KR20190092821A - 구제역 바이러스 7가지 혈청형 진단용 프라이머 세트 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 구제역 바이러스 진단용 프라이머 세트 및 이의 용도에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 구제역 바이러스 진단용 프라이머 세트, 이를 포함하는 조성물, 상기 조성물을 포함하는 키트 및 구제역 바이러스 진단용 프라이머 세트를 이용한 구제역 바이러스 진단 방법에 관한 것이다. 본 발명의 구제역 바이러스 검출용 프라이머 세트는, 낮은 농도의 시료만으로도 7가지 구제역바이러스의 혈청형을 검출할 수 있어 민감도가 높고, 다른 병원체를 제외하고 오직 구제역바이러스만을 검출할 수 있는 특이도가 우수하다. 또한, 본 발명의 구제역 바이러스 검출용 프라이머 세트를 이용한 RT-LAMP법을 이용하면 기존의 PCR 기반 진단법과는 달리 온도 변화가 없는 등온조건에서 유전자 증폭이 이루어지기 때문에 검사시간을 단축할 수 있을 뿐만 아니라 항온 수조와 같은 저가의 장비로도 반응이 가능하다. 따라서, 전문 진단실은 물론 고가의 장비와 시약 및 전문인력이 확보되지 않은 소규모의 진단실이나 현장에서도 구제역 바이러스를 신속하고 효과적으로 진단할 수 있는 바, 국내외 바이러스 진단 시장에서 용이하게 활용될 수 있다.
Description
본 발명은 구제역 바이러스 진단용 프라이머 세트 및 이의 용도에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 구제역 바이러스 진단용 프라이머 세트, 이를 포함하는 조성물, 상기 조성물을 포함하는 키트 및 구제역 바이러스 진단용 프라이머 세트를 이용한 구제역 바이러스 진단 방법에 관한 것이다.
구제역(Foot-and-mouth disease; FMD)은 우제류 가축 및 야생동물에 감염되는 고전염성의 바이러스성 질병으로 발생 국가는 감염 가축의 생산성 저하는 물론 동축산물의 국제 교역 제한으로 인해 심각한 경제적 피해를 입게 된다.
이러한 FMD의 원인체인 구제역 바이러스(FMD virus, FMDV)는 피코르나바이러스과(Picornaviridae과), 아프타바이러스속(Aphthovirus속)에 속하는 RNA 바이러스로 면역학적 및 유전적으로 구별되는 7가지 혈청형 즉, O, A, Asia 1, C, SAT (Southern African Territories) 1, SAT 2, 및 SAT 3형으로 구분되고, 동일 혈청형 내에서도 다양한 지역형(topotypes) 및 유전형(genetic lineages)이 존재하며, 혈청형 및 지역형별로 발생지역의 분포가 다른 특징을 가지고 있다. 7개 혈청형 중에서 C 혈청형은 2004년 케냐 및 브라질 발생 이후 더 이상 발생이 없는 상태이며, SAT 1, 2 및 3 혈청형은 아프리카 지역 국가에서 그리고 Asia 1 혈청형은 아시아 지역의 국가에서 주로 발생하고 있다. 반면에 O 및 A 혈청형의 구제역바이러스는 지역 제한 없이 광범위한 발생 분포를 보이고 있으며, 유럽, 북미, 아시아 및 아프리카 지역의 국가들에서 지속적으로 발생하고 있다. 한국은 지리적으로 O, A 및 Asia 1 혈청형의 구제역바이러스가 주로 발생하는 pool 1 지역에 속하며, 2000년 이후 O 혈청형(2000, 2002, 2010, 2014, 2016 및 2017년)과 A 혈청형(2010 및 2017년)의 구제역바이러스가 주기적으로 발생하여 왔다.
FMD는 전파가 매우 빠른 질병이기 때문에 효율적인 초기 방역을 위해서는 감염 가축을 신속정확하게 진단할 수 있는 진단법의 개발 및 적용이 필수적이다. 이러한 진단 목적을 달성하기 위하여 최근 역전사 중합효소 연쇄반응(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction, RT-PCR) 및 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응(real-time RT-PCR, RRT-PCR)과 같은 PCR 기반 진단법들이 개발되어 널리 활용되고 있으며, 한국의 방역기관에서도 현재 RT-PCR과 RRT-PCR을 표준 진단법으로 활용하고 있는 실정이다.
그러나 PCR 기반의 진단법은 고가의 전용 장비와 시약을 필요로 하며, 숙련된 인력이 갖추어진 전문 실험실에서만 활용이 가능하므로 일선 임상실험실이나 현장 진단용으로 사용하기에는 제한이 있어 왔다. 이러한 PCR 기반 진단법의 단점을 극복할 수 있는 방법 중의 하나로 Notomi 등(Nucleic Acids Res 28(2000), 63~69)은 높은 특이도와 민감도를 가지면서도 등온조건 하에서 신속하게 목표 유전자를 증폭할 수 있는 등온증폭기법(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)을 개발하였다.
LAMP는 기존의 PCR 기반 진단법에서 사용되는 Taq DNA 중합효소(polymerase)와 달리 목표유전자를 염기가닥 치환(strand displacement) 방식에 의해 대량 증폭할 수 있는 Bst DNA 중합효소(polymerase)를 이용함으로써 유전자 증폭효율이 월등하게 높을 뿐만 아니라 기존 PCR 기반 진단법과는 달리 온도 변화가 없는 등온조건에서 유전자 증폭이 이루어지기 때문에 검사시간을 단축되며, 항온수조와 같은 저가의 장비로도 반응이 가능하다. 따라서 전문 진단실은 물론 고가의 장비와 시약 및 전문인력이 확보되지 않은 소규모의 진단실에서도 활용이 가능한 장점이 있다. 또한 LAMP 반응액에 단순히 역전사효소를 첨가함으로써 RNA 주형을 증폭시킬 수 있는 역전사 등온증폭기법(reverse transcription LAMP , RT-LAMP)을 실시할 수 있기 때문에 다양한 세균, 기생충 및 바이러스성 질병의 진단에 널리 이용되고 있다. 또한 기존의 RT-LAMP법에는 외부 프라이머(F3, B3), 루프 프라이머(LF, LB) 및 내부 프라이머와 같은 3쌍의 프라이머(FIP, BIP)가 사용된다.
한편, 한국에서도 최근 수의학 분야의 여러 연구자들이 다양한 세균 및 바이러스성 병원체 진단을 위한 LAMP 및 RT-LAMP 기법을 개발하여 왔으나, 아직 구제역 바이러스의 진단에는 응용된 바가 없다.
이에 본 발명자는 구제역 바이러스를 신속하고 정확하게 진단하기 위하여 연구하던 중, 구제역바이러스의 7가지 혈청형을 표적으로 하는 프라이머 세트 및 증폭 반응의 효율을 높이는 스웜 프라이머 한쌍을 제작하여 RT-LAMP법을 수행한 결과, 낮은 농도의 시료만으로도 구제역바이러스의 7가지 혈청형을 검출할 수 있어 민감도가 높고, 구제역 바이러스에 대한 특이도가 우수함을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은, 구제역 바이러스 진단용 프라이머 세트, 이를 포함하는 조성물, 상기 조성물을 포함하는 키트 및 구제역 바이러스 진단용 프라이머 세트를 이용한 구제역 바이러스 진단 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 및 2로 이루어진 제 1 프라이머 세트, 서열번호 3 및 4로 이루어진 제 2 프라이머 세트 및 서열번호 5 및 6으로 이루어진 제 3 프라이머 세트를 포함하는, 구제역 바이러스(Foot and mouth disease virus, FMDV) 진단용 프라이머 세트를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 구제역 바이러스 진단용 프라이머 세트를 포함하는, 구제역 바이러스 진단용 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 구제역 바이러스 진단용 조성물을 포함하는, 구제역 바이러스 진단용 키트를 제공한다.
또한 본 발명은 a) 시료로부터 핵산을 얻는 단계; b) 본 발명의 구제역 바이러스 진단용 프라이머 세트를 이용하여 상기 a)단계에서 얻어진 핵산을 증폭하는 단계; 및 c) 상기 b)단계에서 얻어진 증폭 산물을 검출하는 단계;를 포함하는, 구제역 바이러스 진단 방법을 제공한다.
