 양을 분석하는 것으로, LAMP 및 RT-LAMP 분석에 기반을 둔 것이다.
본원에서 사용된 용어 “표적” 또는 “표적 핵산”은 본원의 프라이머 세트가 결합하여 본원에 따른 프라이머 세트에 의해 특이적으로 증폭되는 핵산 서열을 일컫는 것으로, RNA 또는 DNA를 포함하는 것이다. 닭빈혈 바이러스, 마렉병 바이러스, 세망내피증 바이러스는 LAMP 방식이고 전염성F낭병 바이러스는 RT-LAMP 방식으로 검출된다.
본원에 따른 프라이머는 표적 핵산에 상보성을 통해 특이적으로 결합을 하고 LAMP 방식으로 표적 핵산을 증폭한다. 본원에서는 특히 표 1 내지 표 4에 기재된 각 균주/바이러스에 특이적인 유전자만을 특이적으로 검출할 수 있다.
LAMP는 등온조건에서 높은 민감도와 특이성으로 표적핵산을 증폭할 수 있는 핵산 증폭 방법 (Notomi, T. et al. 2000. Loop-Mediated Isothermal Amplification of DNA. Nucleic Acids Res 28, E63)으로 가닥교체 (strand displacement) 활성을 갖는 DNA 폴리머레이즈 및 표적핵산의 6개 부위 즉, 5′→ 3′방향으로 B3 영역, B2 영역, B1 영역, F1c 영역, F2c 영역 및 F3c 영역 (상기 영역에 상보적인 영역은 B3c, B2c, B1c, F1, F2 및 F3로 표시)에서 특이적으로 고안된 최소 4개 내지 6개의 프라이머 세트가 사용된다 (한국 특허 제612551호; Nagamine, K. et al. 2002. Accelerated reaction by Loop mediated isothermal amplification using loop primers. Mol Cell Probes 16, 223-9 등 참고). 표준 LAMP 반응에는 최소 4 종류의 두 개의 내측 프라이머 FIP (forward inner primer), BIP (backward inner primer)와 두 개의 외측 프라이머 F3 (forward outer primer) 및 B3 (backward outer primer)를 포함한다. 신속한 반응 (Accelerated LAMP)을 위해서는 LF (Loop F) 및 LB (Loop B)를 추가로 포함하여 총 6개의 프라이머가 사용될 수 있다.
LAMP 반응은 크게 개시 구조 생산단계, 사이클링 증폭단계와 신장 및 재사용(recycling) 단계를 포함한다. 개시단계에서 내측 프라이머 FIP를 구성하는 F2 부분이 표적핵산의 F2c 영역에 결합하여 반응을 개시한다. 이어 외측 프라이머 F3 프라이머가 표적핵산의 F3c 영역에 결합하여 가닥교체 DNA 합성이 개시되며 이에 따라 단일가닥 핵산이 생성된다. 이 단일가닥은 F1/F1c 결합을 통해 5′말단에 고리를 형성하며, 여기에 두 번째 내측 프라이머 BIP 및 외측 프라이머 B3가 결합하여 DNA 합성 및 가닥교체 DNA 합성이 일어난다. 그 결과 덤벨 모양의 양 말단에 고리가 (stem-loop) 형성된 단일가닥이 형성되고, 여기의 F1 영역의 3′말단으로부터 DNA 합성이 시작된다. 이어 사이클링 증폭단계에서는 두 개의 내측 프라이머만이 사용되며, 처음에는 하나의 내측 프라이머가 고리에 결합하여 가닥교체 DNA 합성이 일어나면서 원래의 고리 형성 단일가닥과 고리구조에서 stem 부위가 두 배 늘어난 새로운 고리 형성 단일가닥이 생성되며 이를 주형으로 하여 가닥교체 DNA 합성이 계속 수행되어 증폭산물이 1시간 이내에 약 109개까지 증폭된다. 보다 상세한 원리 및 각 F3 프라이머, B3 프라이머, FIP 프라이머, BIP 프라이머, Loop F 프라이머 (LF), 및 Loop B (LB)프라이머의 특징 및 기능에 대하여 앞서 언급한 문헌 Notomi et al., 2000 and Nagamine et al., 2002을 참고할 수 있다. RT(reverse transcription) LAMP는 주형으로 RNA를 먼저 DNA로 합성한 후에 LAMP를 수행하는 것으로, RNA를 DNA로 합성하는 방법은 당업계에 공지되어 있다.
본원에서 용어 “상보적” 또는 “상보성”은 소정의 혼성화(교잡), 결합 또는 어닐링 조건에서 프라이머 또는 올리고뉴클레오타이드가 표적 핵산에 와슨-크릭 염기의 페어링을 통해 서열 특이적으로 결합할 수 있는 상태를 일컫는 것으로, 부분적 상보성, 실질적으로 상보성(substantially complementary) 및 완전 상보성(perfectly complementary)인 것을 모두 포함한다. 실질적으로 상보성이란, 두 가닥의 핵산 서열이 서로 완전히 상보적인 것은 아니지만, 표적 핵산에 결합하여 본원에 따른 효과 즉 표적 서열을 LAMP 방식을 통해 증폭할 수 있는 정도의 상보성을 의미하는 것이다.
본원에서 사용된 용어 “교잡” 또는 “혼성화”는 두 가닥의 상보적 핵산분자가 수소결합을 통해 서열특이적인 복합체를 형성하는 반응을 의미하는 것이다. 교잡은 본원에 따른 프라이머가 사용되는 LAMP 반응에서 프라이머가 표적 핵산 또는 주형(template)의 결합하는 단계를 구성할 수 있다. 교잡의 정도는 이에 관여하는 임의의 두 개의 핵산 분자의 상보성 정도, 이들의 변성 온도(melting temperature, Tm) 또는 교잡의 엄격도(stringency)와 같은 다양한 인자에 의해 영향을 받는다. 교잡 반응 조건도 이를 고려하여 결정될 수 있다. 교잡 반응의 엄격도는 서로 교잡하고자 하는 임의의 두 개의 핵산 분자가 얼마나 용이하게 결합할 수 있는 지를 결정하는 조건으로, 상보성, 반응 온도, 이온 강도 및/또는 교잡 반응액에 포함되는 일반적인 물질의 농도 및 종류에 따라 결정될 수 있으며, 예를 들면 J. Sambrook and D. W. Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press; 4th Ed., 2012; and F. M. Ausubel, Ed., Short Protocols in Molecular Biology, Wiley; 5th Ed, 2002 등에 기재된 것을 참고 할 수 있다.
