KR20220116761A - 등온증폭과 동시에 플라즈몬 형광증폭 신호를 발생시키는 재조합 효소-중합효소 등온증폭 장치 - Google Patents
등온증폭과 동시에 플라즈몬 형광증폭 신호를 발생시키는 재조합 효소-중합효소 등온증폭 장치 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명의 재조합 효소-중합효소 등온증폭 장치는 등온증폭을 실시함과 동시에 표면형광증폭이 일어나므로 민감도 및 특이도가 우수하며 소형화가 가능하므로 임상 현장의 병원체 진단에 이용될 수 있다.
Description
본 발명은 등온증폭과 동시에 플라즈몬 형광증폭 신호를 발생시키는 재조합 효소-중합효소 등온증폭 장치에 관한 것이다.
하기도 감염(lower respiratory infection)인 폐렴은 모든 연령대에서 4번째 주요 사망원인이었으며, 2017년에는 전세계 5세 미만 아동의 주요 사망원인이었다. 하기도 감염증은 다양한 박테리아와 바이러스에 의해 발생하지만 증상으로는 구별이 어렵다. 따라서 불필요한 항생제 사용을 피하고 조기에 치료하기 위해서는 현장에서 빠르고 정확하게 병원체를 식별할 수 있는 기술이 필요하다.
PCR은 감도 및 특이성이 우수하므로 병원체 식별에 주로 이용되고 있다. 그러나 PCR은 정교한 온도 변화 장치, 긴 증폭시간, 전기영동에 의한 확인 등 복잡한 과정이 필요하므로 현장 진단에 적용하기는 어렵다.
최근에는 현장 진단을 위해 다양한 등온증폭 기술이 연구되고 있다. 등온증폭 기술은 온도 기기의 소형화가 가능하여 현장진단 용도로 주목받고 있으나 증폭 효율, 검출 감도 및 특이성이 PCR에 미치지 못해 임상 적용에 한계가 있다.
또한 표면형광증폭 기판에 부착된 약 50bp 이하의 짧은 길이의 DNA에 대한 검출 효율은 보고된 바 있지만, 표면형광증폭 기판에 프라이머를 부착하고 이에 의해 150bp 이상의 길이를 가지는 DNA 증폭산물을 생성시킬 수 있는지, 그리고 이에 대한 최적의 표면형광증폭 조건이 어떠한지는 알려진 바가 없다.
일 구체예에 따르면, 표적유전자를 등온증폭 함과 동시에 표면형광증폭으로 검출 감도를 향상시킬 수 있는 재조합 효소-중합효소 등온증폭 장치 및 이를 포함하는 재조합 효소-중합효소 등온증폭 키트를 제공한다.
일 양상은 나노기둥을 포함하는 기판; 상기 기판 또는 나노기둥의 표면에 적층된 귀금속층; 상기 기판, 나노기둥, 또는 귀금속층의 표면에 적층된 절연층; 상기 귀금속층 또는 절연층의 표면에 결합된 귀금속 나노입자; 및 상기 기판, 나노기둥, 귀금속층, 절연층, 또는 귀금속 나노입자의 표면에 결합된 정방향 프라이머를 포함하는 재조합 효소-중합효소 등온증폭 장치를 제공한다.
상기 고체상 재조합 효소-중합효소 등온증폭(Recombinase Polymerase Amplfication, 이하 RPA) 장치는 정방향 프라이머가 상기 기판, 귀금속층, 절연층, 또는 귀금속 나노입자의 표면에 고정됨으로써 고체상(solid-phase)에서 RPA를 수행할 수 있다.
본 발명은 다음과 같은 장점을 갖는다. 첫번째로 정방향 프라이머가 기판 등에 고정되어 있고 역방향 프라이머는 별도로 준비되므로 프라이머 이량체 형성과 같은 비특이적 증폭을 감소시킬 수 있다. 두번째로 역방향 프라이머에 표지된 형광단과 플라즈몬 공명을 함으로써 등온증폭과 동시에 강한 형광신호를 얻을 수 있다. 비록 플라즈몬 공명은 기존에 알려진 기술이지만, 본 발명과 같이 고정된 정방향 프라이머 및 형광단 표지된 역방향 프라이머를 구성으로 하여 재조합 효소-중합효소 등온증폭(RPA)를 실시함으로써 등온증폭과 동시에 플라즈몬 형광증폭된 강한 신호를 발생시켜 신속하게 신호를 검출할 수 있는 고체상 등온증폭 장치는 알려진 바가 없다.
상기 나노기둥(nanopillar)은 직경이 약 10 나노미터인 기둥모양의 나노구조이다. 상기 나노기둥은 나노필러로 지칭할 수 있다.
상기 나노기둥을 포함하는 기판은 표면에 다수의 나노기둥이 이격되어 배치된 형태일 수 있다. 상기 기판은 고분자, 유리, 세라믹, 금속, 종이, 수지, 실리콘, 또는 금속 산화물일 수 있다.
상기 나노기둥은 플라즈마 식각(plasma etching), 소프트 리소그라피(soft lithography), 나노임프린트 리소그라피(nanoimprint lithography), 포토 리소그라피(photo lithography), 또는 홀로그래픽 리소그라피(holographic lithography)로 형성된 것일 수 있다.
일 구체예에 따르면 상기 정방향 프라이머는 10개의 타이민 링커를 포함할 수 있다.
상기 귀금속층은 라만활성물질을 증착시켜 형성할 수 있으며, 예를 들면 열증착, 기상증착 또는 용액공정시켜 형성한 것일 수 있다.
일 구체예에 따르면 상기 귀금속은 라만활성물질일 수 있으며, 예를 들면 Au, Ag, Cu, Al, Pt, Pd, Ti, Rd, Ru, 및 이들의 합금 중에서 선택된 하나 이상일 수 있다.
상기 절연층은 귀금속층에 증착시켜 형성할 수 있으며, 예를 들면 열증착, 기상증착 또는 용액공정으로 형성된 것일 수 있다.
일 구체예에 따르면 상기 절연층은 탄화수소 티올(alkanethiol), 이황화 탄화수소(alkyldisulfide), 탄화불소 티올(fluorocarbon thiol), 탄화불소 실란(fluorocarbon silane), 탄화염소 실란(chlorocarbon silane), 탄화불소 카복실산(fluorocarbon carboxylic acid), 탄화불소 아민(fluorocarbon amine), 탄화불소계 고분자(fluorocarbon polymer) 및 이들의 유도체 중 선택된 하나 이상일 수 있으며, 실시예에 따르면 PFDT일 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 재조합-효소 중합효소 등온증폭 장치는 표적 유전자 및 형광단이 표지된 역방향 프라이머로 재조합-효소 중합효소 등온증폭을 실시하여 증폭산물이 생성되면 플라즈몬 형광 증폭이 일어나는 것일 수 있다.
상기 재조합 효소-중합효소 등온증폭 장치의 플라즈몬 커플링 효과는 형광단의 방출파장에서 최대가 되는 것일 수 있다. 일 실시예에 따르면 형광단은 Cy5이고, 재조합 효소-중합효소 등온증폭 장치는 650 nm에서 플라즈몬 커플링 효과가 최대가 되는 것일 수 있다.
상기 재조합 효소-중합효소 등온증폭 장치는 마이크로어레이, 마이크로칩 등의 형태로 제작될 수 있으며, 여러 표적 유전자를 동시에 검출할 수 있는 다중 마이크로어레이 형태로도 제작될 수 있다.
다른 양상은 하기 장치 및 물질을 포함하는 재조합효소-중합효소 증폭(Recombinase-Polymerase Amplification, RPA) 키트로써, 상기 장치 및 물질은 a) 나노기둥을 포함하는 기판; 상기 기판 또는 나노기둥의 표면에 적층된 귀금속층; 상기 기판, 나노기둥, 또는 귀금속층의 표면에 적층된 절연층; 상기 귀금속층 또는 절연층의 표면에 결합된 귀금속 나노입자; 및 상기 귀금속층, 절연층, 또는 귀금속 나노입자의 표면에 결합된 정방향 프라이머를 포함하는 재조합 효소-중합효소 등온증폭 장치, b) 형광단 표지된 역방향 프라이머, c) 가닥치환 중합효소, 재조합효소, 및 단일가닥 DNA 결합 단백질이다.
