CN104711359A - 一种副猪嗜血杆菌的检测试剂盒及其检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种副猪嗜血杆菌的检测试剂盒及其检测方法，属于分子生物学技术领域，该检测试剂盒包括引物对、PCR Mix、阳性对照和ddH2O。本发明针对具有高度保守区域的mviN基因序列设计的引物对，特异性好，能够准确的区别副猪嗜血杆菌LC株同副禽嗜血杆菌、猪胸膜肺炎放线杆菌、巴氏杆菌、化脓隐秘杆菌、金黄色葡萄球菌、猪链球菌；且本发明提供的试剂盒及检测方法灵敏度高，耗时短且检测准确，对于监控该菌的繁殖、疾病发生和流行以及疾病的及时防治都具有重要的意义。

Description

一种副猪嗜血杆菌的检测试剂盒及其检测方法
技术领域
本发明涉及一种试剂盒，具体涉及一种副猪嗜血杆菌的检测试剂盒及其检测方法，属于分子生物学技术领域。
背景技术
副猪嗜血杆菌（Haemophlius parasuis，HPS）是一种NAD依赖型、不运动的革兰氏阴性细小杆菌，属于巴斯德菌科(Pastteurellacea)嗜血杆菌属(Haemophilus)，有15种血清型，还有20%的菌株血清型无法确定。该菌能够引起猪的多发性浆膜炎、关节炎以及脑膜炎，由该菌引起的副猪嗜血杆菌病又称为猪革拉斯氏病（Glässer's disease）。HPS可以影响2周龄～4月龄的猪，主要在断奶前后和保育舍阶段发病，常见于5～8 周龄，发病率可达40%，严重时死亡率可达50%。随着我国规模化养猪场的发展，HPS感染有明显增加趋势，已成为猪场保育仔猪发病率和死亡率增加的重要原因之一，每年给我国养猪业造成巨大经济损失。因此，建立一种副猪嗜血杆菌的检测技术，对于监控该菌的繁殖、疾病发生和流行以及疾病的及时防治都具有重要的意义。
常规的生理生化方法虽然可以准确鉴定待检菌株，但是操作繁琐，耗时长。中国专利CN102220426A公开了副猪嗜血杆菌PCR检测试剂盒，该试剂盒是针对传统的16SrRNA 序列设计的引物，对巴氏杆菌科及嗜血杆菌属的其他成员（如巴氏杆菌、副禽嗜血杆菌等）特异性效果欠佳，且其灵敏度仍需改善。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种特异性强、灵敏度高、耗时短、检测准确、有效的副猪嗜血杆菌的检测试剂盒。
本发明为了实现上述目的所采用的技术方案为：
本发明提供了一种副猪嗜血杆菌的检测试剂盒，该检测试剂盒包括序列如SEQ ID NO：1-2所示的引物对F1、R1各100µL、2×PCR Mix 1.25mL 、阳性对照副猪嗜血杆菌DNA200µL和ddH2O 2×1.25mL；
所述引物对序列为：
mviN-F1 5'GGTATGACCCTACTTTCTCG 3'
mviN-R1 5'TTAATTTACCTTGAATGATCTTATT 3'
上述检测试剂盒内为100次含量。
进一步的，所述PCR Mix包括PCR 缓冲液，dNTP，Pfu DNA 聚合酶。
本发明还提供了一种副猪嗜血杆菌的检测方法，该检测方法为使用上述提供的检测试剂盒进行副猪嗜血杆菌的检测。
上述检测方法包括以下步骤：
a、提取样品DNA：提取待检样品中的DNA备用；
b、基因扩增：将提取的样品DNA加入检测试剂盒中，对待检样品中的DNA进行PCR扩增；
c、结果检测：对DNA扩增结果进行琼脂糖凝胶电泳检测。
进一步的，步骤a中，所述待检样品为细菌分离培养物、组织研磨液或血液样品。
进一步的，步骤b中，PCR扩增条件为：95℃5min；95℃ 45s，55℃ 45s，72℃ 90s，32个循环；72℃ 10min；4℃ 保存。
本发明中所述的检测试剂盒中，阴性对照为灭菌水(ddH2O)，阳性对照为副猪嗜血杆菌DNA。