본원에서 특이적 결합 또는 교잡은 특정 핵산 분자 또는 프라이머가 표적이 아닌 다른 핵산 이외의 핵산에는 실질적으로 결합하지 않고 표적 핵산에만 결합하는 것을 의미한다. 본원에 따른 프라이머는 높은 엄격도 조건에서 본원에 따른 표적인 Chicken anemia virus, Marek's disease virus, Reticuloendotheliosis virus 및 Infectious bursal disease virus의 핵산 또는 그 상보서열에 특이적으로 결합할 수 있으며, 주형 기반의 DNA 또는 RNA 합성에서 프라이머 서열 길이, 완충액, 핵산 종류, pH, 마그네슘 농도 및 반응온도 등을 고려하여 결정할 수 있을 것이다.
본원에서 각 바이러스에 대한 표적 유전자는 표 1 내지 표 4에 개시된 바와 같으며 각 유전자 부위를 특이적으로 인식하여 높은 민감도로 각 바이러스를 검출할 수 있도록 디자인 되었다. 본원에서는 상술한 바와 같이 LAMP 반응은 표적 유전자를 검출하기 위해 최소 4개 내지 6개의 프라이머를 디자인하고, 일정한 특이성과 민감도를 만족하도록 프라이머 및 반응 조건을 개시한다.
본원에 따른 프라이머는 Chicken anemia virus, Marek's disease virus, Reticuloendotheliosis virus 및 Infectious bursal disease virus를 LAMP 방식을 통해 특이적으로 검출할 수 있도록 디자인된 것으로, 표적 핵산 또는 그 상보서열에 특이적으로 결합한다.
상술한 바와 같이 표준 LAMP 반응에는 최소 4 종류의 다음과 같은 프라이머가 사용된다: FIP (forward inner primer), BIP (backward inner primer), F3 (forward outer primer) 및 B3 (backward outer primer). 그리고 신속한 반응 (Accelerated LAMP)을 위해서는 LF (Loop F) 및 LB (Loop B)를 추가로 포함하여 총 6개의 프라이머가 사용될 수 있다. 각 F3 프라이머, B3 프라이머, FIP 프라이머, BIP 프라이머, Loop F 프라이머 (LF), 및 Loop B (LB)프라이머의 특징 및 기능에 대하여 앞서 언급한 문헌 Notomi et al., 2000 and Nagamine et al., 2002을 참고할 수 있다.
본원에 따른 표적 핵산 또는 그 상보서열에 특이적으로 결합하는 프라이머는 길이가 최소 10 뉴클레오타이드이며, F3와 B3의 경우 최소 15 뉴클레오타이드 이며, FIP와 BIP의 경우 최소 30 뉴클레오타이드이며, LF와 LB의 경우 최소 15 뉴클레오타이드이다. 표적 핵산의 상응하는 부분과 최소 70%의 상보성, 특히 80% 상보성, 더욱 90% 상보성, 더더욱 특히 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 상보성을 가진다.
일구현예서 본원에 따른 프라이머는 서열번호 1 내지 78 표시되는 프라이머 및 이와 실질적으로 동일한 것을 포함하며, 표적 핵산 또는 그 상보서열에 특이적으로 결합한다. 실질적으로 동일한 서열의 프라이머는 서열번호 1 내지 78로 표시되는 프라이머와 70%의 상보성, 특히 80% 상보성, 더욱 특히 90% 상보성, 더더욱 특히 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 상보성을 가진다.
본원에 따른 LAMP 프라이머는 표적인 Chicken anemia virus, Marek's disease virus, Reticuloendotheliosis virus 및 Infectious bursal disease virus 핵산에 특이적으로 결합하여 이를 높은 민감도로 검출한다. 전염성F낭병 바이러스는 LAMP 반응 함께, 또는 별도의 반응에서 RNA를 DNA로 합성하는 단계가 추가로 필요하다.
본원에 따른 F3 프라이머, B3 프라이머, FIP 프라이머, BIP 프라이머를 포함하는, 닭빈혈 바이러스(Chicken anemia virus), 마렉병 바이러스(Marek's disease virus), 세망내피증 바이러스(Reticuloendotheliosis virus) 및 닭 전염성F낭병 바이러스(Infectious bursal disease virus)로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 가금 면역억제질병 바이러스 검출을 위한 LAMP 분석용 프라이머 세트는 다음과 같다.
상기 닭빈혈 바이러스 검출을 위한 상기 F3 프라이머는 서열번호 1, 7, 또는 13으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 프라이머로 표시되고; 상기 B3 프라이머는 서열번호 2, 8, 또는 14로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 프라이머로 표시되고; 상기 FIP 프라이머는 서열번호 3, 9, 또는 15로 이루어진 군에서 선택된 하나의 프라이머로 표시되고; 그리고 상기 BIP 프라이머는 서열번호 4, 10, 또는 16으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 프라이머로 표시되고, 상기 마렉병 바이러스 검출을 위한 상기 F3 프라이머는 서열번호 19, 25, 또는 31로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 프라이머로 표시되고, 상기 B3 프라이머는 서열번호 20, 26, 또는 32로 이루어진 군에서 선택된 하나의 프라이머로 표시되고, 상기 FIP 프라이머는 서열번호 21, 27, 또는 33으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 프라이머로 표시되고; 그리고, 상기 BIP 프라이머는 서열번호 22, 28, 또는 34로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 프라이머로 표시되고; 상기 세망내피증 바이러스 검출을 위한 상기 F3 프라이머는 서열번호 37, 43, 49, 또는 55로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 프라이머로 표시되고; 상기 B3 프라이머는 서열번호 38, 44, 50, 또는 56으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 프라이머로 표시되고; 상기 FIP 프라이머는 서열번호 39, 45, 51, 또는 57로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 프라이머로 표시되고; 및 상기 BIP 프라이머는 서열번호 40, 46, 52, 또는 58로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 프라이머로 표시되고, 상기 닭 전염성F낭병 바이러스 검출을 위한 상기 F3 프라이머는 서열번호 61, 67, 또는 73으로 이루어진 군에서 선택된 하나의 프라이머로 표시되고; 상기 B3 프라이머는 서열번호 62, 68, 또는 74로 이루어진 군에서 선택된 하나의 프라이머로 표시되고; 상기 FIP 프라이머는 서열번호 63, 69, 또는 75로 이루어진 군에서 선택된 하나의 프라이머로 표시되고; 그리고 상기 BIP 프라이머는 서열번호 64, 70, 또는 76으로 이루어진 군에서 선택된 하나의 프라이머로 표시되며, 각 균주별 각 프라이머 별로 다양한 조합으로 사용될 수 있다.