본 발명의 구제역 바이러스 검출용 프라이머 세트는, 낮은 농도의 시료만으로도 7가지 구제역바이러스의 혈청형을 검출할 수 있어 민감도가 높고, 다른 병원체를 제외하고 오직 구제역바이러스만을 검출할 수 있는 특이도가 우수하다. 또한, 본 발명의 구제역 바이러스 검출용 프라이머 세트를 이용한 RT-LAMP법을 이용하면 기존의 PCR 기반 진단법과는 달리 온도 변화가 없는 등온조건에서 유전자 증폭이 이루어지기 때문에 검사시간을 단축할 수 있을 뿐만 아니라 항온 수조와 같은 저가의 장비로도 반응이 가능하다. 따라서, 전문 진단실은 물론 고가의 장비와 시약 및 전문인력이 확보되지 않은 소규모의 진단실이나 현장에서도 구제역 바이러스를 신속하고 효과적으로 진단할 수 있는 바, 국내외 바이러스 진단 시장에서 용이하게 활용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 구제역 바이러스 진단용 프라이머 세트의 증폭 부위를 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 프라이머 세트를 이용한 RT-LAMP법 수행 시 최적 온도 조건을 확립하기 위하여, 53 내지 68℃의 반응 온도 조건에서 양성 반응을 확인한 결과로서, (A)는 RT-LAMP 반응이 끝난 튜브의 반응액의 색상 변화를 나타내고, (B)는 전기영동을 실시한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 프라이머 세트를 이용한 RT-LAMP법 수행 시 최적 시간 조건 확립 및 스웜 프라이머의 검출 민감도 증대 효과를 확인하기 위하여, 10 내지 50분 조건의 반응시간과 스웜 프라이머 첨가 여부에 따른 양성 반응 유무를 확인한 결과를 나타낸 도이다. 여기서 (A)는 스웜 프라이머를 첨가한 s(+) RT-LAMP법의 결과이며, (B)는 스웜 프라이머를 첨가하지 않은 s(-) RT-LAMP법의 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명의 프라이머 세트를 이용한 RT-LAMP법에서의 구제역 바이러스 7가지 혈청형 검출 특이도를 확인한 결과를 나타낸 도이다. (A)는 튜브 내 반응을 육안으로 확인한 결과이며, (B)는 전기영동 결과를 나타낸다.
도 5는 본 발명의 프라이머 세트를 이용한 RT-LAMP법의 구제역 바이러스 O 혈청형 검출 민감도 증대 효과를 확인한 결과를 나타낸 도이다. (A)와 (B)는 본 발명의 프라이머 세트를 이용한 s(+) RT-LAMP 반응을 나타내며 (A)는 반응이 끝난 튜브의 반응액의 색상 변화, (B)는 그 반응물을 전기영동을 실시한 결과를 나타낸다. (C)와 (D)는 본 발명의 프라이머 세트를 이용한 s(-) RT-LAMP 반응을 나타내며 (C)는 반응이 끝난 튜브의 반응액의 색상 변화, (D)는 그 전기영동을 실시한 결과를 나타낸다. (E)는 RT-PCR을 실시한 결과이고, (F)는 RRT-PCR을 실시한 결과를 나타낸다.
도 6은 본 발명의 프라이머 세트를 이용한 RT-LAMP법의 구제역 바이러스 A 혈청형 검출 민감도 증대 효과를 확인한 결과를 나타낸 도이다. (A)와 (B)는 본 발명의 프라이머 세트를 이용한 s(+) RT-LAMP 반응을 나타내며 (A)는 반응이 끝난 튜브의 반응액의 색상 변화, (B)는 그 반응물을 전기영동을 실시한 결과를 나타낸다. (C)와 (D)는 본 발명의 프라이머 세트를 이용한 s(-) RT-LAMP 반응을 나타내며 (C)는 반응이 끝난 튜브의 반응액의 색상 변화, (D)는 그 전기영동을 실시한 결과를 나타낸다. (E)는 RT-PCR을 실시한 결과이고, (F)는 RRT-PCR을 실시한 결과를 나타낸다.
도 7은 본 발명의 프라이머 세트를 이용한 RT-LAMP법의 구제역 바이러스 Asia1 혈청형 검출 민감도 증대 효과를 확인한 결과를 나타낸 도이다. (A)와 (B)는 본 발명의 프라이머 세트를 이용한 s(+) RT-LAMP 반응을 나타내며 (A)는 반응이 끝난 튜브의 반응액의 색상 변화, (B)는 그 반응물을 전기영동을 실시한 결과를 나타낸다. (C)와 (D)는 본 발명의 프라이머 세트를 이용한 s(-) RT-LAMP 반응을 나타내며 (C)는 반응이 끝난 튜브의 반응액의 색상 변화, (D)는 그 전기영동을 실시한 결과를 나타낸다. (E)는 RT-PCR을 실시한 결과이고, (F)는 RRT-PCR을 실시한 결과를 나타낸다.
도 8은 본 발명의 프라이머 세트를 이용한 RT-LAMP법의 구제역 바이러스 C 혈청형 검출 민감도 증대 효과를 확인한 결과를 나타낸 도이다. (A)와 (B)는 본 발명의 프라이머 세트를 이용한 s(+) RT-LAMP 반응을 나타내며 (A)는 반응이 끝난 튜브의 반응액의 색상 변화, (B)는 그 반응물을 전기영동을 실시한 결과를 나타낸다. (C)와 (D)는 본 발명의 프라이머 세트를 이용한 s(-) RT-LAMP 반응을 나타내며 (C)는 반응이 끝난 튜브의 반응액의 색상 변화, (D)는 그 전기영동을 실시한 결과를 나타낸다. (E)는 RT-PCR을 실시한 결과이고, (F)는 RRT-PCR을 실시한 결과를 나타낸다.
도 9는 본 발명의 프라이머 세트를 이용한 RT-LAMP법의 구제역 바이러스 SAT1 혈청형 검출 민감도 증대 효과를 확인한 결과를 나타낸 도이다. (A)와 (B)는 본 발명의 프라이머 세트를 이용한 s(+) RT-LAMP 반응을 나타내며 (A)는 반응이 끝난 튜브의 반응액의 색상 변화, (B)는 그 반응물을 전기영동을 실시한 결과를 나타낸다. (C)와 (D)는 본 발명의 프라이머 세트를 이용한 s(-) RT-LAMP 반응을 나타내며 (C)는 반응이 끝난 튜브의 반응액의 색상 변화, (D)는 그 전기영동을 실시한 결과를 나타낸다. (E)는 RT-PCR을 실시한 결과이고, (F)는 RRT-PCR을 실시한 결과를 나타낸다.
도 10은 본 발명의 프라이머 세트를 이용한 RT-LAMP법의 구제역 바이러스 SAT2 혈청형 검출 민감도 증대 효과를 확인한 결과를 나타낸 도이다. (A)와 (B)는 본 발명의 프라이머 세트를 이용한 s(+) RT-LAMP 반응을 나타내며 (A)는 반응이 끝난 튜브의 반응액의 색상 변화, (B)는 그 반응물을 전기영동을 실시한 결과를 나타낸다. (C)와 (D)는 본 발명의 프라이머 세트를 이용한 s(-) RT-LAMP 반응을 나타내며 (C)는 반응이 끝난 튜브의 반응액의 색상 변화, (D)는 그 전기영동을 실시한 결과를 나타낸다. (E)는 RT-PCR을 실시한 결과이고, (F)는 RRT-PCR을 실시한 결과를 나타낸다.
도 11은 본 발명의 프라이머 세트를 이용한 RT-LAMP법의 구제역 바이러스 SAT3 혈청형 검출 민감도 증대 효과를 확인한 결과를 나타낸 도이다. (A)와 (B)는 본 발명의 프라이머 세트를 이용한 s(+) RT-LAMP 반응을 나타내며 (A)는 반응이 끝난 튜브의 반응액의 색상 변화, (B)는 그 반응물을 전기영동을 실시한 결과를 나타낸다. (C)와 (D)는 본 발명의 프라이머 세트를 이용한 s(-) RT-LAMP 반응을 나타내며 (C)는 반응이 끝난 튜브의 반응액의 색상 변화, (D)는 그 전기영동을 실시한 결과를 나타낸다. (E)는 RT-PCR을 실시한 결과이고, (F)는 RRT-PCR을 실시한 결과를 나타낸다.
도 2는 본 발명의 프라이머 세트를 이용한 RT-LAMP법 수행 시 최적 온도 조건을 확립하기 위하여, 53 내지 68℃의 반응 온도 조건에서 양성 반응을 확인한 결과로서, (A)는 RT-LAMP 반응이 끝난 튜브의 반응액의 색상 변화를 나타내고, (B)는 전기영동을 실시한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 프라이머 세트를 이용한 RT-LAMP법 수행 시 최적 시간 조건 확립 및 스웜 프라이머의 검출 민감도 증대 효과를 확인하기 위하여, 10 내지 50분 조건의 반응시간과 스웜 프라이머 첨가 여부에 따른 양성 반응 유무를 확인한 결과를 나타낸 도이다. 여기서 (A)는 스웜 프라이머를 첨가한 s(+) RT-LAMP법의 결과이며, (B)는 스웜 프라이머를 첨가하지 않은 s(-) RT-LAMP법의 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명의 프라이머 세트를 이용한 RT-LAMP법에서의 구제역 바이러스 7가지 혈청형 검출 특이도를 확인한 결과를 나타낸 도이다. (A)는 튜브 내 반응을 육안으로 확인한 결과이며, (B)는 전기영동 결과를 나타낸다.
