CN109371148B

CN109371148B - 鉴别三种猪呼吸道细菌的荧光pcr试剂盒及定量检测方法

Info

Publication number: CN109371148B
Application number: CN201811503131.6A
Authority: CN
Inventors: 于江; 吴家强; 刘艳艳; 张玉玉; 陈智; 杨杰
Original assignee: Institute Animal Science and Veterinary Medicine of Shandong AAS
Current assignee: Institute Animal Science and Veterinary Medicine of Shandong AAS
Priority date: 2018-12-10
Filing date: 2018-12-10
Publication date: 2021-06-11
Anticipated expiration: 2038-12-10
Also published as: CN109371148A

Abstract

本发明公开了一种鉴别三种猪呼吸道细菌的荧光PCR试剂盒及定量检测方法。该试剂盒包括猪链球菌特异引物与探针、副猪嗜血杆菌特异引物与探针、猪胸膜肺炎放线杆菌特异引物与探针，以及细菌通用型引物与探针，其序列如SEQ ID NO.1‑12所示，以4色多重实时荧光PCR对三种细菌进行检测，使检测方法更加准确。本发明猪链球菌、副猪嗜血杆菌和猪胸膜肺炎放线杆菌分别以gdh、16SrRNA及OmlA为专属靶基因，具有高度的特异性与专一性。本发明在提供猪链球菌、副猪嗜血杆菌和猪胸膜肺炎放线杆菌定性检测的同时可以精确定量，并且扩增效率高，灵敏度高，准确率高，重现性好，检测周期短，能在1.5小时内完成检测。

Description

鉴别三种猪呼吸道细菌的荧光PCR试剂盒及定量检测方法

技术领域

本发明涉及一种检测方法，具体涉及一种鉴定猪链球菌(Suis-gdh)、副猪嗜血杆菌(HPS)和猪胸膜肺炎放线杆菌(APP)的荧光PCR检测引物、探针组合物及定量检测方法。属于分子生物学技术领域。

背景技术

猪链球菌、副猪嗜血杆菌和猪胸膜肺炎放线杆菌均是猪呼吸道疾病综合征的常见重要病原体，且往往是混合感染。

猪链球菌病(Swine Streptococcus suis，Suis-gdh)是由多个血清群链球菌引起的一种急性人畜共患传染病，暴发时疫情猛烈，传播迅速，几乎看不到典型症状，几小时内死亡。猪链球菌有35种血清型，有些血清型可引起猪发病，也可导致人发病。猪链球菌病是世界各地的常见病，危害严重，现在已经成为规模化养猪场中最常见的细菌病之一，不仅给世界养猪业造成很大的威胁，而且也会危害公共卫生的安全。由于该病症状病变较为复杂，一般根据病理变化结合临床资料只可作为初步诊断，确诊还需实验室诊断。gdh基因是新近发现的一个与猪链球菌毒力相关的因子，属于谷氨酸脱氢酶蛋白家族，暴露于菌体的细胞壁上，对细菌致病性有重要意义。猪链球菌不同血清型之间gdh基因的核苷酸序列高度保守，同源性约为96％-100％，该蛋白抗原可作为检测猪链球菌的重要标志性抗原，可准确地检测猪链球菌的感染，对于该病的流行病学研究具有重要意义。

副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis，HPS)主要引发猪的多发性浆膜炎，是仔猪高死亡率的主要致病因素，成为危害养猪业发展的关键细菌性传染病。目前世界各国已采取了多种方法预防和控制该病的发生和传播。目前常用检测方法有病原分离鉴定培养法，血清学方法和分子生物学方法。其中PCR技术是目前最常用于检测HPS的分子生物学方法。16S rRNA基因是细菌染色体上编码rRNA相对应的DNA序列，存在于细菌染色体的基因组中，具有高度特异性和保守性，已成为目前国内外病原菌检测、鉴定和分类的一种强有力工具。