선택적으로 상기 프라이머 세트는 LF 프라이머 및 LB 프라이머를 추가로 포함할 수 있다. 상기 닭빈혈 바이러스 검출을 위한 상기 LF 프라이머는 서열번호 5, 11, 또는 17로 이루어진 군에서 선택된 하나로 표시되는 프라이머이고, 상기 LB 프라이머는 서열번호 6, 12 또는 18로 이루어진 군에서 선택된 하나로 표시되는 프라이머이며; 상기 마렉병 바이러스 검출을 위한 상기 LF 프라이머는 서열번호 23, 29, 또는 35로 이루어진 군에서 선택된 하나로 표시되는 프라이머이고, 상기 LB 프라이머는 서열번호 24, 30, 또는 36으로 이루어진 군에서 선택된 하나로 표시되는 프라이머이며; 상기 세망내피증 바이러스 검출을 위한 상기 LF 프라이머는 서열번호 41, 47, 53, 또는 59로 이루어진 군에서 선택된 하나로 표시되는 프라이머이고, 상기 LB 프라이머는 서열번호 42, 48, 54 또는 60으로 이루어진 군에서 선택된 하나로 표시되는 프라이머이며; 그리고 상기 닭 전염성F낭병 바이러스 검출을 위한 상기 LF 프라이머는 서열번호 65, 71, 또는 77로 이루어진 군에서 선택된 하나로 표시되는 프라이머이고, 상기 LB 프라이머는 서열번호 66, 72, 또는 78로 이루어진 군에서 선택된 하나로 표시되는 프라이머이며, 각 균주별 다양한 조합으로 사용될 수 있다.
일 구현예에서 본원에서 Chicken anemia virus를 특이적으로 검출할 수 있는 LAMP 프라이머 세트는 서열번호 3, 9 또는 15로부터 선택되는 FIP, 서열번호 4, 10 또는 16으로부터 선택되는 BIP, 서열번호 1, 7 또는 13으로부터 선택되는 F3 및 서열번호 2, 8 또는 14로부터 선택되는 B3를 포함한다. 다른 구현예에서 Chicken anemia virus를 특이적으로 검출할 수 있는 LAMP 프라이머 세트는 서열번호 3, 9 또는 15로부터 선택되는 FIP, 서열번호 4, 10 또는 16으로부터 선택되는 BIP, 서열번호 1, 7 또는 13으로부터 선택되는 F3 및 서열번호 2, 8 또는 14로부터 선택되는 B3, 서열번호 5, 11 또는 17에서 선택되는 LF 및 서열번호 6, 12 또는 18에서 선택되는 LB를 포함한다.
일 구현예에서 본원에서 Marek's disease virus를 특이적으로 검출할 수 있는 LAMP 프라이머 세트는 서열번호 21, 27 또는 33으로부터 선택되는 FIP, 서열번호 22, 28 또는 34로부터 선택되는 BIP, 서열번호 19, 25 또는 31로부터 선택되는 F3 및 서열번호 20, 26 또는 32로부터 선택되는 B3를 포함한다. 다른 구현예에서 Marek's disease virus를 특이적으로 검출할 수 있는 LAMP 프라이머 세트는 서열번호 21, 27 또는 33으로부터 선택되는 FIP, 서열번호 22, 28 또는 34로부터 선택되는 BIP, 서열번호 19, 25 또는 31로부터 선택되는 F3 및 서열번호 20, 26 또는 32로부터 선택되는 B3, 서열번호 23, 29 또는 35에서 선택되는 LF 및 서열번호 24, 30 또는 36에서 선택되는 LB를 포함한다.
일 구현예에서 본원에서 Reticuloendotheliosis virus를 특이적으로 검출할 수 있는 LAMP 프라이머 세트는 서열번호 39, 45, 51 또는 57로부터 선택되는 FIP, 서열번호 40, 46, 52 또는 58로부터 선택되는 BIP, 서열번호 37, 43, 49 또는 55로부터 선택되는 F3 및 서열번호 38, 44, 50 또는 56으로부터 선택되는 B3를 포함한다. 다른 구현예에서 Reticuloendotheliosis virus를 특이적으로 검출할 수 있는 LAMP 프라이머 세트는 서열번호 39, 45, 51 또는 57로부터 선택되는 FIP, 서열번호 40, 46, 52 또는 58로부터 선택되는 BIP, 서열번호 37, 43, 49 또는 55로부터 선택되는 F3 및 서열번호 38, 44, 50 또는 56으로부터 선택되는 B3, 서열번호 41, 47, 53 또는 59에서 선택되는 LF 및 서열번호 42, 48, 54 또는 60에서 선택되는 LB를 포함한다.
일 구현예에서 본원에서 Infectious bursal disease virus를 특이적으로 검출할 수 있는 RT-LAMP 프라이머 세트는 서열번호 63, 69 또는 75로부터 선택되는 FIP, 서열번호 64, 70 또는 76으로부터 선택되는 BIP, 서열번호 61, 67 또는 73으로부터 선택되는 F3 및 서열번호 62, 68 또는 74로부터 선택되는 B3를 포함한다. 다른 구현예에서 Infectious bursal disease virus를 특이적으로 검출할 수 있는 RT-LAMP 프라이머 세트는 서열번호 63, 69 또는 75로부터 선택되는 FIP, 서열번호 64, 70 또는 76으로부터 선택되는 BIP, 서열번호 61, 67 또는 73으로부터 선택되는 F3 및 서열번호 62, 68 또는 74로부터 선택되는 B3, 서열번호 65, 71 또는 77에서 선택되는 LF 및 서열번호 66, 72 또는 78에서 선택되는 LB를 포함한다.
본원에 따른 프라이머 및 이를 포함하는 방법은 Chicken anemia virus, Marek's disease virus, Reticuloendotheliosis virus 및 Infectious bursal disease virus의 감염 또는 오염 여부 검출을 바이러스의 감염 또는 오염여부가 의심되는 다양한 시료에서 오염, 또는 감염 여부의 스크리닝, 존재 유무 검출 및 정량을 위한 다양한 분석에 유용하게 사용될 수 있다.
본원에 따른 프라이머 세트 및 방법이 사용될 수 있는 시료는 가금의 병성감정 시료, 도축장 등에서의 도축산물, 양계 산업에서 육계. 산란계, 종계, 토종닭 농장의 검체 및 환경 시료를 위시하여 SPF닭 및 이에 준하는 종란을 생산하는 업계의 다양한 시료에 대하여 실시될 수 있다.
또한 이러한 생물학적 시료는 검사 직전에 통상의 시료 수득방법에 의해 직접 수득한 것이거나 또는 미리 분리되어 보관된 것일 수 있다.
또 다른 구현예에서 본원에 따른 시료는 상술한 시료로부터 분리된 핵산이 시료로서 사용될 수 있다. 분리란 핵산이 포함되어 있던 시료로부터의 분리된 것으로, 다양한 순도로 분리된 것을 포함하는 것이다.
본원에 따른 프라이머 및 이를 포함하는 방법은 바이러스가 존재할 가능성이 있는 임의의 시료에서 바이러스의 검출을 위해 LAMP 및 RT-LAMP 방식의 분석에 사용된다.