상기 키트를 구성하는 구성에 대한 내용은 상술한 내용과 동일하다.
일 구체예에 따르면, 상기 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머는 이들 프라이머쌍에 의한 증폭산물의 크기가 162 내지 231bp가 되는 서열로 이루어진 것일 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 재조합 효소-중합효소 등온증폭 장치의 플라즈몬 커플링 효과는 형광단의 방출파장에서 최대가 되는 것일 수 있다. 일 실시예에 따르면 형광단은 Cy5이고, 재조합 효소-중합효소 등온증폭 장치는 650 nm에서 플라즈몬 커플링 효과가 최대가 되는 것일 수 있다. 특히, 본 발명자는 나노필러에 증착한 금층의 두께가 평균 100nm, PFDT 코팅 후 증착한 금층의 두께가 평균 80nm, 나노파티클 직경이 평균 70nm일 때, 650nm에서 플라즈몬 커플링 효과가 최대가 되는 것을 확인하였다.
일 구체예에 따르면, 상기 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머는 서열번호 1의 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 역방향 프라이머로 이루어진 스트렙토코커스 뉴모니에(Streptococcus pneumoniae)의 Ply 유전자 검출용 프라이머쌍; 서열번호 3의 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 역방향 프라이머로 이루어진 클라미도필라 뉴모니에(Chlamydophila pneumoniae)의 OmpA 유전자 검출용 프라이머쌍; 서열번호 5 의 정방향 프라이머 및 서열번호 6의 역방향 프라이머로 이루어진 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae)의 P6 유전자 검출용 프라이머쌍; 및 서열번호 7 의 정방향 프라이머 및 서열번호 8의 역방향 프라이머로 이루어진 미코플라즈마 뉴모니에(Mycoplasma pneumoniae)의 ITS1 유전자 검출용 프라이머쌍으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머는 서열번호 9의 정방향 프라이머 및 서열번호 10의 역방향 프라이머로 이루어진 인간 코로나바이러스 229E(Human Coronavirus 229E)의 S 유전자 검출용 프라이머쌍; 서열번호 11의 정방향 프라이머 및 서열번호 12의 역방향 프라이머로 이루어진 인간 코로나바이러스 OC43(Human Coronavirus OC43)의 M 유전자 검출용 프라이머쌍; 서열번호 13의 정방향 프라이머 및 서열번호 14의 역방향 프라이머로 이루어진 인간 코로나바이러스 NL63(Human Coronavirus NL63)의 S 유전자 검출용 프라이머쌍; 및 서열번호 15의 정방향 프라이머 및 서열번호 16의 역방향 프라이머로 이루어진 인간 메타뉴모바이러스(Human metapneumovirus)의 F 유전자 검출용 프라이머쌍으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 키트의 RPA 반응 온도는 37℃ 내지 42℃일 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 키트의 RPA 반응 시간은 20분 내지 40분일 수 있다.
또 다른 양상은 정방향 프라이머가 나노기둥 표면에 고정된 플라즈몬 기판을 포함하는 등온증폭 장치를 준비하는 단계; 표적 유전자가 포함될 것으로 예상되는 시료를 준비하는 단계; 상기 시료 및 형광단이 표지된 역방향 프라이머를 상기 정방향 프라이머와 접촉시켜 재조합효소-중합효소 증폭 반응을 수행하는 단계; 및 상기 등온증폭 장치에서 발생한 플라즈몬 형광 증폭된 신호를 검출하는 단계를 포함하는 표적 유전자 검출 방법을 제공한다.
일 구체예에 따른 장치는 등온증폭을 수행함과 동시에 표면형광증폭이 일어나므로 민감도 및 특이도가 우수하다.
일 구체예에 따른 장치는 소형화가 가능하며 기존 등온증폭기술보다 민감도 및 특이성이 우수하므로 현장에서 신속 정확하게 병원체를 식별할 수 있다.
도 1의 A 및 B는 3D NPOP 기판 표면에 대한 SEM 이미지를 나타낸 것이다. 도 1의 C 및 D는 3D NPOP 기판의 나노기둥에 대한 TEM 이미지를 나타낸 것이다.
도 2의 A는 3D NPOP 기판이 가시광선의 긴 적색 범위 파장 (650-750 nm) 내에서 레일리 산란(Rayleigh scattering)의 강도가 매우 강하며, Cy5 형광단의 여기 스펙트럼(빨간색 점선) 및 방출 스펙트럼(빨간색 음영 영역)과 일치함을 나타낸 것이다. 도 2의 B는 원거리 광학 현미경 (OM) 이미지로써 3D NPOP 구조가 강한 레일리 산란(Rayleigh scattering)을 나타낸 것이다.
도 3은 3D 금 NPOP 기판에 짧은 길이(25bp)의 이중가닥(ds) DNA를 결합시키고 PEF를 확인한 결과이다.
도 4는 형광 강도 증강 인자 대 Cy5 표지된 dsDNA 농도의 플롯을 나타낸 것이다. 증강인자는 3D 금 NPOP 기판의 평균 스팟 강도에 해당되는 일반 Au 기판의 강도로 나누어 결정하였다.
도 5는 3D 금 NPOP 기판에 짧은 길이(25bp)의 단일가닥(ss) DNA를 결합시키고, 상보가닥으로 혼성화시킨 후 PEF를 확인한 결과이다.
도 6은 H.influenzae의 P6 유전자에 대한 RPA 산물을 겔 전기영동한 결과 및 RPA 산물을 3D 금 NPOP 기판에 결합시키는 과정에 대한 모식도이다.
도 7은 3D 금 NPOP 기판에 결합시킨 RPA 산물에 대한 PEF 결과이다.
도 8은 3D 금 NPOP 기판에 정방향 프라이머를 결합시킨 플라즈모닉 칩에서 고체상 RPA가 실행되는 과정을 나타낸 모식도이다.
도 9는 3D 금 NPOP 기판 상에서 플라즈모닉 RPA를 실행함에 있어 온도 및 반응시간에 대한 최적화 실험 결과를 나타낸 것이다. A 및 C는 액체상 RPA 산물의 아가로스겔 전기영동 결과이고, B와 D는 3D 금 NPOP 기판으로 실시한 고체상 플라즈모닉 RPA의 형광 현미경 이미지 및 형광강도이다.
도 10은 3D 금 NPOP 기판 상에서 플라즈모닉 RT-RPA를 실행함에 있어 반응시간에 대한 최적화 실험 결과를 나타낸 것이다. A는 액체상 RT-RPA 산물의 아가로스겔 전기영동 결과이고, B는 3D 금 NPOP 기판으로 실시한 고체상 플라즈모닉 RT-RPA의 형광이미지 및 형광강도이다.
도 11은 3D 금 NPOP 기판으로 제작한 플라즈모닉 RPA 어레이칩을 이용하여 4종의 박테리아 DNA 검출을 실시한 결과 및 특이성을 나타낸 것이다. 도면에 사용된 박테리아의 약어는 S: Streptococcus pneumoniae, H: Haemophilus influenzae, C: Chlamydia pneumoniae, M: Mycoplasma pneumoniae이다.
도 12는 3D 금 NPOP 기판으로 제작한 플라즈모닉 RPA 어레이칩을 이용하여 4종의 박테리아 DNA 검출을 실시한 결과 및 검출 민감도를 나타낸 것이다.
도 13은 액체상 멀티플렉스 PCR로 4종 박테리아 DNA 검출을 실시한 결과이다.
도 14는 액체상 멀티플렉스 RPA로 4종 박테리아 DNA 검출을 실시한 결과이다.
도 15는 3D 금 NPOP 기판으로 제작한 플라즈모닉 RT-RPA 어레이칩을 이용하여 4종의 바이러스 RNA 검출을 실시한 결과 및 특이성을 나타낸 것이다. 도면에 사용된 바이러스의 약어는 E: Corona virus 229E, O: Corona virus OC43, N: Corona virus NL63, h: human metapneumovirus 이다.
도 16은 3D 금 NPOP 기판으로 제작한 플라즈모닉 RT-RPA 어레이칩을 이용하여 4종의 바이러스 RNA 검출을 실시한 결과 및 민감도를 나타낸 것이다.