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae，APP)能引起猪的呼吸道疾病，表现为纤维素性胸膜肺炎，传染性极强，有很高的发病率和死亡率，一些病猪康复后常伴有慢性肺炎，导致生长停滞且长期带菌而成为其他猪的传染源。此病给养猪业造成较大的经济损失。目前，有报道用ApxIV序列进行PCR检测，但ApxIV氨基酸序列与脑膜炎奈瑟秋菌的铁调RTX蛋白的FrpAC相似，不同的仅是C-末端含有两个具有DNA聚合酶特征的序列。

建立专一性强、灵敏度高的快速检测方法是成功防治疾病的关键。目前国内兽医临床对以上3种病原体的诊断仍普遍采用传统的病原分离鉴定和血清学方法，但病原分离和生化鉴定不仅费时费力，而且敏感性和特异性都较差，不适于临床快速诊断，也不适于大规模的流行病学调查，建立一种准确快速鉴定猪上述三种呼吸道常见病原体的方法十分必要。随着分子生物技术的快速发展，针对病原微生物的核酸建立很多检测方法，这包括PCR检测技术、核酸探针杂交技术、环介导等温扩增技术(LAMP)等。其中PCR技术是分子生物学重要研究手段之一，该方法省时，简便，经济实用，大大提高了临床样品的检测效率。在单重PCR的基础上，建立了多种新型的PCR技术，如多重PCR技术、实时荧光定量PCR技术、多重荧光定量PCR技术、反转录PCR技术等。其中，实时荧光定量PCR被公认为PCR诊断技术的一次质的飞跃。

发明内容

本发明提供一种鉴定猪链球菌、副猪嗜血杆菌和猪胸膜肺炎放线杆菌的荧光PCR检测引物、探针、试剂盒及定量检测方法。该试剂盒具有高度的特异性与专一性，并且扩增效率高，灵敏度高，准确率高，重现性好，检测周期短，且能实时检测DNA扩增反应，具有很高的可行性与应用前景。

为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：一种鉴定三种猪呼吸道细菌(猪链球菌、副猪嗜血杆菌和猪胸膜肺炎放线杆菌)的荧光PCR检测试剂盒，它包括猪链球菌特异引物与探针、副猪嗜血杆菌特异引物与探针、猪胸膜肺炎放线杆菌特异引物与探针和细菌通用型引物与探针，其中，

猪链球菌特异上游引物Suis-gdh QF：5’-CCTCCGCCAGTTTGATGC-3’(SEQ IDNO.1)；猪链球菌特异下游引物Suis-gdh QR:5’-GAAGGATTTACCGTTTGCTGC-3’(SEQ IDNO.2)；

猪链球菌的特异探针Suis-gdh QP：5’-X₁-TCATTGATCCGCCCAGAAGCA-Y₁-3’(SEQ IDNO.3)；

副猪嗜血杆菌特异上游引物HPS QF:5’-GATGTGAAAGCCCCGAGC-3’(SEQ ID NO.4)；副猪嗜血杆菌特异下游引物HPS QR:5’-ACAGCGTTTACAGCGTGGAC-3’(SEQ ID NO.5)；副猪嗜血杆菌的特异探针HPS QP:5’-X₂-TTTGCTCCCCACGCTTTCGC-Y₂-3’(SEQ ID NO.6)；

猪胸膜肺炎放线杆菌特异上游引物APP QF:5’-GCACCAAAAGCGGAGCAG-3’(SEQ IDNO.7)；

猪胸膜肺炎放线杆菌特异下游引物APP QR:5’-TACTTGCGGTTCGTCTGCCT-3’(SEQID NO.8)；

猪胸膜肺炎放线杆菌的特异探针APP QP:5’-X₃-CAAGCGGATAGCCCGAAAGCAG-Y₃-3’(SEQ ID NO.9)