도 5는 본 발명의 프라이머 세트를 이용한 RT-LAMP법의 구제역 바이러스 O 혈청형 검출 민감도 증대 효과를 확인한 결과를 나타낸 도이다. (A)와 (B)는 본 발명의 프라이머 세트를 이용한 s(+) RT-LAMP 반응을 나타내며 (A)는 반응이 끝난 튜브의 반응액의 색상 변화, (B)는 그 반응물을 전기영동을 실시한 결과를 나타낸다. (C)와 (D)는 본 발명의 프라이머 세트를 이용한 s(-) RT-LAMP 반응을 나타내며 (C)는 반응이 끝난 튜브의 반응액의 색상 변화, (D)는 그 전기영동을 실시한 결과를 나타낸다. (E)는 RT-PCR을 실시한 결과이고, (F)는 RRT-PCR을 실시한 결과를 나타낸다.
도 6은 본 발명의 프라이머 세트를 이용한 RT-LAMP법의 구제역 바이러스 A 혈청형 검출 민감도 증대 효과를 확인한 결과를 나타낸 도이다. (A)와 (B)는 본 발명의 프라이머 세트를 이용한 s(+) RT-LAMP 반응을 나타내며 (A)는 반응이 끝난 튜브의 반응액의 색상 변화, (B)는 그 반응물을 전기영동을 실시한 결과를 나타낸다. (C)와 (D)는 본 발명의 프라이머 세트를 이용한 s(-) RT-LAMP 반응을 나타내며 (C)는 반응이 끝난 튜브의 반응액의 색상 변화, (D)는 그 전기영동을 실시한 결과를 나타낸다. (E)는 RT-PCR을 실시한 결과이고, (F)는 RRT-PCR을 실시한 결과를 나타낸다.
도 7은 본 발명의 프라이머 세트를 이용한 RT-LAMP법의 구제역 바이러스 Asia1 혈청형 검출 민감도 증대 효과를 확인한 결과를 나타낸 도이다. (A)와 (B)는 본 발명의 프라이머 세트를 이용한 s(+) RT-LAMP 반응을 나타내며 (A)는 반응이 끝난 튜브의 반응액의 색상 변화, (B)는 그 반응물을 전기영동을 실시한 결과를 나타낸다. (C)와 (D)는 본 발명의 프라이머 세트를 이용한 s(-) RT-LAMP 반응을 나타내며 (C)는 반응이 끝난 튜브의 반응액의 색상 변화, (D)는 그 전기영동을 실시한 결과를 나타낸다. (E)는 RT-PCR을 실시한 결과이고, (F)는 RRT-PCR을 실시한 결과를 나타낸다.
도 8은 본 발명의 프라이머 세트를 이용한 RT-LAMP법의 구제역 바이러스 C 혈청형 검출 민감도 증대 효과를 확인한 결과를 나타낸 도이다. (A)와 (B)는 본 발명의 프라이머 세트를 이용한 s(+) RT-LAMP 반응을 나타내며 (A)는 반응이 끝난 튜브의 반응액의 색상 변화, (B)는 그 반응물을 전기영동을 실시한 결과를 나타낸다. (C)와 (D)는 본 발명의 프라이머 세트를 이용한 s(-) RT-LAMP 반응을 나타내며 (C)는 반응이 끝난 튜브의 반응액의 색상 변화, (D)는 그 전기영동을 실시한 결과를 나타낸다. (E)는 RT-PCR을 실시한 결과이고, (F)는 RRT-PCR을 실시한 결과를 나타낸다.
도 9는 본 발명의 프라이머 세트를 이용한 RT-LAMP법의 구제역 바이러스 SAT1 혈청형 검출 민감도 증대 효과를 확인한 결과를 나타낸 도이다. (A)와 (B)는 본 발명의 프라이머 세트를 이용한 s(+) RT-LAMP 반응을 나타내며 (A)는 반응이 끝난 튜브의 반응액의 색상 변화, (B)는 그 반응물을 전기영동을 실시한 결과를 나타낸다. (C)와 (D)는 본 발명의 프라이머 세트를 이용한 s(-) RT-LAMP 반응을 나타내며 (C)는 반응이 끝난 튜브의 반응액의 색상 변화, (D)는 그 전기영동을 실시한 결과를 나타낸다. (E)는 RT-PCR을 실시한 결과이고, (F)는 RRT-PCR을 실시한 결과를 나타낸다.
도 10은 본 발명의 프라이머 세트를 이용한 RT-LAMP법의 구제역 바이러스 SAT2 혈청형 검출 민감도 증대 효과를 확인한 결과를 나타낸 도이다. (A)와 (B)는 본 발명의 프라이머 세트를 이용한 s(+) RT-LAMP 반응을 나타내며 (A)는 반응이 끝난 튜브의 반응액의 색상 변화, (B)는 그 반응물을 전기영동을 실시한 결과를 나타낸다. (C)와 (D)는 본 발명의 프라이머 세트를 이용한 s(-) RT-LAMP 반응을 나타내며 (C)는 반응이 끝난 튜브의 반응액의 색상 변화, (D)는 그 전기영동을 실시한 결과를 나타낸다. (E)는 RT-PCR을 실시한 결과이고, (F)는 RRT-PCR을 실시한 결과를 나타낸다.
도 11은 본 발명의 프라이머 세트를 이용한 RT-LAMP법의 구제역 바이러스 SAT3 혈청형 검출 민감도 증대 효과를 확인한 결과를 나타낸 도이다. (A)와 (B)는 본 발명의 프라이머 세트를 이용한 s(+) RT-LAMP 반응을 나타내며 (A)는 반응이 끝난 튜브의 반응액의 색상 변화, (B)는 그 반응물을 전기영동을 실시한 결과를 나타낸다. (C)와 (D)는 본 발명의 프라이머 세트를 이용한 s(-) RT-LAMP 반응을 나타내며 (C)는 반응이 끝난 튜브의 반응액의 색상 변화, (D)는 그 전기영동을 실시한 결과를 나타낸다. (E)는 RT-PCR을 실시한 결과이고, (F)는 RRT-PCR을 실시한 결과를 나타낸다.
본 발명은 서열번호 1 및 2로 이루어진 제 1 프라이머 세트, 서열번호 3 및 4로 이루어진 제 2 프라이머 세트 및 서열번호 5 및 6으로 이루어진 제 3 프라이머 세트를 포함하는, 구제역 바이러스(Foot and mouth disease virus, FMDV) 진단용 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명에서 용어 "진단"은 시료(試料) 또는 실험 샘플 내에 화학종이나 미생물 따위의 존재 유무를 알아내는 것을 의미하며, 본 발명에서의 진단 또는 검출은 바람직하게 구제역 바이러스의 존재 유무를 알아내는 것을 의미한다.
본 발명에서 용어 "프라이머"는 증폭하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 중합효소 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다.
또한 상기의 프라이머는 기본 성질을 변화시키지 않은 추가의 특징을 혼입할 수 있다. 즉 핵산 서열이 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형될 수 있다. 이러한 변형의 예로는 메틸화, 캡화, 뉴클레오타이드의 하나 이상의 동족체로의 치환 및 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트 또는 카바메이트 등의 하전되지 않은 연결체나 포스포로티오에이트 또는 포스포로디티오에이트 등의 하전된 연결체로의 뉴클레오타이드의 변형이 가능하다. 또한 핵산은 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그날 펩타이드, 폴리 L 리신 등의 단백질, 아크리딘 또는 프소랄렌 등의 삽입제, 금속, 방사성 금속, 철 산화성 금속 등의 킬레이트화제 및 알킬화제 등의 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기를 가질 수 있다. 또한 본 발명의 프라이머는 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트phosphorothioate) 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)을 포함할 수 있거나, 삽입 물질(intercalating agent)을 포함할 수 있다.
또한 본 발명의 프라이머 서열은 검출 가능한 시그날을 직접적 또는 간접적으로 제공할 수 있는 표지를 이용하여 변형시킬 수 있다. 상기 프라이머는 분광학, 광화학, 생화학, 면역화학 또는 화학적 수단을 이용하여 검출 될 수 있는 표지를 포함할 수 있다. 유용한 표지는 32P, 형광 염료, 전자 밀집 시약, 효소(일반적으로 ELISA 에 이용되는 것), 바이오틴 또는 합텐 및 항혈청 또는 단일클론성 항체가 이용가능한 단백질을 포함한다.