本发明设计的特异性好、灵敏度高的引物是实现所述目的的关键因素，为了克服传统的针对16SrRNA序列设计的引物对于巴氏杆菌、副禽嗜血杆菌等特异性结果欠佳的弊端，本发明针对mviN基因序列，设计出特异性好、灵敏度高的引物，mviN基因有其自身的独特性，存在于许多对人、动物及植物致病的微生物中，且mviN基因具有高度保守区域，因此用于HPS的检测时准确度高。
本发明的优点及有益效果为：本发明针对具有高度保守区域的mviN基因序列设计的引物，具有特异性好，能够准确的区别副猪嗜血杆菌LC株同副禽嗜血杆菌、猪胸膜肺炎放线杆菌、巴氏杆菌、化脓隐秘杆菌、金黄色葡萄球菌、猪链球菌；且本发明提供的试剂盒灵敏度高，可检测副猪嗜血杆菌DNA不低于100×10-5ng/µL的待检样本，耗时短且检测准确、有效。
附图说明
图1为检测引物的选择结果。
其中，M：Marker DL2000；1：固体培养物（引物对F1/R1）；2：液体培养物（引物对F1/R1）；3：固体培养物（引物对F2/R2）；4：液体培养物（引物对F2/R2）；5：阳性对照；6：阴性对照。
图2为副猪嗜血杆菌mviN基因PCR特异性试验结果。
其中，M：Marker DL2000；1：副猪嗜血杆菌LC株；2：副禽嗜血杆菌；3：猪胸膜肺炎放线杆菌；4：巴氏杆菌；5：化脓隐秘杆菌；6：金黄色葡萄球菌；7：猪链球菌；8：阴性对照。
图3为副猪嗜血杆菌mviN基因PCR灵敏度试验结果。
M：Marker DL2000；1：100×10-1ng/µL；2：100×10-2ng/µL；3：100×10-3ng/µL；4：100×10-4ng/µL；5：100×10-5ng/µL；6：100×10-6ng/µL；7：100×10-7ng/µL；8：阴性对照。
图4为死亡猪组织样品中副猪嗜血杆菌的检测结果。
其中，M：Marker DL2000；1：死亡猪1号组织样品；2.死亡猪2号组织样品；3：阴性对照；4：阳性对照。
图5为死亡猪1号的组织扩增产物测序结果。
具体实施方式
以下结合实施例的具体实例方式再对本发明的上述内容作进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例。
本发明所需材料、试剂
1.菌株
副猪嗜血杆菌LC株、副禽嗜血杆菌、猪胸膜肺炎放线杆菌、巴氏杆菌、化脓隐秘杆菌、金黄色葡萄球菌、猪链球菌等均由本实验室分离、鉴定及保存。
2.试剂
TSA培养基 称取40g TSA粉末加入940ml蒸馏水中，经121℃灭菌15分钟。冷却至50℃左右，加入50ml新生牛血清和10ml过滤除菌的浓度为0.1%的辅酶（NAD）溶液，充分摇匀后倒平皿。
TSB培养基 称取30g TSB粉末加入940ml蒸馏水中，经121℃灭菌15分钟。临用前加入50ml新生牛血清和10ml过滤除菌的浓度为0.1%的NAD溶液，混合均匀后配制而成。
PCR Mix（PCR 缓冲液800µL，dNTP 400µL，Pfu DNA 聚合酶50µL），SDS溶液，蛋白酶K，Tris饱和酚，氯仿，异戊醇，无水乙醇。
实施例 1
1.DNA模板的制备：
液体培养物 取副猪嗜血杆菌LC株菌液10000r/min离心5min，弃上清液，用灭菌水重悬后，于沸水中煮沸10min，-20℃冻结，融化后，10000r/min离心5min，取上清液作为DNA模板。
固体培养物 挑取若干个菌落悬浮于100µL灭菌水中，吹吸混匀后，于沸水中煮沸10min，-20℃冻结，融化后，10000r/min离心5min，取上清液作为DNA模板。
2.引物设计
根据GenBank公布的HPS mviN基因序列（CP001321.1），设计两对特异性引物，送上海生工生物工程技术服务有限公司合成，PCR引物对序列见表1。
表1 PCR引物对序列
2.PCR扩增
将上述提取的DNA模板利用上述设计的引物进行PCR扩增，阴性对照为ddH2O，PCR反应体系为25µL。