도 17은 액체상 멀티플렉스 RT-PCR로 4종 바이러스 RNA 검출을 실시한 결과이다.
도 18은 액체상 멀티플렉스 RT-RPA로 4종 바이러스 RNA 검출을 실시한 결과이다.
도 19는 4종 바이러스 감염 환자의 비인두 면봉 샘플을 이용한 플라즈모닉 RT-RPA 어레이칩의 예비 임상평가 결과를 나타낸 것이다.
도 20은 4종 바이러스 감염 환자의 비인두 면봉 샘플을 이용한 액체상 멀티플렉스 RT-RPA 결과를 나타낸 것이다.
도 2의 A는 3D NPOP 기판이 가시광선의 긴 적색 범위 파장 (650-750 nm) 내에서 레일리 산란(Rayleigh scattering)의 강도가 매우 강하며, Cy5 형광단의 여기 스펙트럼(빨간색 점선) 및 방출 스펙트럼(빨간색 음영 영역)과 일치함을 나타낸 것이다. 도 2의 B는 원거리 광학 현미경 (OM) 이미지로써 3D NPOP 구조가 강한 레일리 산란(Rayleigh scattering)을 나타낸 것이다.
도 3은 3D 금 NPOP 기판에 짧은 길이(25bp)의 이중가닥(ds) DNA를 결합시키고 PEF를 확인한 결과이다.
도 4는 형광 강도 증강 인자 대 Cy5 표지된 dsDNA 농도의 플롯을 나타낸 것이다. 증강인자는 3D 금 NPOP 기판의 평균 스팟 강도에 해당되는 일반 Au 기판의 강도로 나누어 결정하였다.
도 5는 3D 금 NPOP 기판에 짧은 길이(25bp)의 단일가닥(ss) DNA를 결합시키고, 상보가닥으로 혼성화시킨 후 PEF를 확인한 결과이다.
도 6은 H.influenzae의 P6 유전자에 대한 RPA 산물을 겔 전기영동한 결과 및 RPA 산물을 3D 금 NPOP 기판에 결합시키는 과정에 대한 모식도이다.
도 7은 3D 금 NPOP 기판에 결합시킨 RPA 산물에 대한 PEF 결과이다.
도 8은 3D 금 NPOP 기판에 정방향 프라이머를 결합시킨 플라즈모닉 칩에서 고체상 RPA가 실행되는 과정을 나타낸 모식도이다.
도 9는 3D 금 NPOP 기판 상에서 플라즈모닉 RPA를 실행함에 있어 온도 및 반응시간에 대한 최적화 실험 결과를 나타낸 것이다. A 및 C는 액체상 RPA 산물의 아가로스겔 전기영동 결과이고, B와 D는 3D 금 NPOP 기판으로 실시한 고체상 플라즈모닉 RPA의 형광 현미경 이미지 및 형광강도이다.
도 10은 3D 금 NPOP 기판 상에서 플라즈모닉 RT-RPA를 실행함에 있어 반응시간에 대한 최적화 실험 결과를 나타낸 것이다. A는 액체상 RT-RPA 산물의 아가로스겔 전기영동 결과이고, B는 3D 금 NPOP 기판으로 실시한 고체상 플라즈모닉 RT-RPA의 형광이미지 및 형광강도이다.
도 11은 3D 금 NPOP 기판으로 제작한 플라즈모닉 RPA 어레이칩을 이용하여 4종의 박테리아 DNA 검출을 실시한 결과 및 특이성을 나타낸 것이다. 도면에 사용된 박테리아의 약어는 S: Streptococcus pneumoniae, H: Haemophilus influenzae, C: Chlamydia pneumoniae, M: Mycoplasma pneumoniae이다.
도 12는 3D 금 NPOP 기판으로 제작한 플라즈모닉 RPA 어레이칩을 이용하여 4종의 박테리아 DNA 검출을 실시한 결과 및 검출 민감도를 나타낸 것이다.
도 13은 액체상 멀티플렉스 PCR로 4종 박테리아 DNA 검출을 실시한 결과이다.
도 14는 액체상 멀티플렉스 RPA로 4종 박테리아 DNA 검출을 실시한 결과이다.
도 15는 3D 금 NPOP 기판으로 제작한 플라즈모닉 RT-RPA 어레이칩을 이용하여 4종의 바이러스 RNA 검출을 실시한 결과 및 특이성을 나타낸 것이다. 도면에 사용된 바이러스의 약어는 E: Corona virus 229E, O: Corona virus OC43, N: Corona virus NL63, h: human metapneumovirus 이다.
도 16은 3D 금 NPOP 기판으로 제작한 플라즈모닉 RT-RPA 어레이칩을 이용하여 4종의 바이러스 RNA 검출을 실시한 결과 및 민감도를 나타낸 것이다.
도 17은 액체상 멀티플렉스 RT-PCR로 4종 바이러스 RNA 검출을 실시한 결과이다.
도 18은 액체상 멀티플렉스 RT-RPA로 4종 바이러스 RNA 검출을 실시한 결과이다.
도 19는 4종 바이러스 감염 환자의 비인두 면봉 샘플을 이용한 플라즈모닉 RT-RPA 어레이칩의 예비 임상평가 결과를 나타낸 것이다.
도 20은 4종 바이러스 감염 환자의 비인두 면봉 샘플을 이용한 액체상 멀티플렉스 RT-RPA 결과를 나타낸 것이다.
이하 하나 이상의 구체예를 실시예를 통해 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 3D Au NPOP 기판 제작
나노기둥이 형성된 돌기형상의 표면을 가지며, 귀금속층 및 절연층이 적층되고, 귀금속 나노입자가 결합된 3D Au NPOP 구조체를 제작하였다. (도 1 참고) 두께가 188 ㎛인 PET 폴리머 기판(Toray industries Inc.)을 맞춤형(custom-built) 13.56 MHz RF 에칭 장비를 이용하여 Ar 플라즈마 처리하였다. 에칭 공정 중의 주입구 Ar 유속 및 반응기 작동 압력은 5sccm 및 55 mTorr로 고정하였다. 플라즈마 전력은 에칭 시간 2분 동안 100W로 유지하였다.
에칭에 의해 나노기둥(nanopillar)이 형성된 PET 나노기둥 기판에 100 nm 두께의 Au 필름을 열증착(thermal evaporation) 방법으로 증착시켰다. 상기 열증착 조건은 증착속도 2.0 Å/s, 기본압력 9.6 μTorr로 하였다. 상기 Au 필름 증착에 의해 고밀도로 금코팅된 나노기둥이 형성되었다.
그 다음 97% PFDT 용액 10 ㎕을 2시간에 걸쳐 3D Au 나노기둥 기판에 첨가하였다. 금코팅된 나노기둥 위에 PFDT가 코팅됨으로써 PFDT-코팅된 Au/PET 나노기둥이 형성되었다.
마지막으로 열증착 시스템을 이용하여 0.3 Å/s의 증착속도로 PFDT-코팅된 Au/PET 나노기둥 기판위에 80 nm 두께의 Au 필름을 증착함으로써 3D 곡면위에 고밀도의 금 나노파티클(AuNPs)를 형성시켰다. AuNPs, PFDT 코팅, 및 금코팅된 PET 나노기둥 기판을 3D Au NPOP 기판으로 명명하였다.
실시예 2: 3D Au NPOP 기판을 이용한 플라즈모닉 RPA 어레이칩 준비
앞서 제작한 3D Au NPOP 기판을 5mm x 5mm 섹션으로 자르고, 스트렙타비딘 용액(PBS에서 18μM)에 밤새 침지시켰다. Nuclease-free water로 3회 세척하고, PBS-Tween 1X 버퍼(Thermofisher)로 1회 세척하였다. 세척된 기판을 1X Elis Blocker (T & I, Gangwon-do, Korea)에 실온에서 2시간 동안 침지시켰다. Nuclease-free water로 3회 세척하고 비오틴으로 개질된 정방향 프라이머(1㎕, 1μM)를 기질에 스팟팅하여 고정시켰다. 실온에서 1시간 동안 배양한 후 기질을 nuclease-free water로 3 회 세척하고 건조시켰다. 프라이머가 고정된 3D Au NPOP 칩을 밀봉하고 RPA 반응에 사용할 때까지 4℃에서 냉장 보관하였다.