细菌通用上游引物16SF：5’-CGTATTACCGCGGCTGCTGG-3’(SEQ ID NO.10)；

细菌通用下游引物16S R：5’-GATTAGATACCCTGGTAGTCC-3’(SEQ ID NO.11)；

细菌通用探针16SP：5’-X₄-CCGCCTTCGCCACCGGTGTTCTT–Y₄-3’(SEQ ID NO.12)。

四种特异探针序列的5’端修饰有报告基团X₁～X₄，3’端修饰有淬灭基团Y₁～Y₄，所述报告基团可以为FAM、JOE、TAMRA、ROX、CY3、CY5中的任一种，所述淬灭基团可以为Dabcyl、BHQ1，BHQ2中的任一种。

优选的，猪链球菌的特异探针Suis-gdh QP：5’-TAMRA-TCATTGATCCGCCCAGAAGCA-BHQ2-3’；

优选的，副猪嗜血杆菌的特异探针HPS QP：5’-JOE-TTTGCTCCCCACGCTTTCGC-BHQ2-3’；

优选的，猪胸膜肺炎放线杆菌的特异探针APP QP：5’-FAM-CAAGCGGATAGCCCGAAAGCAG-BHQ1-3’；

优选的，细菌通用探针16SP：5’-CY5-CCGCCTTCGCCACCGGTGTTCTT–BHQ2-3’。

进一步的，本发明的荧光PCR检测试剂盒，其中各引物终浓度为0.1～0.5μM，各探针终浓度为0.05～0.25μM。

进一步的，本发明的荧光PCR检测试剂盒，它还包括：2×TaqMan Master Mix、DNA模板和双蒸水。

进一步优选的，上述的荧光PCR检测试剂盒，其20μL PCR扩增体系为：2×TaqManMaster Mix，各引物终浓度为0.1～0.5μM，各探针终浓度为0.05～0.25μM，0.5～50ng/μL的DNA模板2μL，双蒸水补足20μL，其配制方法如表1所示。

表1 PCR反应扩增体系

备注：引物组浓度指的是使用的每条引物的浓度都为5μM；探针组合物的浓度指的是每个探针的浓度均为1-2μM。

进一步的，上述的荧光PCR检测试剂盒，还包括猪链球菌阳性对照品、副猪嗜血杆菌阳性对照品、猪胸膜肺炎放线杆菌阳性对照品、阴性对照品和空白对照品。

本发明还提供了一种用于鉴别猪链球菌、副猪嗜血杆菌和猪胸膜肺炎放线杆菌的定性检测方法，其特征是，具体步骤如下：

1)提取待测样本的模板DNA；

2)PCR扩增

使用上述的荧光PCR检测试剂盒进行PCR扩增，需要在5通道或5通道以上的任何型号的荧光定量PCR仪上进行，扩增程序：95℃，2min；95℃，10s；63℃，35s，在此收集荧光信号，40个循环，根据不同型号的PCR仪的不同要求可以对标记荧光号进行相应的调整；

3)设立阳性对照、阴性对照及空白对照，分析实验结果，给出第n个循环时的荧光增加值ΔRn与扩增曲线Ct值，根据不同探针荧光信号及扩增曲线Ct值来判定属于哪种细菌。

进一步的，如果TAMRA和CY5荧光修饰探针有扩增曲线时，且满足Ct≤35说明待检样本为猪链球菌；如果JOE和CY5荧光修饰探针有扩增曲线时，且满足Ct≤35说明待检样本为副猪嗜血杆菌；如果FAM和CY5荧光修饰探针有扩增曲线时，且满足Ct≤35说明待检样本为猪胸膜肺炎放线杆菌；如果FAM、JOE、TAMRA荧光修饰探针都没有扩增曲线，但CY5有扩增曲线时，且满足Ct≤35说明待检样本不是三种细菌中的某一种细菌。

进一步的，本发明还提供了一种猪链球菌、副猪嗜血杆菌和猪胸膜肺炎放线杆菌的基因组精确定量检测方法，具体方法：分别计算猪链球菌、副猪嗜血杆菌和猪胸膜肺炎放线杆菌的标准样品的基因组DNA的拷贝数；