25µL的反应体系如下：
PCR扩增反应程序为：
95℃ 5min；95℃ 45s，55℃ 45s ，72℃ 90s，32个循环；72℃ 10min；4℃ 保存。
3.PCR产物检测及结果分析：
取5µL扩增产物加入点样孔，在恒压100V条件下，于1%琼脂糖凝胶上进行电泳，用1×TAE缓冲液作为电泳液，置于凝胶成像系统下观察PCR扩增结果，并进行拍照。引物对F1/R1和F2/R2的实验结果如图1所示，空白对照无扩增条带，以固体培养物、液体培养物提取的DNA为模板，引物对F1/R1均能扩增出1533bp的目的条带，而引物对F2/R2均无目的条带。从实验结果可以看出，引物的设计难度大，要求高。
实验证明本发明引物对F1/R1可以准确的扩增副猪嗜血杆菌的mviN基因。
4.引物特异性试验
利用设计的引物对F1/R1，分别以副猪嗜血杆菌LC株、副禽嗜血杆菌、猪胸膜肺炎放线杆菌、巴氏杆菌、化脓隐秘杆菌、金黄色葡萄球菌、猪链球菌提取的DNA作为模板，然后进行PCR扩增，阴性对照物为灭菌水，然后进行PCR产物取5µL扩增产物加入点样孔，在恒压100V条件下，于1%琼脂糖凝胶上进行电泳，用1×TAE缓冲液作为电泳液，置于凝胶成像系统下观察PCR扩增结果，并进行拍照。
试验结果如图2所示，只有副猪嗜血杆菌出现目的条带，大小为1533bp，其他6种菌株以及阴性对照均未扩增得到任何条带。
实验证明本发明提供的检测方法特异性强，可以准确的将副猪嗜血杆菌与其他细菌区分开。
5.引物灵敏度试验
将副猪嗜血杆菌划线接种于TSA培养基，37℃培养24～48h，PBS冲洗混匀后，制备DNA模板。副猪嗜血杆菌LC株的DNA浓度测定结果为100ng/µL，并按照100×10-1ng/µL、100×10-2ng/µL、100×10-3ng/µL、100×10-4ng/µL、100×10-5ng/µL、100×10-6ng/µL、100×10-7ng/µL依次进行梯度稀释。分别以倍比稀释的副猪嗜血杆菌基因组DNA为模板，进行PCR扩增，，阴性对照模板为灭菌水。取5µL扩增产物加入点样孔，在恒压100V条件下，于1%琼脂糖凝胶上进行电泳，用1×TAE缓冲液作为电泳液，置于凝胶成像系统下观察PCR扩增结果，并进行拍照。
试验结果如图3所示，模板浓度为100×10-5ng/µL时能出现清晰的目的条带，模板浓度小于100×10-5ng/µL时无条带出现，因此准确检测副猪嗜血杆菌的最低模板浓度为100×10-5ng/µL，使用本发明提供的试剂盒检测待检样本，可准确检测副猪嗜血杆菌DNA不低于100×10-5ng/µL的待检样本。
本发明检测模板DNA浓度下限为100×10-5ng/µL，证明本发明副猪嗜血杆菌检测方法的敏感性高。
实施例 2
使用实施例1特异性好、灵敏度高的试剂盒进行死亡动物组织、血液样品中副猪嗜血杆菌的检测。
1.DNA模板的制备：
将患病后死亡的死亡猪1号及未患病的死亡猪2号，分别制备DNA模板。具体制备方法为：取心脏、肺脏、淋巴结加入PBS研磨，室温孵育10min，5000r/min离心5min，取上清进行组织DNA的提取。血液先将血块弃掉，取液体进行DNA提取。向500µL组织上清液或血液中加入50µL 10%的SDS溶液和10µL 20ug/ml的蛋白酶K，56℃水浴2h；加入500µLTris饱和酚，充分混匀后，12000r/min离心15min；取上清，加入等量的Tris饱和酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），充分混匀后，12000 r/min离心15min；取上清，加入等量的氯仿：异戊醇（24：1），充分混匀后，12000r/min离心15min；取上清，加入2倍体积的无水乙醇，-20℃静置20min，12000r/min离心15min，弃上清；加入70%乙醇冲洗沉淀表面及管壁，弃乙醇，晾干后加入20µL灭菌水溶解沉淀，-20℃保存备用。