실시예 3: 플라즈모닉 RPA 수행 방법
3D Au NPOP 어레이칩에서 수행한 다중(multiplex) RPA 및 RT-RPA는 액체상 RPA와 대부분 동일한 조건에서 수행하였다. 정방향 프라이머가 없는 RPA 반응용 혼합물 20㎕를 정방향 프라이머가 고정된 3D Au NPOP 어레이칩에 로딩하였다. ThermoMixer C를 사용하여 플라즈모닉 RPA 반응은 39℃에서 30분간, 플라즈모닉 RT-RPA 반응은 39℃에서 40분간 각각 수행하였다. 용액을 제거하고 어레이 칩을 PBS-Tween 1X로 3회 세척, Nuclease-free water로 3회 세척하였다. 반응 후에 3D Au 플라즈모닉 어레이칩의 표면 형광을 형광 현미경을 이용하여 여기 파장 675 nm 및 방출 파장 694 nm으로 이미지화 하였다. 형광 강도값은 ImageJ(National Institutes of Health)로 분석하였다. 모든 실험은 3번 반복하고 평균값을 얻었다.
실시예 4: 3D Au NPOP 기판의 특성 분석
고밀도 구형 AuNPs이 형성된 3D Au NPOP 어레이는 Au 나노기둥에 미끄러운(slippery) PFDT(perfluorodecanethiol)가 코팅됨으로써 그 위에 증착시킨 Au 흡착원자(adatom)의 표면이동 향상을 활용하여 제작되었다. PFDT층의 낮은 표면 에너지(γPFDT = 0.015 J/m2)와 금원자의 높은 표면 에너지(γAu = 1.53 J/m2) 사이의 큰 표면 자유 에너지 차이 때문에 금 흡착원자(adatom)의 표면이동이 향상되고, 구형의 금나노입자(AuNPs)가 형성되었다. 도 1A 및 도 1B의 주사전사현미경(SEM) 사진을 참고하면, 구형 AuNP가 PFDT 코팅 금나노기둥의 전체 표면을 완전히 덮고 있음을 알 수 있다.
AuNP 집단(population)의 밀도는 ~350 ㎛-2였다. 도 1C의 투과전자현미경(TEM) 사진을 참고하면, 3D Au NPOP 기판의 명확한 황단면도(corss-section view)를 확인하고, AuNPs가 부착된 Au나노기둥의 곡면 전체 범위를 확인하였다. 나노기둥 사이의 거리에 따라 AuNP는 AuNP 사이에 접합을 형성하거나, 나노기둥 사이에 브리지를 형성하였다. 직경이 약 70nm에 이르는 큰 AuNP는 80nm 두께의 Au 필름을 증착함으로써 Au 나노기둥 상단 표면에 형성되었다.
3차원 공간의 다중스케일 구조(즉, ~100 nm Au 필러에서 수십 나노미터 직경의 나노스케일 접합 및 입자)는 표면증강라만분광기(surface-enhanced Raman spectroscopy: SERS) 및 플라즈몬 증강 분광(Plasmon-enhanced spectroscopy, PEF)에 매우 유리함을 입증하였다. 도 2는 3D NPOP 구조 및 Cy5 형광단(fluorophore)의 광학적 특성을 나타낸다. 3D 플라즈몬 나노구조체 사이의 강화된 빛-물질 상호작용(enhanced light-matter interaction)은 가시광선의 파장범위(검은실선) 중 650-750nm의 장파장 범위에서 높은 Rayleigh 산란값을 야기한다. 도 2의 암시야 광학현미경(Dark-field optical microscopy) 이미지에 따르면, 3D NPOP 구조는 가시광선 조명하에서 파장 선택적 Rayleigh 산란에 해당하는 생생한 붉은 색의 전체 패널을 나타내었다.
Rayleigh 산란은 플라즈몬 나노구조체의 플라즈몬 공명파장을 반사하기 때문에, 3D NPOP 구조는 가시광선의 긴 파장 범위(650-750 nm)에서 강한 플라즈몬 커플링 효과를 가지며, 이는 Cy5 형광단의 방출파장 범위와 일치한다.
플라즈몬 나노구조의 공명파장과 형광단의 방출파장 사이의 정확한 일치는 PEF 기반 바이오센싱을 위한 플라즈몬-형광단 복합구조의 형광 신호를 향상시키는 물리적 메커니즘이다.
실시예 5: 3D Au NPOP 기판의 DNA에 대한 PEF(Plasmon-enhanced fluorescence)
플라즈몬 나노구조와 근위측(proximal) 형광단 사이의 플라즈몬-물질 상호 작용은 5 내지 90nm 사이의 최적 거리에서 증가된 양자 수율을 생성할 수 있다.
앞서 제작된 3D Au NPOP 나노 구조에서 짧은 길이의 DNA에 대한 플라즈몬 증강 형광(PEF)을 평가하기 위해 Cy5로 표지되고 비오틴화된(biotinylated) 25bp(약 8.5nm) 이중가닥 DNA를 스트렙타비딘(약 5 nm) 코팅된 3D Au NPOP 기판에 1μM, 500nM, 250nM, 및 100nM의 농도로 결합시켰다.(도 3A 참고) 음성 대조군으로 바탕용액(blank solution)을 사용했다. PEF 효과를 비교하기 위해 단순(plain) Au 코팅된 PET 기판과 ELISA용으로 상용화된 플라스틱 기판도 평가되었다. 표지된 Cy5는 기판 표면에서 약 13.5 nm 만큼 떨어져서 위치했다.
도 3의 B는 3가지 기질에 대한 세척 과정 후의 형광 이미지를 나타낸 것이고, 도 3의 C는 형광 강도 대비 로딩 농도를 막대 그래프로 나타낸 것이다. 일반 Au 코팅 PET 기질 및 플라스틱 기질과 비교하여, 3D Au NPOP 기질은 전체 표면에서 매우 향상된 형광 신호를 나타냈다. 3D Au NPOP 기질의 형광 신호는 500 nM dsDNA에서 포화되었으며 검출 하한은 100 nM으로 관찰되었다. 그러나, 일반 Au 코팅 PET 기질은 500 nM dsDNA의 낮은 농도에서 검출 가능한 형광 신호를 나타냈지만, 형광 신호는 매우 작은 점 형태였으며 신호 강도는 3D Au NPOP 기질에 비해 매우 약했다.
3D Au NPOP 기질의 증강 인자(enhancement factor)는 배경제거(background subtraction) 후 3D Au NPOP 기질과 일반 Au 코팅 PET 기질을 비교하여 계산하였다. 도 4에 따르면, 증강인자는 dsDNA 농도별로 1μM에서 19배, 500nM에서 15 배, 250 nM에서 35 배, 및 100 nM에서 97 배 차이를 나타냈다. 다른 한편으로, 동일한 조건 하에서 플라스틱 기질은 dsDNA 농도에서 검출 가능한 형광 신호를 보이지 않았다.
다음으로 3D Au NPOP 기판 상에서 DNA 혼성화의 효과를 평가했다. 비오틴화 된 단일가닥 DNA(25 mer)를 스트렙타비딘 코팅된 3D Au 플라즈모닉 기질, 일반 Au 기질 및 플라스틱 기질에 고정하였다. (도 5A 참고) 그 다음 Cy5 표지된 상보 DNA를 1μM, 500nM, 250nM 및 100nM의 농도로 코팅된 기판에 로딩했다. 비표적 대조군(non-targeting control, NTC)으로써 Cy5 표지된 비상보성 DNA(1μM)을 사용하여 특정 혼성화를 확인하였다. 이 경우, 표지된 Cy5는 기판 표면에서 약 13.5nm 떨어진 곳에 위치했다.