일 구현예에서 LAMP 반응물은 총 25 ul에 0.2 uM 의 각 F3 및 B3 primers, 1.6 uM의 각 FIP 및 BIP 프라이머, 0.8 uM의 각 LF 및 LB 프라이머, 0.4M betaine, 10 mM MgSO4, 1.4 mM dNTPs, 1× ThermoPol reaction buffer (Mmonitor, South Korea), 8 U Bst DNA polymerase (Mmonitor, South Korea) 및 1.0~9.5㎕의 분석이 필요한 시료가 포함된다.
또 다른 구현예에서 RT-LAMP 반응물은 총 25 ul에 0.2 uM의 각 F3 및 B3 primers, 1.6 uM의 각 FIP 및 BIP 프라이머, 0.8 uM의 각 LF 및 LB 프라이머, 0.4M betaine, 10 mM MgSO4, 1.4 mM dNTPs, 1× ThermoPol reaction buffer (Mmonitor, South Korea), 8 U Enzyme mix (Mmonitor, South Korea) 및 1.0~9.5㎕의 분석이 필요한 시료가 포함된다.
반응물은 이어서 DNA 폴리머라제 활성에 적합한 온도에서 반응된다. 반응온도는 반응에 사용되는 효소, 표적의 핵산 서열을 고려하여 어려움 없이 결정될 수 있다. 이어 반응물은 표적 핵산의 증폭에 적합한 시간으로 반응된다.
증폭 후 증폭반응 산물은 다양한 방법으로 검출될 수 있으며, 예를 들면 DNA 합성에 따른 반응액의 색변화, 탁도변화, 형광 및/또는 전기영동으로 검출될 수 있으며, 검출된 산물은 양성 및/또는 음성 대조군 시료의 산물과 비교되어 정량 또는 정성분석에 사용된다.
또한 프라이머의 비 특이적 프라이밍 발생에 의한 비특이적 증폭여부의 검출이 필요한 경우, 비특이적 핵산 결합제인 에씨디움 브로마이드 또는 피코그린과 같은 물질을 주형을 포함하지 않는 대조군 반응에 사용하여 비특이적으로 합성된 총 증폭산물의 양을 결정할 수 있다.
본원에 따른 프라이머 세트는 감염 또는 오염 여부 검출을 위해 바이러스의 감염 또는 오염여부가 의심되는 다양한 시료에서 오염, 또는 감염 여부의 스크리닝, 존재 유무 검출 및 정량을 위한 다양한 분석에 유용하게 사용될 수 있다.
본원에 따른 프라이머를 사용하여 Chicken anemia virus, Marek's disease virus, Reticuloendotheliosis virus 및 Infectious bursal disease virus를 핵산수준에서 검출하고, 이를 대조군 또는 참조군과 비교하여, 핵산의 존재 여부, 핵산 증가, 변화 정도에 따라 Chicken anemia virus, Marek's disease virus, Reticuloendotheliosis virus 및 Infectious bursal disease virus 감염, 오염 또는 항생제 치료를 받는 경우 치료의 효과를 예측할 수 있다.
이하 실시예를 통해 본 발명을 상세히 설명하나, 본 실시예는 예시적인 것일 뿐 어떤 식으로든 본원의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명은 달리 언급이 없는 한 세포생물학, 세포배양, 분자생물학, 유전자 형질전환 기술, 미생물학, DNA 재조합기술에 관한 당업자의 기술수준 내인 통상의 기술을 사용하여 실시될 수 있다. 또한, 일반적인 기술에 관한 보다 자세한 설명은 Molecular Biotechnology: (Bernard et al., ASM press 2014); Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4th Ed. (Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press 2012); Short Protocols in Molecular Biology, 5th Ed. (Ausubel F. et al. eds., John Wiley & Sons 2002) 등을 참고할 수 있다.
실시예 1. CAV, MDV, REV 및 IBDV 시료 준비
본원에서 CAV, MDV 및 REV로 각각 진단된 닭의 간 시료에서 QIAamp DNA Mini kit(Qiagen, Germany)을 사용하여 DNA를 추출하고 또한 IBDV로 확인된 닭의 활액낭으로부터 QIAamp RNA Mini kit(Qiagen, Germany)을 이용하여 RNA를 준비하였다.
실시예 2. CAV, MDV, REV 및 IBDV에 특이적인 프라이머 제작
Chicken anemia virus, Marek's disease virus, Reticuloendotheliosis virus 및 Infectious bursal disease virus의 정확한 검출을 위해 NCBI 및 GenBank에서 다양한 유전자를 수득하여 바이러스에 특이적인 최종 프라이머를 선정하였다. 구체적으로 CAV의 표적으로 CAV의 외피단백질을 형성하는 유전자 VP1 및 닭의 apoptosis를 유도하는 유전자 VP3(GenBank accession number, AB031296), MDV의 표적으로 닭의 암을 유발하는 유전자(GenBank accession number, KT768121), REV의 표적으로 바이러스의 외피를 구성하는 표면 당단백질(GenBank accession number, GQ415645) 및 IBDV의 표적으로 바이러스 입자 표면 외피를 구성하는 단백질(GenBank accession number, EF070167)을 기반으로 F3, B3, FIP, BIP, LF 및 LB의 각 프라이머 별로 프라이머를 제작하여 LAMP 증폭용 프라이머 세트를 완성하였다 (표 1 내지 표 4). 각 프라이머 염기서열은 NCBI (National Center for Biotechnology Information), Genbank 및 Blast (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi website)를 이용하여 검증한 결과 해당 바이러스 외에는 일치하는 염기서열이 존재하지 않았다. 각 프라이머 세트는 LAMP 또는 RT-LAMP 반응에 최적화되도록 디자인 및 조합된 것으로 특이성 및 민감도 측면에서 우수한 효과를 나타냈다.
[표 1]
[표 2]
[표 3]
[표 4]
실시예 3. LAMP 및 RT-LAMP 반응의 특이도 및 민감도 확인
우선 6 종류의 프라이머 조합 중 붉은색으로 표시된 1개 조합 (표 1 내지 표 4 참고)을 이용하여 Chicken anaemia virus, Fowl adenovirus, Infectious Laryngotracheitis virus, Marek's disease virus, Reticuloendotheliosis virus 및 Avian leukosis virus간의 교차반응을 통해 반응물의 색 변화와 전기영동 결과로 특이도를 확인하였다 (도1a, 도2a 및 도3a). 또한 RNA를 유전체로 지니는 Infectious bursal disease virus, Infectious bronchitis virus, Newcastle disease virus, Avian Influenza A(H9N2) virus, Avian reovirus, Duck hepatitis A virus 및 Avian encephalomyelitis virus간의 RT-LAMP를 이용한 교차반응을 통해 반응물의 색 변화와 전기영동 결과로 특이도를 확인하였다 (도4a).