2.PCR扩增
分别取上述DNA作为模版，设阳性对照和阴性对照，阳性对照的模板为副猪嗜血杆菌DNA，阴性对照模板为灭菌水，利用本发明的检测试剂盒，其组成如下：
PCR扩增反应程序为：
95℃ 5min；95℃ 45s，55℃ 45s ，72℃ 90s， 32个循环；72℃ 10min；4℃ 保存。
3.PCR产物检测及结果
取5µL扩增产物加入点样孔，在恒压100V条件下，于1%琼脂糖凝胶上进行电泳，用1×TAE缓冲液作为电泳液，置于凝胶成像系统下观察PCR扩增结果，并进行拍照。结果如图4所示，阳性对照出现目的条带，阴性对照未出现目的条带，1号中检测出副猪嗜血杆菌的存在，2号猪中未检出。
4.测序
将死亡猪1号组织扩增产物送上海生工生物工程股份有限公司测序，如图5所示，测序结果表明，产物条带序列与副猪嗜血杆菌SH0165株全基因组序列中的mviN基因序列的同源性为99%，鉴定为副猪嗜血杆菌。
本发明PCR检测结果与测序方法的结果一致，说明PCR方法能够有效的从临床待检样品中检测出副猪嗜血杆菌。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受实施例的限制，其它任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、组合、替代、简化均应为等效替换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
<110>山东省农业科学院畜牧兽医研究所
<120>一种副猪嗜血杆菌的检测试剂盒及其检测方法
<160>2
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>人工合成
<220>
<223>
<400>1
GGTATGACCCTACTTTCTCG 20
<210>2
<211>25
<212>DNA
<213>人工合成
<220>
<223>
<400>2
TTAATTTACCTTGAATGATCTTATT 25

Claims (6)

1.一种副猪嗜血杆菌的检测试剂盒，其特征在于：包括序列如SEQ ID NO：1-2所示的引物对F1、R1各100µL、2×PCR Mix 1.25mL 、阳性对照副猪嗜血杆菌DNA200µL和ddH2O 2×1.25mL；
所述引物对序列为：
mviN-F1 5'GGTATGACCCTACTTTCTCG 3'
mviN-R1 5'TTAATTTACCTTGAATGATCTTATT 3'。
2.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于：所述PCR Mix包括PCR 缓冲液，dNTP，Pfu DNA 聚合酶。
3.一种副猪嗜血杆菌的检测方法，其特征在于：使用权利要求1所述的检测试剂盒进行副猪嗜血杆菌的检测。
4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
a、提取样品DNA：提取待检样品中的DNA备用；
b、基因扩增：将提取的样品DNA加入检测试剂盒中，对待检样品中的DNA进行PCR扩增；
c、结果检测：对DNA扩增结果进行琼脂糖凝胶电泳检测。
5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于：步骤a中，所述待检样品为细菌分离培养物、组织研磨液或血液样品。
6.根据权利要求4或5所述的检测方法，其特征在于：步骤b中，PCR扩增条件为：95℃5min；95℃ 45s，55℃ 45s，72℃ 90s，32个循环；72℃ 10min；4℃ 保存。
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