CN117625814A - 检测肺炎支原体的试剂盒及其检测方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了检测肺炎支原体的试剂盒及其检测方法与应用。具体地公开了由引物FH‑F和引物FH‑R组成的引物对，所述引物FH‑F可为SEQ ID No.1所示的单链DNA分子；所述引物FH‑R可为SEQ ID No.2所示的单链DNA分子。本发明还公开了用于检测肺炎支原体的组合物及实时荧光RPA检测方法。本发明的引物对、组合物及检测方法具有简捷、快速、灵敏、特异的优点，最低检测限可以达到10fg/μL，特异性好，与常见的呼吸道病原及其他支原体属病原菌均无交叉反应，可应用于肺炎支原体的检测及肺炎支原体感染引起的疾病的诊断、筛查、预后评估、治疗监测等领域，适合现场快速检测，具有极为广泛的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于临床检测技术领域，涉及检测肺炎支原体的试剂盒及其检测方法与应用，具体涉及重组酶聚合酶扩增结合实时荧光探针检测肺炎支原体的引物探针组合物、试剂盒、检测方法与应用。
背景技术
肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae，MP)是儿童和青少年社区获得性肺炎最常见的病原之一。MP流行期间，由MP引起的社区获得性肺炎约占20-40％，而在学校等人口密集的场所可高达70％。MP感染者临床表现多样，轻症患者仅表现为轻微的呼吸道感染症状，重症患者可表现为重症肺炎，大约有25％重症患者可伴有严重的肺外并发症。MP临床表现不具有特异性，且对呼吸道感染常规药物β-内酰胺类抗生素治疗无效。因此研发一个可用于MP简单、快速和可靠的诊断方法，对合理应用抗生素，有效治疗MP感染性疾病至关重要。
目前MP感染实验室诊断常用的方法主要包括培养法、血清学检测和分子诊断方法。培养法是MP诊断的金标准，但是MP基因组较小，对培养条件和实验室要求苛刻。MP生长缓慢，培养周期较长，一般为7-10天，做出判断需要3-4周，并且检出率比较低。因此，培养法对临床早期诊断和治疗意义不大，该方法多用于回顾性研究。血清学检测因其便利性和快捷性仍是目前国内外最常用的MP感染诊断方法，在MP感染的诊断中起到非常重要的作用，但是血清学抗体检测存在窗口期和抗体持续存在的问题以及不同检测试剂盒之间敏感性和特异性存在较大的差异，因此限制了它的临床使用。随着核酸诊断技术的快速发展，一些以PCR为基础的诊断技术(如普通PCR技术，荧光PCR技术)被用于MP的快速诊断，然而这些方法依赖于昂贵的仪器设备，需要后续的电泳操作，昂贵的探针合成，以及熟练的操作人员。对于一些落后的实验室无法进行，限制了这些技术的运用。
为了克服PCR扩增技术的劣势，近年来发展了许多恒温扩增技术。恒温扩增技术较PCR技术而言，不依赖于热循环扩增设备，反应速度快，敏感性好。因此，恒温扩增技术有利于实现快速扩增，便捷检测及现场诊断。重组酶聚合酶扩增(Recombinase polymeraseamplification，RPA)技术是一种依赖多种酶的恒温扩增技术，该检测技术仅需要2条引物，30分钟内即可完成扩增，且具有灵敏性高、特异性强的优点。另外，该检测技术与实时荧光探针检测技术相结合，可实现扩增产物可靠读取，且消除了气溶胶污染，并且不需复杂仪器设备，适合现场快速检测，具有极为广泛的应用前景。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何简单、快速、准确和/或可靠地检测肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae，MP)。所要解决的技术问题不限于所描述的技术主题，本领域技术人员通过以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它技术主题。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了用于检测肺炎支原体的试剂或试剂盒，所述试剂或试剂盒可包含用于检测肺炎支原体的组合物，所述组合物可包括引物对和探针，所述引物对可由引物FH-F和引物FH-R组成，所述引物FH-F可为SEQ ID No.1所示的单链DNA分子；所述引物FH-R可为SEQ ID No.2所示的单链DNA分子。