또한 본 발명의 프라이머는 적절한 서열의 클로닝 및 제한효소 분해 및 나랭(Narang)등의 포스포트리에스테르 방법(1979, Meth, Enzymol. 68:90-99), 보카지(Beaucage)등의 디에틸포스포라미다이트 방법(1981, Tetrahedron Lett. 22: 1859-1862), 및 미국 특허 제 4458066호의 고형물 지지 방법과 같은 직접적인 화학적 합성법을 포함하는 임의의 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다.
또한 본 발명의 상기 구제역 바이러스 진단용 프라이머 세트는 서열번호 7 및 8로 이루어진 제 4 프라이머 세트를 더 포함할 수 있다.
상기 제 4 프라이머 세트는 스웜(swarm) 프라이머로, 상기 스웜 프라이머를 첨가함으로써 증폭 속도를 증가시킬 수 있을 뿐만 아니라 반응물의 양 또한 증대시킬 수 있어 결과적으로 반응 효율을 높일 수 있다.
또한 상기 제 3 프라이머 세트의 서열번호 5로 표시되는 염기서열은 서열번호 9 및 10 으로 표시되는 염기서열로 구성될 수 있으며, 서열번호 6으로 표시되는 염기서열은 서열번호 11 및 12 로 표시되는 염기서열로 구성될 수 있다.
본 발명의 프라이머 세트에 포함되는 상기 서열번호 1 내지 12 에 기재된 염기서열은 이에 제한되지 않으며, 상기 염기서열의 상동체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 프라이머 세트는 서열번호 1 내지 12 의 염기서열과 각각 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다. 또한 상기 서열번호 1 내지 12 에 기재된 염기서열 중 “Y”는 T(thymine, 티민) 또는 C(cytosine, 사이토신) 일 수 있으며, “R”은 A(adenine, 아데닌) 또는 G(guanine, 구아닌)일 수 있다.
본 발명의 용어 "구제역 바이러스(foot and mouth disease virus, FMDV)"는 피코나바이러스과(Picornaviridae) 아프토바이러스(Aphthovirus)속에 속하는 RNA 바이러스로서, 면역학적 및 유전적으로 구별되는 7가지 혈청형으로 구분할 수 있다. 상기 구제역 바이러스 혈청형은 VP1 유전자의 염기서열 차이에 의해 구분된다. 또한 구제역 바이러스는 발굽이 둘로 갈라진 우제류 동물에서 발열, 침 흘림, 수포, 가피, 궤양을 보이고 식욕이 저하되는 전파력이 매우 강한 전염병이다.
본 발명에서 상기 구제역 바이러스는 O, A, Asia 1, C, SAT1, SAT2 및 SAT3으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 혈청형(serotype)을 가진 바이러스일 수 있다. 또한 본 발명의 구제역 바이러스 진단용 프라이머 세트는 구제역 바이러스 O, A, Asia 1, C, SAT1, SAT2 및 SAT3 혈청형 동시진단용 프라이머 세트일 수 있다.
또한 본 발명의 구제역 바이러스 진단용 프라이머 세트는 LAMP(Loop Mediated Isothermal Amplification) 또는 RT-LAMP(Reverse Rranscription-Loop Mediated Isothermal Amplification)용 프라이머 세트일 수 있으며, 바람직하게는 RT-LAMP용 프라이머 세트일 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 또한 본 발명의 구제역 바이러스 진단용 프라이머 세트를 LAMP법에 이용 시 RNA를 대상으로 전사반응을 선 수행하여 만들어진 cDNA을 이용하여 2차적으로 LAMP법을 수행할 수 있다.
본 발명에서 상기 "RT-LAMP(Reverse Transcription-Loop Mediated Isothermal Amplification)"는 박테리아 또는 바이러스로 야기된 질병을 진단하고, PCR법의 단점을 보완한 진단법으로서, PCR법과는 달리 일정한 온도(등온)에서 어닐링(annealing) 및 신장(extension)이 가능하여 온도조절장치가 필요하지 않아 일정한 온도조건에서 유전자를 증폭할 수 있다. 또한 신속성, 특이성 및 검출 감도가 높아 1시간 이내에 109 copy의 유전자를 증폭시킬 수 있는 방법이다. 또한, LAMP 또는 RT-LAMP 기법은 기존의 PCR 기반 진단법에서 사용되는 Taq DNA 중합효소(polymerase)와 달리 목표유전자를 염기가닥 치환(strand displacement) 방식에 의해 대량 증폭할 수 있는 Bst DNA 중합효소(polymerase)를 이용함으로써 유전자 증폭효율이 월등하게 높다. 또한 기존의 PCR 기반 진단법과는 달리 온도변화가 없는 등온조건에서 유전자 증폭이 이루어지기 때문에 검사시간이 단축될 뿐만 아니라 항온수조와 같은 저가의 장비로도 반응이 가능하다. 따라서 전문 진단실은 물론 고가의 장비와 시약 및 전문인력이 확보되지 않은 소규모의 진단실이나 현장 진단용 등으로 이용이 가능한 방법이다.
또한 본 발명의 구제역 바이러스 진단용 프라이머 세트는 구제역 바이러스의 3D 유전자를 표적으로 하는 프라이머 세트일 수 있다.
본 발명에서 구제역 바이러스의 3D 유전자는 구제역 바이러스의 RNA 중합효소를 구성하는 유전자를 의미한다. 상기 3D 유전자는 구제역 바이러스를 구성하는 유전자 중에서 가장 변이가 적은 안정적인 유전자로서 구제역바이러스의 다양한 혈청형에 관계없이 높은 안정성을 가지는 유전자이다. 따라서 본 발명에서는 다양한 혈청형의 구제역바이러스를 공통적으로 진단할 수 있는 유전자 진단법을 개발하기 위하여 상기 구제역바이러스 진단용 프라이머 세트를 3D 유전자의 염기서열 부위를 이용하여 제조하였다.
또한 본 발명의 구제역 바이러스 진단용 프라이머 세트의 검출한계는 100 내지 104 TCID50/mL 일 수 있으며, 바람직하게는 100 내지 101 TCID50/mL 일 수 있다. 따라서 본 발명의 구제역 바이러스 진단용 프라이머 세트를 이용하면 낮은 농도의 샘플에서도 구제역 바이러스를 정확하게 진단할 수 있다.
본 발명의 구제역 바이러스 검출용 프라이머 세트를 이용하면, 민감도가 높아 낮은 농도의 시료만으로도 7가지 구제역바이러스의 혈청형을 검출할 수 있고, 다른 병원체를 제외하고 오직 구제역바이러스만을 특이적으로 검출할 수 있다.
또한 본 발명은 상기 구제역 바이러스 진단용 프라이머 세트를 포함하는 구제역바이러스 진단용 조성물을 제공한다.
상기 조성물은 반응 증폭 혼합물, 예컨대 중합효소, dNTPs, 반응 버퍼 등이 포함된 혼합물을 더 포함할 수 있고, 진단 여부를 육안으로 확인할 수 있는 형광 염색물질을 포함할 수 있으며, 이에 제한되지는 않는다.
또한 본 발명은 상기 구제역 바이러스 진단용 조성물을 포함하는 구제역 바이러스 진단용 키트를 제공한다.
상기 키트는 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함할 수 있으며, 이에 제한되지는 않는다. 또한, 상기 키트는 병, 통 (tub), 작은 봉지 (sachet), 봉투 (envelope), 튜브, 앰플 (ampoule) 등과 같은 형태를 취할 수 있으며, 이들은 부분적으로 또는 전체적으로 플라스틱, 유리, 종이, 호일, 왁스 등으로부터 형성될 수 있다. 용기는, 처음에는 용기의 일부이거나 또는 기계적, 접착성, 또는 기타 수단에 의해 용기에 부착될 수 있는, 완전히 또는 부분적으로 분리가 가능한 마개를 장착할 수 있다. 용기는 또한 주사바늘에 의해 내용물에 접근할 수 있는, 스토퍼가 장착될 수 있다. 상기 키트는 외부 패키지를 포함할 수 있으며, 외부 패키지는 구성 요소들의 사용에 관한 사용설명서를 포함할 수 있다. 또한 상기 사용설명서는 키트 사용법, 예를 들면, LAMP 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서에 해당할 수 있다. 또한 사용설명서는 팸플릿 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상의 설명을 포함할 수 있으며, 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보에 해당할 수 있다.
또한 본 발명은 a) 시료로부터 핵산을 얻는 단계; b) 본 발명의 구제역 바이러스 진단용 프라이머 세트를 이용하여 상기 a)단계에서 얻어진 핵산을 증폭하는 단계; 및 c) 상기 b)단계에서 얻어진 증폭 산물을 검출하는 단계;를 포함하는, 구제역 바이러스 진단 방법을 제공한다.
상기 구제역 바이러스는 O, A, Asia 1, C, SAT1, SAT2 및 SAT3으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 혈청형(serotype)을 가진 바이러스일 수 있다.