도 5의 B 및 C에 따르면, 혼성화된 ssDNA 결합 3D Au NPOP 기판은 앞서 실험한 dsDNA 결합 기판들과 유사한 형광 패턴을 나타냈다. 형광 강도는 dsDNA(1.5 ~ 2배)보다 감소했지만, 3D Au NPOP 기질은 일반 Au 코팅 PET 기질 및 플라스틱 기질에 비해 매우 향상된 형광 신호를 나타냈으며 100 nM 만큼의 낮은 농도의 ssDNA도 형광신호 검출이 가능했다. 혼성화된 ssDNA 결합 3D Au NPOP 기판의 형광 감소는 표면에 결합된 형광단의 수가 감소했기 때문일 가능성이 가장 높으며, 이는 용액 혼성화에 비해 표면 고체 혼성화의 효율성이 낮기 때문이다. 비표적 대조군(NTC)에서는 검출 가능한 형광이 없었기 때문에 특이적 혼성화를 확인했다. 반면에 일반 Au 코팅 기질 및 플라스틱 기질은 최대 1μM ssDNA 농도에서 조차 검출 가능한 형광 신호를 나타내지 않았으며 이는 NTC에서 확인된 결과와 유사했다. 상기 결과에 따르면 혼성화된 ssDNA 결합 3D Au NPOP 기질에서도 고효율 PEF가 가능함을 확인할 수 있었다.
3D Au NPOP 기질에서 긴 길이의 DNA 엠플리콘(long DNA amplicon)의 RPA 산물의 PEF를 평가하기 위해, 비오틴 표지된 정방향 프라이머와 Cy5 표지된 역방향 프라이머를 사용하여 액체상(liquid-phase) RPA를 수행하고, RPA 산물을 스트렙타비딘으로 코팅된(약 5nm) 3D Au NPOP 기질에 부착시켰다. 비교를 위해 일반 Au 코팅 기질 및 스트렙타비딘으로 코팅된 플라스틱 기질을 사용했다. RPA 산물의 적절한 크기는 100-200bp(약 34 내지 68 nm)로 보고되어 있다(Lobato et al. 2018). 여기서는 H. influenzae의 P6 유전자를 표적 유전자로 사용하였다. P6 유전자에 대한 RPA 앰플리콘은 201bp(68.34nm)이다.
기질에 고정된 정방향 프라이머는 기질 고정 및 혼성화를 개선하기 위해 비오틴- 10개 타이민(thymine) 링커로 개질되었다. 따라서 RPA 산물에 표시된 Cy5는 기질 표면으로부터 약 76 nm 떨어져 위치하엿다. H.influenzae 유전자에 대한 액체상 RPA 반응(101 copies/reaction(rxn) - 107 copies/rxn)은 39℃에서 30분 동안 수행되었다. 107 copies/rxn 농도의 S. pneumoniae 유전자를 NTC로서 사용했다. 도 6에 따르면, 아가로스겔 전기영동으로 201bp의 RPA 앰플리콘을 확인하였으며, 이는 102 copies/rxn만큼 낮은 표적 유전자 농도에서 검출할 수 있었다.
그 다음 액체상 RPA 산물을 3D Au NPOP 기판, 일반 Au 코팅 기판 및 플라스틱 기판에 로딩하였다. 상기 3가지 기판은 모두 streptavidin으로 사전 코팅하였다. 실온에서 10 분 동안 배양하고 PBS-Tween 20 완충액으로 세척한 후, 3가지 기질의 표면을 형광 현미경으로 이미지화했다. 도 7의 A 및 B는 형광 이미지 및 강도 대 표적유전자 농도(intensity versus target gene concentration)의 플롯을 나타낸 것이다. RPA 산물을 부착한 3D Au NPOP 기판은 앞서 실험한 짧은 DNA와 유사한 형광 패턴을 나타냈다. 3D Au NPOP 기판은 일반 Au 코팅 기판 및 플라스틱 기판에 비해 전체 표면에서 매우 향상된 형광 신호를 보였으며 101 copies/rxn의 낮은 표적 유전자 농도에서 형광 검출이 가능했다. 일반 Au 코팅 기질은 105 copies/rxn의 낮은 농도에서 검출 가능한 형광 신호를 나타냈지만, 형광 신호는 작은 점 형태였으며 신호 강도는 3D Au NPOP 기질에 비해 매우 약했다.
따라서 3D Au NPOP 기질은 일반 Au 코팅 기질보다 104 배, 겔 전기영동보다 10배 높은 감도를 나타냈다. 반면에 플라스틱 기질은 모든 농도에서 검출 가능한 형광 신호를 보이지 않았다. NTC에 대해서도 검출 가능한 형광이 없었다. 따라서 3D Au NPOP 구조는 길이가 긴 DNA 앰플리콘에 대해서도 높은 PEF를 나타냄이 확인되었다. 3D Au NPOP 기질은 감도가 크게 증가하였으므로 고체상 핵산 증폭의 낮은 효율을 극복 할 수 있을 것으로 기대된다.
박테리아 DNA 검출 실험에 사용된 프라이머는 하기 표 1 에 개시되어 있다.
| Bacteria | Target gene | Primer sequence | Amplicon length |
| Streptococcus pneumoniae | Ply | F: Biotin-TTTTTTTTTTGGTCAAGTTTGGTTCTGACTTTGR: Cy5-TCTTGAACACATCTCCTGGATT | 162bp |
| Chlamydophila pneumoniae | OmpA | F: Biotin-TTTTTTTTTTAACTGCATGGAACCCTTCTTTAR: Cy5-GAGCTTCTGCAGTAAGTGACCAT | 183bp |
| Haemophilus influenzae | P6 | F: Biotin-TTTTTTTTTTCTCATTTAGGAGAAATCTAATGAACR: Cy5-GTGATGTCGTATTTATCAAAACC | 201bp |
| Mycoplasma pneumoniae | ITS1 | F: Biotin-TTTTTTTTTTGGTAATGGCTAGAGTTTGACTGR: Cy5-TTCACCGCTCCACATGAA | 231bp |
바이러스 RNA 검출 실험에 사용된 프라이머는 하기 표 2 에 개시되어 있다.
| Virus | Target gene | Primer sequence | Amplicon length |
| Human Coronavirus 229E | S | F: Biotin-TTTTTTTTTTAGAAAATGTATTTGCTGTTGAGAR: Cy5-AAACATCTGAGGAAAAACCTT | 230bp |
| Human Coronavirus OC43 | M | F: Biotin-TTTTTTTTTTACAATGTATGTTAGGCCGATR: Cy5-ACATAAACAGCAAAACCACTA | 215bp |
| Human Coronavirus NL63 | S | F: Biotin-TTTTTTTTTTACTGTGAATGTCACCACACAR: Cy5-ACAGGCCATAAACAAGTTAAACG | 218bp |
| Human Metapneumovirus | F | F: Biotin-TTTTTTTTTTTAAGAATGCCCTCAAAACGR: Cy5-TCTGTTGAATTGACTGAAGC | 185bp |
실시예 6: 3D Au NPOP 기판에서의 플라즈모닉 RPA
도 8에 따르면, 3D Au NPOP 기판에서의 고체상(solid-phase) RPA 반응(이하 플라즈모닉 RPA로 지칭)은 용액과 표면에서 동시에 발생할 수 있다.
도 8의 1)에 따르면, 정방향 프라이머는 표면에 고정되어 있고 용액에는 포함되어 있지 않다. 도 8의 2)에 따르면, 표적유전자(dsDNA)는 recombinase 및 SSB(single-stranded DNA binding protein)에 의해 용액에 포함된 역방향 프라이머 또는 기판 표면에 고정된 정방향 프라이머에 결합하고, 가닥-치환 중합효소(strand-displacing polymerase)에 의해 신장된 프라이머(elongated primer)를 생성한다. 도 8의 3)에 따르면, 용액에 포함된 역방향 프라이머는 기판 표면의 신장된 정방향 프라이머에 결합하여 신장(elongation)될 수 있다. 반면, 도 8의 4)에 따르면 용액 내의 신장된 역방향 프라이머는 방출되어 기질 표면의 정방향 프라이머에 결합할 수 있다. 도 8의 5)에 따르면, 반응 결과 신장된 역방향 프라이머가 기질 표면에 존재할 수 있다.