所述引物FH-F为正向引物，所述引物FH-R为反向引物。
所述正向引物FH-F和反向引物FH-R为特异性扩增肺炎支原体(Mycoplasmapneumoniae，MP)的引物对，即用于检测肺炎支原体的特异引物对。
进一步地，上述试剂或试剂盒中，所述探针的结构可为核苷酸片段1-四氢呋喃-核苷酸片段2，其中核苷酸片段1的核苷酸序列可为SEQ ID No.3，核苷酸片段2的核苷酸序列可为SEQ ID No.4。
进一步地，所述核苷酸片段1的3’端可标记荧光基团，所述核苷酸片段2的5’端可标记淬灭基团。
所述荧光基团选自FAM、6-FAM、VIC、HEX、TRT、CY3、CY5、ROX、JOE、FITC、TET、NED、TAMRA、LC RED640、LC RED705、Quasar705或Texas Red中的至少一种。
所述淬灭基团选自TAMRA、BHQ1、BHQ2、BHQ3、MGB、Dabcy1中的至少一种。
进一步地，所述荧光基团可为6-FAM，所述淬灭基团可为BHQ1。
进一步地，所述探针的序列如下：
ATACCAAGAGTGGTTCACAACACGATT/i6FAMdT/idsp//Ibhq1dt/ATGTATGTCCTTTG。
所述探针中含有四氢呋喃(THF)，THF的两侧分别是核苷酸片段1和核苷酸片段2。
核苷酸片段1的核苷酸序列如下所示：
5’-ATACCAAGAGTGGTTCACAACACGATTT-6-FAM-3’(SEQ ID No.3)。
核苷酸片段2的核苷酸序列如下所示：
5’-BHQ1-TATGTATGTCCTTTG-3’(SEQ ID No.4)。
其中，i6FAMdT为荧光基团6-FAM(6-羧基荧光素)标记的胸腺嘧啶T。
Idsp为无碱基(碱基缺失)的四氢呋喃(Tetrahydrofuran，THF)。
Ibhq1dt为淬灭基团BHQ1标记的胸腺嘧啶T。
进一步地，所述试剂盒还包括阴性对照、阳性对照、缓冲液中的一种或多种。所述阴性对照可为不含肺炎支原体基因组模板的反应体系。
所述阳性对照可为含肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae，MP)基因组模板的反应体系。
所述试剂盒的各种试剂组分可以存在于分开的容器中，或者可以全部或部分预组合成试剂混合物。
进一步地，所述试剂盒还可包括记载有本文中所述检测肺炎支原体的方法的可读性载体。所述可读性载体可为关于实践本发明方法的试剂盒说明书(例如印刷形式的说明书)或在其上已记录了信息的计算机可读的介质(例如软盘、CD等)。
所述引物对(引物FH-F和引物FH-R)或本文中任一所述的组合物均在本发明的保护范围内。
本发明还提供了所述引物对，和/或，本文中任一所述组合物的下述任一种应用：
A1)在检测肺炎支原体或制备用于检测肺炎支原体的产品中的应用；
A2)在鉴定或辅助鉴定肺炎支原体或制备用于鉴定或辅助鉴定肺炎支原体的产品中的应用；
A3)在诊断或辅助诊断肺炎支原体感染引起的疾病或制备用于诊断或辅助诊断肺炎支原体感染引起的疾病的产品中的应用；
A4)在筛查肺炎支原体感染引起的疾病或制备用于筛查肺炎支原体感染引起的疾病的产品中的应用；
A5)在肺炎支原体感染引起的疾病的预后评估或制备用于肺炎支原体感染引起的疾病的预后评估的产品中的应用；
A6)在肺炎支原体感染引起的疾病的治疗监测或制备用于肺炎支原体感染引起的疾病的治疗监测的产品中的应用。
本文所述产品可为试剂、试剂盒、芯片或试纸。
本发明还提供了检测肺炎支原体的方法，所述方法可包括使用所述引物对(引物FH-F和引物FH-R)或本文中任一所述组合物对待测样品进行重组酶聚合酶扩增(Recombinase polymerase amplification，RPA)反应(RPA反应)，根据扩增产物确定待测样品是否含有肺炎支原体或是否为肺炎支原体。
进一步地，所述RPA反应可为实时荧光定量RPA反应。
所述检测肺炎支原体的方法可为实时荧光RPA检测方法。
上述方法中，所述重组酶聚合酶扩增反应的温度可为37-41℃。
上述方法中，所述重组酶聚合酶扩增反应的温度可为39℃。