또한 상기 b)단계의 증폭은 LAMP법 또는 RT-LAMP법을 이용하여 이루어질 수 있으며, 바람직하게는 RT-LAMP법을 이용하여 이루어질 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 또한 상기 b)단계의 증폭은 45 내지 75℃, 바람직하게는 50 내지 70℃, 더욱 바람직하게는 53 내지 68℃에서 이루어질 수 있다. b)단계의 증폭이 45 내지 75℃, 바람직하게는 50 내지 70℃, 더욱 바람직하게는 53 내지 68℃에서 이루어짐에 따라 급격한 온도 변화 없이 안정적이며 효율적으로 증폭 반응을 시킬 수 있으며, 가열시키는 데에 요구되는 에너지를 절약시킬 수 있고 온도 변화에 필요한 시간 또한 단축시킬 수 있다.
또한 상기 b)단계의 증폭은 30 내지 60분, 바람직하게는 30 내지 50분, 더욱 바람직하게는 40 내지 50분 동안 이루어질 수 있다. b)단계의 증폭이 30 내지 60분, 바람직하게는 30 내지 50분, 더욱 바람직하게는 40 내지 50분 동안 이루어짐에 따라 신속한 검출이 가능하게 되며 짧은 반응 시간임에도 낮은 농도의 샘플까지 정확하게 검출할 수 있다. 따라서 본 발명의 구제역 바이러스 진단 방법을 이용하면 신속하며 더욱 효율적인 진단이 가능하다.
또한 상기 c)단계의 검출은 겔 전기영동, 모세관 전기영동, DNA 칩, 반응산물의 탁도 측정, 방사성 측정, 형광 측정, 인광 측정 및 발색 지시제 측정으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 방법을 이용할 수 있으며, 바람직하게는 겔 전기영동, 반응산물의 탁도 측정, 형광 측정 또는 발색 지시제 측정, 더욱 바람직하게는 겔 전기영동 또는 발색 지시제 측정을 이용할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.
상기 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 젤 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한 상기 반응산물의 탁도 측정법은, LAMP 반응 양성반응 시에 생성되는 피로인산 마그네슘(magnesium pyrophosphate) 침전물에 의해 반응산물의 탁도가 증가하는 현상을 이용한 측정방법으로 육안 관찰 또는 탁도계를 이용하여 실시간으로 탁도를 측정할 수 있는 방법을 의미할 수 있다. 또한, 상기 형광 측정에는 당해 분야에서 일반적으로 사용되는 형광 염색 물질을 적용할 수 있으며, 바람직하게는, SYBR 그린I과 Quant-iT PicoGreen, GeneFinder, Ethdium bromide를 사용할 수 있고, 더욱 바람직하게는 SYBR 그린I을 사용할 수 있다. 상기 형광 염색 물질은 이중가닥에 선택적으로 결합하는 특성을 이용하여 추가적 실험을 필요로 하지 않고도 결과의 여부를 판독할 수 있도록 첨가한 물질일 수 있으며 특히, 상기 SYBR 그린I은 RT-LAMP 생성물에 삽입되어 자연광에서 혹은 자외선 조사 시 녹색의 형광을 발현하는 물질을 의미한다. 예컨대 구제역 바이러스 핵산을 본 발명의 구제역 바이러스 진단용 프라이머 세트를 이용하여 RT-LAMP법으로 증폭시키고, 증폭된 RT-LAMP 생성물에 상기 SYBR 그린I을 첨가하면 녹색 형광을 나타내게 된다. 따라서 상기 형광 측정 방법을 이용하면 전기영동 등 별도의 추가적인 실험을 거치지 않고도, RT-LAMP 증폭실험 후 SYBR 그린I을 통해 나타나는 녹색형광을 인지함에 따라 구제역 바이러스에 감염된 것을 파악할 수 있다. 즉, 녹색형광을 나타내지 않으면 비감염을 의미하므로 시료가 구제역 바이러스에 감염되었는지의 여부를 고감도이면서 신속하게 육안으로 확인할 수 있다.
또한, 상기 발색 지시제(colorimetric indicator) 측정 방법에서 발색 지시제로는 칼세인(calcein) 또는 하이드록시나프톨블루(hydroxy naphthol blue, HNB), 바람직하게는 HNB를 사용할 수 있다. 상기 발색지시제를 첨가할 경우 LAMP 증폭 과정 중에 생성된 반응산물(pyrophosphate, Mg2+)에 의해 반응액의 색깔이 오렌지색 또는 청색으로 변화되는 특성을 이용하여 검출할 수 있는 바, 추가적 실험을 거치지 않고도 검출 여부를 신속하게 판독할 수 있다. 또한 상기 HNB는 증폭 이전의 반응액에 미리 첨가하여 반응을 진행할 수 있다. HNB를 증폭 이전의 반응액에 혼합하면, 반응튜브를 개봉하지 않고도 반응 결과의 확인이 가능하기 때문에, 반응 후에 염색액을 첨가해주어야 하는 방법에 비해 교차오염을 방지할 수 있는 장점이 있다.
본 발명의 구제역 바이러스 검출용 프라이머 세트를 이용한 구제역 바이러스 진단 방법을 이용하면, 민감도가 높아 낮은 농도의 시료만으로도 7가지 구제역바이러스의 혈청형을 검출할 수 있고, 다른 병원체를 제외하고 오직 구제역바이러스만을 특이적으로 검출할 수 있다. 또한 증폭에 LAMP법 또는 RT-LAMP법을 이용할 경우 기존의 PCR 기반 진단법과는 달리 온도 변화가 없는 등온조건에서 유전자 증폭이 이루어지기 때문에 검사시간을 효과적으로 단축시킬 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의거하여 보다 구체적으로 설명한다. 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 구제역 바이러스의 핵산 추출
구제역 바이러스(foot and mouth disease virus; FMDV)의 7가지 혈청형(O, A, Asia1, C, SAT1, SAT2, SAT3) 특이적 프라이머를 제작하기 위해 우선 구제역 바이러스의 핵산을 추출하였다.
구체적으로, 실험에 사용한 구제역 바이러스의 7가지 혈청형 중 O 혈청형은 국내분리주 2주 O/Andong/KOR/2010, O/Boeun/KOR/2017 및 백신주 1주 O/Manisa/Turkey/69, A 혈청형은 국내분리주 2주 A/Pocheon/SKR/2010, A/Yeoncheon/2017 및 베트남분리주 1주 A/VN15/2014, Asia 1 혈청형은 백신주 1주 As1/Shamir/89, C 혈청형은 외국분리주 1주 C3/Resende/BRA/55, SAT1 혈청형은 SAT1/BOT/1/68, SAT2 혈청형은 SAT2/ZIM/5/8, SAT3 혈청형은 SAT3/ZIM/4/81 분리주를 이용하였으며 상기와 같이 총 7종의 혈청형에 대하여 11개 분리주를 이용하여 핵산을 추출하였다. 상기 공시 바이러스를 이용한 모든 실험은 농림축산검역본부에서 수행하였다.
또한 본 발명의 구제역 바이러스 7가지 혈청형 특이적 프라이머 세트의 특이도 검증을 위하여 구제역 바이러스 이외에 농림축산검역본부에서 보관하고 있는 돼지수포성질병을 일으키는 바이러스(Seneca A virus)와 배양세포(BHK21, PK-15, Vero cell)로부터 동일하게 핵산을 추출하여 사용하였다. 추출한 핵산은 -80℃에 보관한 후 실험에 이용하였으며 사용한 병원체, 이의 분리주 및 이의 제공처를 표 1에 나타내었다.
| No. | 혈청형 (Serotype) |
지역형 /유전형 (Topotype/lineage) |
분리주명 (Isolate name) |
수탁번호 (GenBank Accession No.) |
적정 농도 (Viral titer (TCID50/mL)) |
비고 (Notice) |
| 1 | O | SEA/Mya-98 | O/Andong/KOR/2010 | KC503937 | 8.4 x 106 | Korean isolate |
| 2 | O | ME-SA/Ind2001 | O/Boeun/KOR/2017 | Unregistered | 1.4 x 107 | Korean isolate |
| 3 | O | ME-SA | O/Manisa/Turkey/69 | AY593823 | 1.1 x 106 | Vaccine strain |
| 4 | A | Asia/Sea-97 | A/Pocheon/SKR/2010 | KC588943 | 4.7 x 106 | Korean isolate |
| 5 | A | Asia/Sea-97 | A/Yeoncheon/KOR/2017 | Unregistered | 1.5 x 106 | Korean isolate |
| 6 | A | Asia/Sea-97 | A/VN15/2014 | Unregistered | 2.7 x 106 | Foreign isolate |
| 7 | Asia 1 | Asia | As1/Shamir/89 | JF739177 | 1.1 x 107 | Vaccine strain |
| 8 | C | EURO-SA | C3/Resende/BRA/55 | AY593807 | 4.7 x 107 | Foreign isolate |
| 9 | SAT 1 | Ⅲ-WZ | SAT1/BOT/1/68 | AY593845 | 2.0 x 107 | Foreign isolate |
| 10 | SAT 2 | Ⅱ-WZ | SAT2/ZIM/5/81 | KF112972 | 6.3 x 106 | Foreign isolate |
| 11 | SAT 3 | I-SEZ | SAT3/ZIM/4/81 | KY825732 | 2.7 x 107 | Foreign isolate |
| 12 | Seneca A virus | ATCC (PTA-5343) | DQ641257 | 1.5 x 105 | Foreign isolate | |
실시예 2. 구제역 바이러스 7가지 혈청형 특이적 프라이머 설계
등온증폭 유전자 진단법((Reverse Transcription-Loop Mediated Isothermal Amplification; RT-LAMP)법에 이용할 수 있고 구제역 바이러스의 7가지 혈청형에 대해 특이적으로 검출할 수 있는 프라이머 세트를 다음과 같이 설계하였다.