3D Au NPOP 기질에서의 RPA 반응 조건을 최적화하기 위해 H. influenzae P6 유전자를 표적 유전자로 사용했다. 비오틴과 10개의 타이민 링커로 개질된 정방향 프라이머를 스트렙타비딘으로 코팅된 3D Au NPOP 기질에 고정하였다. 그 다음 Cy5 표지된 역방향 프라이머, RPA 시약, 및 표적 유전자를 포함하는 RPA 반응 혼합물을 정방향 프라이머가 고정된 3D Au NPOP 기질에 로딩했다. RPA 반응은 일정한 온도에서 수행되었으며 세척 단계 시작시 중단되었다.
반응 온도를 최적화하기 위해 RPA 반응은 25℃, 37℃, 39℃, 42℃ 및 45℃에서 30 분 동안 수행되었다. 비교를 위해 액체상 RPA 반응도 수행했다. 도 9의 A에 따르면, 겔 전기영동에서 볼 수 있듯이 액체상 RPA는 37℃ 내지 42℃에서 반응이 진행되었으나 25℃ 또는 45℃에서는 반응이 진행되지 않았다. 도 9의 B에 따르면, 이와 유사하게 플라즈몬 RPA 반응의 경우 형광 신호가 37℃ 내지 42℃에서 검출되었다. 이는 Cy5 표지된 역방향 프라이머가 RPA 앰플리콘에 의해 혼성화되었지만 25℃ 또는 45℃에서는 그렇지 않음을 의미한다.
형광신호 강도 대비 온도 플롯의 결과를 참고하여, 3D Au NPOP 기질에 대한 RPA 반응 온도로 39℃를 선택했다. 최적화를 위해 음성 대조군 (공백)의 신호 강도, 표준 편차 및 비특이적 신호를 고려했다. 그 다음 RPA 반응 시간을 테스트했다. 도 9의 C에 따르면, 10분간 반응시켜 얻은 액체상 RPA 앰플리콘은 겔 전기영동에서 약하게 검출되었으며, 반응시간을 최대 40분까지 증가시킴에 따라 신호가 지속적으로 증가했다. 도 9의 D에 따르면, 플라즈몬 RPA 반응은 반응시작 후 10 분부터 약한 형광 신호가 감지되었고 20분부터 구별 가능한 형광 신호가 감지되었다. 신호는 최대 40 분까지 반응 시간에 따라 증가했다. 고체상 증폭은 고체상의 고유한 입체 장애로 인해 액체상 증폭보다 더 지체될 수 있다. 그러나 3D Au NPOP 기질의 높은 PEF로 인해 20분 증폭 후 뚜렷한 형광 신호가 검출되었다.
또한 바이러스 RNA 검출을 위해 역전사 RPA(RT-RPA)의 반응 시간을 최적화했다. 바이러스 RNA의 검출을 위해 역전사 효소를 기존의 RT-PCR과 유사한 방식으로 RPA 혼합물에 첨가했다. 표적 유전자 CoV 229E S의 액체상 RT-RPA는 39℃에서 수행되었다.
도 10의 A에 따르면, 액체상 증폭은 10분 후부터 겔 전기 영동에서 약하게 검출되었으며, 신호는 액체상 RPA에서 관찰된 것과 유사하게 최대 40 분 동안 반응 시간에 따라 증가했다. 도 10의 B에 따르면, 플라즈모닉 RT-RPA에서는 10분 후부터 약한 형광 신호가 감지되었고, 20분 후부터 구별 가능한 형광 신호가 감지되었다. 신호는 최대 40 분 동안 반응 시간에 따라 증가했다.
또한, 호흡기 감염성 박테리아(S. pneumoniae, C. pneumoniae, M. pneumoniae) 및 바이러스(CoV OC43, CoV NL63, hMPV)에 대해 상술한 온도 및 시간에서 반응 후 형광 신호(Fluorescence signal)을 분석하였다. 모든 반응 효율을 고려하여 반응 온도는 39℃로 최적화하였으며, 반응시간은 플라즈모닉 RPA의 경우 30분, 플라즈모닉 RT-RPA의 경우 40 분으로 최적화하였다. 3D Au NPOP 기질의 플라즈모닉 RPA는 기존의 액체상 RPA과 증폭에 필요한 시간이 큰 차이가 나지 않고 감도가 우수하므로 고도의 다중검출을 위한 어레이 칩으로 이용될 수 있으며, 다양한 호흡기 감염의 현장 임상 진단에 유용하게 사용될 수 있다.
실시예 7: 3D Au NPOP 어레이칩에서 플라즈모닉 RPA에 의한 박테리아 DNA 검출
3D Au NPOP 기질(플라즈모닉 RPA 어레이칩)을 사용하여 S. pneumoniae, C. pneumoniae, H. influenzae 및 M. pneumoniae 4종 박테리아 검출을 위한 4-plex RPA 어레이칩을 제작하고 상기 실시예에서 최적화한 조건에서 검출을 수행하였다.
S. pneumoniae의 Ply 유전자, C. pneumoniae의 OmpA 유전자, H. influenzae의 P6 유전자 및 M. pneumoniae의 ITS1 유전자에 대한 비오틴화 정방향 프라이머를 스트렙타비딘이 코팅된 3D Au NPOP 기질(넓이 5mm× 5 mm)에 고정화시켰다. 상기 고정화는 각 프라이머 용액(1 μL, 1 mM)을 기판에 도트 스포팅함으로써 실시하였다.
Ply, OmpA, P6 및 ITS1 유전자에 대해 최적화된 Cy5 표지 역방향 프라이머를 포함하는 RPA 반응 혼합물을 어레이칩에 로딩했다. RPA 반응 혼합물은 정방향 프라이머를 포함하지 않았다. 표면에 고정된 정방향 프라이머만을 사용하면 고도로 다중 반응하는 동안 프라이머간의 비특이적 반응을 크게 감소시킬 수 있는 장점이 있다. 박테리아 검출을 위한 플라즈모닉 RPA 어레이칩의 특이성을 평가하기 위해 S. pneumoniae, C. pneumoniae, H. influenzae 또는 M. pneumoniae에서 추출한 105 copies/rxn 농도의 DNA를 표적유전자로 사용했다.
도 11에 따르면, 표적 박테리아 DNA에 대한 특이적 형광 신호는 그 유전자에 대한 정방향 프라이머가 고정된 위치에서 검출되었으며, 다른 유전자에 대한 정방향 프라이머가 고정된 위치에서는 식별 가능한 형광 신호가 검출되지 않았다. 따라서 우리는 4-plex plasmonic RPA 어레이 칩이 조사된 박테리아의 검출에 매우 특이적임을 확인했다.
박테리아 검출을 위한 플라즈모닉 RPA 어레이 칩의 감도를 평가하고 기존의 액체상 멀티 플렉스 PCR 및 액체상 멀티 플렉스 RPA의 감도와 비교했다. 액체상 PCR 및 액체상 RPA의 경우, 플라즈모닉 RPA 어레이 칩과 동일한 서열 및 농도의 프라이머가 사용되었다. 정방향 프라이머의 농도는 역방향 프라이머의 농도와 동일했다. 추출 된 S. pneumoniae, C. pneumoniae, H. influenzae 및 M. pneumoniae의 표적 유전자를 107 copies/rxn에서 101 copies/rxn으로 연속 희석하였다. 액체상 RPA 및 플라즈몬 RPA의 증폭 반응 시간은 30 분, 액체상 PCR의 증폭 반응 시간은 80 분이었다.
액체상(liquid-phase) 멀티플렉스 RPA 및 RT-RPA 반응은 TwistAmp® Liquid Basic(TwistDX)을 사용하여 제조사 프로토콜에 따라 실시했다. 구체적으로, 액체상 RPA 반응은 10 ㎕의 TwistAmp 재수화 버퍼, 2 ㎕의 E-mix 버퍼, 1.8 mM dNTP, 멀티플렉스 프라이머(S. pneumoniae 및 C. pneumoniae는 250 nM, H. influenza 및 M. pneumoniae는 480 nM), 1 ㎕의 20X 코어 반응 믹스, 1 ㎕의 280 mM 마그네슘 아세테이트 및 1 ㎕의 표적 유전자를 이용하였다. 액체상 RT-RPA 반응은 CoV 229E, CoV OC43, CoV NL63, 및 hMPV에 대한 멀티플렉스 프라이머들을 모두 480 nM의 농도로 첨가하고, 1 ㎕의 역전사효소(200U/㎕), 1 ㎕의 RNase inhibitor (100 ng/㎕)를 도입하였다. 액체상 RPA 및 RT-RPA는 39℃에서 40분간 실시하고, 증폭산물을 아가로스겔 전기영동으로 확인하였다.