将猪链球菌、副猪嗜血杆菌及猪胸膜肺炎放线基因组DNA分别按10×逐级稀释5个梯度；以上述标准品为模板，进行实时荧光定量PCR检测，生成标准曲线，同时对未知样本进行精确定量。

本发明以OmlA为专属靶基因，外膜脂蛋白(OmlA，outer membrane lipoproteinA)是一种外膜蛋白(Outer membrance lipoproteins,OMP)，OMP是革兰氏阴性菌表面成分，也是胸膜肺炎放线杆菌的一个重要的毒力基因，在所有血清型中较为保守，是重要的免疫原蛋白，在猪胸膜肺炎放线杆菌的致病中起着重要作用。相比采用ApxIV(与脑膜炎奈瑟秋菌的铁调RTX蛋白的FrpAC相似)为专属靶基因，本发明的特异性更强。

本发明的有益效果：

1、与现有的技术相比，本发明猪链球菌、副猪嗜血杆菌和猪胸膜肺炎放线杆菌分别以gdh、16SrRNA及OmlA为专属靶基因，具有高度的特异性与专一性。本发明以4色多重实时荧光PCR对三种细菌，设计的引物及探针双重特异使检测方法更加准确；同时采用本发明的多重实时荧光PCR检测方法可以一次对三种猪呼吸道病原进行精确定量，大大节省了检测时间。

2、相比一般的多重PCR方法，本发明的多重实时荧光PCR检测方法不仅可以精确定量，并且扩增效率高，检测周期短，能在1.5小时内完成检测，且能实时监测。

总之，本发明具有“对猪链球菌、副猪嗜血杆菌和猪胸膜肺炎放线杆菌定性检测的同时可以精确定量，并且扩增效率高，灵敏度高，准确率高，重现性好，检测周期短，能在1.5小时内完成检测，且能实时监测”的优势具有很高的可行性与应用前景，为猪疫病临床诊断提供科学可靠的检测方法。

附图说明

图1为猪链球菌在不同荧光修饰探针下的扩增曲线图；从图中可以看出：当TAMRA、CY5荧光修饰探针有扩增曲线时，且满足Ct≤35说明待检样本为猪链球菌；

图2为副猪嗜血杆菌在不同荧光修饰探针下的扩增曲线图；从图中可以看出：当JOE、CY5荧光修饰探针有扩增曲线时，且满足Ct≤35说明待检样本为副猪嗜血杆菌；

图3为猪胸膜肺炎放线杆菌在不同荧光修饰探针下的扩增曲线图；从图中可以看出：当FAM、CY5荧光修饰探针有扩增曲线时，且满足Ct≤35说明待检样本为猪胸膜肺炎放线杆菌；

图4为三种细菌之外的细菌在不同荧光修饰探针下的扩增曲线图；从图中可以看出：当只有CY5荧光修饰探针有扩增曲线时，且满足Ct≤35说明待检样本不是这三种细菌中的某一种细菌；

图5为猪链球菌板分别为1ng、0.1ng、0.01ng、0.001ng、0.0001ng时的灵敏度扩增曲线图；从图中可以看出：其最低检出限为0.01ng；

图6为副猪嗜血杆菌模板分别为1ng、0.1ng、0.01ng、0.001ng、0.0001ng时的灵敏度扩增曲线图；从图中可以看出：其最低检出限为0.001ng；

图7为猪胸膜肺炎放线杆菌模板分别为1ng、0.1ng、0.01ng、0.001ng、0.0001ng、0.00001ng时的灵敏度扩增曲线图；从图中可以看出：其最低检出限为0.01ng。

图8为副猪嗜血杆菌标准曲线图；

图9为猪链球菌标准曲线图；

图10为猪胸膜肺炎放线杆菌标准曲线图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明进行进一步的阐述，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。