进一步地，上述方法中，所述重组酶聚合酶扩增反应的体系包括：缓冲液A、缓冲液B、正向引物FH-F、反向引物FH-R、探针probe、模板。
进一步地，上述反应体系中，引物FH-F和引物FH-R的摩尔比可为1:1。
进一步地，上述反应体系中，引物FH-F、引物FH-R和探针的摩尔比可为1:1:1.4。
进一步地，所述重组酶聚合酶扩增反应的体系可为29.5μL缓冲液A，2.5μL缓冲液B，10μM正向引物FH-F 2μL，10μM反向引物FH-R2μL，10μM探针probe 0.6μL，模板1μL(模板浓度≥10fg/μL)，补加去离子水至50μL。
进一步地，模板浓度可为10fg/μL。
缓冲液A和缓冲液B用于RPA扩增，均购买于潍坊安普未来生物科技有限公司，货号：WLE8202KIT。
进一步地，所述重组酶聚合酶扩增反应的条件可为恒温39℃，每30s采集一次FAM通道荧光值，共40个循环；反应时间为20min。
进一步地，所述待测样品可为多种体液样品(痰液、灌洗液、胃液、胸腹腔积液、血液等)、组织样品、环境样品(如空气)、衣物或毛巾或作为食品的动物组织和/或器官等。
上述方法中，所述根据扩增产物确定待测样品是否含有肺炎支原体或是否为肺炎支原体的方法如下所示：
若待测样品显示UNDET或无典型S型扩增曲线时，报告为阴性；若待测样品呈典型的“S型”扩增曲线，FAM通道CT值为37-40，需再一次进行复检，如检测结果仍为37-40，则报告为阴性。
若待测样品呈典型的“S型”扩增曲线，FAM通道CT值显示≤37，报告为阳性。
上述应用和方法的目的可以是疾病诊断目的、疾病预后目的和/或疾病治疗目的，它们的目的也可以是非疾病诊断目的、非疾病预后目的和非疾病治疗目的；它们的直接目的可以是获取疾病诊断结果、疾病预后结果和/或疾病治疗结果的中间结果的信息，它们的直接目的可以是非疾病诊断目的、非疾病预后目的和/或非疾病治疗目的。
重组酶聚合酶扩增技术(recombinase polymerase amplification，RPA)是一种高效的恒温核酸扩增技术。其技术原理是：重组酶与引物结合形成的蛋白-DNA复合物，能在双链DNA中寻找同源序列。一旦引物定位了同源序列，就会发生链交换反应形成并启动DNA合成，对模板上的目标区域进行指数式扩增。整个过程进行得非常快，一般可在十分钟之内获得可检出水平的扩增产物。由于其技术原理的特殊性，PCR引物往往不适用于RPA。建立灵敏度高的RPA最佳体系的关键是要设计出扩增效率高、特异性强的引物和探针。本发明人经过广泛而深入的研究，针对肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae，MP)特异基因设计了一套RPA扩增引物和探针(即引物FH-F、引物FH-R和探针probe)，并建立了一种基于RPA的简单快速和准确可靠的MP诊断方法。该方法简捷、快速、灵敏、特异，最低检测限可以达到10fg/μL，并且特异性好，与常见的呼吸道病原及其他支原体属病原菌均无交叉反应，可应用于肺炎支原体的检测及肺炎支原体感染引起的疾病的诊断、筛查、预后评估、治疗监测等领域，适合现场快速检测，具有极为广泛的应用前景。
附图说明
图1为实施例2中实时荧光RPA检测方法最佳反应温度测试结果图。图1中a为反应温度为37℃时的扩增曲线，图1中b为反应温度为38℃时的扩增曲线，图1中c为反应温度为39℃时的扩增曲线，图1中d为反应温度为40℃时的扩增曲线，图1中e为反应温度为41℃时的扩增曲线。
图2为实施例4中实时荧光RPA检测方法灵敏度检测结果图。图2中a为肺炎支原体基因组模板分别为1fg，10fg，100fg，1pg，10pg，100pg进行敏感性验证，图2中b为支原体基因组模板分别为1fg和10fg进行敏感性验证。
图3为实施例5中实时荧光RPA检测方法特异性检测评价图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。其中，用于RPA扩增的缓冲液A和缓冲液B均购买于潍坊安普未来生物科技有限公司(货号：WLE8202KIT)。