이를 위해 실시예 1에서 확보한 Chicken anaemia virus, Fowl adenovirus, Infectious Laryngotracheitis virus, Marek's disease virus, Reticuloendotheli- osis virus 및 Avian leukosis virus의 바이러스에서 유전체를 추출한 후 각각의 DNA를 500ng/ul로 준비하였다. 이어 LAMP 분석을 위해 Mmiso DNA amplification kit(Mmonitor, South Korea)을 사용하여 총 부피 25 μl에서 0.2 μM 의 각 F3 및 B3 프라이머, 1.6 μM의 각 FIP 및 BIP 프라이머, 0.8 μM의 각 LF 및 LB 프라이머, 0.4M betaine, 10 mM MgSO4, 1.4 mM dNTPs, 1× ThermoPol reaction buffer (Mmonitor, South Korea), 8 U Bst DNA polymerase (Mmonitor, South Korea) 및 2μl의 상기 분리한 DNA를 포함하는 조성의 용액을 사용하였다. 상기 조성으로 63℃에서 40분 동안 등온증폭을 실시한 뒤 80℃에서 5분간 반응시켜 반응을 종료하였다.
또한 Infectious bursal disease virus, Infectious bronchitis virus, Newcastle disease virus, Avian Influenza A(H9N2) virus, Avian reovirus, Duck hepatitis A virus 및 Avian encephalomyelitis virus의 바이러스에서 RNA 유전체를 추출한 후 각각의 RNA를 500ng/ul 농도로 준비하여 RT-LAMP를 수행하였다. RT-LAMP 분석을 위해 Mmiso RNA amplification kit(Mmonitor, South Korea)을 사용하여 총 부피 25 μl에서 0.2 μM 의 각 F3 및 B3 프라이머, 1.6 μM의 각 FIP 및 BIP 프라이머, 0.8 μM의 각 LF 및 LB 프라이머, 2XThermoPol reaction buffer (Mmonitor, South Korea), 8 U Enzyme mix (Mmonitor, South Korea) 및 2μl의 상기 분리한 RNA를 포함하는 조성의 용액으로 58℃에서 40분 동안 등온증폭을 수행한 후 80℃에서 5분간 반응시켜 반응을 종료하였다.
결과는 도 1a, 도 2a, 도 3a 및 도 4a에 기재된 바와 같이 본원에 따른 프라이머 세트는 다른 유사한 바이러스에는 교차반응을 하지 않으며, 해당 바이러스만 특이적으로 검출하는 것으로 나타났다. 상기 결과는 다른 조합의 프라이머 세트 (표 1 내지 표 4)로 특이성도 충분히 나타낼 수 있다.
다음으로 각 조합의 프라이머 세트 (표 1 내지 표 4)를 이용하여 Chicken anemia virus, Marek's disease virus, Reticuloendotheliosis virus 및 Infectious bursal disease virus에 대한 민감도를 확인하였다. 이를 위해 CAV, MDV 및 REV에 각각 단독 감염된 닭의 간 조직으로부터 DNA를 추출한 후 500pg/ul, 100pg/ul, 20pg/ul, 4pg/ul, 800fg/ul, 160fg/ul, 32fg/ul의 시료를 준비한 후 동일한 조성에서 63℃에서 35분 동안 등온증폭을 실시한 뒤 80℃에서 5분간 반응하고 반응물의 색 변화를 확인하였다(도 1b, 도 2b 및 3b). 또한 IBDV에 단독 감염된 닭의 F낭으로부터 RNA를 추출한 뒤 500pg/ul, 100pg/ul, 20pg/ul, 4pg/ul, 800fg/ul, 160fg/ul, 32fg/ul의 시료를 준비하고 58℃에서 40분 동안 등온증폭을 실시한 뒤 80℃에서 5분간 반응하여 반응물의 색 변화를 확인하였다(도 4b). 또한 상기의 민감도 결과를 토대로 Chicken anemia virus에 특이적인 프라이머 2의 F3 및 프라이머 1의 B3, Marek's disease virus에 특이적인 프라이머 5의 F3 및 프라이머 6의 B3와 Reticuloendotheliosis virus에 특이적인 프라이머 7의 F3 및 프라이머 9의 B3를 이용하여 PCR(94℃, 5min; 94℃, 30sec, 55℃, 30sec, 72℃, 30sec, 35cycles; 72℃, 7min)을 수행하였다. 그리고 Infectious bursal disease virus에 특이적인 프라이머 13의 F3 및 프라이머 12의 B3를 이용하여 RT-PCR(45℃, 30min; 94℃, 5min; 94℃, 5min; 94℃, 30sec, 55℃, 30sec, 72℃, 30sec, 35cycles; 72℃, 7min)을 실시하였다. PCR 및 RT-PCR을 통해 증폭된 산물은 1% TAE agarose 젤에서 전기영동을 한 후 제조자의 방법에 따라 gel extraction(Qiagen, Germany)을 실시한 뒤 TOPcloner TA kit(Enzynomics, Korea)의 pTOP TA V2 벡터에 각각 삽입하여 pTOP-CAV, pTOP-MDV, pTOP-REV 및 pTOP-IBDV를 제작하였다.
그리고 상기의 제작된 pTOP-CAV plasmid를 ㎕ 반응액 중에 6.25 x 103 copies, 1.25 x 103 copies, 2.5 x 102 copies, 50copies, 10copies, 2copies, 0.4copy, pTOP-MDV plasmid를 ㎕ 반응액 중에 1.25 x 104 copies, 2.5 x 103 copies, 5.0 x 102 copies, 1.0 x 102 copies, 20copies, 4copies, 0.8copy, pTOP-REV plasmid를 ㎕ 반응액 중에 1.0 x 104 copies, 2.0 x 103 copies, 4.0 x 102 copies, 80copies, 16copies, 3.2copies, 0.64copy 및 pTOP-IBDV plasmid를 ㎕ 반응액 중에 6.25 x 103 copies, 1.25 x 103 copies, 2.50 x 102 copies, 50copies, 10copies, 2copies, 0.4copy의 농도로 사용하여 동일한 조성에서 63℃에서 40분 동안 등온증폭을 실시한 뒤 80℃에서 5분간 반응하고 반응물의 색 변화와 전기영동 결과로 민감도를 확인하였다 (도1c, 도2c, 도3c 및 도4c).
따라서 반응 전에는 보라색으로 존재하다가, DNA 합성 반응이 일어나면서 Mg2+ 이온의 농도가 줄어들고 이에 따라서 보라색에서 푸른색으로 색의 변화(가) 일어난다. 색의 변화는 핵산이 증폭되었음을 나타내는 양성 반응.
본원에 따른 방법은 신속하고 편리하게 결과를 눈으로 보고 정성 분석을 할 수 있으며, 또한 분광광도계를 이용하여 650nm 파장에서 흡광도를 측정할 경우 정성 및 정량 분석이 가능한 장점이 있다.