액체상 멀티플렉스 PCR 및 RT-PCR은 AccuPower® PCR PreMix (Bioneer, Korea)를 사용하여 제조사 프로토콜에 따라 실시했다. 프라이머와 표적유전자의 농도는 액체상 다중 RPA 반응에서 사용된 것과 동일하였따. PCR 증폭은 96 well Thermal cycler (Applied Biosystems)를 사용하여 수행했다. 증폭조건은 95℃에서 5분 predenaturation, 95℃에서 30초간 35 cycle denaturation, 55℃에서 30초간 annealing, 72℃에서 1분동안 신장(extension), 그리고 최종 신장반응은 72℃에서 5분으로 하였다. 멀티플렉스 RT-PCR은 AccuPower® RT-PCR PreMix를 사용하여 수행했다. 42℃에서 60분간 cDNA 합성 후 모든 증폭조건은 PCR과 동일하였다. 증폭산물은 2% 아가로스겔 전기영동으로 확인하였다.
도 12에 따르면, 플라즈몬 RPA는 표적 유전자 농도가 증가함에 따라 형광 신호가 증가하였다. 액체상 PCR 및 액체상 RPA의 전기영동 결과는 도 13 및 도 14에 표시되어 있다. 각 증폭 방법에 따른 각 표적 박테리아 DNA에 대한 LOD는 표 3에 요약되어 있다.
| DNA detection method |
Reaction Time |
LOD (copies/reaction) | |||
| S.pneumoniae | C.pneumoniae | H.influenzae | M.pneumoniae | ||
| Liquid phase multiplex PCR |
1h 20 min | 103 | 102 | 104 | 103 |
| Liquid phasemultiplex RPA | 30 min | 102 | 101 | 104 | 104 |
| Plasmonic RPAarray chip | 30 min | 101 | 101 | 104 | 103 |
플라즈몬 RPA 칩의 경우, IUPAC 검출한계(LOD) 정의에 따라 음성 대조군 분석 결과의 평균에 표준 편차의 3 배를 더한 값을 계산하고, 이 값보다 큰 최소 표적 유전자 농도가 LOD로 결정되었다.
전기 영동 결과는 정량화하기 어렵기 때문에 음성 대조군과 시각적으로 구별되는 최소 표적 유전자 농도를 LOD로 결정하였다. S. pneumoniae의 경우 플라즈모닉 RPA 칩의 LOD는 101 copies/rxn으로 액체상 RPA(102 copies/rxn)보다 10 배 낮고 액체상 PCR(103 copies/rxn)보다 100배 낮았다. C. pneumoniae의 경우 플라즈모닉 RPA 칩의 LOD는 101 copies/rxn으로 액체상 RPA(101 copies/rxn)와 유사하고 액체상 PCR (102 copies/rxn)보다 10배 낮았다. H. influenzae의 경우 플라즈모닉 RPA 칩의 LOD는 104 copies/rxn로 나타났는데, 이는 액체상 RPA(104 copies/rxn) 및 액체상 PCR (104 copies/rxn)의 LOD와 유사했다. M. pneumoniae의 경우 플라즈모닉 RPA 칩의 LOD는 103 copies/rxn으로 액체상 RPA(104 copies/rxn)보다 10배 낮고 액체상 PCR (103 copies/rxn)와 유사했다. 이러한 결과를 바탕으로 플라즈모닉 RPA 어레이칩의 4 종 세균에 대한 민감도는 액체상 멀티플렉스 RPA 및 PCR에 비해 10 배 이상 높은 것을 확인했다.
실시예 8: 바이러스 RNA 검출을 위한 3D Au NPOP 칩 상의 플라즈모닉 RT-RPA
CoV 229E, CoV OC43, CoV NL63 및 hMPV 바이러스를 검출하기 위해 3D Au NPOP 기판을 사용하여 4-plex RPA 어레이칩을 제작했다. 표적 유전자는 CoV 229E의 S 유전자, CoV OC43의 M 유전자, NL63의 S 유전자, hMPV의 F 유전자였다. 바이러스 검출을 위한 플라즈모닉 RT-RPA 어레이 칩의 특이성을 평가하기 위해 CoV 229E, CoV OC43, CoV NL63 또는 hMPV에서 추출한 바이러스 RNA를 107 copies/rxn 농도의 표적 유전자로 사용했다.
도 15에 따르면, 표적 바이러스에 대한 정방향 프라이머가 고정된 위치에서 표적 바이러스에 대한 특이적 형광 신호가 검출되었고, 비표적 바이러스에 대한 정방향 프라이머가 고정된 위치에서는 형광 신호가 검출되지 않았다. 따라서 플라즈모닉 RT-RPA 어레이칩이 바이러스 검출에 매우 특이적임을 확인했다.
바이러스 검출을 위한 플라즈모닉 RT-RPA 어레이칩의 감도를 평가하고 기존의 액체상 다중 RT-PCR 및 액체상 다중 RT-RPA의 감도와 비교했다. CoV 229E, CoV OC43, CoV NL63 및 hMPV로부터 추출된 표적 유전자를 107 copies/rxn에서 101 copies/rxn으로 연속 희석했다. 증폭 반응시간은 플라즈모닉 RT-RPA 및 액체상 RT-RPA의 경우 40분, 액체상 RT-PCR의 경우 140분이었다. 도 16에 따르면, 플라즈몬 RT-RPA 어레이칩은 표적 유전자의 존재하에 구별 가능한 형광 신호를 보였다. CoV OC43, CoV NL63 및 hMPV는 표적 유전자 농도가 증가함에 따라 형광 신호를 증가시키는 경향이있는 반면 CoV 229E는 103 copies/rxn 이상의 농도에서 포화를 나타냈다. 액체상 RT-PCR 및 RT-RPA의 전기 영동 결과는 도 17 및 도 18에 나와 있으며, 사용된 방법에 따른 각 표적 바이러스 유전자에 대한 검출한계(LOD)는 표 4에 요약되어 있다.
| RNA detection method |
Reaction Time |
LOD (copies/reaction) | |||
| CoV 229E | CoV OC43 | CoV NL63 | hMPV | ||
| Liquid phase multiplex RT-PCR |
2h 20 min | 104 | 104 | 105 | 104 |
| Liquid phasemultiplex RT-RPA | 40 min | 104 | 104 | 105 | 104 |
| Plasmonic RT-RPAarray chip | 40 min | 103 | 104 | 105 | 102 |
CoV 229E 및 hMPV의 경우 플라즈모닉 RT-RPA 칩의 LOD는 103 copies/rxn으로 액체상 RT-RPA 및 액체상 RT-PCR (104 copies/rxn)보다 10 배 낮았다. CoV OC43 및 CoV NL63의 경우 플라즈모닉 RT-RPA 칩은 각각 104 copies/rxn 및 105 copies/rxn의 LOD를 보여 주었는데, 이는 액체상 RT-RPA 및 액체상 RT-PCR의 LOD와 유사했다. 이러한 결과를 바탕으로 플라즈모닉 RT-RPA 어레이칩의 4 종 바이러스에 대한 민감도가 다중 액체상 RT-RPA 및 액체상 RT-PCR과 비슷하거나 10 배 더 높은 것을 확인했다. 박테리아 DNA의 LOD와 비교하여 바이러스 RNA의 LOD는 모든 검출 방법에서 다소 높았다. 이는 프라이머 및 역전사 효소 효율에 따라 증폭 효율의 차이 때문일 수 있다. 그러나 플라즈모닉 RT-RPA 칩이 액체상 RT-RPA 검출에 해당하는 감도를 보이는 것으로 판단하여 이 플랫폼의 타당성을 확인했다. 보다 정확한 프라이머 디자인 또는 효소 최적화에 의하면 RT-RPA의 속도와 감도를 더욱 높일 수 있을 것이다.