本发明中所用实验材料、试剂与仪器如下：

实验材料：猪链球菌、副猪嗜血杆菌、猪胸膜肺炎放线杆菌、猪多杀性巴氏杆菌、大肠杆菌、化脓杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、副鸡禽杆菌、凝结芽孢杆菌、罗伊氏乳杆菌、植物乳杆菌、卡氏杆菌和屎肠球菌。

所用试剂：细菌DNA提取试剂盒、PCR反应试剂购自宝生物工程(大连)有限公司。引物与探针由生工生物工程(上海)有限公司负责合成。2×TaqMan Master Mix为DBIBioscience品牌。DNA测序由山东省农业科学院生物技术中心测序中心完成。

所用仪器：ABI 7500荧光定量PCR仪为ABI公司产品，Takara PCR仪为宝生物工程(大连)有限公司产品。5424D型高速离心机为Eppendorf公司产品。

实施例1

1、猪链球菌样品、副猪嗜血杆菌样品、猪胸膜肺炎放线杆菌样品及其他细菌样本DNA提取：

采用细菌DNA提取试剂盒提取，具体操作步骤见试剂盒说明书。提取的基因组DNA经紫外分光光度计测定其纯度和浓度。测定OD260/OD280值均为1.8～1.9左右，浓度在10ng/μL以上，说明DNA纯度较高，浓度适中，符合PCR扩增要求。

2、靶基因的选择和引物的设计：猪链球菌(Suis)、副猪嗜血杆菌(HPS)及猪胸膜肺炎放线杆菌(APP)分别以Gdh gene、16S rRNA gene及OmlA gene为特异性靶基因，引物及探针的核苷酸序列见表2。

表2引物及探针的核苷酸序列

3.标准品构建：

猪链球菌基因组-标准品制备：初始浓度为30ng/μL，猪链球菌基因组大小为2.007Mb，Copy数＝(6.02×10²³)×(30ng/μl×10^-9)/(2.007×10⁶×660)＝1.36×10⁷copies/μL；

副猪嗜血杆菌-标准品制备：初始浓度为30ng/μL，副猪嗜血杆菌基因组大小2.224Mb，Copy数＝(6.02×10²³)×(30ng/μl×10^-9)/(2.224×10⁶×660)＝1.23×10⁷ copies/μL；

猪胸膜肺炎放线杆菌-标准品制备：初始浓度为30ng/μL，猪胸膜肺炎放线杆菌基因组大小2.224 Mb，Copy数＝(6.02×10²³)×(30ng/μl×10^-9)/(2.274×10⁶×660)＝1.20×10⁷copies/μL。

将猪链球菌、副猪嗜血杆菌及猪胸膜肺炎放线杆菌基因组DNA分别从1.36×10⁷copies/μL、1.23×10⁷ copies/μL及1.20×10⁷ copies/μL按10×逐级稀释5个梯度，即10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²数量级拷贝数。以上述标准品为模板，设4～5个平行样，进行实时荧光定量PCR检测，生成标准曲线，同时对未知样本进行精确定量。

4.荧光检测：

优先选用20μL的实时荧光PCR扩增体系，反应体系见表3。

表3 PCR反应扩增体系

5、PCR扩增条件为：95℃2min；95℃10s，63℃，35s，在此收集荧光信号，40个循环。

6、结果分析：每次试验设立猪链球菌阳性对照、副猪嗜血杆菌阳性对照、猪胸膜肺炎放线杆菌阳性对照、阴性对照和空白对照，试验结束后打开分析软件，分析实验结果，给出ΔRn(第n个循环时的荧光增加值)与扩增曲线Ct值，根据探针荧光信号及扩增曲线Ct值来判定待测样品是否为三种细菌。结果见图1，TAMRA、CY5荧光修饰探针有扩增曲线时，且满足Ct≤35说明待检样本为猪链球菌；图2，JOE、CY5荧光修饰探针有扩增曲线时，且满足Ct≤35说明待检样本为副猪嗜血杆菌；图3，FAM、CY5荧光修饰探针有扩增曲线时，且满足Ct≤35说明待检样本为猪胸膜肺炎放线杆菌；图4，显示当只有CY5荧光修饰探针有扩增曲线时，且满足Ct≤35说明待检样本中不是这三种细菌中的某一种细菌。