도 1c 내지 도 4c에 기재된 바와 같이 본원에 따른 프라이머 세트를 이용한 바이러스의 검출은 민감도가 Chicken anemia virus의 유전체가 포함된 plasmid를 이용한 경우 50copies ; Marek's disease virus의 유전체가 포함된 plasmid를 이용한 경우 20copies ; Reticuloendotheliosis virus의 유전체가 포함된 plasmid를 이용한 경우 16copies ; Infectious bursal disease virus의 유전체가 포함된 plasmid를 이용한 경우 250copies로 매우 높은 것으로 나타났다.
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> F3 primer for LAMP detection of Chicken anaemia virus vp1, vp3
<400> 1
accgagaggc cgatttta 18
<210> 2
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> B3 primer for LAMP detection of Chicken anaemia virus vp1, vp3
<400> 2
agtcatagtt gattgggggt t 21
<210> 3
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FIP primer for LAMP detection of Chicken anaemia virus vp1, vp3
<400> 3
cctccgatgt cgaaatttat atcttcagaa gaggacggtg gcac 44
<210> 4
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BIP primer for LAMP detection of Chicken anaemia virus vp1, vp3
<400> 4
agcggtatcg tagacgagct ttagcctcac actatacgta cc 42
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> LF primer for LAMP detection of Chicken anaemia virus vp1, vp3
<400> 5
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<210> 6
<211> 20
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<213> Artificial Sequence
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<223> LB primer for LAMP detection of Chicken anaemia virus vp1, vp3
<400> 6
ggaaggcctt tcacaacccc 20
<210> 7
<211> 21
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> F3 primer for LAMP detection of Chicken anaemia virus vp1, vp3
<400> 7
tctccaagaa gatactccac c 21
<210> 8
<211> 21
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> B3 primer for LAMP detection of Chicken anaemia virus vp1, vp3
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<223> FIP primer for LAMP detection of Chicken anaemia virus vp1, vp3
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<210> 10
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<212> DNA
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cggattggta tcgctggaat tacacgtggg agcgcgagca tt 42
<210> 11
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<223> LF primer for LAMP detection of Chicken anaemia virus vp1, vp3
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<211> 18
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accccgaacc gcaagaag 18
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<211> 19
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<213> Artificial Sequence
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<223> F3 primer for LAMP detection of Marek's disease virus meq
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<223> B3 primer for LAMP detection of Marek's disease virus meq
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<223> FIP primer for LAMP detection of Marek's disease virus meq
<400> 21
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<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> BIP primer for LAMP detection of Marek's disease virus meq
<400> 22
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<213> Artificial Sequence
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<400> 23
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<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LB primer for LAMP detection of Marek's disease virus meq
<400> 24
tcggagaaga cgcaggga 18
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<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> F3 primer for LAMP detection of Marek's disease virus meq
<400> 25
tcgatctttc tctcgggtc 19
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<211> 23
<212> DNA
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<220>
<223> B3 primer for LAMP detection of Marek's disease virus meq
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<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FIP primer for LAMP detection of Marek's disease virus meq
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<213> Artificial Sequence
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<223> BIP primer for LAMP detection of Marek's disease virus meq
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LF primer for LAMP detection of Marek's disease virus meq
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LB primer for LAMP detection of Marek's disease virus meq
<400> 30
gctggaaagg aggagaaaaa gga 23
<210> 31
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> F3 primer for LAMP detection of Marek's disease virus meq
<400> 31
aggaggagaa acagaagct 19
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<211> 19
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<213> Artificial Sequence
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<223> B3 primer for LAMP detection of Marek's disease virus meq
<400> 32
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<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FIP primer for LAMP detection of Marek's disease virus meq
<400> 33
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<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BIP primer for LAMP detection of Marek's disease virus meq
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<213> Artificial Sequence
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<223> LF primer for LAMP detection of Marek's disease virus meq
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<211> 23
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<213> Artificial Sequence
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<223> LB primer for LAMP detection of Marek's disease virus meq
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<210> 37
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> F3 primer for LAMP detection of Reticuloendotheliosis virus gp90
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<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> B3 primer for LAMP detection of Reticuloendotheliosis virus gp90
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FIP primer for LAMP detection of Reticuloendotheliosis virus gp90
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<213> Artificial Sequence
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<223> BIP primer for LAMP detection of Reticuloendotheliosis virus gp90
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<220>
<223> LF primer for LAMP detection of Reticuloendotheliosis virus gp90
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LB primer for LAMP detection of Reticuloendotheliosis virus gp90
<400> 42
gcggtcccac tgacatgatt 20
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> F3 primer for LAMP detection of Reticuloendotheliosis virus gp90
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accaagagga gtagatctgg 20
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<223> B3 primer for LAMP detection of Reticuloendotheliosis virus gp90
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<223> FIP primer for LAMP detection of Reticuloendotheliosis virus gp90
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<223> LB primer for LAMP detection of Reticuloendotheliosis virus gp90
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<213> Artificial Sequence