구체적으로, 2000년 이후에 NCBI(National Center for Biotechnology Information)의 GenBank database에 등록된 구제역 바이러스의 3D 중합효소(polymerase) 유전자 염기서열 정보 중에서 혈청형 별로 지역형 및 유전형이 고루 포함되도록 하여 총 109개(O 혈청형 57, A 혈청형 21, Asia 1 혈청형 14, C 혈청형 2, SAT1 혈청형 5, SAT2 혈청형 7 및 SAT3 혈청형 3)의 유전자 염기서열 정보를 확보하였다. 상기 확보한 구제역 바이러스 7가지 혈청형 유전자 염기서열을 DNASTARⓡLasergene (DNASTAR, Inc, USA) 프로그램으로 비교 분석하여 가장 안정적인 부위를 선발하였다.
그 후 LAMP용 프라이머 설계 프로그램인 Primer-Explorer V3 software (http://primerexplorer.jp/e/index.html; Eiken Chemical Co. Ltd, Japan)를 이용하여 2종의 내부 프라이머(forward inner prime(FIP) 및 backward inner primer(BIP)), 2종의 외부 프라이머(F3 및 B3) 및 2종의 루프 프라이머(forward loop primer(LF) 및 backward loop primer (LB))를 설계하였다. 또한 LAMP반응의 효율을 높이기 위해 2종의 스웜 프라이머(forward swarm primer(F1S) 및 backward swarm primer(B1S))를 설계하였다.
상기 설계한 프라이머 세트는 프라이머 제조업체(Bioneer Co, Korea)에 의뢰하여 합성하였으며, 설계한 프라이머 세트의 부위 및 구체적인 서열을 도 1 및 표 2에 나타내었다.
| 프라이머 특징 | 프라이머 명 | 염기서열 (5’-3’) | 서열번호 |
| 외부 프라이머 (제1프라이머세트) |
FMDV-F3 | CATYACTCCAGCTGACAA | 1 |
| FMDV-B3 | CCAACGCAGGTAAAGTGA | 2 | |
| 루프(loop) 프라이머 (제2프라이머세트) |
FMDV-LF | RGTCTTCGAAGCCATCACA | 3 |
| FMDV-LB | GAYCTCCGTGGCAGGRCT | 4 | |
| 내부 프라이머 (제3프라이머세트) |
FMDV-FIP (F1c+F2) |
GCAAAGGAGAGGATAGCYTCRCATGGAYTATGGAACTGGGT | 5 |
| FMDV-BIP (B1c+B2) |
CGTGGGACCATACAGGAGAAGGTACTCGTCAGGTCCRGA | 6 | |
| 스웜(swarm) 프라이머 (제4프라이머세트) |
FMDV-F1S | CGTGCAAAGGAGAGGATAGC | 7 |
| FMDV-B1S | CGTGGGACCATACAGGAG | 8 | |
| 내부 프라이머 구성 | FMDV-F1c | GCAAAGGAGAGGATAGCYTCR | 9 |
| FMDV-F2 | CATGGAYTATGGAACTGGGT | 10 | |
| FMDV-B1c | CGTGGGACCATACAGGAGAAG | 11 | |
| FMDV-B2 | GTACTCGTCAGGTCCRGA | 12 |
실시예 3. 본 발명의 구제역 바이러스 7가지 혈청형 특이적 프라이머 세트를 이용한 RT-LAMP법 최적 반응조건 확립
상기 실시예 2에서 제작한 본 발명의 프라이머 세트를 이용한 RT-LAMP법의 최적 반응조건을 다음과 같이 확립하였다.
3-1. 반응액 제조
구체적으로, RT-LAMP법을 위한 반응액으로 1μL의 Bst DNA polymerase(8U/μL, NEW England Biolabs, USA), 0.2μL의 AMV reverse transcriptase(10U/μL, Promega, Durham, NC, USA), 0.8M 베타인(betaine) (Sigma-Aldrich, USA), 20 mM Tris-HCl(pH 8.8), 10 mM KCl, 4 mM MgSO4, 10 mM (NH4)2SO4, 0.1 % Triton X-100, 1.6 mM dNTPs 및 3 mM hydroxy naphthol blue(HNB: Lemongreen, Shanghai, China)를 사용하였다.
또한 서열번호 1 내지 6으로 표시되는 각각의 프라이머 2μL(각 2.5 pmol/μL의 외부 프라이머 F3 및 B3(서열번호 1 및 2), 각 10 pmol/μL의 루프 프라이머 LF 및 LB(서열번호 3 및 4), 각 20 pmol/μL의 내부 프라이머 FIP 및 BIP(서열번호 5 및 6)) 및 서열번호 7 및 8로 표시되는 각각의 프라이머 1.5 μL(각 50 pmol/μL의 스웜 프라이머 F1S 및 B1S(서열번호 7 및 8))를 첨가 혹은 비첨가하여 반응액을 제조하였다. 상기 제조한 반응액에 상기 실시예 1에서 추출한 핵산 중 5μL의 RNA 시료를 첨가한 다음, 멸균증류수로 최종 용량을 25μL로 조정하였다.
3-2. RT-LAMP법의 온도 조건 확립
또한 구제역 바이러스 7가지 혈청형 검출에 적합한 최적 RT-LAMP법 조건을 확립하기 위하여 우선 공시 바이러스(O/Andong/KOR/2010) 배양액으로부터 추출한 RNA을 이용하여 반응온도(53 내지 68℃)를 달리하여 RT-LAMP법을 실시하였다. 그 후, 80℃에서 5분간 처리하여 반응액 내의 효소 활성을 제거하였으며, 반응이 끝난 튜브의 반응액을 육안으로 관찰하여 색깔 변화를 관찰함으로써 양성 여부를 판독하였다. 또한 2.0% 아가로스 젤에 전기영동을 실시한 다음, 자외선판독기(Bio-Rad, USA)를 이용하여 LAMP 반응에서 특이적으로 나타나는 사다리 모양의 유전자 증폭 밴드 형성 여부를 확인하였으며 이에 대한 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2는 53 내지 68℃의 반응 온도 조건에서 양성 반응을 확인한 결과로서, (A)는 RT-LAMP 반응이 끝난 튜브의 반응액의 색상 변화를 나타내고, (B)는 전기영동을 실시한 결과를 나타낸 것이다. 또한 도 2의 레인 1 내지 6은 각 53, 56, 59, 62, 65 및 68℃ 에서의 결과를 나타내며 NC는 음성컨트롤을 나타낸다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 반응온도가 53 내지 68℃일 때 양성반응이 나타남을 확인하였다. 구체적으로 도 2A에서와 같이 육안으로 레인 3 내지 5에 해당하는 59, 62 및 65℃에서 가장 뚜렷하게 양성반응의 색상 변화를 확인하였으며, 도 2B의 전기영동 결과에서도 레인 3 내지 5에 해당하는 59, 62 및 65℃에서 가장 뚜렷하게 LAMP 특유의 양성밴드를 확인하였다.
3-3. RT-LAMP법의 시간 조건 확립 및 스웜 프라이머의 검출 민감도 증대 효과 확인
또한 구제역 바이러스 7가지 혈청형 검출에 적합한 최적 RT-LAMP법 조건을 확립하기 위하여 상기 3-2의 실험 조건에서 반응시간(10 내지 50분)을 달리하여 RT-LAMP법을 실시하였으며 이에 대한 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3은 10, 20, 30, 40 및 50분 조건의 반응시간으로 양성 반응의 유무를 확인한 결과로서, 레인 1 내지 3은 각각 103, 102 및 101 TCID50/mL 희석 계수에 대한 결과이고, NC는 음성컨트롤을 나타낸다. 또한 도 3A는 스웜 프라이머를 첨가한 s(+) RT-LAMP법의 결과이며, 도 3B는 스웜 프라이머를 첨가하지 않은 s(-)RT-LAMP법의 결과를 나타낸 것이다.