下述实施例中的肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae，MP)M129记载于如下文献中：Zhao F,Liu Z,Gu Y,Yang Y,Xiao D,Tao X,Meng F,He L,Zhang J.Detection ofMycoplasma pneumoniae by colorimetric loop-mediated isothermalamplification.Acta Microbiol Immunol Hung.2013Mar；60(1):1-9.doi:10.1556/AMicr.60.2013.1.1。公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的实验所用，不可作为其它用途使用。
实施例1、引物和探针的设计
本实施例针对肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae，MP)特异基因设计一套RPA扩增引物，以进一步开发和验证RPA实时荧光扩增技术的可行性，敏感性，特异性及可靠性。
该基因存在于所有MP中，其保守性和特异性良好，可以将MP与其他密切相近的菌种区分开。利用引物设计软件Primer Explorer V4(Eiken Chemical)(http://primerexplorer.jp/e/)和引物设计软件Primer Premier 5.0设计RPA引物，并将获得的特异性引物在NCBI数据库(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)中进行序列比对分析，以排除引物与其他物种序列可能存在的非特异性匹配，最终获得优化后的RPA扩增引物，设计的引物序列及探针见表1。
表1、RPA实时荧光扩增检测方法引物和探针序列信息
其中，i6FAMdT为荧光基团6-FAM(6-羧基荧光素)标记的胸腺嘧啶T。
Idsp为无碱基(碱基缺失)的四氢呋喃(Tetrahydrofuran，THF)。
Ibhq1dt为淬灭基团BHQ1标记的胸腺嘧啶T。
探针probe中含有四氢呋喃(THF)，THF的两侧分别是核苷酸片段1和核苷酸片段2。
核苷酸片段1的核苷酸序列如下所示：
5’-ATACCAAGAGTGGTTCACAACACGATTT-6-FAM-3’(SEQ ID No.3)。
核苷酸片段2的核苷酸序列如下所示：
5’-BHQ1-TATGTATGTCCTTTG-3’(SEQ ID No.4)。
实施例2、实时荧光RPA检测的最佳反应温度
1、提取待测样品基因组DNA
本实施例中待测样品为：肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae，MP)M129。
MP基因组DNA的提取使用Qiagen公司的DNA提取试剂盒(QIAamp DNA mini kits；Qiagen,Hilden,Germany)，按照说明书进行操作。利用紫外分光光度计测定基因组DNA的浓度和纯度，提取的MP基因组DNA用TE缓冲液连续稀释(从100pg/μL，10pg/μL，10fg/μL，1fg/μL到0.1fg/μL)。各种基因组DNA均少量分装，-20℃保存备用。连续稀释的MP基因组DNA用于RPA实时荧光扩增的最佳温度的探索及扩增体系的建立。
2、实时荧光RPA反应温度优化
实时荧光RPA检测的反应体系包括：缓冲液A、缓冲液B、正向引物FH-F、反向引物FH-R、探针probe、模板。
本实施例中，实时荧光RPA检测的反应体系为：29.5μL缓冲液A，2.5μL缓冲液B，10μM正向引物FH-F 2μL，10μM反向引物FH-R 2μL，10μM探针probe 0.6μL，模板1μL(模板浓度≥10fg/μL)，补加去离子水至50μL。
在上述反应体系条件下，加入MP基因组DNA作为模板及实施例1中所设计的MP引物和探针(表1)，其模板浓度为10pg/μL。反应在恒温条件下进行(设置了37℃、38℃、39℃、40℃、41℃五个反应温度)，结果运用实时热循环仪进行检测，在不同的温度下得到不同的动态曲线图(图1)。结果显示，37-41℃条件下RPA扩增效率较高且无明显区别，本发明中选择39℃作为恒温条件进行RPA扩增。图1表示针对MP特异基因序列设计的检测MP RPA引物温度动态曲线图。