플라즈모닉 RPA 및 RT-RPA 어레이칩은 긴 DNA 앰플리콘에 대해 높은 PEF를 나타냈으며 기존의 액체상 기반 증폭 및 검출에 필적하는 감도를 보여줌으로써 고체상 증폭의 낮은 증폭 효율과 감도를 극복하였다. 이러한 결과는 고체상 증폭에 매우 고무적이며 임상 진단에서 고체상 증폭 기반 멀티플렉스 기술의 실용화 가능성을 시사한다.
실시예 9: 임상샘플을 이용한 예비적 임상 평가(preliminary clinical evaluation)
플라즈몬 RT-RPA 어레이칩은 CoV 229E (n = 3), CoV OC43 (n = 3), CoV NL63 (n = 3) 및 hMPV (n = 3)에 대해 양성 또는 음성으로 테스트된 환자의 임상 비인두 면봉 샘플(clinical nasopharyngeal swab sample)을 사용하여 평가되었다.
RNA 추출 후 상기 확립된 절차에 따라 플라즈모닉 RT-RPA를 수행하였다. 도 19에 따르면, 플라즈모닉 RT-RPA 어레이칩은 각 바이러스에 대한 프라이머가 고정 된 특정 부위에서 모든 양성 샘플에 대해 강한 형광 신호를 나타냈다. 4 개의 바이러스 사이에는 교차 반응이 없었다. 음성 샘플(n = 3)에 대해 검출 가능한 형광 신호는 나타나지 않았다. 도 20에 따르면, 액체상 다중 RPA의 겔 전기영동에서 바이러스 양성 샘플이 증폭되고 음성 샘플이 증폭되지 않음을 확인했다. 따라서 플라즈모닉 RT-RPA 어레이칩을 이용하면 환자의 비인두 면봉 샘플로부터 성공적으로 바이러스를 검출할 수 있음이 확인되었다. 임상 응용을 위한 플라즈모닉 RPA 어레이칩의 최적화를 위해서는 많은 임상 샘플에 대한 추가 테스트가 필요하지만, 임상 다중 분자 진단을 위해 플라즈모닉 RPA 어레이칩의 사용 가능성을 확인했다. 플라즈모닉 RPA 어레이칩은 신속하고 고감도, 고수준의 다중 진단이 가능하므로 자동화 된 전처리 및 분석 장비와 연계하여 현장 다중 분자 진단 시스템 개발에 기여할 수 있을 것으로 기대된다.
<110> SAMSUNG LIFE PUBLIC WELFARE FOUNDATION
<120> Device for recombinase-polymerase amplification that generates
plasmon-enhanced fluorescence signal at the same time as
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer for Ply gene of Streptococcus pneumoniae
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<223> reverse primer for Ply gene of Streptococcus pneumoniae
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<223> foward primer for OmpA gene of Chlamydophila pneumoniae
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<210> 4
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<223> forward primer for P6 gene of Haemophilus influenzae
<400> 5
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Claims (12)
- 나노기둥을 포함하는 기판;
상기 기판 또는 나노기둥의 표면에 적층된 귀금속층;
상기 기판, 나노기둥, 또는 귀금속층의 표면에 적층된 절연층;
상기 귀금속층 또는 절연층의 표면에 결합된 귀금속 나노입자; 및
상기 기판, 나노기둥, 귀금속층, 절연층, 또는 귀금속 나노입자의 표면에 결합된 정방향 프라이머를 포함하는,
재조합 효소-중합효소 등온증폭 장치. - 제1항에 있어서,
상기 정방향 프라이머는 10개의 타이민 링커를 포함하는,
재조합 효소-중합효소 등온증폭 장치. - 제1항에 있어서,
상기 절연층은 상기 절연층은 탄화수소 티올(alkanethiol), 이황화 탄화수소(alkyldisulfide), 탄화불소 티올(fluorocarbon thiol), 탄화불소 실란(fluorocarbon silane), 탄화염소 실란(chlorocarbon silane), 탄화불소 카복실산(fluorocarbon carboxylic acid), 탄화불소 아민(fluorocarbon amine), 탄화불소계 고분자(fluorocarbon polymer) 및 이들의 유도체 중 선택된 하나 이상인,
재조합 효소-중합효소 등온증폭 장치. - 제1항에 있어서,
상기 귀금속은 Au, Ag, Cu, Al, Pt, Pd, Ti, Rd, Ru, 및 이들의 합금 중에서 선택된 하나 이상인,
재조합 효소-중합효소 등온증폭 장치. - 제1항에 있어서,
상기 재조합-효소 중합효소 등온증폭 장치는 표적 유전자 및 형광단이 표지된 역방향 프라이머로 재조합-효소 중합효소 등온증폭을 실시하여 증폭산물이 생성되면 플라즈몬 형광 증폭이 일어나는,
재조합 효소-중합효소 등온증폭 장치. - 하기 장치 및 물질을 포함하는 재조합효소-중합효소 증폭(Recombinase-Polymerase Amplification, RPA) 키트:
a) 나노기둥을 포함하는 기판; 상기 기판 또는 나노기둥의 표면에 적층된 귀금속층; 상기 기판, 나노기둥, 또는 귀금속층의 표면에 적층된 절연층; 상기 귀금속층 또는 절연층의 표면에 결합된 귀금속 나노입자; 및 상기 기판, 나노기둥, 귀금속층, 절연층, 또는 귀금속 나노입자의 표면에 결합된 정방향 프라이머를 포함하는 재조합 효소-중합효소 등온증폭 장치
b) 형광단 표지된 역방향 프라이머
c) 가닥치환 중합효소, 재조합효소, 및 단일가닥 DNA 결합 단백질. - 제6항에 있어서,
상기 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머는 이들 프라이머쌍에 의한 증폭산물의 크기가 162 내지 231bp가 되는 서열로 이루어진 것인,
재조합효소-중합효소 증폭 키트. - 제6항에 있어서,
상기 플라즈몬 핵산 증폭 장치의 플라즈몬 커플링 효과는 형광단의 방출파장에서 최대가 되는 것인,
재조합효소-중합효소 증폭 키트. - 제6항에 있어서,
상기 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머는,
서열번호 1의 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 역방향 프라이머로 이루어진 스트렙토코커스 뉴모니에(Streptococcus pneumoniae)의 Ply 유전자 검출용 프라이머쌍;
서열번호 3의 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 역방향 프라이머로 이루어진 클라미도필라 뉴모니에(Chlamydophila pneumoniae)의 OmpA 유전자 검출용 프라이머쌍;
서열번호 5 의 정방향 프라이머 및 서열번호 6의 역방향 프라이머로 이루어진 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae)의 P6 유전자 검출용 프라이머쌍; 및
서열번호 7 의 정방향 프라이머 및 서열번호 8의 역방향 프라이머로 이루어진 미코플라즈마 뉴모니에(Mycoplasma pneumoniae)의 ITS1 유전자 검출용 프라이머쌍으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인,
재조합효소-중합효소 증폭 키트. - 제6항에 있어서,
상기 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머는,
서열번호 9의 정방향 프라이머 및 서열번호 10의 역방향 프라이머로 이루어진 인간 코로나바이러스 229E(Human Coronavirus 229E)의 S 유전자 검출용 프라이머쌍;
서열번호 11의 정방향 프라이머 및 서열번호 12의 역방향 프라이머로 이루어진 인간 코로나바이러스 OC43(Human Coronavirus OC43)의 M 유전자 검출용 프라이머쌍;
서열번호 13의 정방향 프라이머 및 서열번호 14의 역방향 프라이머로 이루어진 인간 코로나바이러스 NL63(Human Coronavirus NL63)의 S 유전자 검출용 프라이머쌍; 및
서열번호 15의 정방향 프라이머 및 서열번호 16의 역방향 프라이머로 이루어진 인간 메타뉴모바이러스(Human metapneumovirus)의 F 유전자 검출용 프라이머쌍으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인,
재조합효소-중합효소 증폭 키트. - 제6항에 대해서,
상기 키트의 RPA 반응 온도는 37℃ 내지 42℃인,
재조합효소-중합효소 증폭 키트. - 제6항에 대해서,
상기 키트의 RPA 반응 시간은 20분 내지 40분인,
재조합효소-중합효소 증폭 키트.
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