도 3에 나타낸 바와 같이, s(+) RT-LAMP(도 3A)와 s(-)RT-LAMP(도 3B) 결과를 비교하였을 때 스웜 프라이머를 첨가한 경우에 그렇지 않은 경우보다 검출 반응이 빨리 진행됨을 확인하였다. 또한 s(+) RT-LAMP의 경우 40분부터 10 TCID50/mL의 샘플에서 양성반응이 뚜렷하게 나타남을 확인하였다. 따라서 스웜 프라이머를 첨가하였을 때 구제역 바이러스 7가지 혈청형 특이적 프라이머를 이용한 RT-LAMP법을 통한 검출이 더욱 효과적으로 가능함을 확인하였고 최소 40분의 반응시간에 걸쳐 검출 반응이 이루어짐을 확인하였다.
따라서, 상기 3-2 및 3-3의 결과에 따라 이후의 모든 실험은 62℃의 반응온도와 40분의 반응시간으로 반응조건을 고정하여 실시하였다.
실시예 4. 본 발명의 프라이머 세트를 이용한 RT-LAMP법에서의 구제역 바이러스 7가지 혈청형 검출 특이도 분석
본 발명의 서열번호 1 내지 8로 이루어진 프라이머 세트를 이용한 RT-LAMP법 진단 시 구제역 바이러스의 7가지 혈청형을 특이적으로 검출할 수 있는지 확인하기 위하여, 실시예 1에서 추출한 구제역 바이러스의 7가지 혈청형(O, A, Asia 1, C, SAT1, SAT2, SAT3), 돼지 유래 병원체 및 배양세포 4종의 핵산을 대상으로 구제역 바이러스 7가지 혈청형 검출에 대한 특이도를 분석하였다.
구체적으로, 상기 실시예1에서 추출하고 표 1에 기재한 구제역 바이러스의 7가지 혈청형(O, A, Asia 1, C, SAT1, SAT2, SAT3), 돼지 유래 병원체 및 배양세포 4종의 핵산에 대하여, 상기 실시예 3에서 확립한 62℃ 및 40분 반응 조건으로 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 RT-LAMP을 수행하였으며, 그 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4에서 도 4A는 튜브 내 반응을 육안으로 확인한 결과이며, 도 4B는 전기영동 결과를 나타낸다. 또한 레인 1 내지 3은 구제역 바이러스 7가지 혈청형 중 O 혈청형이며 각각 O/Andong/KOR/2010, O/Boeun/KOR/2017 및 O/Manisa/Turkey/69, 레인 4 내지 6은 A 혈청형이며 각각 A/Pocheon/SKR/2010, A/Yeoncheon/KOR/2017 및 A/VN15/2014, 레인 7은 Asia1 혈청형이며 As1/Shamir/89, 레인 8은 C 혈청형이며 C3/Resende/BRA/55, 레인 9는 SAT1 혈청형이며 SAT1/BOT/1/68, 레인 10은 SAT2 혈청형이며 SAT2/ZIM/5/81, 레인 11은 SAT3 혈청형이며 SAT3/ZIM/4/81, 레인 12는 Seneca A virus, 레인 13 내지 15는 배양세포 BHK21, PK-15 및 Vero cell의 결과이며 NC는 음성컨트롤을 나타낸다.
도 4에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 RT-LAMP법을 실시하였을 때 레인 1 내지 11에서만 모두 양성반응이 나타남을 확인하였다. 따라서 이를 통해 본 발명의 프라이머 세트를 이용하면 구제역 바이러스만을 특이적으로 검출할 수 있고, 본 발명의 프라이머 세트는 구제역 바이러스 7가지 혈청형 모두에 대해 특이도를 갖는 것을 확인하였다.
실시예 5. 본 발명의 프라이머 세트를 이용한 RT-LAMP법의 구제역 바이러스 검출 민감도 증대 효과 확인
본 발명의 프라이머 세트를 이용한 RT-LAMP법을 실시하였을 때, 기존의 검출 키트에서 사용하고 있는 다른 종류의 프라이머를 이용한 진단법에 비해 구제역 바이러스 검출 민감도가 증대되는지 확인하기 위해 RT-PCR법 및 RRT-PCR법을 실시하여 본 발명의 RT-LAMP법과 비교하였다.
5-1. RT-PCR 수행 조건 및 방법
RT-PCR은 Reid 등(J Virol Methods 89: 167-176)의 내용을 참고하여, 모든 아형의 5’UTR 유전자 부위를 특이적으로 증폭할 수 있는 Foot and Mouth virus (FMDV-type U) Detection Kit (iNtRON Biotechnology, Korea)를 이용하여 수행하였다.
구체적으로, 공시 재료로부터 추출한 RNA 5 μL를 RT-PCR premix에 첨가한 다음 PCR 증폭기(Biometra, Germany)를 이용하여 45 ℃에서 30분간 역전사반응을 거친 다음, 94 ℃에서 5분간 처리하였고, 35 회전의 PCR 과정(denaturation 94 ℃, 30초; annealing 55 ℃, 30초; extension 72 ℃, 45초)를 수행하였고, 72 ℃에서 5분간 최종 반응하였다.
그 후 PCR 증폭산물은 NEO green 염색액(NEO science, Korea)을 첨가한 1.5 % agarose gel에 전기 영동한 다음, 자외선판독기(Bio-Rad, USA)로 326 bp(O/SKR/JC/2014 국내분리주 대비)의 특이 밴드를 관찰하여 판독하였다.
5-2. RRT-PCR 수행 조건 및 방법
RRT-PCR은 농림축산검역본부에서 구제역 바이러스 혈청형 공통진단용 표준진단법으로 사용하고 있는 Callahan 등(2002)의 방법을 준용하여 구제역바이러스의 3D 중합효소 유전자(polymerase gene)를 검출할 수 있는 AccuPower® FMDV Real-Time RT-PCR MasterMix Kit (Bioneer, Korea)와 CFX96 Touch™ Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad, USA)을 사용하여 실시하였다.
구체적으로는, 16.2 μL의 FMDV Master mixture 용액에 Internal positive control(IPC) 0.3μL을 첨가한 후 RNA 주형 3.5 μL를 첨가하여 최종 용량을 20 μL로 조정하였다. RRT-PCR 반응은 45 ℃에서 15분간 역전사반응을 거친 다음, 95 ℃에서 5분간 처리하였고, 45 회전의 PCR 과정(denaturation 95 ℃ 5초, annealing 55 ℃ 5초)을 거친 다음, 형광신호가 배경 값(background)이상으로 검출되는 경우 양성으로 판정하여 해당 threshold cycle(Ct) value를 확인하였고, 형광신호가 배경 값 이상으로 검출되지 않는 경우에는 음성으로 판정하였다.
5-3. 각 진단법의 구제역 바이러스 검출 민감도 측정
본 발명의 프라이머 세트를 이용한 RT-LAMP법과 기존에 알려진 RT-PCR법 및 RRT-PCR법 간의 민감도를 비교하기 위하여 우선, 공시 구제역 바이러스를 해당 바이러스 배양액으로부터 시판 RNA 추출키트(Inclone biotech, Korea)를 이용하여 7가지 혈청형 모두에 대한 RNA를 추출한 다음 희석하였다.
상기 각 희석액을 대상으로 본 발명의 프라이머 세트를 이용한 RT-LAMP는 상기 실시예 3의 반응조건으로, RT-PCR은 상기 5-1의 조건으로, RRT-PCR는 상기 5-2의 조건으로 각각 실시하여 검출한계를 비교하였으며, 구제역 바이러스 7가지 혈청형인 O, A, Asia 1, C, SAT1, SAT2 및 SAT3 에 대한 검출 결과를 각각 도 5 내지 도 11에 나타내었다. 도 5 내지 도 11에서 (A)와 (B)는 본 발명의 프라이머 세트를 이용한 s(+) RT-LAMP 반응을 나타내며 (A)는 반응이 끝난 튜브의 반응액의 색상 변화, (B)는 그 반응물을 전기영동을 실시한 결과를 나타낸 것이다. 반면, (C)와 (D)는 본 발명의 프라이머 세트를 이용한 s(-) RT-LAMP 반응을 나타내며 (C)는 반응이 끝난 튜브의 반응액의 색상 변화, (D)는 그 전기영동을 실시한 결과를 나타낸 것이다. (E)는 RT-PCR을 실시한 결과이고, (F)는 RRT-PCR을 실시한 결과이다. 또한 상기 (A) 내지 (E)에서 레인 1 내지 8은 구제역 바이러스의 RNA를 10배수 단계별로 희석한 106 내지 10-1 TCID50/mL을 나타내며, NC는 음성컨트롤을 나타낸다. 또한 본 발명의 프라이머 세트를 이용한 RT-LAMP법과 기존에 알려진 RT-PCR법 및 RRT-PCR법 간의 검출한계를 비교한 결과를 하기 표 3에 나타내었다.