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<223> F3 primer for LAMP detection of Reticuloendotheliosis virus gp90
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<213> Artificial Sequence
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<223> B3 primer for LAMP detection of Reticuloendotheliosis virus gp90
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<213> Artificial Sequence
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<223> FIP primer for LAMP detection of Reticuloendotheliosis virus gp90
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LF primer for LAMP detection of Reticuloendotheliosis virus gp90
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<223> LB primer for LAMP detection of Reticuloendotheliosis virus gp90
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<220>
<223> F3 primer for LAMP detection of Reticuloendotheliosis virus gp90
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<210> 56
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<220>
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LF primer for LAMP detection of Reticuloendotheliosis virus gp90
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<210> 60
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LB primer for LAMP detection of Reticuloendotheliosis virus gp90
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<210> 61
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<220>
<223> F3 primer for LAMP detection of Infectious bursal disease virus
vp2
<400> 61
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<213> Artificial Sequence
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<223> B3 primer for LAMP detection of Infectious bursal disease virus
vp2
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<213> Artificial Sequence
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<223> FIP primer for LAMP detection of Infectious bursal disease virus
vp2
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<211> 43
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<223> BIP primer for LAMP detection of Infectious bursal disease virus
vp2
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<210> 65
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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gtagtgagca cccacaattg agc 23
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<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> LB primer for LAMP detection of Infectious bursal disease virus
vp2
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agaacctacc ggccagcta 19
<210> 67
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> F3 primer for LAMP detection of Infectious bursal disease virus
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cataaacgcc gtgacctt 18
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<211> 18
<212> DNA
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<223> B3 primer for LAMP detection of Infectious bursal disease virus
vp2
<400> 68
ggtcaccaag tctcacat 18
<210> 69
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FIP primer for LAMP detection of Infectious bursal disease virus
vp2
<400> 69
tgatgttggc tgttgcagac caaggaagcc tgagtgaact 40
<210> 70
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BIP primer for LAMP detection of Infectious bursal disease virus
vp2
<400> 70
aaaatcggga acgtcctagt agggacccaa gatcatatga tgtgggta 48
<210> 71
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LF primer for LAMP detection of Infectious bursal disease virus
vp2
<400> 71
tcaacccatt gtagctaaca tctgtc 26
<210> 72
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LB primer for LAMP detection of Infectious bursal disease virus
vp2
<400> 72
aaggggtaac cgtcctcag 19
<210> 73
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> F3 primer for LAMP detection of Infectious bursal disease virus
vp2
<400> 73
agatcaaacc caacagattg t 21
<210> 74
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> B3 primer for LAMP detection of Infectious bursal disease virus
vp2
<400> 74
cacaattgag ccagggaa 18
<210> 75
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FIP primer for LAMP detection of Infectious bursal disease virus
vp2
<400> 75
agggtgtcgt ccggaatggt ccgttcatac ggagccttct 40
<210> 76
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BIP primer for LAMP detection of Infectious bursal disease virus
vp2
<400> 76
gagaagcaca ctctcaggtc agaaaagaca attagccctg accctgt 47
<210> 77
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LF primer for LAMP detection of Infectious bursal disease virus
vp2
<400> 77
cggtccggtt gttggcat 18
<210> 78
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LB primer for LAMP detection of Infectious bursal disease virus
vp2
<400> 78
tcgacctaca atttgactgt gggg 24
Claims (10)
- F3 프라이머, B3 프라이머, FIP 프라이머, BIP 프라이머를 포함하는, 닭빈혈 바이러스(Chicken anemia virus), 마렉병 바이러스(Marek's disease virus), 세망내피증 바이러스(Reticuloendotheliosis virus) 및 닭 전염성F낭병 바이러스(Infectious bursal disease virus)로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 가금 면역억제질병 바이러스 검출을 위한 LAMP 또는 RT-LAMP 분석용 프라이머 세트로,
상기 닭빈혈 바이러스 검출을 위한 상기 F3 프라이머는 서열번호 1, 7, 또는 13으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 프라이머로 표시되고; 상기 B3 프라이머는 서열번호 2, 8, 또는 14로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 프라이머로 표시되고; 상기 FIP 프라이머는 서열번호 3, 9, 또는 15로 이루어진 군에서 선택된 하나의 프라이머로 표시되고; 그리고 상기 BIP 프라이머는 서열번호 4, 10, 또는 16으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 프라이머로 표시되고,
상기 마렉병 바이러스 검출을 위한 상기 F3 프라이머는 서열번호 19, 25, 또는 31로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 프라이머로 표시되고, 상기 B3 프라이머는 서열번호 20, 26, 또는 32로 이루어진 군에서 선택된 하나의 프라이머로 표시되고, 상기 FIP 프라이머는 서열번호 21, 27, 또는 33으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 프라이머로 표시되고; 그리고, 상기 BIP 프라이머는 서열번호 22, 28, 또는 34로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 프라이머로 표시되고;
상기 세망내피증 바이러스 검출을 위한 상기 F3 프라이머는 서열번호 37, 43, 49, 또는 55로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 프라이머로 표시되고; 상기 B3 프라이머는 서열번호 38, 44, 50, 또는 56으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 프라이머로 표시되고; 상기 FIP 프라이머는 서열번호 39, 45, 51, 또는 57로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 프라이머로 표시되고; 및 상기 BIP 프라이머는 서열번호 40, 46, 52, 또는 58로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 프라이머로 표시되고,
상기 닭 전염성F낭병 바이러스 검출을 위한 상기 F3 프라이머는 서열번호 61, 67, 또는 73으로 이루어진 군에서 선택된 하나의 프라이머로 표시되고; 상기 B3 프라이머는 서열번호 62, 68, 또는 74로 이루어진 군에서 선택된 하나의 프라이머로 표시되고; 상기 FIP 프라이머는 서열번호 63, 69, 또는 75로 이루어진 군에서 선택된 하나의 프라이머로 표시되고; 그리고 상기 BIP 프라이머는 서열번호 64, 70, 또는 76으로 이루어진 군에서 선택된 하나의 프라이머로 표시되는 것인, 가금 면역억제질병 바이러스 검출을 위한 LAMP 또는 RT-LAMP분석용 프라이머 세트.
- 제 1 항에 있어서,
상기 프라이머 세트는 LF 프라이머 및 LB 프라이머를 추가로 포함하며,
상기 닭빈혈 바이러스 검출을 위한 상기 LF 프라이머는 서열번호 5, 11, 또는 17로 이루어진 군에서 선택된 하나로 표시되는 프라이머이고, 상기 LB 프라이머는 서열번호 6, 12 또는 18로 이루어진 군에서 선택된 하나로 표시되는 프라이머이며;
상기 마렉병 바이러스 검출을 위한 상기 LF 프라이머는 서열번호 23, 29, 또는 35로 이루어진 군에서 선택된 하나로 표시되는 프라이머이고, 상기 LB 프라이머는 서열번호 24, 30, 또는 36으로 이루어진 군에서 선택된 하나로 표시되는 프라이머이며;
상기 세망내피증 바이러스 검출을 위한 상기 LF 프라이머는 서열번호 41, 47, 53, 또는 59로 이루어진 군에서 선택된 하나로 표시되는 프라이머이고, 상기 LB 프라이머는 서열번호 42, 48, 54 또는 60으로 이루어진 군에서 선택된 하나로 표시되는 프라이머이며; 그리고
상기 닭 전염성F낭병 바이러스 검출을 위한 상기 LF 프라이머는 서열번호 65, 71, 또는 77로 이루어진 군에서 선택된 하나로 표시되는 프라이머이고, 상기 LB 프라이머는 서열번호 66, 72, 또는 78로 이루어진 군에서 선택된 하나로 표시되는 프라이머인,
가금 면역억제질병 바이러스 검출을 위한 LAMP 또는 RT-LAMP 분석용 프라이머 세트.