标准曲线分析：副猪嗜血杆菌标准曲线见图8，通过方程y＝-3.262X+19.098(R2:0.991，Eff％:102.554)，来计算待检样本副猪嗜血杆菌的浓度，进一步根据上述3.计算出拷贝数；猪链球菌标准曲线图如图9，，通过方程y＝-3.389X+25.731(R2:0.992，Eff％:97.279)，来计算待检样本副猪嗜血杆菌的的浓度，进一步根据上述3.计算拷贝数；猪胸膜肺炎放线杆菌如图10，通过方程y＝-3.994X+26.747(R2:0.990，Eff％:91.38)，来计算待检样本副猪嗜血杆菌的浓度，进一步根据上述3.计算出拷贝数。

实施例2特异性验证

利用本发明设计的引物和探针，分别以猪链球菌、副猪嗜血杆菌、猪胸膜肺炎放线杆菌、猪多杀性巴氏杆菌、大肠杆菌、化脓杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、副鸡禽杆菌、凝结芽孢杆菌、罗伊氏乳杆菌、植物乳杆菌、卡氏杆菌和屎肠球菌总基因组DNA为模板，进行实时荧光PCR检测，验证其引物和探针的特异性。其结果见表4及图2，结果表明本研究所设计的探针及引物具有很强的特异性。

表4特异性验证试验

实施例3灵敏度实验

将猪链球菌、副猪嗜血杆菌、猪胸膜肺炎放线杆菌的基因组DNA定量分别到5ng/μL，按10×梯度稀释，每个梯度均取2.0μL为模板量，(即：10ng、1ng、0.1ng、0.01ng、0.001ng、0.0001ng)进行实时荧光定量PCR检测，评估本发明的检测限。见图5显示猪链球菌检出限为0.01ng，图6显示副猪嗜血杆菌检出限为0.001ng，图7显示猪胸膜肺炎放线杆菌检出限为0.01ng，因此本方法定量检测限定为0.01ng，说明本发明所提供的方法具有很高的灵敏度。

实施例4临床可疑样本检测

本发明所建立的同时针对猪链球菌、副猪嗜血杆菌、猪胸膜肺炎放线杆菌三种类细菌的多重实时荧光PCR检测方法对22份临床可疑样本进行检测，样本类型包括寿光、烟台、青州等不同地区的病料和血清。22份临床可疑样本的来源及编号见表5。同时使用病毒分离方法和测序进行检测。其荧光定量检测结果见表5，结果显示本发明所建立的方法与病毒分离后测序结果验证完全一致，本方法准确、可靠。

表5临床可疑样本检测数据

上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东省农业科学院畜牧兽医研究所

<120> 鉴别三种猪呼吸道细菌的荧光PCR试剂盒及定量检测方法

<130> 0

<160> 12

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 猪链球菌特异上游引物Suis-gdh QF

<400> 1

cctccgccag tttgatgc 18

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 猪链球菌特异下游引物Suis-gdh QR

<400> 2

gaaggattta ccgtttgctg c 21

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 猪链球菌的特异探针Suis-gdh QP

<400> 3

tcattgatcc gcccagaagc a 21

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 副猪嗜血杆菌特异上游引物HPS QF

<400> 4

gatgtgaaag ccccgagc 18

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 副猪嗜血杆菌特异下游引物HPS QR

<400> 5

acagcgttta cagcgtggac 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 副猪嗜血杆菌的特异探针HPS QP