实施例3、实时荧光RPA检测方法的建立
1、提取待测样品基因组DNA
待测样品基因组DNA的提取使用Qiagen公司的DNA提取试剂盒(QIAamp DNA minikits；Qiagen,Hilden,Germany)，按照说明书进行操作。利用紫外分光光度计测定基因组DNA的浓度和纯度，提取的基因组DNA均少量分装，-20℃保存备用。
2、实时荧光RPA检测方法
以步骤1中提取的基因组DNA为模板，采用实施例1中设计的引物FH-F、引物FH-R和探针probe对待测样品进行实时荧光RPA扩增反应，其中：
实时荧光RPA反应体系为：29.5μL缓冲液A，2.5μL缓冲液B，10μM正向引物FH-F 2μL，10μM反向引物FH-R2μL，10μM探针probe 0.6μL，模板1μL(模板浓度≥10fg/μL)，补加去离子水至50μL。
实时荧光RPA反应条件为：恒温39℃，每30s采集一次FAM通道荧光值，共40个循环；反应时间为20min。
3、结果判定
根据步骤2得到的扩增产物确定待测样品是否含有肺炎支原体或是否为肺炎支原体的方法如下所示：
若待测样品显示UNDET或无典型S型扩增曲线时，报告为阴性；若待测样品呈典型的“S型”扩增曲线，FAM通道CT值为37-40，需再一次进行复检，如检测结果仍为37-40，则报告为阴性。
若待测样品呈典型的“S型”扩增曲线，FAM通道CT值显示≤37，报告为阳性。
实施例4、实时荧光RPA检测方法的灵敏度
采用实施例2步骤1中连续稀释的MP基因组DNA作为模板，按照实施例3中的步骤2、3进行实时荧光RPA检测。结果如图2所示。
实时荧光RPA检测结果显示：运用连续稀释好的MP基因组DNA作为模板进行RPA扩增反应。MP基因组DNA模板量为100pg/μL～10fg/μL时，扩增曲线呈S型，表示阳性扩增(图2)。当反应体系中基因组模板量降低至10fg以下时，扩增曲线并没有上升，表示阴性结果(图2)。因此，本发明实时荧光RPA检测范围为100pg/μL～10fg/μL，表明本发明的实时荧光RPA检测方法具有高度的灵敏性。
实施例5、实时荧光RPA检测方法的特异性
本实施例以常见的呼吸道病原和其他支原体属DNA为模板评价实时荧光RPA检测方法的特异性。
本实施例中的待测样品(MP及其他病原微生物)菌株信息如表2所示。
表2、菌株信息表
表2中的支原体属分离株由中国疾控中心赵飞老师馈赠，其他病原分离株由北京儿童医院实验室分离得到，公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的实验所用，不可作为其它用途使用。
按照实施例3的方法对待测样品进行实时荧光RPA检测，结果如图3所示。
以呼吸道常见病原及其他支原体属(肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯杆菌、铜绿假单胞菌、结核分枝杆菌、流感嗜血杆菌、鲍曼不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌、百日咳杆菌、军团菌、呼吸道合胞病毒、3型腺病毒、鼻病毒、H1N1型流感病毒、生殖支原体、口腔支原体、人型支原体、穿通支原体感染、灵长类支原体)基因组DNA为模板评价实时荧光RPA检测方法的特异性，结果显示，仅待测样品MP产生典型的扩增曲线，其他待测样品均无扩增曲线，说明本发明的实时荧光RPA检测方法能准确的鉴别MP，提示本发明的实时荧光RPA检测方法特异性良好。
实施例6、实时荧光RPA检测方法用于MP检测的临床应用
收集190例疑似MP感染的社区获得性肺炎患儿痰标本，采用实时荧光RPA检测方法和Real-time PCR检测方法对上述标本行MP检测，以Real-time PCR检测结果为标准，评价本发明实时荧光RPA检测方法对MP的诊断性能。
Real-time PCR检测方法如下：
(1)提取待测样品基因组DNA
步骤同实施例3中步骤1。
(2)Real-time PCR检测方法
以步骤(1)中提取的基因组DNA为模板，采用Real-time PCR检测方法对待测样品进行扩增反应，其中，Real-time PCR检测采用成品试剂盒，该试剂盒购买于江苏默乐生物有限公司。