- 제 1 항에 있어서,
상기 프라이머 세트는 다음 중 어느 하나인, 가금 면역억제질병 바이러스 검출을 위한 LAMP 또는 RT-LAMP 분석용 프라이머 세트:
상기 닭빈혈 바이러스를 검출하기 위한 프라이머 세트는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 프라이머를 포함하는 프라이머 세트; 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9 및 서열번호 10으로 표시되는 프라이머를 포함하는 프라이머 세트; 또는 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15 및 서열번호 16으로 표시되는 프라이머를 포함하는 프라이머 세트 중에서 선택되고;
상기 마렉병 바이러스를 검출하기 위한 프라이머 세트는 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21 및 서열번호 22로 표시되는 프라이머를 포함하는 프라이머 세트; 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 27 및 서열번호 28로 표시되는 프라이머를 포함하는 프라이머 세트; 또는 서열번호 31, 서열번호 32, 서열번호 33 및 서열번호 34로 표시되는 프라이머를 포함하는 프라이머 세트 중에서 선택되고;
상기 세망내피증 바이러스를 검출하기 위한 프라이머 세트는 서열번호 37, 서열번호 38, 서열번호 39, 및 서열번호 40으로 표시되는 프라이머를 포함하는 프라이머 세트; 서열번호 43, 서열번호 44, 서열번호 45 및 서열번호 46으로 표시되는 프라이머를 포함하는 프라이머 세트; 서열번호 49, 서열번호 50, 서열번호 51 및 서열번호 52로 표시되는 프라이머를 포함하는 프라이머 세트; 또는 서열번호 55, 서열번호 56, 서열번호 57 및 서열번호 58로 표시되는 프라이머를 포함하는 프라이머 세트 중에서 선택되고; 그리고
상기 전염성F낭병 바이러스를 검출하기 위한 프라이머 세트는 서열번호 61, 서열번호 62, 서열번호 63 및 서열번호 64로 표시되는 프라이머를 포함하는 프라이머 세트; 서열번호 67, 서열번호 68, 서열번호 69 및 서열번호 70으로 표시되는 프라이머를 포함하는 프라이머 세트; 또는 서열번호 73, 서열번호 74, 서열번호 75 및 서열번호 76으로 표시되는 프라이머를 포함하는 프라이머 세트 중에서 선택되는 것인, 가금 면역억제질병 바이러스 검출을 위한 LAMP 또는 RT-LAMP분석용 프라이머 세트.
- 제 2 항에 있어서,
상기 프라이머 세트는 다음 중 어느 하나인, 가금 면역억제질병 바이러스 검출을 위한 LAMP 또는 RT-LAMP 분석용 프라이머 세트:
상기 닭빈혈 바이러스를 검출하기 위한 프라이머 세트는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 및 서열번호 6으로 표시되는 프라이머를 포함하는 프라이머 세트; 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11 및 서열번호 12으로 표시되는 프라이머를 포함하는 프라이머 세트; 또는 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17, 및 서열번호 18로 표시되는 프라이머를 포함하는 프라이머 세트 중에서 선택되고;
상기 마렉병 바이러스를 검출하기 위한 프라이머 세트는 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23 및 서열번호 24로 표시되는 프라이머를 포함하는 프라이머 세트; 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 29 및 서열번호 30으로 표시되는 프라이머를 포함하는 프라이머 세트; 또는 서열번호 31, 서열번호 32, 서열번호 33, 서열번호 34, 서열번호 35 및 서열번호 36으로 표시되는 프라이머를 포함하는 프라이머 세트 중에서 선택되고;
상기 세망내피증 바이러스를 검출하기 위한 프라이머 세트는 서열번호 37, 서열번호 38, 서열번호 39, 서열번호 40, 서열번호 41 및 서열번호 42로 표시되는 프라이머를 포함하는 프라이머 세트 ; 서열번호 43, 서열번호 44, 서열번호 45, 서열번호 46, 서열번호 47 및 서열번호 48로 표시되는 프라이머를 포함하는 프라이머 세트 ; 서열번호 49, 서열번호 50, 서열번호 51, 서열번호 52, 서열번호 53 및 서열번호 54로 표시되는 프라이머를 포함하는 프라이머 세트; 또는 서열번호 55, 서열번호 56, 서열번호 57, 서열번호 58, 서열번호 59 및 서열번호 60으로 표시되는 프라이머를 포함하는 프라이머 세트 중에서 선택되고;
상기 닭 전염성F낭병 바이러스를 검출하기 위한 프라이머 세트는 서열번호 61, 서열번호 62, 서열번호 63, 서열번호 64, 서열번호 65 및 서열번호 66으로 표시되는 프라이머를 포함하는 프라이머 세트; 서열번호 67, 서열번호 68, 서열번호 69, 서열번호 70, 서열번호 71 및 서열번호 72로 표시되는 프라이머를 포함하는 프라이머 세트; 또는 서열번호 73, 서열번호 74, 서열번호 75, 서열번호 76, 서열번호 77 및 서열번호 78로 표시되는 프라이머를 포함하는 프라이머 세트 중에서 선택되는 것인, 가금 면역억제질병 바이러스 검출을 위한 LAMP 또는 RT-LAMP 분석용 프라이머 세트.
- 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 각 세트의 하나 이상의 프라이머는 검출가능한 표지 물질로 표지된 것인, 가금 면역억제질병 바이러스 검출을 위한 LAMP 또는 RT-LAMP 분석용 프라이머 세트.
- 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 따른 프라이머 세트를 이용한 인비트로에서 LAMP 또는 RT-LAMP 방식으로 가금 면역억제질병 바이러스를 검출하는 방법으로, 상기 방법은 하기의 단계를 포함하는 방법:
가금 면역억제질병 바이러스 감염 또는 오염이 의심되는 시료를 제공하는 단계;
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 따른 프라이머 세트를 제공하는 단계;
상기 시료 및 프라이머 세트를 이용하여 LAMP 또는 RT-LAMP 반응을 수행하는 단계; 및
상기 LAMP 또는 RT-LAMP 반응 중 또는 종료 후에 반응 결과물을 분석하고, 이를 음성 대조군 시료와 비교하여 차이가 있는 경우, 상기 시료를 가금 면역억제질병 바이러스 감염 또는 오염으로 판정하는 단계.
- 제 6 항에 있어서,
상기 시료는 가금의 병성감정 시료; 도축산물; 육계. 산란계, 종계, 토종닭 또는 이들 사육장 유래의 검체; SPF (Specific Pathogen Free) 닭 또는 그 종란 또는 이들 사육장 유래의 검체를 포함하는 방법
- 제 6 항에 있어서,
상기 LAMP 또는 RT-LAMP 반응 결과물의 분석은 상기 반응 결과물의 색변화 측정 또는 탁도(turbidity) 중 하나 이상을 이용하여 측정을 통해 결정되는 것인, 방법.
- 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 따른 프라이머 세트를 포함하는 LAMP 또는 RT-LAMP 방식을 이용한 가금 면역억제질병 바이러스 검출용 조성물.
- 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 따른 프라이머 세트를 포함하는 LAMP 또는 RT-LAMP 방식을 이용한 가금 면역억제질병 바이러스 검출용 키트.
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| CN113897461A (zh) * | 2021-11-18 | 2022-01-07 | 内蒙古自治区农牧业科学院 | Alv、rev、ibdv、ciav、arv和ghv的六重pcr检测引物组和试剂盒 |
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| CN114480729A (zh) * | 2021-12-08 | 2022-05-13 | 广西壮族自治区兽医研究所 | 鸡圆圈病毒3型可视化lamp检测成套试剂 |
| CN114480729B (zh) * | 2021-12-08 | 2023-10-27 | 广西壮族自治区兽医研究所 | 鸡圆圈病毒3型可视化lamp检测成套试剂 |
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