| 구제역 바이러스 혈청형 | 검출한계 (TCID50/mL) | ||||||||
| O | A | Asia1 | C | SAT1 | SAT2 | SAT3 | |||
| 검출방법 | PCR | RT-PCR | 103 | 104 | 102 | 104 | 104 | 104 | 105 |
| RRT-PCR | 101 | 102 | 103 | 102 | 101 | 102 | 102 | ||
| LAMP | s(-)RT-LAMP | 102 | 103 | 103 | 103 | 103 | 104 | 103 | |
| s(+)RT-LAMP | 100 | 101 | 101 | 101 | 101 | 101 | 101 | ||
도 5 및 표 3에 나타낸 바와 같이, 추출한 구제역 바이러스 O 혈청형 유전자를 대상으로 본 발명의 프라이머 세트를 이용한 RT-LAMP와 기존의 RT-PCR 및 RRT-PCR을 실시한 결과, RT-LAMP의 검출한계는 s(+) RT-LAMP의 경우 각각 101 내지 100 TCID50/mL를 나타냈으며, s(-) RT-LAMP의 경우 104 내지 102 TCID50/mL를 나타냈다. 반면, 표준진단법인 RT-PCR의 검출한계는 105 내지 102 TCID50/mL를 나타냈으며. RRT-PCR의 검출한계는 103 내지 101 TCID50/mL를 나타내었다.
또한 본 발명의 프라이머 세트를 이용한 s(-)RT-LAMP의 민감도는 RT-PCR보다는 대체적으로 높았으나, RRT-PCR에 비해서는 대체적으로 낮은 경향을 나타냄을 확인하였다. 반면에 s(+)RT-LAMP의 민감도는 s(-)RT-LAMP과 RT-PCR에 비해서는 10배 내지 100배 향상되었으며, RRT-PCR에 비해서도 10배 내지 100배 민감도가 향상된 것을 확인하였다. 이러한 결과를 통해 본 실험에서 설계한 스웜 프라이머를 RT-LAMP법에 사용하였을 경우, RT-LAMP의 민감도를 크게 향상시킬 수 있음을 확인하였다.
한편, 도 6 내지 도 11에 나타낸 다른 혈청형 A, Asia 1, C, SAT1, SAT2 및 SAT3 에 대한 검출 결과에서도 도 5의 O 혈청형 결과에서와 동일한 경향이 나타남을 확인하였다. 이러한 결과는 본 발명의 프라이머 세트를 이용한 s(+) RT-LAMP법이 기존의 RT-PCR법이나 RRT-PCR법을 대체할 수 있는 획기적인 구제역 바이러스 7가지 혈청형 진단법으로 활용할 수 있음을 나타낸다.
상기 실시예에서 확인한 바와 같이, 본 발명의 구제역 바이러스 7가지 혈청형 특이적 프라이머 세트는, 돼지 유래 병원체 및 배양세포 3종과 같은 다른 유전자는 검출하지 않으면서 구제역바이러스의 7가지 혈청형(O, A, Asia1, C, SAT1, SAT2, SAT3)만을 정확하게 검출하여 특이도가 높음을 확인하였다. 또한 본 발명의 프라이머 세트를 이용한 RT-LAMP법은, 기존의 RT-PCR 및 RRT-PCR법과 비교하여서도 민감도가 더욱 높은 방법임을 확인하였다.
실시예 6. 본 발명의 프라이머 세트를 이용한 RT-LAMP법의 국내외 구제역 바이러스 검출 효용성 확인
본 발명의 프라이머 세트를 이용한 RT-LAMP법을 실시하였을 때 국내뿐만 아니라 국외의 구제역 바이러스도 특이적으로 검출할 수 있는지 확인하기 위해, 농림축산검역본부에서 보유하고 있는 국내외 표준 구제역 바이러스 배양액 35점에서 추출한 핵산을 대상으로 실험하였으며 이에 대한 결과는 표 4에 나타내었다.
| 구제역 바이러스 혈청형 | 실험결과 (양성반응 수/전체 n수) |
| RT-LAMP | |
| O | 21/21 |
| A | 10/10 |
| Asia 1 | 3/3 |
| C | 1/1 |
| 종합 | 35/35 |
실험 결과 상기 표 4에서와 같이, 본 발명의 프라이머 세트를 이용한 RT-LAMP법을 실시하였을 때 국내외 35점의 구제역 바이러스 시료를 모두 검출할 수 있음을 확인하였다. 따라서 본 발명의 프라이머 세트를 이용한 RT-LAMP 진단법은 국내의 구제역 바이러스 뿐만 아니라 국외에서 분리된 구제역 바이러스의 진단에도 유용하게 활용할 수 있음을 확인하였다.
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<223> FMDV-B3
<400> 2
ccaacgcagg taaagtga 18
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<220>
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<223> FMDV-LB
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<220>
<223> FMDV-FIP
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<223> FMDV-BIP
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<223> FMDV-B2
<400> 12
gtactcgtca ggtccrga 18
Claims (15)
- 서열번호 1 및 2로 이루어진 제 1 프라이머 세트, 서열번호 3 및 4로 이루어진 제 2 프라이머 세트 및 서열번호 5 및 6으로 이루어진 제 3 프라이머 세트를 포함하는, 구제역 바이러스(Foot and mouth disease virus, FMDV) 진단용 프라이머 세트.
- 제1항에 있어서,
상기 구제역 바이러스 진단용 프라이머 세트는 서열번호 7 및 8로 이루어진 제 4 프라이머 세트를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 구제역 바이러스 진단용 프라이머 세트.
- 제1항에 있어서,
상기 구제역 바이러스는 O, A, Asia 1, C, SAT1, SAT2 및 SAT3으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 혈청형(serotype)을 가진 바이러스인 것을 특징으로 하는, 구제역 바이러스 진단용 프라이머 세트.
- 제1항에 있어서,
상기 구제역 바이러스 진단용 프라이머 세트는 구제역 바이러스 O, A, Asia 1, C, SAT1, SAT2 및 SAT3 혈청형 동시진단용인 것을 특징으로 하는, 구제역 바이러스 진단용 프라이머 세트.
- 제1항에 있어서,
상기 구제역 바이러스 진단용 프라이머 세트는 LAMP(Loop Mediated Isothermal Amplification) 또는 RT-LAMP(Reverse Rranscription-Loop Mediated Isothermal Amplification)용 프라이머 세트인 것을 특징으로 하는, 구제역 바이러스 진단용 프라이머 세트.
- 제1항에 있어서,
상기 구제역 바이러스 진단용 프라이머 세트는 구제역 바이러스의 3D 유전자를 표적으로 하는 프라이머 세트인 것을 특징으로 하는, 구제역 바이러스 진단용 프라이머 세트.
- 제1항에 있어서,
상기 구제역 바이러스 진단용 프라이머 세트의 검출한계는 100 내지 104 TCID50/mL 인 것을 특징으로 하는, 구제역 바이러스 진단용 프라이머 세트.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 프라이머 세트를 포함하는, 구제역 바이러스 진단용 조성물.
- 제8항에 따른 구제역 바이러스 진단용 조성물을 포함하는, 구제역 바이러스 진단용 키트.
- a) 시료로부터 핵산을 얻는 단계;
b) 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 프라이머 세트를 이용하여 상기 a)단계에서 얻어진 핵산을 증폭하는 단계; 및
c) 상기 b)단계에서 얻어진 증폭 산물을 검출하는 단계;를 포함하는, 구제역 바이러스 진단 방법.
- 제10항에 있어서,
상기 구제역 바이러스는 O, A, Asia 1, C, SAT1, SAT2 및 SAT3으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 혈청형(serotype)을 가진 바이러스인 것을 특징으로 하는, 구제역 바이러스 진단 방법.
- 제10항에 있어서, 상기 b)단계의 증폭은 LAMP법 또는 RT-LAMP법을 이용하여 이루어지는 것을 특징으로 하는, 구제역 바이러스 진단 방법.
- 제10항에 있어서, 상기 b)단계의 증폭은 45 내지 75℃에서 이루어지는 것을 특징으로 하는, 구제역 바이러스 진단 방법.
- 제10항에 있어서, 상기 b)단계의 증폭은 30 내지 60분 동안 이루어지는 것을 특징으로 하는, 구제역 바이러스 진단 방법.
- 제10항에 있어서,
상기 c)단계의 검출은 겔 전기영동, 모세관 전기영동, DNA 칩, 반응산물의 탁도 측정, 방사성 측정, 형광 측정, 인광 측정 및 발색 지시제 측정으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 방법을 이용하는 것을 특징으로 하는, 구제역 바이러스 진단 방법.
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