Real-time PCR反应体系为：6.0μL缓冲液，2.0μL引物探针，0.5μL酶，5.0μL模板，11.5μL水，总反应体积为25μL。
Real-time PCR反应条件为：50℃2min，95℃2min，91℃15s 40个循环，64℃1min。
阴性对照为不含肺炎支原体基因组模板的反应体系。
阳性对照为含肺炎支原体P1基因组模板的反应体系。
(3)结果判定
若待测样品显示UNDECT或无典型S扩增曲线时为阴性样本；待检样品FAM荧光Ct值≥35.33时为阴性样本。
若待测样品FAM荧光Ct值＜35.33，且呈典型S型扩增曲线时为阳性样本。
利用上述Real-time PCR检测方法和本发明的实时荧光RPA检测方法(实施例3的方法)对190例临床标本进行检测，结果如表3所示。
表3、实时荧光RPA与Real-time PCR用于MP检测临床评价
结果显示：在190例标本中，92例标本实时荧光RPA检测阳性，其中88例Real-timePCR检测阳性，4例Real-time PCR检测阴性；98例实时荧光RPA和Real-time PCR同时检测阴性。以Real-time PCR为金标准，实时荧光RPA检测MP的敏感性为100％，特异性为96.1％。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
Claims (10)
1.用于检测肺炎支原体的试剂或试剂盒，其特征在于，所述试剂或试剂盒包含用于检测肺炎支原体的组合物，所述组合物包括引物对和探针，所述引物对由引物FH-F和引物FH-R组成，所述引物FH-F为SEQ ID No.1所示的单链DNA分子；所述引物FH-R为SEQ ID No.2所示的单链DNA分子。
2.根据权利要求1所述的试剂或试剂盒，其特征在于，所述探针的结构为核苷酸片段1-四氢呋喃-核苷酸片段2，其中核苷酸片段1的核苷酸序列为SEQ ID No.3，核苷酸片段2的核苷酸序列为SEQ ID No.4。
3.根据权利要求2所述的试剂或试剂盒，其特征在于，所述核苷酸片段1的3’端标记荧光基团，所述核苷酸片段2的5’端标记淬灭基团。
4.根据权利要求3所述的试剂或试剂盒，其特征在于，所述荧光基团为6-FAM，所述淬灭基团为BHQ1。
5.权利要求1中所述的引物对或权利要求1-4中任一所述的组合物。
6.权利要求1中所述的引物对，和/或，权利要求1-4中任一所述组合物的下述任一种应用：
A1)在检测肺炎支原体或制备用于检测肺炎支原体的产品中的应用；
A2)在鉴定或辅助鉴定肺炎支原体或制备用于鉴定或辅助鉴定肺炎支原体的产品中的应用；
A3)在诊断或辅助诊断肺炎支原体感染引起的疾病或制备用于诊断或辅助诊断肺炎支原体感染引起的疾病的产品中的应用；
A4)在筛查肺炎支原体感染引起的疾病或制备用于筛查肺炎支原体感染引起的疾病的产品中的应用；
A5)在肺炎支原体感染引起的疾病的预后评估或制备用于肺炎支原体感染引起的疾病的预后评估的产品中的应用；
A6)在肺炎支原体感染引起的疾病的治疗监测或制备用于肺炎支原体感染引起的疾病的治疗监测的产品中的应用。
7.检测肺炎支原体的方法，其特征在于，所述方法包括使用权利要求1中所述引物对或权利要求1-4中任一所述组合物对待测样品进行重组酶聚合酶扩增反应，根据扩增产物确定待测样品是否含有肺炎支原体或是否为肺炎支原体。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述重组酶聚合酶扩增反应的温度为37-41℃。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述重组酶聚合酶扩增反应的温度为39℃。
10.根据权利要求7-9中任一所述的方法，其特征在于，所述根据扩增产物确定待测样品是否含有肺炎支原体或是否为肺炎支原体的方法为：
若待测样品显示UNDET或无典型S型扩增曲线时，报告为阴性；若待测样品呈典型的“S型”扩增曲线，FAM通道CT值为37-40，需再一次进行复检，如检测结果仍为37-40，则报告为阴性；
若待测样品呈典型的“S型”扩增曲线，FAM通道CT值显示≤37，报告为阳性。
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