<400> 6

tttgctcccc acgctttcgc 20

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 猪胸膜肺炎放线杆菌特异上游引物APP QF

<400> 7

gcaccaaaag cggagcag 18

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 猪胸膜肺炎放线杆菌特异下游引物APP QR

<400> 8

tacttgcggt tcgtctgcct 20

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 猪胸膜肺炎放线杆菌的特异探针APP QP

<400> 9

caagcggata gcccgaaagc ag 22

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 细菌通用上游引物16SF

<400> 10

cgtattaccg cggctgctgg 20

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 细菌通用下游引物16S R

<400> 11

gattagatac cctggtagtc c 21

<210> 12

<211> 23

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 细菌通用探针16SP

<400> 12

ccgccttcgc caccggtgtt ctt 23

Claims

1.一种鉴定三种猪呼吸道细菌的荧光PCR试剂盒，它包括猪链球菌特异引物与探针、副猪嗜血杆菌特异引物与探针、猪胸膜肺炎放线杆菌特异引物与探针，以及细菌通用型引物与探针，其中，

猪链球菌特异上游引物Suis-gdh QF：5’-CCTCCGCCAGTTTGATGC-3’；

猪链球菌特异下游引物Suis-gdh QR:5’-GAAGGATTTACCGTTTGCTGC-3’；

猪链球菌的特异探针Suis-gdh QP：5’-X₁-TCATTGATCCGCCCAGAAGCA-Y₁-3’；

副猪嗜血杆菌特异上游引物HPS QF:5’-GATGTGAAAGCCCCGAGC-3’；

副猪嗜血杆菌特异下游引物HPS QR:5’-ACAGCGTTTACAGCGTGGAC-3’；

副猪嗜血杆菌的特异探针HPS QP:5’-X₂-TTTGCTCCCCACGCTTTCGC-Y₂-3’；

猪胸膜肺炎放线杆菌特异上游引物APP QF:5’-GCACCAAAAGCGGAGCAG-3’；

猪胸膜肺炎放线杆菌特异下游引物APP QR:5’-TACTTGCGGTTCGTCTGCCT-3’；

猪胸膜肺炎放线杆菌的特异探针APP QP:5’-X₃-CAAGCGGATAGCCCGAAAGCAG-Y₃-3’；

细菌通用上游引物16SF：5’-CGTATTACCGCGGCTGCTGG 3’；

细菌通用下游引物16S R：5’-GATTAGATACCCTGGTAGTCC-3’；

细菌通用探针16SP：5’-X₄-CCGCCTTCGCCACCGGTGTTCTT-Y₄-3’；

所述X₁～X₄不同，为FAM、JOE、TAMRA、ROX、CY3、CY5中的任一种；Y₁～Y₄为Dabcyl、BHQ1，BHQ2中的任一种。

2.如权利要求1所述的一种鉴定三种猪呼吸道细菌的荧光PCR试剂盒，其特征是，

所述猪链球菌的特异探针Suis-gdh QP为：5’-TAMRA-TCATTGATCCGCCCAGAAGCA-BHQ2-3’；

所述副猪嗜血杆菌的特异探针HPS QP为：5’-JOE-TTTGCTCCCCACGCTTTCGC-BHQ2-3’；

所述猪胸膜肺炎放线杆菌的特异探针APP QP为：5’-FAM-CAAGCGGATAGCCCGAAAGCAG-BHQ1-3’；

所述细菌通用探针16SP为：5’-CY5-CCGCCTTCGCCACCGGTGTTCTT–BHQ2-3’。

3.如权利要求2所述的一种鉴定三种猪呼吸道细菌的荧光PCR试剂盒，其特征是，所述荧光PCR试剂盒，其中各引物终浓度为0.1～0.5μM，各探针终浓度为0.05～0.25μM。

4.如权利要求2所述的一种鉴定三种猪呼吸道细菌的荧光PCR试剂盒，其特征是，所述荧光PCR试剂盒，它还包括：2×TaqMan Master Mix、DNA模板和双蒸水。

5.如权利要求4所述的一种鉴定三种猪呼吸道细菌的荧光PCR试剂盒，其特征是，其20μL PCR扩增体系为：2×TaqMan Master Mix，各引物终浓度为0.1～0.5μM，各探针终浓度为0.05～0.25μM，0.5～50ng/μL的DNA模板2μL，双蒸水补足20μL。